JPH0136065B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0136065B2 JPH0136065B2 JP55144689A JP14468980A JPH0136065B2 JP H0136065 B2 JPH0136065 B2 JP H0136065B2 JP 55144689 A JP55144689 A JP 55144689A JP 14468980 A JP14468980 A JP 14468980A JP H0136065 B2 JPH0136065 B2 JP H0136065B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pro
- hcg
- antibody
- ser
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明は、人絨毛性ゴナドトロピン（以下hCG
と略称することもある。）の免疫化学的測定法に
関する。hCGは妊娠と同時に形成される絨毛細胞
から産生される蛋白ホルモンの一種であり、プロ
ゲステロンの分泌を促進する。hCGの検出は妊娠
の初期診断に汎用されている。さらに胞状奇胎、
破壊胞状奇胎、絨毛癌など絨毛性疾患において、
尿中、血中など体液中のhCG測定は、これらの疾
患の早期発見、治療効果の判定、予後管理などの
面から極めて重要であることが分つてきた。しか
しこれらの診断には約100IU／以下の微量hCG
の測定が必要であり、この際問題となるのはhCG
と類似の構造を有する蛋白ホルモン、すなわち黄
体形成ホルモン（以下hLHと略称することもあ
る。）、卵胞刺激ホルモン（以下hFSHと略称する
こともある。）および甲状腺刺激ホルモン（以下
hTSHと略称することもある。）との免疫学的な
交差反応である。特にhLHはhCGと類似性が高
く、生理的な尿中のhLH量は150IU／に達する
こともあるので、微量の体液中のhCGを測定する
ためにはhCGとhLHとを免疫学的に区別するこ
とが必要である。 一方、これらの蛋白ホルモンの化学的解析か
ら、その交差反応性が共通構造の多いそれぞれの
α−サブユニツト部分に起因することが分つた。
そこで比較的類似性の少ないhCGのβ−サブユニ
ツト（以下hCG−βと略称することもある。）を
分離精製し、抗hCG−β抗体を作製してhCGを特
異的に検出する試みがなされている。しかしhCG
−βの分離精製は繁雑であり、またhCGやhCGの
α−サブユニツト（以下hCG−αと略称すること
もある。）の混在を避けることは極めて難しく、
これらの混在と、hCGとhLHとのβ−サブユニ
ツト間になお残存する共通のアミノ酸配列のた
め、抗hCG−β抗体の使用ではhLHとの交差反
応性を完全には除去できない。しかしながら、
hCG−βのＣ末端にある約30個のアミノ酸よりな
るペプチドはhLHには存在しないアミノ酸配列
を示しており、この部分においてはhCGとhLH
とを完全に識別することが可能であることが分つ
た。 かかる構造解析の結果から、Matsuuraらは
hCG−βのＣ末端ペプチドを合成し、ウサギに免
疫してhCG特異抗血清を得たのち、それを用いて
競合法によるラジオイムアツセイ（以下RIAと略
称する）を実施し〔“Endocrinology”、第104巻
（1979年）、第396頁〕、特異性については満足すべ
き結果を得ているが感度については十分ではなか
つた。 さらに特願昭55−42484、同55−80467に記載さ
れているようにhCGを動物に免疫して得られる抗
hCG抗体を、hCG−βの合成Ｃ末端ペプチドを不
溶化して得た固相を用いて精製し、競合法による
酵素免疫測定法（以下EIAと略称することもあ
る。）を実施し、特異性ならびに感度について満
足すべき結果を得ている。 しかしながら、競合法によるRIAやEIAは被検
液中の他の成分の影響を受けやすく、測定に長時
間を要するという欠点を有する。そこで、更に簡
易な方法を求めて研究を重ねたところ、hCGを非
競合法（以下サンドイツチ法と呼ぶ）により測定
することにより、特異的高感度に測定することが
できることを見い出し、これに基づいてさらに研
究した結果本発明を完成した。 本発明は、担体上に保持された抗体、抗原およ
び標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測
定方法において、担体上に保持される抗体と標識
剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重
複しない２種の抗体であり、該抗体のうち一方が 一般式 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH ［式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１ないし
14個の部分ペプチド鎖を表わす。］で表わされる
ペプチドとキヤリア用タンパクとをグルタルアル
デヒドの存在下に縮合せしめた縮合生成物を人以
外の温血動物に接種して形成せしめ、これを採取
することにより得られた人絨毛性ゴナドトロピン
に特異的に反応する抗体であることを特徴とする
人絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定方法。 本明細書において、しばしば表現されている競
合法およびサンドイツチ法について、その測定原
理を説明する。 (1) 競合法；未知量の抗原を含む被検液と標識剤
で標識した抗原の一定量とを対応する抗体の一
定量に対して競合反応させ、抗体と結合した標
識剤もしくは抗体と結合しながつた標識剤の活
性を測定する。 (2) サンドイツチ法；未知量の抗原を含む被検液
に担体上に保持された過剰量の抗体を加えて反
応させ（第１反応）、次に標識剤で標識した過
剰量の抗体の一定量を加えて反応させる（第２
反応）。担体上に保持された標識剤もしくは担
体上に保持されなかつた標識剤の活性を測定す
る。第１反応、第２反応は同時に行なつてもよ
いし時間をずらして行なつてもよい。 一般にサンドイツチ法を用いる免疫化学的測定
方法において、第１反応および第２反応で用いら
れている抗体は、同一の抗血清から調製されてい
る。しかしながら、hCGを特異的に測定するサン
ドイツチ法による本発明の免疫化学的測定方法に
おいて、hLHなどの類似した化学構造を有する
蛋白ホルモンとの交差反応による測定誤差を無く
するためには、第一反応で用いる抗体と第二反応
で用いる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しな
い２種の抗体であり、該抗体のうち一方はhCGに
特異的に反応する抗体が用いられる。 hCGに特異的に反応する抗体としては、たとえ
ば “Endocrinology”、第104巻（1979年）、第
396頁に記載されているような抗体が挙げられ
る。即ち、hCG−β鎖のＣ末端側のhCGに特異
的なペプチドと牛アルブミンや牛チログロブリ
ンなどキヤリアー用タンパクとを１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドなど水溶性カルボジイミドを用いて得た
縮合物をフロインドの完全アジユバントもしく
は不完全アジユバントと共に人以外の温血動物
たとえばウサギに頻回接種して抗体を形成せし
め、これを採取することによりhCGに特異的に
反応する抗血清を得ることができる。 特願昭55−42484、特願昭55−80467に記載さ
れたhCGに特異的に反応する抗hCG抗体、すな
わち担体上に不溶化した一般式〔〕 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH〔〕 〔式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされるペプ
チドに抗hCG抗体を含有する体液を接触させ、つ
いで特異的に吸収された抗hCG抗体を溶出するこ
とにより得られた抗hCG抗体が挙げられる。 上記のhCGに特異的に反応する抗体を製造する
際に用いられるペプチドにおけるＲで示される のペプチドの14位のGlyを含む１ないし14個の部
分ペプチド鎖としては、たとえばGly、Pro−
Gly、Leu−Pro−Gly、Arg−Leu−Pro−Gly、
Ser−Arg−Leu−Pro−Gly、Pro−Ser−Arg−
Leu−Pro−Gly、Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly、Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly、Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−
Leu−Pro−Gly、Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−
Ser−Arg−Leu−Pro−Gly、Pro−Ser−Leu−
Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly、
Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−
Arg−Leu−Pro−Gly、Pro−Pro−Pro−Ser−
Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−
Gly、Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−
Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Glyが挙げら
れる。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Ala：アラニン Pro：プロリン Ser：セリン Leu：ロイシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Tyr：チロシン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ile：イソロイシン Gln：グルタミン Glu：グルタミン酸 Ｚ：ベンジルオキシカルボニル OBut：ｔ−ブチルエステル HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミド・エステル DMF：Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド DCC：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド DMSO：ジメチルスルホキシド THF：テトラヒドロフラン HOBt：１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール OSu：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル ECDI：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド CMCT：１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）−カルボジイミド・メト−パラ−
トルエンスルホネート GLA：グルタルアルデヒド ｍ−MBHS：メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ハイドロキシスクシンイミドエステル ｐ−MCHS：パラ−マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボキシル−Ｎ−ハイドロキシ
スクシンイミドエステル 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなペプチド
合成の手段としては、たとえば“The
Peptides”、第１巻（1966）、Schro¨der and
Lubke著、Academic Press、New York、U.S.
