JPH0272873A - ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヌクレオシドの酸化反応を触媒する新しい酵
素、詳しくはヌクレオシドと分子状酸素との反応によっ
てヌレオシド−５′−アルデヒドを経てヌクレオシド−
５′−カルボン酸を生成するが、過酸化水素は副生じな
い新規ヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１及び該酵素を
利用した新規な分析法に関する。

従来の技術 ヌクレオシドに作用する酵素としては、その加水分解酵
素や脱アミノ酵素と共に、次式に示される酸化反応を触
媒する酵素（ヌクレオシドオキシダーゼ）が知られてい
る。

上記ヌクレオシドオキシダーゼは、従来より例えば代表
的にはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｐｕｔｉｄａ）等の微生物から単離、精製され、ヌ
クレオシド−５′−カルボン酸類の製造や、ヌクレオシ
ド類の字母、更には反応によってヌクレオシドが生成し
たり減少したりする酵素類の活性測定系等に種々利用さ
れている。

しかるに、上記オキシダーゼの利用によれば酸化反応系
においてＨ２Ｏ２の発生が必然的に起こり、例えば上記
ヌクレオシド−５′−カルボン酸類の製造においては、
反応系にカタラーゼ等を添加して上記Ｈ２Ｏ２を分解さ
せる必要があり、また上記反応系内に生成するＨ２　ｏ
２ｆｆｉの測定によってヌクレオシドを測定、定量する
方法では、パーオキシダーゼの利用が必須となる不利が
ある。

しかも上記測定法では、測定系が繁雑となる等の弊害が
ある（例えば特開昭５７−５８８８３号公報、特開昭５
７−６８７９４号公報、特開昭５７−９４３００号公報
等参照）。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、以前から各種微生物起源等のヌクレオシ
ドオキシダーゼにつき、鋭意研究を重ねてきたが、その
過程で、新たに土壌から単離したシュードモナス属に属
する一菌株が、従来のヌクレオシドオキシダーゼとは異
なる酸化反応を触媒する酵素の産生能を有することを見
出すと共に、該酵素の単離精製、その性質等の解明に成
功し、更に該酵素の利用による新しい分析、測定技術の
開発にも成功し、ここに本発明を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 即ち、本発明はヌクレオシドの酸化反応を触媒する酵、
素であって、該ヌクレオシドと分子状酸素との反応によ
ってヌレオシド−５′−アルデヒドを経てヌクレオシド
−５′−カルボン酸を生成するが、過酸化水素は副生し
ないことを特徴とする新規ヌクレオシドオキシダーゼＹ
Ｔ−１、並びにヌクレオシドを含有するか又はこれを生
成させる系を被検液とし、酸化により発色する発色試薬
と上記被検液との混合物に上記ヌクレオシドオキシダー
ゼＹＴ−１を作用させ、被検液のヌクレオシド母変化に
比例する上記発色試薬の発色度合を測定することを特徴
とする被検液の分析法に係わる。

本発明酵素の触媒する上記ヌクレオシドの酸化反応は、
次式（１）及び（２）で示され、これまで知られている
ヌクレオシドオキシダーゼの酸化反応とは明確に区別さ
れる。勿論、従来かかる式（１）及び（２）で示される
反応を触媒するヌクレオシドオキシダーゼは全く知られ
ていない。

また、本発明のヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１は、
後記に詳述する通り、上記式で示される該ヌクレオシド
の酸化反応と同時に、該ヌクレオシド量に応じてラッカ
ーゼ様活性を示すという該酵素に特有の性質を有してお
り、この点においても従来のヌクレオシドオキシダーゼ
とは全く異なっている。本発明の分析法は、該酵素に特
有の上記ラッカーゼ様活性を利用して、発色試薬の発色
度合を例えば吸光度ｌｌす定により行なうものであり、
従来のヌクレオシドオキシダーゼの利用では、かる分析
は実施できない。

以下、本発明酵素の製造法、その性質及びこれを利用し
た本発明の分析法につき順次説明する。

本発明酵素は、シュードモナス属に属する該酵素生産菌
を用いて製造できる。ここで用いられる上記酵素の生産
菌としては、例えば本発明者らが新たに単離した以下の
性質を有する菌株を例示できる。

■、菌学的性質 （Ａ）形態学的性質 ■　細胞は桿菌であり、大きさは０．　５Ｘ１．　５〜
１．７μｍである。

■　運動性を有し、べん毛は極べん毛である。

■　胞子は形成されない。

■　ダラム染色においては陰性である。

（Ｂ）培養所見 ■　肉汁寒天平板培養 生育は中庸であり、集落は円形で、表面は滑かで黄色で
ある。

■　肉汁寒天斜面培養 生育は中庸であり、表面は滑かで黄色である。

■　肉、汁液体培養 表面に生育し、生育は中庸である。

■　　肉汁ゼラチン穿刺培養 表面部分に生育し、ゼラチンを液化する（Ｓｔｒａｔｉ
ｆｏｒｍ）。

（Ｃ）生理的性質 ■　硝酸塩の還元　　　　　陰性 ■　脱窒反応　　　　　　　陰性 ■　インドールの生成　　　陰性 ■　硫化水素の生成　　　　陰性 ■　澱粉の加水分解　　　　陰性 ■　硝酸塩の利用　　　　　陰性 ■　アンモニウム塩の利用　陽性 ■　色素の生成 蛍光色素、ビオシアニン、キサントモナジンはいずれも
生成しない。肉汁寒天培地では褐色の拡散性色素を生産
することがある。

■　ウレアーゼ　　　　　　陰性 ［株］　オキシダーゼ　　　　　陰性〜四隅性■　カタ
ラーゼ　　　　　　陽性 ■　生育の範囲 ｐＨ４，５で生育しない。４°Ｃ及び４１℃で生育しな
い。生育ｐＨは５〜８の範囲が適当であり、温度は３５
℃が最適である。

０　酸素に対する態度　　好気性である■　０−Ｆテス
ト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法）　酸化的■　糖類か
らの酸の生成 り−グルコース　　　陽性 Ｄ−フルクトース　　陽性 Ｄ−マルトース　　　陽性 Ｄ−ガラクトース　　陽性 Ｄ−キシロース　　　陽性 Ｄ−マンニトール　　陰性 ショ糖　　　　　　　陰性 乳　糖　　　　　　　陽性 ＠　エスクリンの分解　　　　　　　陽性０　ア、ルギ
ニンジヒドラーゼ　　　　陰性＠　リジンデカルボキシ
ラーゼ　　　陽性０　オルニチンデカルボキシラーゼ　
陰性［相］　フェニルアラニンデアミナーゼ　陰性■　
卵黄反応　　　　　　　　　　　陰性■　ツイーン２０
の分解　　　　　　陽性■　ツイーン８０の分解　　　
　　　陽性［相］　ポリベーターヒドロキシ酪酸の蓄積
　陰性［相］　栄養要求性 メチオニン或いはシスチンを要求する。

以上の各性質をもとに、本菌株の検索をパージ（Ｂｃｒ
ｇｃｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４））に従って
行なうと、本菌株は■グラム陰性の桿菌であり、胞子を
形成しないこと、■カタラーゼ陽性であること、■極べ
ん毛で運動すること、■グルコースを酸化的に分解する
こと、■ｐＨ７，０の普通寒天培地によく生育すること
等の特徴を有していることより、シュードモナス属（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）に属すると認められた。更に
■シスチン或いはメチオニンを生育に要求すること、■
アルギニンジヒドロラーゼ陰性であること、■ポリベー
ターヒドロキシ酪酸を蓄積しないこと、■コロニーが黄
色であること、■キサントモナジンを産生じないこと、
■オキシダーゼ反応が微弱であること等、シュードモナ
ス　マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌ
ｔｏｐｈｉｌｉａ　）の特徴とよく一致した。

以上の結果より、本発明者らは本菌株をシュードモナス
　マルトフィリアの一菌株と同定し、これをシュードモ
ナス　マルトフィリアＬＢ−８６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｌｌｌａ　ＬＢ−８８）と命名し
た。

該菌株は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に上
記表示にて、微工研菌寄第９８１３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−９８１３）として寄託された。

本発明のヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１は、上記Ｌ
Ｂ−８６株、その変異株等を含むシュードモナス、属に
属し、上記ヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１の産生能
を有する微生物を培養することにより製造できる。

上記微生物の培養は、適当な栄養含有培地中で実施でき
る。この培地としては、シュードモナス属に属する微生
物の培養に通常使用される各種の炭素源、窒素源、無機
物等を含有する合成培地、半合成培地及び天然培地のい
ずれをも使用することができる。上記炭素源としては具
体的には例えば高級脂肪酸、スターチ分解物（デキスト
リン）、マルトース、乳糖、ブドウ糖、糖密、果糖等の
微生物が同化可能な各種炭素化合物が単独で又は２種以
上組合せて用いられる。窒素源としては、例えばペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、綿実粉、コンステ
ィープリカー等を例示できる。

無機物としては、例えば食塩の他、カリウム、ナトリウ
ム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄等の無機金属
のリン酸塩類や硫酸塩類等の無機塩類が必、要に応じて
適宜利用され得る。

上記微生物の培養は、液体培養でも、固体培養でも実施
でき、通常通気攪拌条件下に、好気的に行なわれるのが
望ましい。培地のｐＨ，培養温度、培養時間等の培養条
件は、培養する微生物の発育に適しており、しかも目的
とする酵素の生産金をできるだけ多くする条件から選択
されるのがよい。

例えば培地のｐＨは約６〜８の範囲、培養温度は約２０
〜３５℃の範囲から選択されるのが好適である。培養時
間は目的とする酵素の生産蓄積量が最高に達する時間を
選べばよく、通常は約１２〜４８時間の範囲から選択さ
れる。勿論、上記培養の各条件や培養方法等は、用いる
微生物の種類や培養のための外的条件等に応じて適宜変
化させ得る。

かくして得られる培養物中には、通常その菌体区分に、
目的とする酵素が蓄積される。この酵素の採取及びその
精製は、従来より微生物を利用して酵素２等を製造する
方法に採用されている通常の各種方法に従うことができ
る。上記精製手段としては、例えば溶媒に対する溶解性
を利用する手段、イオン結合力の差を利用する手段、分
子世の差を利用する手段、等電点の差を利用する手段、
疎水性の差を利用する手段等をそれぞれ単独で又は適宜
組合せて採用することができる。

上記菌体区分からの目的酵素の採取につき詳述すれば、
これは例えば遠心分離等の常法に従い集めて得られる湿
潤菌体を、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等に懸濁させ、
超音波処理、フレンチプレス、リゾチーム処理等の種々
の菌体処理手段を適宜組合せ採用することにより行なわ
れ、がくして粗製酵素含有液を得ることができる。

上記粗製酵素含有液は、これを更に通常の方法により精
製して精製酵素標品を得ることができる。

この精製手段としては、例えばエタノール、アセトン等
の有機溶媒による分別沈澱法、硫安、硫酸アルミニウム
等を用いた塩析法等により、まず上記粗製酵素含有液か
ら沈澱を回収し、次いで該沈澱を、ジエチルアミノエチ
ルデキストラン等のイオン交換体、ポリアクリルアミド
ゲル等のゲル滑過剤によるクロマトグラフィー操作に付
すことにより実施でき、またかくして得られる精製酵素
標品は、更に凍結乾燥等の操作によって精製粉末標品と
することもできる。

以上のようにして得られる本発明酵素は、前記した式（
１）及び（２）で示される酸化反応を触媒する酵素作用
を有する点において特徴づけられる他、以下に示す物理
化学的性質等を有する点においてもまた特徴付けられる
。

（１）基質特異性： イノシン等の各種ヌクレオシドに作用する。ヒポキサン
チン等の塩基、イノシン酸等のヌクレオチド、リボース
等には作用しない。

（２）温度及びｐＨ安定性： ｐＨ６，０，６０℃、１５分で９５％以上残存し、７０
℃、１５分では失活する。

また、３７℃、６０分の処理ではｐＨ５，０〜６．０で
９５％以上残存する。

（３）至適ｐＨ：　　ｐＨ５，０〜６．０である。

（４）分子量：約１３００００である。

（ゲル濾過法による） （５）等電点：ｐＨ５，３である。

（６）阻害剤の影響ニジアン酸カリウム、アジ化ナトリ
ウムによって阻害される。

（７）可視部吸収ニリン酸緩衝液等の中性緩衝液中にお
いては４５０ｎｍ以上に吸収極大がない。基質、亜ニチ
オン（ハイドロサルファイドナトリウム）等によって還
元されていない酸化型酵素は４５０ｎｍ以上に吸収極大
がない。