A.あるいは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株
式会社（1975年）に記載された方法、たとえばア
ジド法、クロライド法、酸無水物法、混合無水物
法、DCC法、活性エステル法、ウツドワード試
薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸
化還元法、DCC／アデイテイブ（例、HONB、
HOBt、HOSu）法などがあげられる。 上記した抗体を製造する方法において用いられ
る担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガ
ロースゲル〔例、セフアロース4B、セフアロー
ス6B（フアルマシア・フアインケミカル社（スエ
ーデン）製〕、デキストランゲル〔例、セフアデ
ツクスG75、セフアデツクスG100、セフアデツ
クスG200（フアルマシア・フアインケミカル社
製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオゲル
P30、バイオゲルP60、バイオゲルP100（バイオ
ラツド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セルロー
ス粒子〔例、アビセル（旭化成製）、イオン交換
セルロース（例、ジエチルアミノエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着
剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロツド、
アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラス
ロツド）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポ
リスチレン球、ポリスチレン粒子）〕、イオン交換
樹脂（例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバ
ーライトIRC−50（ローム・ハース社（米国）
製）、ゼオカーブ226（パームチツト社（西ドイツ）
製）〕、弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバー
ライトIR−4B、ダウエツクス３（ダウケミカル社
（米国）製）〕｝などが挙げられる。 ペプチドを担体上に不溶化するには公知の常套
手段を応用しうるが、そのような不溶化ペプチド
合成の手段は、たとえば“代謝”、第８巻（1971
年）、第696頁に記載されている方法に従えばよ
い。たとえばブロムシアン法、GLA法、DCC法
などが挙げられ、好ましくはブロムシアンで活性
化された担体にペプチドを結合させる方法が用い
られる。次に、hCGを動物に免疫して得られた抗
hCG抗体を含む体液、特に血清を、担体上に不溶
化した一般式〔〕で表わされるペプチドに接触
させる。この方法は、硫酸ナトリウムまたは硫酸
アンモニウムなどで塩析沈澱させ、直接もしくは
更にDEAE−セルロースなどのカラムクロマトグ
ラフイーでIgGフラクシヨンを分取したのち、上
記の不溶化ペプチドに接触させ特異抗hCG抗体の
みを固相に吸収させる。これにより、hLH、
hFSHおよびhTSHと交差反応する他の抗hCG抗
体を除去することができる。ついで、固相に吸収
された特異抗hCG抗体を溶出する。この溶出を行
なうには低PHもしくは高PHの緩衝液（例、PH2.3
の0.17Mグリシン−塩酸緩衝液、PH11のアンモニ
ア水）や高濃度の塩を含有する緩衝液（例、6M
グアニジン塩酸溶液、7M尿素溶液）が用いられ、
特異抗体画分を溶出分取する。上記の操作はバツ
チ法で行つても良いが、好ましくはカラムを使用
する方法で実施される。 このようにして得られた抗体の物性は、(1)オク
タロニー法〔“医化学実験法講座”第４巻159頁
（1972年）（中山書店）〕でhCGおよびhCG−βと
の間に沈降線を与え、(2)電気泳動易動度はγ−グ
ロブリン画分に属し、(3)hCGを感作させた赤血球
と混合して赤血球を凝集させ、(4)分子量は約14〜
17万で約２〜７％の糖を含み、(5)PH２〜12の水性
溶媒に易溶であり、(6)冷蔵保存で１カ年以上安定
であり、(7)第１図に示した紫外吸収スペクトルを
有し、(8)アミノ酸組成は、グリシン100モル当り
の各アミノ酸のモル数で示すと、リジン85〜97、
ヒスチジン35〜43、アルギニン38〜45、アスパラ
ギン酸110〜132、スレオニン98〜107、セリン118
〜135、グルタミン酸138〜145、プロリン92〜
134、グリシン100、アラニン73〜79、バリン129
〜138、メチオニン２〜10、イソロイシン28〜37、
ロイシン100〜112、チロシン38〜48、フエニルア
ラニン55〜68であり、(9)それぞれ２本のＨ鎖とＬ
鎖とがＳ−Ｓ結合して分子を形成する。 hCGに特異的に反応する抗体としては、さら
に、(3)一般式〔〕 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH〔〕 〔式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１ないし
14個の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされる
ペプチドとキヤリア用タンパクとをグルタルアル
デヒド（「GLA」と略称することもある。）の存
在下に縮合せしめた縮合生成物を人以外の温血動
物に接種して抗体を形成せしめ、これを採取する
ことにより得られた抗体が挙げられる。 ここにおいてキヤリア用タンパクとは、単独で
は抗体産生を誘導することができないペプタイド
などハプテン（低分子量物質）に対する抗体を産
生させるためにハプテンと結合させて用いられる
ものをいい、その例としてはたとえば牛血清アル
ブミン、牛ガンマグロブリン、牛チログロブリ
ン、破傷風トキソイド、ヘモシアニンおよびポリ
アミノ酸などが挙げられる。 一般式〔〕で表わされるペプチドとキヤリア
用タンパクとをGLAの存在下に結合させるには、
公知の方法〔例、“Hormone and Metabolic
Research”、第８巻（1976年）、第241頁〕によつ
て実施し得る。一般式〔〕で表わされるペプチ
ドとキヤリア用タンパクの使用量比は１対１ない
し２対１が適当であり、反応PHは7.3前後が良好
な結果を与える場合が多い。また反応に要する時
間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３時間
が適当である。この様にして作成した縮合生成物
は常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結
乾燥して保存することができる。 以上の様にして製造した縮合生成物は人以外の
温血動物に接種される。 上記hCGに特異的に反応する抗体の製造に用い
られる人以外の温血動物としては、たとえば哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラツト、マウ
ス、モルモツト、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、
ニワトリ、ハト、アヒル、ガチヨウ、ウズラ）な
どが挙げられる。 該縮合生成物を人以外の温血動物に接種する方
法としては、動物に接種する縮合生成物は抗体産
生するに有効な量でよく、たとえばウサギに１回
２mgを等容量（１ml）の生理食塩水およびフロイ
ンドの完全アジユバントで乳化して、背部ならび
に後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体
を産生させ得る場合が多い。 このようにして、温血動物中に形成された抗体
を採取する方法としては、たとえばウサギでは、
通常最終接種後７日から12日の間に耳静脈から採
血し、遠心分離して血清として得られる。 hCGの測定において用いられる担体上に保持さ
れた抗体における担体としては、前記した抗体の
製造の際に用いられる担体と同様のものが挙げら
れる。 担体に抗体を結合させるには、公知の常套手段
を応用し得るが、たとえば“代謝”、第８巻
（1971年）、第696頁に記載されているブロムシア
ン法、GLA法などが挙げられる。また、より簡
易な方法として抗体を物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。 本サンドイツチ法において測定対象となる抗原
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液
等の体液が挙げられ、とりわけ尿、血清が繁用さ
れる。 hCGの測定において用いられる標識剤を結合さ
せた抗体における標識剤としては、放射性同位元
素、酵素、螢光物質、発光物質などが挙げられ
る。放射性同位元素としてはたとえば 125I、
131I、 3H、 14Cなどが、上記酵素としては、安
定で比活性の大きなものが好ましく、その例とし
てはたとえば(1)カルボヒドラーゼ〔例、グリコシ
ダーゼ（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコ
シダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−フルクト
シダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシ
ダーゼ、α−マンノシダーゼ）、アミラーゼ（例、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼＡ）、セ
ルラーゼ、リゾチーム〕、(2)アミダーゼ（例、ウ
レアーゼ、アスパラギナーゼ）、(3)エステラーゼ
〔例、コリンエステラーゼ（例、アセチルコリン
エステラーゼ）、ホスフアターゼ（例、アルカリ
ホスフアターゼ）、スルフアターゼ、リパーゼ〕、
(4)ヌクレアーゼ（例、デオキシリボヌクレアー
ゼ、リボヌクレアーゼ）、(5)鉄・ポルフイリン酵
素（例、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトク
ロームオキシダーゼ）、(6)銅酵素（例、チロシナ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ）、(7)脱水素
酵素（例、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水
素酵素、乳酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵
素）などが、螢光物質としては、フルオレスカミ
ン、フルオレツセンスイソチオシアネートなど
が、発光物質としてはルミノール、ルミノール誘
導体、ルシフエリン、ルシゲニンなどがそれぞれ
挙げられる。 上記hCGに特異的に反応する抗体と標識剤とを
結合させるには、公知の常套手段であるクロラミ
ンＴ法〔“Nature、第194巻（1962年）、第495
頁〕、過ヨウ素酸法〔“Journal of
Histochemistry and Cytochemistry”、第22巻
（1974年）、第1084頁〕、マレイミド法〔“Journal
of Biochemistry”、第79巻（1976年）、第233頁〕
などが用いられる。 hCGおよびhCG−βのサンドイツチ法による特
異的免疫化学的測定方法を実施するには、(1)未知
量のhCGおよびhCG−βを含有する被検試料に公
知の常套手段で物理的もしくは化学的に抗体を結
合させた固相を加えて反応させる（第１反応）。
固相を洗浄したのち、標識剤で標識した抗体の一
定量を加えて反応させる（第２反応）。次に通常、
固相をよく洗浄し、固相上に結合している標識剤
の活性を測定する。標識剤が放射性同位元素であ
る場合、ウエルカウンターもしくは液体シンチレ
ーシヨンカウンターで測定する。標識剤が酵素で
ある場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは
螢光法で酵素活性を測定する。標識剤が螢光物
質、発光物質であつても、それぞれ公知の方法に
従つて測定する。上述のアツセイ方法において、
第１反応と第２反応の間における洗浄を省略して
もよいし、さらに簡略化するために被検液、抗体
結合固相および標識剤で標識した抗体を同時に加
えて反応させてもよい。即ち本発明で用いられた
抗体は互いに抗原決定部位が異なつているため、
試薬の添加順序、添加時期、洗浄操作の有無など
によつて影響を受けないという極めて優れた特色
を有するものである。 かくして、本発明によれば、 (1) hLHなどhCGと類似のペプチドホルモンに
よる影響を完全に受けることなく微量のhCGお
よびhCG−βを測定できる。 (2) サンドイツチ法を用いているので競合法と比
べて測定濃度範囲が広い。 (3) 用いられた２種の抗体と抗原とを同時に反応
させることもできるので、操作方法が簡易であ
り、測定に要する時間が短かくてすむ。 (4) したがつて絨毛癌など絨毛性疾患の早期診断
や予後管理に極めて適用性の高いものである。 本発明のサンドイツチ法によるhCGの免疫化学
的測定法に用いられる定量用キツトとしては、主
として (1) 担体上に保持された抗体 (2) 標識化された抗体 (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝液であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。） (5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝液であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) 標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測
定に必要な試薬。その一例として、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの場合は、酵素基質（好ましく
は４−メチルウンベリフエリルβ−Ｄ−ガラク
トシドまたはオルトニトロフエニル−β−Ｄ−
ガラクトシド）、酵素基質の溶解に用いる緩衝
液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応
停止に用いる緩衝液（好ましくは炭酸緩衝液ま
たはグリシン緩衝液）が挙げられる。標識剤に
発光性物質を用いる場合は、該発光性物質を測
定する材料。その一例としてルミノールでは酸
化剤（好ましくは過酸化水素）、触媒（好まし
くはミクロパーオキシダーゼまたは次亜塩素酸
塩）および酸化剤、触媒の溶解に用いる緩衝液
（好ましくは水酸化ナトリウム液または炭酸緩
衝液）が挙げられる。 また、上記(1)と(2)とは、あらかじめ混合してあ
るものでもよい。 上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。 標準hCGもしくは被検液約10〜200μに試薬
(4)を加えて希釈し、一定量の試薬(1)、次いで試薬
(2)を約10〜300μを加えたのち、約０〜40℃で
反応させる。約１〜24時間反応後、試薬(5)で洗浄
し担体上に結合している標識剤の活性を測定す
る。標識剤が放射性同位元素である場合、ウエル
カウンターもしくは液体シンチレーシヨンカウン
ターで測定する。標識剤が酵素である場合、基質
液約10〜1000μを加えて約20〜40℃で約0.5〜24
時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反応
液中の吸光度もしくは螢光強度を測定する。 標識剤が螢光物質、発光性物質であつても、そ
れぞれ公知の常套手段によつて測定し得る。 以下に、実施例、参考例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 以下の参考例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、特に記載のない場合、メルク社製シリカゲ
ルプレート60F254を用い、下記の展開溶媒を用い