（８）金属含量：鉄を含む。

上記各物理化学的性質及びその他の性質については、後
記実施例において詳述する。

以上の性質を有する本発明酵素ヌクレオシドオキシダー
ゼＹＴ−１は、従来のヌクレオシドオキシダーゼと同様
にヌクレオシドの定量に利用することができる。即ち、
本発明酵素はヌクレオシドを分子状酸素を電子受容体と
して酸化するので、酸素消費量の測定によりヌクレオシ
ドの定量に利用できる。この方法によれば、本発明酵素
の利用によりヌクレオシドを基質とする反応系やヌクレ
オシドを生成する反応系で該ヌクレオシドを測定でき、
これにより例えば５′−ヌクレオチダーゼ等のヌクレオ
シドを生成する反応を触媒する酵素等の各種酵素の活性
の測定等を行ない得る。また例えば魚介類の抽出液中の
ヌクレオシド量の測定により、該魚介類の鮮度の測定も
行なうことができ、更に例えばヌクレオシド−５′−カ
ルボン酸の製造等にも有用である。

特に、本発明酵素は上記ヌクレオシドの酸化反応と同時
に、該ヌクレオシド存在下においてヌクレオシド量に応
じたラッカーゼ反応を示すという該酵素に特有の性質を
有している。しかもこのラッカーゼ様活性はヌクレオシ
ド量と完全に比例しており、従ってこの性質の利用によ
れば、例えばハイドロキノンのような代表的ラッカーゼ
基質を酸化させることができる他、ポリポラス・ベルシ
カラー（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）
起源のラッカーゼのように、４−アミノアンチピリンと
フェノールやアニリン系の物質等を酸化的にカップリン
グさせてキノンイミン等の色素を生成させることができ
、この色素生成量の測定によってヌクレオシド量を定量
することができる。更に本発明酵素の利用によれば、ヌ
クレオシドを遊離させる酵素反応の初速度を分光光学的
に正確且つ簡便に６（１１定することができる。

本発明は上記本発明酵素に特有のラッカーゼ活性を利用
した新しい被検液の検定方法をも提供するものである。

この検定方法につき、詳述すれば、該方法はヌクレオシ
ドを含有するか又はこれを生成させる系を被検液とし、
酸化により発色する発色試薬と上記被検液との混合物に
本発明のヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１を作用させ
、被検液のヌクレオシド量変化に比例する上記発色試薬
の発色度合を測定することにより実施される。

上記において用いられる被検液は、ヌクレオシドを含有
するか又はこれを遊離、生成させる系（ヌクレオシド生
成、遊離酵素反応系）であればいずれでもよい。上記被
検液の代表例としては以下の缶液を例示できる。

（１）　　５’−ＩＭＰ、５’　−ＡＭＰ等の５′−ヌ
クレオチドに５′−ヌクレオチダーゼを作用させてイノ
シン、アデノシン等のヌクレオシドを遊離させる酵素活
性測定用試料液 （２）　　３’−ＩＭＰ、３’　−ＡＭＰ等の３′−ヌ
クレオチドに３′−ヌクレオチダーゼを作用させてイノ
シン、アデノシン等のヌクレオシドを遊離させる酵素活
性測定用試料液 （３）　　生体成分の分解によってヌクレオシドを生じ
これを含む例えば鮮魚、獣肉等の鮮度測定用試料液 （４）　　ＲＮＡ５ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド等にリ
ボヌクレアーゼやデオキシリボヌクレアーゼを作用させ
、生じるヌクレオチドに更にアルカリフォスファターゼ
等を作用させてヌクレオシドを遊離させるリボヌクレア
ーゼやデオキシリボヌクレアーゼの活性測定用試料液 （５）　　アデノシン、デオキシウリジン、キサントシ
ン、チミジン、ウリジン、グアノシン、シチジン、デオ
キシイノシン等のヌクレオシドの試薬試料液 （６）　　イノシナーゼ等のヌクレオシドを基質としこ
れを加水分解する酵素の活性測定用試料液。

上記の内で特に、（１）に記載の酵素活性測定用試料液
、即ちヌクレオシド遊離酵素反応系としては、人血清と
ヌクレオチドとを含有する系を具体例として例示でき、
該系に対して本発明の検定法を実施する時には、上記人
血清中の５′−ヌクレオチダーゼ活性が測定され、これ
は肝機能検査法として非常に有用である。しかして、従
来上記人血清中の５′−ヌクレオチダーゼの活性測定法
としては、５’　−ＡＭＰを基質として遊離する無機リ
ンを測定する方法やアデノシンデアミナーゼ、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼを利用した酵素法等が知られてい
るが、上記無機リンを測定する方法は、反応時間が長く
、操作が複雑であり、共存するアルカリフォスファター
ゼ活性の補正が必要である等の欠点があり、また上記酵
素法でも測定系が複雑であり、反応開始前に３０分程度
の予備反応が必要である等の欠点があったが、本発明検
定法によれば非常に簡単な操作で、従来法より感度よく
、しかも通常約２〜５分秒度の非常に短時間で、目的と
する人血清中の５′−ヌクレオチダーゼ活性を測定する
ことができる。

また、本発明検定法において用いられる酸化により発色
する発色試薬としては、単独の化合物で酸化されて可視
部に吸収を示す試薬及び２種以上の化合物の組合せで酸
化されて縮合して可視部に吸収を示す試薬が包含される
。上記単独化合物の例としては、各種のラッカーゼ基質
、例えば０−トリジン、ｏ−トルイジン、０−ジアニシ
ジン、１Ｏ−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−シメチ
ルアミノー１Ｏ−Ｈ−フェノチアジン、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノ
フェニル〕アミン等のアニリン系物質等を例示できる。

また、上記２種以上の化合物の組合せとしては、従来よ
り臨床診断薬として汎用されている４−アミノアンチピ
リン及びフェノールで代表されるように、所謂カップラ
ーとトリンダー試薬（水素供与体）との組合せを挙げる
ことができる。上記カップラーの具体例としては、４−
アミノアンチピリン（４−ＡＡ）の他、２゜６−ジブロ
モアミノフェノール、３−メチル−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン等を、またトリンダー試薬（水素供与体）の
具体例としては、フェノールの他、β−クロロフェノー
ル、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフ
ェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン（ＤＭＡ）　、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフオプロピ
ル）−ｍ−アニンジン（ＡＤＯ３）　、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルフオプロピル）−アニリ
ン（ＡＬＯ８）　、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルフオプロビル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ８
）　、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロピル）　−ｍ−ア
ニシジン（ＡＤＰＳ）　、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフォプ
ロピルアニリン（ＡＬＰＳ）　、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
フオンロピルー３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウ
ム塩（ＤＡＰＳ）　、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルフォプロピル）−３，５−ジメトキシアニ
リン・ナトリウム塩（ＤＡＯ３）　、Ｎ−スルフォプロ
ビルー３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）　、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフオンロピル）−３，
５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯ８）　、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフオプロビル）−３
，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯ３）　、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルフォプロピルー３，５−ジメチルアニリン（Ｍ
ＡＰＳ）　、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロビルーｍ−
トルイジン（ＴＯＰＳ）　、Ｎ２−エチル−Ｎ２−　（
３−メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエチレンジアミ
ン（ＥＭＡＥ）等を例示できる。

本発明検定法によれば、まず上記被検液と発色試薬との
混合物に本発明酵素を作用させる。これは通常被検液に
発色試薬を添加し、更に本発明酵素を添加するか又は発
色試薬に本発明酵素を添加した液に、被検液を添加し、
その後混合物を所定温度下に所定時間放置することによ
り実施され、かくして酵素反応によって、発色試薬の発
色が認められる。上記において、被検液は適当に希釈し
て利用できる。ここで用いられる希釈液としては例えば
リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の各種の緩衝液や水
等を例示できる。また、上記酵素反応系における各試薬
の使用量は、任意に決定され特に限定されるものではな
いが、通常発色試薬は反応系における濃度が約０．１〜
１０ｔｒ＋Ｍ程度の範囲となる量で、本発明酵素は反応
液１或当たり約０．０５〜１０ユニツトの範囲で、また
被検液は該液中のヌクレオシド濃度が反応液において約
０〜０．２ｍＭ以下の濃度の範囲となる量でそれぞれ用
いられるのが好適である。また酵素反応系の反応条件は
、特に制限されるものではないが、通常約２０〜４０℃
の温度条件を採用するのがよく、反応時間は使用する本
発明酵素の量、反応温度、ｐＨ等に応じて適宜決定でき
、一般には非常に短く、約２０分以内で反応は完結する
。更に上記酵素反応系のｐＨは通常約３〜１０の範囲内
であれば充分に良好に反応は進行するが、一般にはｐＨ
約４〜８の範囲とするのが好適である。

本発明方法では次いで上記酵素反応混合液の発色度合を
測定することによって被検液のヌクレオシド量変化を測
定することができる。この発色度合の測定は、通常の方
法に従って、酵素反応により生じる色素等の可視部に吸
収を示す物質の該可視部吸収を分光学的に測定すること
により行ない得る。例えば４−アミノアンチピリンとフ
ェノールとからキノンイミン色素を生成する系では分光
光度計を用いて、５００　ｎｍの吸光度を測定すること
により、その発色度合を測定できる。その他の系の代表
例及び之等各系における吸光度測定の実例は後記実施例
において詳述する。

更に本発明の上記分析法において、被検液としてヌクレ
オシドを遊離させる酵素反応系、例えばヌクレオチダー
ゼ等を含有する液を用いる場合は、上記本発明酵素によ
る反応を分光光度計のセル中で行ない、単位時間当たり
の吸光度の増加を求めることによって、上記ヌクレオチ
ダーゼ等の酵素活性を測定することもできる。

以上の通り、本発明によれば本発明酵素を利用してなる
、ヌクレオシドの定量やヌクレオシドを生成、遊離する
系等における各種酵素の活性測定に極めて有効な新しい
分析法が提供される。

実　　施　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる
。

尚、ヌクレオシドオキシダーゼ活性は、以下の方法によ
り測定した。

〈ヌクレオシドオキシダーゼ活性測定法〉７ｍＭイノシ
ンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）１ｍ１
２を酵素電極のセルに入れ、酵素標品５μＱを添加し、
２５℃において酵素消費の初速度を測定する。即ち、２
５℃における飽和溶存酸素量的２５０μＭからの溶存酸
素量の減少を酸素電極により経時的に測定し、１分間当
たり１μモルの酸素を消費させた場合を１ユニツト（Ｕ
）とする。

実施例　１ シュードモナス　マルトフィリアＬＢ−８６（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｌａ　ＬＢ−８６
、微工研菌寄第９８１３号）を、ブイヨン培地（肉エキ
ス１％、ペプトン１％及びＮａＣＱＯ，５％、以下同じ
）１００脱を５００鵬容の坂ロフラスコに入れたものに
接種し、２５℃で１２時間振盪培養（１１０ｒｐｍ）し
て種培養物を得る。

得られた種培養物を、予め１０ｆ２容量のジャーファー
メンタ−に殺菌した６Ｑのブイヨン培地及び消泡剤「ア
デカノール」　（旭電化工業社製）０．０７％を添加し
たものの中に接種（接種ｎ：２％）する。培養温度２５
℃、攪拌２５Ｏｒｐｍ。

通気ｍ６Ｑ／分の条件で１２時間培養し、培養終了後、
集菌し、ＩＱのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に菌体を懸
濁させ、２０ＫＨｚ、２００Ｗの条件で１５分間超音波
処理を行なう。かくして菌体抽出液を得る。

このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、１．２Ｕ
／戒であった。

実施例　２ シュードモナス　マルトフィリアＬＢ−８６（微工研菌
寄第９８１３号）を、ブイヨン培地１００或を５００或
容の坂ロフラスコに入れたものに接種し、２５℃で１２
時間振盪培養（１１０ｒｐｍ）して種培養物を得る。

得られた種培養物を、予め５００ＴＩＩＱ容量の坂ロフ
ラスコに殺菌した１００或の酵母エキス・グルコース培
地（酵母エキス２．５％、グルコース３％、ＫＣＱｏ、
１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００
，０５％、ｐＨ７，２）を入れたものの中に接種（接種
量：２％）する。

培養温度２５℃、攪拌１１０ｒｐｍの条件で２４時間培
養し、培養終了後、集菌し、フラスコ１本当たり３０戒
のリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）に菌体を懸濁させ、以
後実施例１と同条件下に超音波処理を行なう。かくして
菌体抽出液を得る。

このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、７、ＯＵ
／戒であった。

実施例　３ 実施例２と同様にして得られた菌体抽出液２７２Ｔｔｌ
Ｑに、２０％ストレプトマイシン硫酸塩６０脱を添加し
て生じた沈澱を遠心除去した後、硫安を３５％飽和にな
るように添加する。生じた沈澱を除去した後、更に硫安
を６０％飽和になるまで添加する。冷所に一夜放置して
沈澱を生成させた後、これを集め、２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）に溶解させる。これを透析チューブに
人、れ、−日透析した後、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨバール６５０
Ｍカラム（トーソー社製）にかけ、同緩衝液で充分洗浄
後、食塩０〜０．５Ｍのリニアグラジェントにて溶出さ
せる。

活性画分を分画分子ｆｆ１２００００のアミコン膜（ア
ミコン社製）を用いて濃縮し、更に２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファクリールＳ−２０
０カラム（ファルマシア社製）にチャージしてゲル濾過
を行なう。溶出してくる活性画分を集め、再び分画分子
ｆｆ１２００００のアミコン膜で濃縮し、セファクリー
ルＳ−２００によるゲル濾過を繰返す。