る。 Rf1：クロロホルム：メタノール＝95：５ Rf2：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf3：酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝60：
20：６：10 Rf4：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 Rf5：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝
１：１：１：１ Rf6：ｎ−ブタノーノール：酢酸：水＝12：３：
５ 参考例 １ Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−
Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro
−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−
Gln−OH〔以下、ペプチド（）と称する。〕
〔hCG−β（123−145）Ｃ末端ペプチド部分〕の
製造 (a) Ｚ−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Gln−
OBut12.5ｇをメタノール500mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒として接触還元する。触媒をろ
去し、溶媒を留去したのち、残留物を酢酸エチ
ル300mlに溶解する。これにＺ−Pro−OH9.7
ｇとHONB8.4ｇ、DCC8.8ｇより合成したＺ−
Pro−ONBの酢酸エチル溶液200mlを加え５時
間かきまぜる。反応液を0.2N−塩酸、４％−
炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥する。酢酸エチルを留去し、残
留物に石油ベンジンと少量のエーテルを加え結
晶とし、さらに同じ溶媒系で再結晶する。 収量13.1ｇ（81.5％）、融点86−88℃、〔α〕26 D
−64.8゜（ｃ＝0.5、メタノール）、Rf10.42、
Rf20.73。 元素分析C22H31C6N3：計算値C60.95；
H7.21；N9.69.分析値C61.04；H7.20；N9.49。 (b) Ｚ−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−
Pro−Gln−OBut13ｇをメタノール500mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒とし、水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物を酢酸エチル300mlに溶解し、Ｚ−Leu−
OH7.9ｇ、HONB6.5ｇ、DCC6.8ｇとから合成
したＺ−Leu−ONBの酢酸エチル溶液を加え、
５時間かきまぜる。反応液を0.2N−塩酸、４
％−炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去する。残留
物に石油ベンジンを加え粉末としてろ取する。 収量10.6ｇ（66.2％）、融点74−77℃、〔α〕23 D
−81.4゜（ｃ＝0.6、メタノール）、Rf10.38、
Rf20.66。 元素分析C28H42O7N4：計算値：C61.52；
H7.74；N10.25.分析値：C61.61；H7.94；
N9.92。 (c) Ｚ−Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ
−Leu−Pro−Gln−OBut10.6ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として接
触還元したのちメタノールを留去し、残留物を
酢酸エチル300mlに溶解する。これにＺ−Ile−
OH5.1ｇ、HONB4.2ｇ、DCC4.4ｇから合成し
たＺ−Ile−ONBの酢酸エチル−ジオキサン混
合溶液（１：１）200mlを加え16時間かきまぜ
る。反応液より溶媒を留去し、残留物を酢酸エ
チル400mlに溶解し、0.2N−塩酸、４％−炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。溶媒を留去し、残留物に石油
ベンジンを加え粉末としてろ取する。 収量12.1ｇ（94.5％）、融点78−80℃（分
解）、〔α〕23 D−87.0゜（ｃ＝0.42、メタノール）、
Rf10.23、Rf20.67。 元素分析C34H53O8N5計算値：C61.89；
H8.10；N10.62.分析値：C62.35；H8.31；
N10.16。 (d) Ｚ−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製
造：Ｚ−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut12ｇをメ
タノール500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒
とし、水素気流中で還元したのち、触媒をろ
去、溶媒を留去する。残留物をDMF100mlに溶
解し、さらにＺ−Pro−OH4.7ｇ、HOBt3.0ｇ
を加え、０℃に冷却し、DCC4.3ｇを加え０℃
で４時間、室温で10時間かきまぜる。析出物を
ろ去し、溶媒を留去したのち、残留物を酢酸エ
チル400mlに溶解し、0.2N−塩酸、４％−炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。溶媒を留去し、残留物にエー
テルを加えて加温し、上清をのぞいたのち、さ
らにエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量12.6ｇ（91.5％）、融点83−87℃（分
解）、〔α〕23 D−121.0゜（ｃ＝0.5、メタノール）、
Rf10.31、Rf20.84。 元素分析C39H60O9N6計算値：C61.88；
H7.99；N11.10.分析値：C62.04；H8.21；
N10.70。 (e) Ｚ−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−
OButの製造：Ｚ−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln
−OBut12.5ｇをメタノール500mlに溶解し、パ
ラジウム黒を触媒として、水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留
物をDMF100mlに溶解する。この溶液に、Ｚ−
Thr−OH4.2ｇ、HOBt2.7ｇを加えて溶解し、
０℃に冷却する。次にDCC3.7ｇを加え０℃で
４時間、室温で８時間かきまぜたのち、析出物
をろ去する。溶媒を留去し残留物を酢酸エチル
400mlに抽出し、0.2N−塩酸、４％炭酸水素ナ
トリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒を留去し、残留物にエーテルを
加え粉末としてろ取する。 収量11.8ｇ（86.8％）、融点101−105℃、
〔α〕23 D−124.3゜（ｃ＝0.58、メタノール）、
Rf10.20、Rf20.68。 元素分析C43H67O11N7計算値：C60.19；
H7.87；N11.43.分析値：C59.54；H7.91；
N11.19。 (f) Ｚ−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Thr−Pro−Ile
−Leu−Pro−Gln−OBut11.8ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を
留去し、残留物をDMF100mlに溶解する。これ
にＺ−Asp（OBut）−OH4.5ｇ、HOBt2.3ｇを
加え溶解し、０℃に冷却する。DCC3.2ｇを加
え０℃で４時間、室温で10時間かきまぜ、析出
物をろ去し、溶媒を留去する。残留物に酢酸エ
チル150mlを加え析出するゲル状物をろ取し、
酢酸エチルとエーテルから結晶化し、エーテル
でろ取する。 収量12.15ｇ（85.9％）、融点94−96℃（分
解）、〔α〕21 D−109.1゜（ｃ＝0.59、メタノール）、
Rf10.13、Rf20.47。 元素分析C51H80O14N8・H2O計算値：
C58.49；H7.89；N10.70.分析値：C58.60；
H8.07；N10.71。 (g) Ｚ−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Asp
（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−
OBut12ｇをメタノール500mlに溶解し、パラジ
ウム黒を触媒として、水素気流中で還元する。
触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留物を
Ｚ−Ser−OH2.93ｇ、HOBt2.0ｇとともに
DMF100mlに溶解し、０℃に冷却する。これに
DCC2.8ｇを加え０℃で４時間、室温で12時間
かきまぜ、析出物をろ去し、溶媒を留去する。
残留物を酢酸エチル500mlに溶解し、0.2N−塩
酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、
無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち、溶媒を留去
する。残留物に酢酸エチルとエーテルを加え粉
末としてろ取する。 収量11.7ｇ（90.0％）、融点111−115℃、
〔α〕21 D−112.3゜（ｃ＝0.63、メタノール）、
Rf10.06、Rf20.31。 元素分析C54H85O16N9H2O計算値：C57.17；
H7.73；N11.11.分析値：C57.34；H7.77；
N11.14。 (h) Ｚ−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−
Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Ser
−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−
Gln−OBut11.6ｇをメタノール500mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒として水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留
物を、Ｚ−Pro−ONB4.3ｇとともにDMF100
mlに溶解し、室温で16時間かきまぜる。溶媒を
留去し残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、
0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥したの
ち、溶媒を留去する。残留物にエーテルを加え
粉末としてろ取する。 収量11.1ｇ（88.1％）、融点117−120℃、
〔α〕21 D−119.2゜（ｃ＝0.61、メタノール）、
Rf20.45。 元素分析C59H92O17N10H2O計算値：
C57.54；H7.69；N11.38.分析値：C57.44；
H7.69；N11.38。 (i) Ｚ−Gly−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−
Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ
−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OBut10ｇをメタノール500ml
に溶解し、パラジウム黒を触媒として、水素気
流中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を留去
する。残留物をＺ−Gly−ONB4ｇとともに
DMF80mlに溶解し室温で12時間かきまぜる。
溶媒を留去し残留物を酢酸エチル500mlに溶解
し、0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム
水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶
媒を留去する。残留物をメタノール180mlに溶
解し、抱水ヒドラジン4.5mlを加え、室温で16
時間かきまぜたのち溶媒を留去する。残留物を
酢酸エチル500mlに溶解し、水洗ののち無水硫
酸ナトリウムで乾燥し溶媒を留去する。残留物
にエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量7.35ｇ（70.2％）、融点131−135℃（分
解）、〔α〕22 D−119.4゜（ｃ＝0.35、メタノール）、
Rf20.27。 元素分析C61H95O18N11H2O計算値：
C56.86；H7.59；N11.96.分析値：C56.65；
H7.68；N12.02。 (j) Ｚ−Leu−Pro−OButの製造：Ｚ−Pro−
OBut20.2ｇをメタノール800mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元する。
触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を酢酸エ
チル300mlに溶解し、Ｚ−Leu−OSu26.3ｇを加
え16時間かきまぜる。反応液を0.2N−塩酸、
４％−炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水
硫酸ナトリウムで乾燥し留去して、油状物を得
る。 収量27.6ｇ（100％）、Rf10.71、Rf20.78。 (k) Ｚ−Arg−（NO2）−Leu−Pro−OButの製
造：Ｚ−Leu−Pro−OBut13.8ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として、
水素気流中で還元し、触媒をろ去し、溶媒を留
去する。残留物とＺ−Arg−（NO2）−OH11.7
ｇ、HOBt6.7ｇをDMF200mlに溶解し、０℃に
冷却する。これにDCC7.5ｇを加え０℃で４時
間、室温で12時間かきまぜ析出物をろ去し、溶
媒を留去する。残留物を酢酸エチル600mlに抽
出し、0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウ
ム水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、溶媒を留去する。残留物を放置し、析出す
る結晶をエーテルでろ取したのち、メタノール
より再結晶する。 収量12.4ｇ（60.6％）、融点170−172℃、
〔α〕26 D−67.8゜（ｃ＝0.48、メタノール）、
Rf30.77。 元素分析C29H45O8N7計算値：C56.20；
H7.32；N15.82、分析値：C55.79；H7.16；
N15.85。 (l) Ｚ−Ser−Arg−Leu−Pro−OButの製造：
Ｚ−Arg（NO2）−Leu−Pro−OBut12.3ｇをメ
タノール500mlに溶解し、6N−塩酸6.6mlを加
えたのち、パラジウム黒を触媒として水素気流
中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を留去す
る。残留物をトリエチルアミン2.8mlとともに
DMF100mlに溶解し、析出するトリエチルアミ
ン・塩酸塩をろ去する。ろ液にＺ−Ser−
OH4.8ｇとHONB5.4ｇを加え０℃に冷却し、
DCC4.95ｇを加え０℃で４時間、室温で16時間
かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を留去した
のち、残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、食
塩飽和の水でよく洗い、無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、溶媒を留去し、アメ状の残留物を得
る。Rf30.53。 (m) Ｚ−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OButの
製造：Ｚ−Ser−Arg−Leu−Pro−OBut10.5ｇ