上記で溶出してくる活性画分を集め、凍結乾燥を行なう
ことにより、精製ヌクレオンドオキシダーゼＹＴ−１を
得る。

この精製品は、ディスク電気泳動的に単一であった。

上記１、精製結果をまとめて下記第１表に示す。

第１表 以下、上記実施例３で得られた本発明ヌクレオシドオキ
シダーゼＹＴ−１精製標品の性質の試験例につき詳述す
る。

（１）酵素作用試験Ｉ ■　酸化反応生成物の検出 酵素、標品１０Ｕを、適当量の水に溶解させて透析チュ
ーブに入れ、７ｍＭイノシン溶液１００ｍＱ中に投入し
て反応させた。

反応０分〜８００分の間の適当時間にそれぞれ反応液の
一部を採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）にて分析した。該ＨＰＬＣはファインＳＩＬ０１８（
Ｆ１ｎｅＳＩＬｃｍ８、日本分光社製）カラムを用い、
溶媒として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３，０）／メタ
ノール＝９５１５を使用し、流速１．　５ｍＱ／分とし
て、２６０　ｎｍの吸光度検出を行なった。

所定時間での結果を第１図に示す。

図においてＸ軸はリテンションタイム（分）を、ｙ軸は
反応時間（インキュベーションタイム、分）を、Ｚ軸は
２６０ｎｍでの吸光度を示す。

第１図より次のことが判る。即ち、経時的にイノシンは
減少し、これに伴って２つのピーク（Ｐ−１及びＰ−２
）が現われ、ｐ−１は反応の初期に増加後、次第に減少
しやがて消失し、最終的にはＰ−２のみが残存した。

上記Ｐ−１をＨＰＬＣにより分離してヌクレオシドオキ
シダーゼ酵素標品と反応させた所、酸素の消費を伴って
Ｐ−２に変化することが確認された。一方、Ｐ−２は上
記酵素標品との反応に供しても変化はなかった。

この結果より本発明酵素標品はイノシンを酸化してＰ−
１を生成し、更に該Ｐ−１を酸化してＰ−２を生成する
作用を有することが判った。

■　反応生成物の同定 ■−Ｉ　Ｐ−１及びＰ−２の調製 イノシン水溶液（２ｍｇ／ｍＱ）　１００ｎ１２に透析
チューブに入れた本酵素標品１００Ｕを投入し、通気攪
拌しなから３７°Ｃで一夜反応させ、ｐ−２を生成させ
た。透析チューブを取出した後、反応液に塩酸を添加し
てｐＨ３，０とし、生じたｐ−２の結晶を遠心分離によ
り集めた。これをｐＨ３，０の塩酸溶液で洗浄し、減圧
乾燥させてＰ−２の結晶的１９０Ｂを得た。

また本酵素標品１０Ｕを透析チューブに入れ、上記Ｐ−
２の調製と同様にしてイノシン水溶液に投入して反応さ
せた。経時的に反応物を採取し、ＨＰＬＣにて分析し、
Ｐ−１蓄積量が増加した時点（３７℃、約３０分）で、
酵素を入れた透析チューブを取出し、反応を停止させた
。この反応液を減圧濃縮後、ＨＰＬＣにてｐ−１画分を
分離し、凍結乾燥により精製して、Ｐ−１粉末を得た。

■−２Ｐ−１及びＰ−２の塩基成分及び糖の分析Ｐ−１
、Ｐ−２及びイノシンをそれぞれＩＮ塩酸にて１００℃
、１時間加水分解した。それぞれの分解液について、含
有される塩基及び糖の分析を行なった。

その結果、いずれの塩基成分も、薄層クロマトグラフィ
ー及びＨＰＬＣにおいて、ヒポキサンチンの標準品と同
一挙動を示した。このことから上記Ｐ−１及びＰ−２の
塩基成分は、共にイノシンと同じヒポキサンチンである
と同定できた。

また上記薄層クロマトグラフィーにおける糖の分析では
、イノシンの分解液からはＤ−リボースが検出されたが
、Ｐ−１及びＰ−２の分解液からはＤ−リボースとは異
なる位置にスポットが検出された。このことから、Ｐ−
１及びＰ−２ではイノシンの糖部分が酸化されているこ
とが明らかとなった。

■−３Ｐ−１の同定 Ｐ−１を１．２倍当量の水素化硼素ナトリウムにより還
元した。この還元生成物を薄層クロマトグラフィー及び
ＨＰＬＣで分析した所、その挙動はイノシンの標準品と
一致した。従って、ｐ−１の水素化硼素ナトリウムによ
る還元生成物はイノシンであると同定された。しかして
、水素化硼素ナトリウムにより還元され、基質であるイ
ノシンに戻り得る唯一の構造はイノシン−５′−アルデ
ヒドのみである。これはＰ−１の核磁気共鳴スペクトル
及び赤外線スペクトルによっても支持された。以上より
Ｐ−１をイノシン−５′−アルデヒドと同定した。

■−４Ｐ−２の同定 Ｐ−２の結晶標品のＣ１Ｃ１３−Ｎスペクトル及びＨｌ
　−ＮＭＲスペクトルを測定した。

Ｃ１Ｃ１３−Ｎは完全カップリング及びデカップリング
にて、Ｈｌ　−ＮＭＲはジメチルスルフオキシド（ＤＭ
ＳＯ−ｄｓ）中のスペクトル及びその重水（Ｄ２０）添
加後のスペクトル測定にて行なった。

その結果、全てのシグナルは、そのケミカルシフト、結
合定数等によって、下記第２表のように帰属でき、この
ことがらｐ−２はイノシン−５′−カルボン酸と同定で
きた。

第　　２　　表 Ｈ ＨＯＨ 但し、表中Ｓはシングレットを、ｄはダブレットを示す
。

■　反応の化学量論 ５０ナノモルのイノシンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液
１脱に本酵素標品ＩＵを添加し、酸素消費量、Ｐ−２生
成量及び過酸化水素量を測定した。

その結果、イノシン５０ナノモルにおける酸素消費量５
１ナノモルにおいてＰ−２の４７ナノモルを生成した。

また過酸化水素は検出されなかった。

次に、１００ナノモルのＰｌを含む１００ｍＭリン酸緩
衝液１脱に本酵素標品ＩＵを添加し、酸素消費ｆｆｌ、
Ｐ−２生成０及び過酸化水素量を測定した。

その結果、Ｐ−１の１００ナノモルにおける酸素消費量
４８ナノモルにおいてＰ−２の９７ナノモルを生成した
。この場合も過酸化水素は検出されなかった。

また、上記反応において、カタラーゼＩＵを添加した場
合においても、酸素消費量に差が認められず、この点か
らも本反応においては過酸化水素は発生しないことが明
らかにされた。