を6N−塩酸３mlとともにメタノール500mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をDMF100mlに溶解し、トリエチルアミン
2.52mlを加えて中和する。析出するトリエチル
アミン塩酸塩をろ去したのちＺ−Pro−
ONB8.4ｇを加え室温で16時間かきまぜ、溶媒
を留去し、残留物に酢酸エチル300mlと食塩飽
和の水300mlを加えてよくふりまぜる。静置の
のち水層に沈澱してくる油状物を集め、これに
エーテルを加え粉末とする。次にこの粉末をメ
タノールに溶解し、不溶物をろ去したのち溶媒
を留去し、再びエーテルを加えて粉末としてろ
取する。 収量8.45ｇ（70.8％）、融点115−120℃（分
解）、〔α〕22 D−84.7゜（ｃ＝0.53、メタノール）、
Rf30.41。 元素分析C37H58O9N8・HCl・H2O計算値：
C54.63；H7.56；N13.78；Cl4.36。分析値：
C54.50；H7.70；N14.11；Cl4.21。 (n) Ｚ−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−
OButの製造：Ｚ−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro
−OBut3.8ｇをメタノール200mlに溶解し、パ
ラジウム黒を触媒として水素気流中で還元し、
触媒をろ去したのち溶媒を留去し、残留物を
DMF30mlに溶解する。この溶液に、Ｚ−Ser−
OH1.37ｇ、HONB1.24ｇとDCC1.30ｇとから
合成したＺ−Ser−ONBのDMF溶液（10ml）
を加え室温で16時間かきまぜる。析出物をろ去
したのち溶媒を留去し、残留物に酢酸エチル１
mlとアセトニトリル１mlを加えて溶解し、次に
エーテルを加えて沈澱とし、さらに粉末にして
ろ取する。この粉末をRf3の溶媒と酢酸エチル
を１：１で混合した溶媒２mlに溶解し、同じ溶
媒で充填したシリカゲルカラム（5.6×9.0cm）
に付し、同じ溶媒で展開する。365ml〜746mlの
区分を集め溶媒を留去し、残留物にエーテルを
加え粉末としてろ取する。 収量2.12ｇ（50.2％）、融点130−135℃（分
解）、〔α〕22 D−83.5゜（ｃ＝0.38、メタノール）、
Rf30.34。 元素分析C40H63O11N9・HCl・H2O計算値：
C53.35；H7.39；N14.00；Cl3.94。分析値：
C53.67；H7.45；N13.72；Cl3.52。 (o) Ｚ−Ser−Leu−Pro−OButの製造：Ｚ−
Leu−Pro−OBut13.8ｇをメタノール700mlに
溶解し、パラジウム黒を触媒とし、水素気流中
で還元する。触媒をろ去し溶媒を留去し、残留
物をＺ−Ser−OH7.9ｇ、HONB8.9ｇとともに
アセトニトリル200mlに溶解し、０℃に冷却す
る。次にDCC7.5ｇを加え０℃で４時間、室温
で16時間かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を
留去し、残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、
0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を留去して油状物17ｇを得る。これをクロロホ
ルムとメタノールの混合溶媒（200：３）15ml
に溶解し、同じ溶媒で充填したシリカゲルカラ
ム（5.4×20cm）に付し、同じ溶媒で展開する。
1300〜2100mlの部分を集め溶媒を留去し油状物
を得る。 収量12.2ｇ（73.1％）、Rf10.38、Rf20.69。 (p) Ｚ−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg
−Leu−Pro−OButの製造：Ｚ−Ser−Pro−
Ser−Arg−Leu−Pro−OBut1.0ｇをＮ−塩酸
1.2mlとともにメタノール60mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒として水素気流中で還元し、触
媒をろ去したのち溶媒を留去し、残留物を
DMF20mlに溶解する。Ｚ−Ser−Leu−Pro−
OBut700mgをトリフルオロ酢酸７mlに溶解し、
50分ののち溶媒を留去し、残留物にエーテルと
石油エーテル（１：２）の混合溶媒を加えて洗
い、洗液を除き、残つた油状物を真空ポンプ下
の減圧で粉末となるまでに乾燥したのち、直に
先のDMF溶液に、HONB407mgとともに加え
て溶解し、０℃に冷却する。DCC466mgをこれ
に加え、０℃で６時間、室温で16時間かきまぜ
析出物をろ去し、溶媒を留去する。残留物を
Rf3と酢酸エチル（４：１）の混合溶媒５mlに
溶解し、同じ溶媒で充填したシリカゲルカラム
（3.6×9.0cm）に付し、同じ溶媒で溶出し、333
〜572mlの区分を集め、溶媒を留去したのち残
留物にエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量450mg（33.8％）、融点110−120℃（分
解）、〔α〕24 D−106.6゜（ｃ＝0.31、メタノール）、
Rf50.71。 (q) Ｚ−Pro−Pro−OButの製造：Ｚ−Pro−
OBut10.1ｇをメタノール500mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元し、触
媒をろ去し、溶媒を留去し残留物をＺ−Pro−
OH8.47ｇ、HOBt5.4ｇとともに酢酸エチル300
mlに溶解し、０℃に冷却する。次にDCC7.5ｇ
を加え０℃で４時間、室温で12時間かきまぜ析
出物をろ去する。ろ液を0.2N−塩酸、４％炭
酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、溶媒を留去する。残留物の結
晶をエーテルでろ取する。 収量9.85ｇ（74.1％）、融点94−96℃、〔α〕22 D
−116.9゜（ｃ＝0.54、メタノール）、Rf10.58、
Rf20.72。 元素分析C22H30O5N2 計算値：C65.65；
H7.51；N6.96。分析値：C65.42；H7.38；
N7.20 (r) Ｚ−Pro−Pro−Pro−OButの製造：Ｚ−
Pro−Pro−OBut９ｇをメタノール300mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として、水素気流中
で還元し、触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をＺ−Pro−OH5.6ｇ、HOBt3.63ｇととも
に、酢酸エチル250mlに溶解し、０℃に冷却す
る。次にDCC5.1ｇを加え０℃で６時間、室温
で16時間かきまぜ、析出物をろ去する。ろ液を
0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を留去する。析出する結晶をエーテルでろ取す
る。 収量9.6ｇ（85.9％）、融点155−157℃、〔α〕
22 D−176.0゜（ｃ＝0.55、メタノール）、Rf10.40、
Rf20.69。 元素分析C27H37O6N3・ 1/2H2O計算値：
C63.76；H7.53；N8.26。分析値：C63.77；
H7.53；N8.62。 (s) Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−OButの製造：
Ｚ−Pro−Pro−Pro−OBut５ｇをメタノール
200mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元し、触媒をろ去ののち溶媒を留
去し、残留物をＺ−Ala−OH2.23ｇ、
HOBt1.62ｇとともにDMF20mlに溶解し、０℃
に冷却する。この溶液にDCC2.27ｇを加え、０
℃で４時間、室温で12時間かきまぜ、析出物を
ろ去する。溶媒を留去し、残留物を３mlの２％
メタノール／クロロホルムに溶解し、同じ溶媒
で充填したシリカゲルカラム（3.7×10.5cm）
に付し、同じ溶媒で展開する。170〜380mlの区
分を集め溶媒を留去し、油状物4.05ｇ（71.0
％）を得る。Rf10.33、Rf20.67。 (t) Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OButの
製造：Ｚ−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−
Arg−Leu−Pro−OBut400mgをＮ−塩酸0.8ml
とともにメタノール80mlに溶解し、パラジウム
黒を触媒とし、水素気流中で還元する。触媒を
ろ去し、溶媒を留去し、残留物をDMF10mlに
溶解し、トリエチルアミン0.11mlで中和し、析
出するトリエチルアミン・塩酸塩をろ去する。
Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−OBut233mgをトリ
フルオロ酢酸２mlに溶解する。50分後に溶媒を
留去し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ
取し、乾燥する。これをHONB122mgとともに
先のDMF溶液に加えて溶解し、０℃に冷却す
る。この溶液にDCC140mgを加え、０℃で６時
間、室温で12時間かきまぜ、析出物をろ去し溶
媒を留去する。残留物にエーテルを加え粉末と
してろ取し、アセトニトリルと酢酸エチルとか
ら再沈澱精製する。 収量430mg（82.1％）、融点152−155℃（分
解）、〔α〕24 D−153.6゜（ｃ＝0.45、メタノール）、
Rf30.10、Rf50.54。 元素分析C72H112O19N16・HCl・H2O計算
値：C55.42；H7.43；N14.37；Cl2.27。分析
値：C56.21；H7.54；N14.04；Cl2.30。 (u) Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu
−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Gly−Pro−
Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro
−Gln−OBut363mgをメタノール30mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒として水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を
DMF10mlに溶解する。Ｚ−Ala−Pro−Pro−
Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg
−Leu−Pro−OBut430mgをトリフルオロ酢酸
３mlに溶解し、45分間室温に置く。溶媒を留去
し残留物にエーテルを加え粉末としてろ取し、
乾燥後、HONB130mgとともに、先のDMF溶
液に加えて溶解し、０℃に冷却する。次に
DCC118mgを加え、０℃で６時間、室温で40時
間かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を留去
し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ取
し、さらにDMFとエーテルから再沈澱精製す
る。 収量700mg（95.5％）、融点120−125℃（分
解）、〔α〕23 D−127.7゜（ｃ＝0.12、メタノール）、
Rf50.62、Rf60.44。 元素分析C121H191O34N27・HCl・2H2O計算
値：C53.12；H7.80；N14.94；Cl1.40。分析
値：C53.39；H7.62；N15.10；Cl1.54。 (v) Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro
−Gln−OH〔ペプチド（）…hCG−β（123−
145）Ｃ末端ペプチド部分の製造：Ｚ−Ala−
Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro
−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro−Ser−
Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln
−OBut580mgをＮ−塩酸0.45mlとともにメタノ
ール50mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として
水素気流中で還元する。触媒をろ去し、溶媒を
留去し、残留物に水１mlを加え、再び留去した
のち残留物を90％−トリフルオロ酢酸水10mlに
溶解し、室温に60分置く。溶媒を留去し、残留
物に水10mlを加えて溶解し、アンバーライト
IRA−410（酢酸型）の樹脂カラム（１×５cm）
に付し、溶出液を集める。樹脂を水50mlでよく
洗い、洗液を先の溶出液と合して凍結乾燥し、
白色粉末390mgを得る。次にこれをＮ−酢酸で
充填したセフアデツクスLH−20のカラム（２
×83cm）に付し同じ溶媒で展開する。70〜100
mlの区分を集め凍結乾燥し、さらに同じカラム
で再クロマトグラフイーに付し、目的物を含む
区分を集めて凍結乾燥し、白色粉末を得る。 収量185mg（35.2％）、〔α〕23 D−194.5゜（ｃ＝
0.13、0.1N−酢酸）、Rf50.06、Rf4（セルロー
ス）0.78。 アミノ酸分析値（理論値）Arg1.00(1)、
Asp1.00(1)、Thr1.00(1)、Ser3.74(4)、Glu1.03
(1)、Pro9.59(9)、Gly0.98(1)、Ala0.94(1)、
Ile0.95(1)、Leu2.97(3)、平均回収率79.3％。 参考例 ２ Ｈ−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro
−Gln−OH〔以下、ペプチド（）と称する。〕
〔hCG−β（130−145）Ｃ末端ペプチド部分〕の
製造 Ｚ−Gly−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro
−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut2.16ｇをメタノー
ル100mlに溶解し、パラジウム黒を触媒とし、水
素気流中で還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去
し、残留物をDMF25mlに溶解する。この溶液に、
Ｚ−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OBut1.5
ｇをトリフルオロ酢酸処理して得たＺ−Ser−
Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OHとHONB1.22
ｇを加え０℃に冷却する。次にDCC701mgを加
え、０℃で６時間、室温で40時間かきまぜ、析出
物をろ去し、溶媒を留去する。残留物に酢酸エチ
ルとエーテルを加え沈澱としてろ取する。これを
Rf3の溶媒５mlに溶解し、同じ溶媒で充填したシ
リカゲルカラム（5.7×９cm）に付し、同じ溶媒
で展開する。534−914mlの区分を集め溶媒を留去
し、残留物にエーテルを加えてろ取する。 収量1.1ｇ（33.9％）、Rf30.20。 次にこの保護ペプチドの一部70mgをメタノール
10mlに溶解しパラジウム黒を触媒として、水素気
流中で還元し、触媒をろ去、溶媒を留去する。残
留物を90％−トリフルオロ酢酸１mlに溶解し、60
分後に溶媒を留去し、残留物に水３mlを加えて溶
解する。この水溶液をアンバーライトIRA−410
（酢酸型）のカラム（１×１cm）に通し凍結乾燥
する。次にこれをＮ−酢酸0.5mlに溶解し、Ｎ−
酢酸で充填したセフアデツクスLH−20のカラム
に付し、同じ溶媒で展開する。目的物を含有する
区分を集め凍結乾燥し、白色粉末を得る。 収量22mg（36.1％）、〔α〕23 D−159.3゜（ｃ＝0.15
、
0.1N−酢酸）、Rf50.15。 アミノ酸分析（理論値）Arg−1.01(1)、
Asp1.01(1)、Thr0.93(1)、Ser2.57(3)、Glu0.96(1)、
Pro4.85(5)、Gly1.00(1)、Ile0.96(1)、Leu2.04(2)、
平均回収率81.1％。 参考例 ３ Ｈ−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH〔以下、ペプチド（）
と称する。〕〔hCG−β（136−145）Ｃ末端ペプ
チド部分〕の製造 Ｚ−Gly−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro
−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut150mgを90％トリ
フロオロ酢酸2.5mlに溶解し、室温に60分置く。
次に溶媒を留去し、残留物を50％−酢酸30mlに溶
解しパラジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元
する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を水
10mlに溶解し、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×３cm）に付し、次に樹脂を水
でよく洗う。溶出液と洗液を合して凍結乾燥す
る。これをＮ−酢酸で充填したセフアデツクス
LH−20のカラム（２×83cm）に付し、同じ溶媒
で溶出する。90〜105mlの区分を集めて凍結乾燥
し、白色粉末を得る。 収量70mg（57.9％）、〔α〕19 D−150.5゜（ｃ＝0.2
、
0.1N−酢酸）、Rf50.29、Rf4（セルロース）0.55。 アミノ酸分析値：Asp1.02(1)、Thr0.98(1)、
Ser0.92(1)、Glu1.04(1)、Pro3.17(3)、Gly0.99(1)、
Ile0.99(1)、Leu1.00(1)。平均回収率82.6％。 参考例 ４ 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／mg
のhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これにフ
ロインドの完全アジユバント（Freund′s
complete adjuvant、“免疫の生化学”、橘ら著、
共立出版株式会社（1967年））１mlを加えてよく
混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射する。以上の操作
を３週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血し
パイロツトアツセイを実施する。その結果、hCG
−βのＣ末端ペプチド（）、（）および（）
にも親和性をもつ抗hCG抗体を得る。 参考例 ５ 特異抗hCG抗体の製造 参考例１で得られたペプチド（）５mgを
0.5M NaClを含む0.1M NaHCO38mlに溶解し、
予めＮ／1000HClで洗浄したブロムシアン活性化
セフアロース4B（フアルマシア・フアイン・ケミ
カルズ社製）１ｇに加え、５℃で一夜撹拌した。
反応終了後同じ0.5M NaClを含む0.1MNaHCO3
で十分に洗浄し、次いでHClでPH８に調整した
0.5Mエタノールアミン10mlを添加して室温で１
時間反応させた後、(1)1M NaClを含む0.1M酢酸
緩衝液（PH4.0）、(2)1M NaClを含む0.1Mホウ酸
緩衝液（PH8.0）および(3)0.15M NaClを含む
0.02Mホウ酸緩衝液（PH8.0）で順次洗浄しカラ
ムに充填した。 参考例４で得られた抗hCG血清８mlを1.5ｇの
無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈澱させ、得ら
れたγ−グロブリン画分を上記のペプチド（）
結合セフアロース4Bカラム（0.9×４cm）に付し
た。 0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、hLH、hFSHおよび
hTSHと交差反応する抗hCG抗体を除去した。次
いで0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.3）で溶
出することによつてhCG−βC末端ペプチドと強
い親和性をもつ特異抗hCG抗体を得た（蛋白量
1.8mg）。 以下、本抗体の物性について述べる。 本抗体は最終希釈濃度80nｇ／mlで、約2μU
の酵素活性を有するhCG−酵素標識体の約95％
を結合する能力を有する。 本抗体の抗原結合活性の至適PHは６−９であ
る。 本抗体は冷蔵保存で１年以上安定である。 分子量は約15万で約３％の糖を含む。 PH２−12の水性溶媒に易溶である。 電気泳動においては、陰極側に移動するγ−
グロブリン分画に属する。 紫外吸収スペクトルは第１図参照。 アミノ酸分析値は第１表を参照。 他の物性は免疫グロブリンＧの物性（“医科
免疫学”、第61頁、菊地ら著、南江堂（1976
年））と同じである。
と略称することもある。）の免疫化学的測定法に
関する。hCGは妊娠と同時に形成される絨毛細胞
から産生される蛋白ホルモンの一種であり、プロ
ゲステロンの分泌を促進する。hCGの検出は妊娠
の初期診断に汎用されている。さらに胞状奇胎、
破壊胞状奇胎、絨毛癌など絨毛性疾患において、
尿中、血中など体液中のhCG測定は、これらの疾
患の早期発見、治療効果の判定、予後管理などの
面から極めて重要であることが分つてきた。しか
しこれらの診断には約100IU／以下の微量hCG
の測定が必要であり、この際問題となるのはhCG
と類似の構造を有する蛋白ホルモン、すなわち黄
体形成ホルモン（以下hLHと略称することもあ
る。）、卵胞刺激ホルモン（以下hFSHと略称する
こともある。）および甲状腺刺激ホルモン（以下
hTSHと略称することもある。）との免疫学的な
交差反応である。特にhLHはhCGと類似性が高
く、生理的な尿中のhLH量は150IU／に達する
こともあるので、微量の体液中のhCGを測定する
ためにはhCGとhLHとを免疫学的に区別するこ
とが必要である。 一方、これらの蛋白ホルモンの化学的解析か
ら、その交差反応性が共通構造の多いそれぞれの
α−サブユニツト部分に起因することが分つた。
そこで比較的類似性の少ないhCGのβ−サブユニ
ツト（以下hCG−βと略称することもある。）を
分離精製し、抗hCG−β抗体を作製してhCGを特
異的に検出する試みがなされている。しかしhCG
−βの分離精製は繁雑であり、またhCGやhCGの
α−サブユニツト（以下hCG−αと略称すること
もある。）の混在を避けることは極めて難しく、
これらの混在と、hCGとhLHとのβ−サブユニ
ツト間になお残存する共通のアミノ酸配列のた
め、抗hCG−β抗体の使用ではhLHとの交差反
応性を完全には除去できない。しかしながら、
hCG−βのＣ末端にある約30個のアミノ酸よりな
るペプチドはhLHには存在しないアミノ酸配列
を示しており、この部分においてはhCGとhLH
とを完全に識別することが可能であることが分つ
た。 かかる構造解析の結果から、Matsuuraらは
hCG−βのＣ末端ペプチドを合成し、ウサギに免
疫してhCG特異抗血清を得たのち、それを用いて
競合法によるラジオイムアツセイ（以下RIAと略
称する）を実施し〔“Endocrinology”、第104巻
（1979年）、第396頁〕、特異性については満足すべ
き結果を得ているが感度については十分ではなか
つた。 さらに特願昭55−42484、同55−80467に記載さ
れているようにhCGを動物に免疫して得られる抗
hCG抗体を、hCG−βの合成Ｃ末端ペプチドを不
溶化して得た固相を用いて精製し、競合法による
酵素免疫測定法（以下EIAと略称することもあ
る。）を実施し、特異性ならびに感度について満
足すべき結果を得ている。 しかしながら、競合法によるRIAやEIAは被検
液中の他の成分の影響を受けやすく、測定に長時
間を要するという欠点を有する。そこで、更に簡
易な方法を求めて研究を重ねたところ、hCGを非
競合法（以下サンドイツチ法と呼ぶ）により測定
することにより、特異的高感度に測定することが
できることを見い出し、これに基づいてさらに研
究した結果本発明を完成した。 本発明は、担体上に保持された抗体、抗原およ
び標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的測
定方法において、担体上に保持される抗体と標識
剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重
複しない２種の抗体であり、該抗体のうち一方が 一般式 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH ［式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１ないし
14個の部分ペプチド鎖を表わす。］で表わされる
ペプチドとキヤリア用タンパクとをグルタルアル
デヒドの存在下に縮合せしめた縮合生成物を人以
外の温血動物に接種して形成せしめ、これを採取
することにより得られた人絨毛性ゴナドトロピン
に特異的に反応する抗体であることを特徴とする
人絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定方法。 本明細書において、しばしば表現されている競
合法およびサンドイツチ法について、その測定原
理を説明する。 (1) 競合法；未知量の抗原を含む被検液と標識剤
で標識した抗原の一定量とを対応する抗体の一
定量に対して競合反応させ、抗体と結合した標
識剤もしくは抗体と結合しながつた標識剤の活
性を測定する。 (2) サンドイツチ法；未知量の抗原を含む被検液
に担体上に保持された過剰量の抗体を加えて反
応させ（第１反応）、次に標識剤で標識した過
剰量の抗体の一定量を加えて反応させる（第２
反応）。担体上に保持された標識剤もしくは担
体上に保持されなかつた標識剤の活性を測定す
る。第１反応、第２反応は同時に行なつてもよ
いし時間をずらして行なつてもよい。 一般にサンドイツチ法を用いる免疫化学的測定
方法において、第１反応および第２反応で用いら
れている抗体は、同一の抗血清から調製されてい
る。しかしながら、hCGを特異的に測定するサン
ドイツチ法による本発明の免疫化学的測定方法に
おいて、hLHなどの類似した化学構造を有する
蛋白ホルモンとの交差反応による測定誤差を無く
するためには、第一反応で用いる抗体と第二反応
で用いる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しな
い２種の抗体であり、該抗体のうち一方はhCGに
特異的に反応する抗体が用いられる。 hCGに特異的に反応する抗体としては、たとえ
ば “Endocrinology”、第104巻（1979年）、第
396頁に記載されているような抗体が挙げられ
る。即ち、hCG−β鎖のＣ末端側のhCGに特異
的なペプチドと牛アルブミンや牛チログロブリ
ンなどキヤリアー用タンパクとを１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドなど水溶性カルボジイミドを用いて得た
縮合物をフロインドの完全アジユバントもしく
は不完全アジユバントと共に人以外の温血動物
たとえばウサギに頻回接種して抗体を形成せし
め、これを採取することによりhCGに特異的に
反応する抗血清を得ることができる。 特願昭55−42484、特願昭55−80467に記載さ
れたhCGに特異的に反応する抗hCG抗体、すな
わち担体上に不溶化した一般式〔〕 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH〔〕 〔式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされるペプ
チドに抗hCG抗体を含有する体液を接触させ、つ
いで特異的に吸収された抗hCG抗体を溶出するこ
とにより得られた抗hCG抗体が挙げられる。 上記のhCGに特異的に反応する抗体を製造する
際に用いられるペプチドにおけるＲで示される のペプチドの14位のGlyを含む１ないし14個の部
分ペプチド鎖としては、たとえばGly、Pro−
Gly、Leu−Pro−Gly、Arg−Leu−Pro−Gly、
Ser−Arg−Leu−Pro−Gly、Pro−Ser−Arg−
Leu−Pro−Gly、Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly、Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly、Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−
Leu−Pro−Gly、Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−
Ser−Arg−Leu−Pro−Gly、Pro−Ser−Leu−
Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly、
Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−
Arg−Leu−Pro−Gly、Pro−Pro−Pro−Ser−
Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−
Gly、Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−
Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Glyが挙げら
れる。 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Ala：アラニン Pro：プロリン Ser：セリン Leu：ロイシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Tyr：チロシン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ile：イソロイシン Gln：グルタミン Glu：グルタミン酸 Ｚ：ベンジルオキシカルボニル OBut：ｔ−ブチルエステル HONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミド ONB：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，
３−ジカルボキシイミド・エステル DMF：Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド DCC：Ｎ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド DMSO：ジメチルスルホキシド THF：テトラヒドロフラン HOBt：１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール OSu：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル ECDI：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド CMCT：１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）−カルボジイミド・メト−パラ−
トルエンスルホネート GLA：グルタルアルデヒド ｍ−MBHS：メタ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ハイドロキシスクシンイミドエステル ｐ−MCHS：パラ−マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボキシル−Ｎ−ハイドロキシ
スクシンイミドエステル 本発明で用いられる種々のペプチドは、ペプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなペプチド
合成の手段としては、たとえば“The
Peptides”、第１巻（1966）、Schro¨der and
Lubke著、Academic Press、New York、U.S.