以上の結果より、本発明酵素は、イノシン１モルを１．
７２モルの酸素を電子受容体として酸化して、１モルの
イノシン−５′−アルデヒドと１モルの水とを生成し、
更に１モルのイノシン−５′アルデヒドを１／２モルの
酸素を電子受容体として酸化して、１モルのイノシン−
５′−カルボン酸を生成することが明らかとなった。

（２）酵素作用試験■ ■　１，４−ハイドロキノンを基質とした時の反応生成
物の同定と化学量論 ０．５μモルのイノシン及び０，２μモルの１゜４−ハ
イドロキノンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）１脱に本酵素標品ＩＵを加え、室温で１０分間反応
させ、反応生成物をＨＰＬＣにより分析した。

その結果、溶出位置はｐ−キノンの標準品のそれと一致
した。

更にその紫外線スペクトルも一致した。

従って、上記反応生成物はｐ−キノンと同定された。

また、０．０６μモルのイノシン及び０．１２μモルの
１，４−ハイドロキノンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）　１＋１１１２に本酵素標品ＩＵを加え
、室温で１０分間反応させ、この時の酸素消費量を酸素
電極を用いて測定した。

その結果、酸素消費量は０．１１５μモルであり、この
うちイノシンの酸化に用いられた酸素０．０６μモルを
差引いた値０．０５５μモルは、０．１２μモルの１，
４−ハイドロキノンの酸化に用いられたことになる。

従って、本酵素は、１モルの１，４−ハイドロキノンを
１／２モルの酸素で酸化して、１モルのｐ−キノンと１
モルの水とを生成すると認められた。これは即ち、従来
知られているラッカーゼ（Ｌａｃｃａｓｅ　ＥＣ１，ｌ
ＯＪ、２　）の反応に合致する。

■　ヌクレオシド酸化とラッカーゼ作用の関連本酵素と
１，４−ハイドロキノン等のラッカーゼ基質を混合して
も何らの反応も起こらない。しかるに、上記反応系にイ
ノシン、アデノシン等のヌクレオシドを共存させるとラ
ッカーゼ反応が起こる。即ち、本酵素のラッカーゼ活性
はヌクレオシドの存在を必須とするものであり、この事
実は、以下の試験により確認された。

０．０６μモルのイノシン及び０．０２．０．０６．０
．１２及び０．６μモルのいずれかの１，４−ハイドロ
キノンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１
＋ｎＱに、本酵素ＩＵを作用させた。この時の酸素消費
量及びｐ−キノンの生成丘を調べた結果を下記第３表に
示す。

第３表 上記第３表より、本酵素は１モルのヌクレオシドを、１
モルの酸素を電子受容体として酸化させる場合、同時に
且つ該ヌクレオシドの酸化とは別に、酸素１モルを電子
受容体としてラッカーゼ反応を行なうことが確認される
。

■　フェノール、４−アミノアンチピリンに対する作用 本酵素は、ヌクレオシド存在下に、従来知られているラ
ッカーゼ（ポリポラス　ペルシカラー起源等）と同様に
、フェノールと４−アミノアンチピリンとを酸化的にカ
ップリング反応させて、赤色のキノンイミン色素を生成
させる。この時生成される赤色色素は、その紫外、可視
吸収スペクトル及びＨＰＬＣによる溶出位置等において
、従来の過酸化水素存在下におけるパーオキシダーゼに
よる上記フェノール−４−アミノアンチピリンの酸化反
応により生成するキノンイミン色素と同一であることが
確認される。

上記本発明酵素によるキノンイミン色素の生成（発色度
合）とヌクレオシド量との関係を以下の通り調べた。即
ち、ヌクレオシドとしてイノシンを用い、これを１０ｍ
Ｍフェノール及び４−アミノアンチピリンを含む１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　ＢｒｒＩＱ中に所定
濃度で添加し、該液中にＩＵの本酵素を添加して反応、
発色を行なわせた。その結果は第２図に示す通りである
。

図において、横軸はイノシン濃度（ナノモル）を、縦軸
は５００ｎｍでの吸光度を示す。

第２図より、ヌクレオシド合と発色との間には直線関係
が成立しており、このことがら本酵素は上記反応を利用
してヌクレオシドの比色字母に利用できることが明らか
である。

（３）基質特異性試験 下記、第４表に示す各種の化合物を基質として、これら
に対する本酵素の相対活性（イノシンに対する活性を１
００とする）を測定した。

結果を第４表に併記する。

第４表 前後の試料液の吸収スペクトルを求めた。

その結果を下記第５表に示す。

第５表 し、核酸塩基や糖単独には作用せず、ヌクレオチドにも
作用しないことが明らかである。

また、本酵素の作用するヌクレオシドの糖部分はリボー
スでもデオキシリボースでもよく、塩基部分も各種のも
のでよいことが判る。

（４）ラッカーゼ基質に対する特異性試験本酵素の７ｍ
Ｍイノシン存在下におけるラッカーゼ様活性の基質特異
性を以下の通り調べた。即ち、イノシン７ｍＭと共に下
記第５表に示す各種ラッカーゼ基質の１ｍＭを含む試料
液に本酵素１ユニツトを添加して５分間放置し、上記酵
素添加上記第５表より、本酵素はイノシン存在下では各
種ラッカーゼ基質に作用することが判る。

また、上記ラッカーゼ様活性の発現にはイノシンの他、
第４表に示したような各種のヌクレオシドオキシダーゼ
の基質となるヌクレオシドならば、いずれでもよいこと
が確認されている。

（５）温度及びｐＨ試験 ■　温度安定性： 本酵素をリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）１００脱中にて１
５分間処理視した後、その残存活性を測定した。

その結果は、第３図（横軸＝温度、縦軸＝残存活性）に
示す通りであり、本酵素は６０℃で１５分間安定である
ことが判る。

■　ｐＨ安定性： 本酵素をそれぞれのｐＨで３７℃下に６０分間処理し、
その後、ｐＨ６，０にて残存活性を測定した。

その結果は、第４図（横軸＝ｐＨ，縦軸＝残存活性）に
示す通りであり、本酵素はｐＨ５〜６で安定であること
が判る。

■　至適ｐＨ： 第５図（横軸＝ｐＨ，縦軸＝相対活性）に示す通り１１
本酵素の至適ｐＨは５〜６であった。尚、第５図中（１
）は酢酸緩衝液（μ＝０．０５）を、（２）はリン酸緩
衝液（μ＝０．０５）を示す。