A.あるいは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株
式会社（1975年）に記載された方法、たとえばア
ジド法、クロライド法、酸無水物法、混合無水物
法、DCC法、活性エステル法、ウツドワード試
薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸
化還元法、DCC／アデイテイブ（例、HONB、
HOBt、HOSu）法などがあげられる。 上記した抗体を製造する方法において用いられ
る担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガ
ロースゲル〔例、セフアロース4B、セフアロー
ス6B（フアルマシア・フアインケミカル社（スエ
ーデン）製〕、デキストランゲル〔例、セフアデ
ツクスG75、セフアデツクスG100、セフアデツ
クスG200（フアルマシア・フアインケミカル社
製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオゲル
P30、バイオゲルP60、バイオゲルP100（バイオ
ラツド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セルロー
ス粒子〔例、アビセル（旭化成製）、イオン交換
セルロース（例、ジエチルアミノエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着
剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロツド、
アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラス
ロツド）、シリコン片、スチレン系樹脂（例、ポ
リスチレン球、ポリスチレン粒子）〕、イオン交換
樹脂（例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバ
ーライトIRC−50（ローム・ハース社（米国）
製）、ゼオカーブ226（パームチツト社（西ドイツ）
製）〕、弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバー
ライトIR−4B、ダウエツクス３（ダウケミカル社
（米国）製）〕｝などが挙げられる。 ペプチドを担体上に不溶化するには公知の常套
手段を応用しうるが、そのような不溶化ペプチド
合成の手段は、たとえば“代謝”、第８巻（1971
年）、第696頁に記載されている方法に従えばよ
い。たとえばブロムシアン法、GLA法、DCC法
などが挙げられ、好ましくはブロムシアンで活性
化された担体にペプチドを結合させる方法が用い
られる。次に、hCGを動物に免疫して得られた抗
hCG抗体を含む体液、特に血清を、担体上に不溶
化した一般式〔〕で表わされるペプチドに接触
させる。この方法は、硫酸ナトリウムまたは硫酸
アンモニウムなどで塩析沈澱させ、直接もしくは
更にDEAE−セルロースなどのカラムクロマトグ
ラフイーでIgGフラクシヨンを分取したのち、上
記の不溶化ペプチドに接触させ特異抗hCG抗体の
みを固相に吸収させる。これにより、hLH、
hFSHおよびhTSHと交差反応する他の抗hCG抗
体を除去することができる。ついで、固相に吸収
された特異抗hCG抗体を溶出する。この溶出を行
なうには低PHもしくは高PHの緩衝液（例、PH2.3
の0.17Mグリシン−塩酸緩衝液、PH11のアンモニ
ア水）や高濃度の塩を含有する緩衝液（例、6M
グアニジン塩酸溶液、7M尿素溶液）が用いられ、
特異抗体画分を溶出分取する。上記の操作はバツ
チ法で行つても良いが、好ましくはカラムを使用
する方法で実施される。 このようにして得られた抗体の物性は、(1)オク
タロニー法〔“医化学実験法講座”第４巻159頁
（1972年）（中山書店）〕でhCGおよびhCG−βと
の間に沈降線を与え、(2)電気泳動易動度はγ−グ
ロブリン画分に属し、(3)hCGを感作させた赤血球
と混合して赤血球を凝集させ、(4)分子量は約14〜
17万で約２〜７％の糖を含み、(5)PH２〜12の水性
溶媒に易溶であり、(6)冷蔵保存で１カ年以上安定
であり、(7)第１図に示した紫外吸収スペクトルを
有し、(8)アミノ酸組成は、グリシン100モル当り
の各アミノ酸のモル数で示すと、リジン85〜97、
ヒスチジン35〜43、アルギニン38〜45、アスパラ
ギン酸110〜132、スレオニン98〜107、セリン118
〜135、グルタミン酸138〜145、プロリン92〜
134、グリシン100、アラニン73〜79、バリン129
〜138、メチオニン２〜10、イソロイシン28〜37、
ロイシン100〜112、チロシン38〜48、フエニルア
ラニン55〜68であり、(9)それぞれ２本のＨ鎖とＬ
鎖とがＳ−Ｓ結合して分子を形成する。 hCGに特異的に反応する抗体としては、さら
に、(3)一般式〔〕 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH〔〕 〔式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１ないし
14個の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされる
ペプチドとキヤリア用タンパクとをグルタルアル
デヒド（「GLA」と略称することもある。）の存
在下に縮合せしめた縮合生成物を人以外の温血動
物に接種して抗体を形成せしめ、これを採取する
ことにより得られた抗体が挙げられる。 ここにおいてキヤリア用タンパクとは、単独で
は抗体産生を誘導することができないペプタイド
などハプテン（低分子量物質）に対する抗体を産
生させるためにハプテンと結合させて用いられる
ものをいい、その例としてはたとえば牛血清アル
ブミン、牛ガンマグロブリン、牛チログロブリ
ン、破傷風トキソイド、ヘモシアニンおよびポリ
アミノ酸などが挙げられる。 一般式〔〕で表わされるペプチドとキヤリア
用タンパクとをGLAの存在下に結合させるには、
公知の方法〔例、“Hormone and Metabolic
Research”、第８巻（1976年）、第241頁〕によつ
て実施し得る。一般式〔〕で表わされるペプチ
ドとキヤリア用タンパクの使用量比は１対１ない
し２対１が適当であり、反応PHは7.3前後が良好
な結果を与える場合が多い。また反応に要する時
間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３時間
が適当である。この様にして作成した縮合生成物
は常套手段で４℃前後で水に対して透析し、凍結
乾燥して保存することができる。 以上の様にして製造した縮合生成物は人以外の
温血動物に接種される。 上記hCGに特異的に反応する抗体の製造に用い
られる人以外の温血動物としては、たとえば哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラツト、マウ
ス、モルモツト、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、
ニワトリ、ハト、アヒル、ガチヨウ、ウズラ）な
どが挙げられる。 該縮合生成物を人以外の温血動物に接種する方
法としては、動物に接種する縮合生成物は抗体産
生するに有効な量でよく、たとえばウサギに１回
２mgを等容量（１ml）の生理食塩水およびフロイ
ンドの完全アジユバントで乳化して、背部ならび
に後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体
を産生させ得る場合が多い。 このようにして、温血動物中に形成された抗体
を採取する方法としては、たとえばウサギでは、
通常最終接種後７日から12日の間に耳静脈から採
血し、遠心分離して血清として得られる。 hCGの測定において用いられる担体上に保持さ
れた抗体における担体としては、前記した抗体の
製造の際に用いられる担体と同様のものが挙げら
れる。 担体に抗体を結合させるには、公知の常套手段
を応用し得るが、たとえば“代謝”、第８巻
（1971年）、第696頁に記載されているブロムシア
ン法、GLA法などが挙げられる。また、より簡
易な方法として抗体を物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。 本サンドイツチ法において測定対象となる抗原
を含む被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液
等の体液が挙げられ、とりわけ尿、血清が繁用さ
れる。 hCGの測定において用いられる標識剤を結合さ
せた抗体における標識剤としては、放射性同位元
素、酵素、螢光物質、発光物質などが挙げられ
る。放射性同位元素としてはたとえば 125I、
131I、 3H、 14Cなどが、上記酵素としては、安
定で比活性の大きなものが好ましく、その例とし
てはたとえば(1)カルボヒドラーゼ〔例、グリコシ
ダーゼ（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコ
シダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−フルクト
シダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシ
ダーゼ、α−マンノシダーゼ）、アミラーゼ（例、
α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼＡ）、セ
ルラーゼ、リゾチーム〕、(2)アミダーゼ（例、ウ
レアーゼ、アスパラギナーゼ）、(3)エステラーゼ
〔例、コリンエステラーゼ（例、アセチルコリン
エステラーゼ）、ホスフアターゼ（例、アルカリ
ホスフアターゼ）、スルフアターゼ、リパーゼ〕、
(4)ヌクレアーゼ（例、デオキシリボヌクレアー
ゼ、リボヌクレアーゼ）、(5)鉄・ポルフイリン酵
素（例、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チトク
ロームオキシダーゼ）、(6)銅酵素（例、チロシナ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ）、(7)脱水素
酵素（例、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水
素酵素、乳酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵
素）などが、螢光物質としては、フルオレスカミ
ン、フルオレツセンスイソチオシアネートなど
が、発光物質としてはルミノール、ルミノール誘
導体、ルシフエリン、ルシゲニンなどがそれぞれ
挙げられる。 上記hCGに特異的に反応する抗体と標識剤とを
結合させるには、公知の常套手段であるクロラミ
ンＴ法〔“Nature、第194巻（1962年）、第495
頁〕、過ヨウ素酸法〔“Journal of
Histochemistry and Cytochemistry”、第22巻
（1974年）、第1084頁〕、マレイミド法〔“Journal
of Biochemistry”、第79巻（1976年）、第233頁〕
などが用いられる。 hCGおよびhCG−βのサンドイツチ法による特
異的免疫化学的測定方法を実施するには、(1)未知
量のhCGおよびhCG−βを含有する被検試料に公
知の常套手段で物理的もしくは化学的に抗体を結
合させた固相を加えて反応させる（第１反応）。
固相を洗浄したのち、標識剤で標識した抗体の一
定量を加えて反応させる（第２反応）。次に通常、
固相をよく洗浄し、固相上に結合している標識剤
の活性を測定する。標識剤が放射性同位元素であ
る場合、ウエルカウンターもしくは液体シンチレ
ーシヨンカウンターで測定する。標識剤が酵素で
ある場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは
螢光法で酵素活性を測定する。標識剤が螢光物
質、発光物質であつても、それぞれ公知の方法に
従つて測定する。上述のアツセイ方法において、
第１反応と第２反応の間における洗浄を省略して
もよいし、さらに簡略化するために被検液、抗体
結合固相および標識剤で標識した抗体を同時に加
えて反応させてもよい。即ち本発明で用いられた
抗体は互いに抗原決定部位が異なつているため、
試薬の添加順序、添加時期、洗浄操作の有無など
によつて影響を受けないという極めて優れた特色
を有するものである。 かくして、本発明によれば、 (1) hLHなどhCGと類似のペプチドホルモンに
よる影響を完全に受けることなく微量のhCGお
よびhCG−βを測定できる。 (2) サンドイツチ法を用いているので競合法と比
べて測定濃度範囲が広い。 (3) 用いられた２種の抗体と抗原とを同時に反応
させることもできるので、操作方法が簡易であ
り、測定に要する時間が短かくてすむ。 (4) したがつて絨毛癌など絨毛性疾患の早期診断
や予後管理に極めて適用性の高いものである。 本発明のサンドイツチ法によるhCGの免疫化学
的測定法に用いられる定量用キツトとしては、主