■　至適温度： 本酵素の活性測定に用いる酸素電極は、４０℃以上でそ
の精度が低下し、正しい測定ができない。

４０℃までの範囲では４０℃で最も高い活性を示した。

（６）分子量測定試験 セファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラム（
径２．　５ｃ＋ｎＸ長さ９０ｃｍ）を用いたゲル清適法
により、本酵素の分子量を測定した。

その結果、本酵素の分子量は１３００００と求められた
。

（７）等電点試験 キャリアーアンホライト（ｐＨ３，５〜１０．５）を用
い、ＬＫＢ社製焦点電気泳動装置を用いて、冷却（４°
Ｃ）下に４８時間泳動を行なって、本酵素の等電点を求
めた。

得られた本酵素の等電点はｐＨ５，３であった。

（８）阻害剤の影響試験 本酵素溶液（０，０２Ｕ）を各種阻害剤の存在下ニ、ｐ
Ｈ６，０，２５℃、１０分間イノシンニ作用させた後、
活性を測定した。

その結果を下記第６表に示す。

上記第６表より、本酵素は、シアン化カリウム、アジ化
ナトリウム、Ｎ−ブロモコハク酸イミド等により阻害さ
れることが判る。

（９）紫外、可視吸収スペクトル分析 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中における本酵
素のスペクトル分析を行なった。

その結果を第６図に示す。

（１０）金属含量 原子吸光法により測定した結果、本酵素中には鉄が含ま
れていることが確認されたが、モリブデン、銅、マンガ
ン、亜鉛は検出されなかった。

（１１）活性に及ぼす金属イオンの影響本酵素溶液（０
，０２Ｕ）を各種金属イオンの存在下に、ｐＨ６，０，
２５℃、１０分間イノシンに作用させた後、活性を測定
して、各種金属イオンの本酵素活性に及ぼす影響を調べ
た。

その結果を下記第７表に示す。

第７表 （１２）Ｋｍ値 イノシンに対する見掛けのＫｍ値を求めた結果、該Ｋｍ
値は４．４Ｘ１０−５Ｍであった。

（１３）アミノ酸組成 本酵素を６Ｎ塩酸を用いて減圧下に２４．４８又は７２
時間加水分解し、充分に塩酸を除去した後、０．０９Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐ　Ｈ２，２）に溶解させ、この溶液
について日本電子社製ＪＬＣ２００、Ａ型自動アミノ酸
分析機を用いてアミノ酸の分析を行なった。

トリプトファン（Ｔｒｐ）の含量は、４．２ＮＮａＯＨ
にて１１０℃下に２４時間加水分解後、同様にして測定
した。シスチン（Ｃｙｓ）の定量は、本酵素を過蟻酸酸
化後、塩酸分解を行なって分析した［Ｓ、　Ｍｏｏｒｅ
、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２３８．　２３５
（１９６３）　）。

結果を下記第８表に示す。

第８表 （１４）ディスク電気泳動 ７％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，５）　を使用シ
、デイビスの方法（Ｊ、Ｂ、Ｄａｖｉｓ、　Ａｎｎ、Ｎ
、Ｙ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　１２１　、　４０４　（１９８
４）　）に従って、本酵素のディスク電気泳動を２本行
なった。一方は蛋白染色を、もう一方はｌｌｌ１ｍ単位
で切って活性測定を行ない、それぞれ泳動位置を調べた
。

その結果、酵素蛋白は単一バンドを示し、その泳動位置
は活性の泳動位置と一致した。

以下、本発明酵素を用いた本発明分析法の実施例を示す
。尚、以下の各側において酵素としては、前記実施例３
で得られたヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１精製標品
を用いた。

実施例　４ ４−アミノアンチピリン　　　　　２３．４ｍｇ５％フ
ェノール　　　　　　　　　　　２ｍｆ２５ＱｍＭ　　
ＨＥＰＥＳ緩衝液　　　９８　脱（ｐ　Ｈ７，５） 計　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　鵬上記
組成の発色液２．０鵬にヌクレオシドオキシダーゼ１０
μΩ　（０，３５Ｕ）を加え、次いで種々の濃度のアデ
ノシン含有被検液０．　３１ＴＩＩ２を加え、混合液を
３０℃で２０分間反応させた後、５００ｎｍの吸光度を
測定した。

その結果は第７図に示す通りである。図において縦軸は
吸光度を、横軸は被検液のアデノシン濃度（ミリモル）
を示す。

第７図より、吸光度測定により被検液中のアデノシンを
簡便且つ良好に定量できることが判る。

実施例　５ ４−アミノアンチピリン　　　　　２Ｂ、４ＤＮ−エチ
ル−Ｎ＝（２−ヒドロキ シ−３−スルフォプロピル）−３゜ ５−ジメチルアニリン　　　　　１７８．７ｍｇ５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液 −（ｐＨ６，０）　　　　　　　　　１００　　ｍＱ計
　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　脱上記
組成の発色液２．　　ｏｍｃにヌクレオシドオキシダー
ゼ１０μＱ　　（０，３５Ｕ）を加え、次いで種々の濃
度のイノシン、グアノシン、デオキシアデノシン含有被
検液０．　３ｍｆ２を加え、混合液を３０℃で２０分間
反応させた後、６３０ｒ＋ｍの吸光度を測定した。

その結果を第７図と同様にして、第８図（イノシン測定
結果）、第９図（グアノシン測定結果）及び第１０図（
デオキシアデノシン測定結果）に示す。

２等各図より、吸光度測定により被検液中の各ヌクレオ
シド量を簡便且つ良好に定量できることが判る。

実施例　６ ４−アミノアンチピリン　　　　　２３．４ｍｇＮ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキ シ−３−スルフオンロピル）　−ｍ −トルイジン　　　　　　　　　１７１．３ｍｇグリセ
ロール−２−リン酸φ２ナ トリウム　　　　　　　　　　　　　１．７６ｇＭｎＳ
Ｏ４−４〜６Ｈ２０１９，４ｍｇ５０ｍＭ　　ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液 （ｐＨ７，５）　　　　　　　　　　１００　　或計　
　　　　　　　　　　　　　　　　１００　戒上記組成
の発色液２．０戚にヌクレオシドオキシダーゼ１０μＱ
　（０，３５Ｕ）を加え、次いで種々の濃度の５′−ヌ
クレオチダーゼ含有被検液（シグマ社製、５’　−ＮＤ
コントロールＥ）０．１購を加え、次に基質である１１
．５ｍＭ５′−アデニル酸（５’−ＡＭＰ）溶液０．２
鴫を添加し、分光光度計にて単位時間当りの５５５０Ｉ
１１の吸光度の増加を約５分間測定した。

その結果を第１１図に示す。図において縦軸は１分間当
りの吸光度の増加値を、横軸は５′−ヌクレオチダーゼ
濃度（Ｕ／Ｑ）を示す。

第１１図より、吸光度測定により被検液中のヌクレオチ
ダーゼ量を簡便且つ良好に定量できることが判る。

実施例　７ ４−アミノアンチピリン　　　　　２３，４ｍｇ５％、
フェノール　　　　　　　　　　　２　或ＭｎＳＯ４・
４〜６Ｈ２０１９，４ｍｇ５０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ緩衝
液 （ｐＨ７，５）　　　　　　　　　　９８　１１ＩＱ計
　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　脱上記
組成の発色液２．　ｏ＋ｎｃにヌクレオシドオキシダー
ゼ１０μＱ　（０，３５Ｕ）を加え、次いで種々の濃度
の３′−ヌクレオチダーゼ含有被検液（シグマ社製）０
．１ｍＯを加え、次に基質である１１．５ｍＭ　　３’
　−アデニル酸（３’　＝ＡＭＰ）溶液０．２１１Ｑを
添加し、分光光度計にて単位時間当りの５０５ｎｍの吸
光度の増加を約５分間測定した。

その結果を第１１図と同様にして、第１２図に示す。

該図より、吸光度測定により被検液中のヌクレオチダー
ゼ量を簡便、迅速且つ良好に定量できることが判る。

実施例、８ 実施例６に示した発色液と同一組成の発色液に、ヌクレ
オシドオキシダーゼ１０μＱ　（０，３５Ｕ）及び人血
清０．　１ｍＱを加え、次に５’　−ＡＭＰ（１１，５
ｍＭ）０．２ＴｎＱを添加し、分光光度計にて５５５ｎ
ｍの吸光度の増加を測定することにより人血清中の５７
−ヌクレオチダーゼ活性を測定した。

同一血清試料を用いて１５回上記測定を繰返した結果は
下記第９表に示す通りである。

第９表 第１０表 上記表より本測定法によれば、人血清中の５′−ヌクレ
オチダーゼ活性を高い再現性をもって測定できることが
明らかである。

実施例　９ 実施例８と同様にして人血清５検体について、５′　−
ヌクレオチダーゼ活性を測定した。

また、比較のため同人血清検体に対して従来知られてい
る酵素法（Ｃ，Ｌ、Ｍ、Ａｒｋｅｓｔｅｉｊｎ、　Ｊ、
Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、Ｃｌ１ｎ、Ｂ１ｏｃｈ＋；ｍ、、　Ｖｏｌ、
１４．ｐ１５５−１５８（１９７Ｂ）　：］を行なって
、同酵素活性を測定した。

得られた結果（Ｕ／Ｑ）を下記第１０表に対比して示す
。

上記表、より本測定法によれば、従来の測定系が複雑で
、反応開始前に３０分程度の予備反応が必要である等の
欠点を有している酵素法に代って、人血清中の５′−ヌ
クレオチダーゼ活性を、非常に簡単な操作で、高感度に
しかも短時間で測定できることが明らかである。

実施例１０ 種々の濃度のイノシンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ６，０）２ｍｆ２に、１ｍＭｏ−）ルイジン溶液１
ｍＱを加え、次いでヌクレオシドオキシダーゼ１０μＱ
　　（０，３５Ｕ）を添加し、３７℃で１５分間反応さ
せ、反応液の４８０　ｎｍの吸光度を測定した。

得られた結果を第１３図に示す。図において縦軸は４８
０　ｎｍの吸光度を、横軸は反応液中のイノシン量（μ
モル）を示す。

該図より、被検液のイノシン含有量と吸光度との比例関
係を利用して、被検液中のイノシン量を良好に測定でき
ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素作用試験Ｉに従い、イノシンを基質
として本酵素による酸化反応を行なって得られる反応生
成物の高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図であ
る。 第２図は本発明酵素作用試験Ｈに従い、イノシンを基質
としてフェノール及び４−アミノアンチピリンの存在下
に本酵素による酸化反応を行なって得られるキノンイミ
ン色素の発色度合と上記基質濃度との関係を示す図であ
る。 第３図は本酵素の温度安定性を調べた図である。 第４図は本酵素のｐＨ安定性を調べた図である。 第５図は本酵素の至適ｐＨを調べた図である。 第６図は１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中おけ
る本酵素のスペクトル分析結果を示す図である。 第７図乃至第１０図は実施例４及び５に従い、各種被検
液中のヌクレオシド量と吸光度測定値との関係を求めた
グラフである。 第１１図及び第１２図は実施例６及び７に従い、各種被
検液中のヌクレオチダーゼ量と吸光度測定値との関係を
求めたグラフである。 第１３図は実施例１０に従う測定結果（イノシン量と吸
光度測定値との関係）を求めたグラフである。 （以　上） 第 図 ノテンションタイム　（脅） 第 図 イノシン１１度（ナノモル） 第 図 Ｈ 第 図 第 図 イノシン′Ｊ農道 （ミリモル） 第 図 Ｕ 弘ヌクレオチターセ゛ｓｉ度（Ｉ＋Ｉ）３′−ヌクレオ
チダーセ゛５１１蔓（、ｌＪｇ）第 図 Ｏ１０ グアノシン：／居ｒ＜ミリモル） 第 図 テにキシアテンシンＪｉ（ミリモル） 第１３ 図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヌクレオシドの酸化反応を触媒する酵素であって
   、該ヌクレオシドと分子状酸素との反応によってヌレオ
   シド−５′−アルデヒドを経てヌクレオシド−５′−カ
   ルボン酸を生成するが、過酸化水素は副生しないことを
   特徴とする新規ヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１。
2. （２）ヌクレオシドを含有するか又はこれを生成させる
   系を被検液とし、酸化により発色する発色試薬と上記被
   検液との混合物に請求項１に記載のヌクレオシドオキシ
   ダーゼＹＴ−１を作用させ、被検液のヌクレオシド量変
   化に比例する上記発色試薬の発色度合を測定することを
   特徴とする被検液の分析法。
3. （３）被検液がヌクレオシドを含有する試料、ヌクレオ
   シドを遊離させる酵素反応系及びヌクレオシドを分解さ
   せる酵素反応系から選択される請求項（２）に記載の分
   析法。
4. （４）被検液が人血清とヌクレオチドとを含有するヌク
   レオシド遊離酵素反応系であり、上記人血清中の５′−
   ヌクレオチダーゼ活性が測定される請求項（２）に記載
   の分析法。