として (1) 担体上に保持された抗体 (2) 標識化された抗体 (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝液であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。） (5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝液であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) 標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測
定に必要な試薬。その一例として、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼの場合は、酵素基質（好ましく
は４−メチルウンベリフエリルβ−Ｄ−ガラク
トシドまたはオルトニトロフエニル−β−Ｄ−
ガラクトシド）、酵素基質の溶解に用いる緩衝
液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応
停止に用いる緩衝液（好ましくは炭酸緩衝液ま
たはグリシン緩衝液）が挙げられる。標識剤に
発光性物質を用いる場合は、該発光性物質を測
定する材料。その一例としてルミノールでは酸
化剤（好ましくは過酸化水素）、触媒（好まし
くはミクロパーオキシダーゼまたは次亜塩素酸
塩）および酸化剤、触媒の溶解に用いる緩衝液
（好ましくは水酸化ナトリウム液または炭酸緩
衝液）が挙げられる。 また、上記(1)と(2)とは、あらかじめ混合してあ
るものでもよい。 上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。 標準hCGもしくは被検液約10〜200μに試薬
(4)を加えて希釈し、一定量の試薬(1)、次いで試薬
(2)を約10〜300μを加えたのち、約０〜40℃で
反応させる。約１〜24時間反応後、試薬(5)で洗浄
し担体上に結合している標識剤の活性を測定す
る。標識剤が放射性同位元素である場合、ウエル
カウンターもしくは液体シンチレーシヨンカウン
ターで測定する。標識剤が酵素である場合、基質
液約10〜1000μを加えて約20〜40℃で約0.5〜24
時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反応
液中の吸光度もしくは螢光強度を測定する。 標識剤が螢光物質、発光性物質であつても、そ
れぞれ公知の常套手段によつて測定し得る。 以下に、実施例、参考例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 以下の参考例において、薄層クロマトグラフイ
ーは、特に記載のない場合、メルク社製シリカゲ
ルプレート60F254を用い、下記の展開溶媒を用い
る。 Rf1：クロロホルム：メタノール＝95：５ Rf2：クロロホルム：メタノール：酢酸＝９：
１：0.5 Rf3：酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝60：
20：６：10 Rf4：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝
30：20：６：24 Rf5：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水＝
１：１：１：１ Rf6：ｎ−ブタノーノール：酢酸：水＝12：３：
５ 参考例 １ Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−
Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro
−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−
Gln−OH〔以下、ペプチド（）と称する。〕
〔hCG−β（123−145）Ｃ末端ペプチド部分〕の
製造 (a) Ｚ−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Gln−
OBut12.5ｇをメタノール500mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒として接触還元する。触媒をろ
去し、溶媒を留去したのち、残留物を酢酸エチ
ル300mlに溶解する。これにＺ−Pro−OH9.7
ｇとHONB8.4ｇ、DCC8.8ｇより合成したＺ−
Pro−ONBの酢酸エチル溶液200mlを加え５時
間かきまぜる。反応液を0.2N−塩酸、４％−
炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥する。酢酸エチルを留去し、残
留物に石油ベンジンと少量のエーテルを加え結
晶とし、さらに同じ溶媒系で再結晶する。 収量13.1ｇ（81.5％）、融点86−88℃、〔α〕26 D
−64.8゜（ｃ＝0.5、メタノール）、Rf10.42、
Rf20.73。 元素分析C22H31C6N3：計算値C60.95；
H7.21；N9.69.分析値C61.04；H7.20；N9.49。 (b) Ｚ−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−
Pro−Gln−OBut13ｇをメタノール500mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒とし、水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物を酢酸エチル300mlに溶解し、Ｚ−Leu−
OH7.9ｇ、HONB6.5ｇ、DCC6.8ｇとから合成
したＺ−Leu−ONBの酢酸エチル溶液を加え、
５時間かきまぜる。反応液を0.2N−塩酸、４
％−炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去する。残留
物に石油ベンジンを加え粉末としてろ取する。 収量10.6ｇ（66.2％）、融点74−77℃、〔α〕23 D
−81.4゜（ｃ＝0.6、メタノール）、Rf10.38、
Rf20.66。 元素分析C28H42O7N4：計算値：C61.52；
H7.74；N10.25.分析値：C61.61；H7.94；
N9.92。 (c) Ｚ−Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ
−Leu−Pro−Gln−OBut10.6ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として接
触還元したのちメタノールを留去し、残留物を
酢酸エチル300mlに溶解する。これにＺ−Ile−
OH5.1ｇ、HONB4.2ｇ、DCC4.4ｇから合成し
たＺ−Ile−ONBの酢酸エチル−ジオキサン混
合溶液（１：１）200mlを加え16時間かきまぜ
る。反応液より溶媒を留去し、残留物を酢酸エ
チル400mlに溶解し、0.2N−塩酸、４％−炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。溶媒を留去し、残留物に石油
ベンジンを加え粉末としてろ取する。 収量12.1ｇ（94.5％）、融点78−80℃（分
解）、〔α〕23 D−87.0゜（ｃ＝0.42、メタノール）、
Rf10.23、Rf20.67。 元素分析C34H53O8N5計算値：C61.89；
H8.10；N10.62.分析値：C62.35；H8.31；
N10.16。 (d) Ｚ−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製
造：Ｚ−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut12ｇをメ
タノール500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒
とし、水素気流中で還元したのち、触媒をろ
去、溶媒を留去する。残留物をDMF100mlに溶
解し、さらにＺ−Pro−OH4.7ｇ、HOBt3.0ｇ
を加え、０℃に冷却し、DCC4.3ｇを加え０℃
で４時間、室温で10時間かきまぜる。析出物を
ろ去し、溶媒を留去したのち、残留物を酢酸エ
チル400mlに溶解し、0.2N−塩酸、４％−炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。溶媒を留去し、残留物にエー
テルを加えて加温し、上清をのぞいたのち、さ
らにエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量12.6ｇ（91.5％）、融点83−87℃（分
解）、〔α〕23 D−121.0゜（ｃ＝0.5、メタノール）、
Rf10.31、Rf20.84。 元素分析C39H60O9N6計算値：C61.88；
H7.99；N11.10.分析値：C62.04；H8.21；
N10.70。 (e) Ｚ−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−
OButの製造：Ｚ−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln
−OBut12.5ｇをメタノール500mlに溶解し、パ
ラジウム黒を触媒として、水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留
物をDMF100mlに溶解する。この溶液に、Ｚ−
Thr−OH4.2ｇ、HOBt2.7ｇを加えて溶解し、
０℃に冷却する。次にDCC3.7ｇを加え０℃で
４時間、室温で８時間かきまぜたのち、析出物
をろ去する。溶媒を留去し残留物を酢酸エチル
400mlに抽出し、0.2N−塩酸、４％炭酸水素ナ
トリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで
乾燥する。溶媒を留去し、残留物にエーテルを
加え粉末としてろ取する。 収量11.8ｇ（86.8％）、融点101−105℃、
〔α〕23 D−124.3゜（ｃ＝0.58、メタノール）、
Rf10.20、Rf20.68。 元素分析C43H67O11N7計算値：C60.19；
H7.87；N11.43.分析値：C59.54；H7.91；
N11.19。 (f) Ｚ−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−
Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Thr−Pro−Ile
−Leu−Pro−Gln−OBut11.8ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を
留去し、残留物をDMF100mlに溶解する。これ
にＺ−Asp（OBut）−OH4.5ｇ、HOBt2.3ｇを
加え溶解し、０℃に冷却する。DCC3.2ｇを加
え０℃で４時間、室温で10時間かきまぜ、析出
物をろ去し、溶媒を留去する。残留物に酢酸エ
チル150mlを加え析出するゲル状物をろ取し、
酢酸エチルとエーテルから結晶化し、エーテル
でろ取する。 収量12.15ｇ（85.9％）、融点94−96℃（分
解）、〔α〕21 D−109.1゜（ｃ＝0.59、メタノール）、
Rf10.13、Rf20.47。 元素分析C51H80O14N8・H2O計算値：
C58.49；H7.89；N10.70.分析値：C58.60；
H8.07；N10.71。 (g) Ｚ−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Asp
（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−
OBut12ｇをメタノール500mlに溶解し、パラジ
ウム黒を触媒として、水素気流中で還元する。
触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留物を
Ｚ−Ser−OH2.93ｇ、HOBt2.0ｇとともに
DMF100mlに溶解し、０℃に冷却する。これに
DCC2.8ｇを加え０℃で４時間、室温で12時間
かきまぜ、析出物をろ去し、溶媒を留去する。
残留物を酢酸エチル500mlに溶解し、0.2N−塩
酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、
無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち、溶媒を留去
する。残留物に酢酸エチルとエーテルを加え粉
末としてろ取する。 収量11.7ｇ（90.0％）、融点111−115℃、
〔α〕21 D−112.3゜（ｃ＝0.63、メタノール）、
Rf10.06、Rf20.31。 元素分析C54H85O16N9H2O計算値：C57.17；
H7.73；N11.11.分析値：C57.34；H7.77；
N11.14。 (h) Ｚ−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−
Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Ser
−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−
Gln−OBut11.6ｇをメタノール500mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒として水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留
物を、Ｚ−Pro−ONB4.3ｇとともにDMF100
mlに溶解し、室温で16時間かきまぜる。溶媒を
留去し残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、
0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥したの
ち、溶媒を留去する。残留物にエーテルを加え
粉末としてろ取する。 収量11.1ｇ（88.1％）、融点117−120℃、
〔α〕21 D−119.2゜（ｃ＝0.61、メタノール）、
Rf20.45。 元素分析C59H92O17N10H2O計算値：
C57.54；H7.69；N11.38.分析値：C57.44；
H7.69；N11.38。 (i) Ｚ−Gly−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−
Pro−Ile−Leu−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ
−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OBut10ｇをメタノール500ml
に溶解し、パラジウム黒を触媒として、水素気
流中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を留去
する。残留物をＺ−Gly−ONB4ｇとともに
DMF80mlに溶解し室温で12時間かきまぜる。
溶媒を留去し残留物を酢酸エチル500mlに溶解
し、0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム
水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶
媒を留去する。残留物をメタノール180mlに溶
解し、抱水ヒドラジン4.5mlを加え、室温で16
時間かきまぜたのち溶媒を留去する。残留物を
酢酸エチル500mlに溶解し、水洗ののち無水硫
酸ナトリウムで乾燥し溶媒を留去する。残留物
にエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量7.35ｇ（70.2％）、融点131−135℃（分
解）、〔α〕22 D−119.4゜（ｃ＝0.35、メタノール）、
Rf20.27。 元素分析C61H95O18N11H2O計算値：
C56.86；H7.59；N11.96.分析値：C56.65；
H7.68；N12.02。 (j) Ｚ−Leu−Pro−OButの製造：Ｚ−Pro−
OBut20.2ｇをメタノール800mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元する。
触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を酢酸エ
チル300mlに溶解し、Ｚ−Leu−OSu26.3ｇを加
え16時間かきまぜる。反応液を0.2N−塩酸、
４％−炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水
硫酸ナトリウムで乾燥し留去して、油状物を得
る。 収量27.6ｇ（100％）、Rf10.71、Rf20.78。 (k) Ｚ−Arg−（NO2）−Leu−Pro−OButの製
造：Ｚ−Leu−Pro−OBut13.8ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として、
水素気流中で還元し、触媒をろ去し、溶媒を留
去する。残留物とＺ−Arg−（NO2）−OH11.7
ｇ、HOBt6.7ｇをDMF200mlに溶解し、０℃に
冷却する。これにDCC7.5ｇを加え０℃で４時
間、室温で12時間かきまぜ析出物をろ去し、溶
媒を留去する。残留物を酢酸エチル600mlに抽
出し、0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウ
ム水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、溶媒を留去する。残留物を放置し、析出す
る結晶をエーテルでろ取したのち、メタノール
より再結晶する。 収量12.4ｇ（60.6％）、融点170−172℃、
〔α〕26 D−67.8゜（ｃ＝0.48、メタノール）、
Rf30.77。 元素分析C29H45O8N7計算値：C56.20；
H7.32；N15.82、分析値：C55.79；H7.16；
N15.85。 (l) Ｚ−Ser−Arg−Leu−Pro−OButの製造：
Ｚ−Arg（NO2）−Leu−Pro−OBut12.3ｇをメ
タノール500mlに溶解し、6N−塩酸6.6mlを加
えたのち、パラジウム黒を触媒として水素気流
中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を留去す
る。残留物をトリエチルアミン2.8mlとともに
DMF100mlに溶解し、析出するトリエチルアミ
ン・塩酸塩をろ去する。ろ液にＺ−Ser−
OH4.8ｇとHONB5.4ｇを加え０℃に冷却し、
DCC4.95ｇを加え０℃で４時間、室温で16時間
かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を留去した
のち、残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、食
塩飽和の水でよく洗い、無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、溶媒を留去し、アメ状の残留物を得
る。Rf30.53。 (m) Ｚ−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OButの
製造：Ｚ−Ser−Arg−Leu−Pro−OBut10.5ｇ
を6N−塩酸３mlとともにメタノール500mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をDMF100mlに溶解し、トリエチルアミン
2.52mlを加えて中和する。析出するトリエチル
アミン塩酸塩をろ去したのちＺ−Pro−
ONB8.4ｇを加え室温で16時間かきまぜ、溶媒
を留去し、残留物に酢酸エチル300mlと食塩飽
和の水300mlを加えてよくふりまぜる。静置の
のち水層に沈澱してくる油状物を集め、これに
エーテルを加え粉末とする。次にこの粉末をメ
タノールに溶解し、不溶物をろ去したのち溶媒
を留去し、再びエーテルを加えて粉末としてろ
取する。 収量8.45ｇ（70.8％）、融点115−120℃（分
解）、〔α〕22 D−84.7゜（ｃ＝0.53、メタノール）、
Rf30.41。 元素分析C37H58O9N8・HCl・H2O計算値：
C54.63；H7.56；N13.78；Cl4.36。分析値：
C54.50；H7.70；N14.11；Cl4.21。 (n) Ｚ−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−
OButの製造：Ｚ−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro
−OBut3.8ｇをメタノール200mlに溶解し、パ
ラジウム黒を触媒として水素気流中で還元し、
触媒をろ去したのち溶媒を留去し、残留物を
DMF30mlに溶解する。この溶液に、Ｚ−Ser−
OH1.37ｇ、HONB1.24ｇとDCC1.30ｇとから
合成したＺ−Ser−ONBのDMF溶液（10ml）
を加え室温で16時間かきまぜる。析出物をろ去
したのち溶媒を留去し、残留物に酢酸エチル１
mlとアセトニトリル１mlを加えて溶解し、次に
エーテルを加えて沈澱とし、さらに粉末にして
ろ取する。この粉末をRf3の溶媒と酢酸エチル
を１：１で混合した溶媒２mlに溶解し、同じ溶
媒で充填したシリカゲルカラム（5.6×9.0cm）
に付し、同じ溶媒で展開する。365ml〜746mlの
区分を集め溶媒を留去し、残留物にエーテルを
加え粉末としてろ取する。 収量2.12ｇ（50.2％）、融点130−135℃（分
解）、〔α〕22 D−83.5゜（ｃ＝0.38、メタノール）、
Rf30.34。 元素分析C40H63O11N9・HCl・H2O計算値：
C53.35；H7.39；N14.00；Cl3.94。分析値：
C53.67；H7.45；N13.72；Cl3.52。 (o) Ｚ−Ser−Leu−Pro−OButの製造：Ｚ−
Leu−Pro−OBut13.8ｇをメタノール700mlに
溶解し、パラジウム黒を触媒とし、水素気流中
で還元する。触媒をろ去し溶媒を留去し、残留
物をＺ−Ser−OH7.9ｇ、HONB8.9ｇとともに
アセトニトリル200mlに溶解し、０℃に冷却す
る。次にDCC7.5ｇを加え０℃で４時間、室温
で16時間かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を
留去し、残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、
0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を留去して油状物17ｇを得る。これをクロロホ
ルムとメタノールの混合溶媒（200：３）15ml
に溶解し、同じ溶媒で充填したシリカゲルカラ
ム（5.4×20cm）に付し、同じ溶媒で展開する。
1300〜2100mlの部分を集め溶媒を留去し油状物
を得る。 収量12.2ｇ（73.1％）、Rf10.38、Rf20.69。 (p) Ｚ−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg
−Leu−Pro−OButの製造：Ｚ−Ser−Pro−
Ser−Arg−Leu−Pro−OBut1.0ｇをＮ−塩酸
1.2mlとともにメタノール60mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒として水素気流中で還元し、触
媒をろ去したのち溶媒を留去し、残留物を
DMF20mlに溶解する。Ｚ−Ser−Leu−Pro−
OBut700mgをトリフルオロ酢酸７mlに溶解し、
50分ののち溶媒を留去し、残留物にエーテルと
石油エーテル（１：２）の混合溶媒を加えて洗
い、洗液を除き、残つた油状物を真空ポンプ下
の減圧で粉末となるまでに乾燥したのち、直に
先のDMF溶液に、HONB407mgとともに加え
て溶解し、０℃に冷却する。DCC466mgをこれ
に加え、０℃で６時間、室温で16時間かきまぜ
析出物をろ去し、溶媒を留去する。残留物を
Rf3と酢酸エチル（４：１）の混合溶媒５mlに
溶解し、同じ溶媒で充填したシリカゲルカラム
（3.6×9.0cm）に付し、同じ溶媒で溶出し、333
〜572mlの区分を集め、溶媒を留去したのち残
留物にエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量450mg（33.8％）、融点110−120℃（分
解）、〔α〕24 D−106.6゜（ｃ＝0.31、メタノール）、
Rf50.71。 (q) Ｚ−Pro−Pro−OButの製造：Ｚ−Pro−
OBut10.1ｇをメタノール500mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元し、触
媒をろ去し、溶媒を留去し残留物をＺ−Pro−
OH8.47ｇ、HOBt5.4ｇとともに酢酸エチル300
mlに溶解し、０℃に冷却する。次にDCC7.5ｇ
を加え０℃で４時間、室温で12時間かきまぜ析
出物をろ去する。ろ液を0.2N−塩酸、４％炭
酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナト
リウムで乾燥し、溶媒を留去する。残留物の結
晶をエーテルでろ取する。 収量9.85ｇ（74.1％）、融点94−96℃、〔α〕22 D
−116.9゜（ｃ＝0.54、メタノール）、Rf10.58、
Rf20.72。 元素分析C22H30O5N2 計算値：C65.65；
H7.51；N6.96。分析値：C65.42；H7.38；
N7.20 (r) Ｚ−Pro−Pro−Pro−OButの製造：Ｚ−
Pro−Pro−OBut９ｇをメタノール300mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として、水素気流中
で還元し、触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をＺ−Pro−OH5.6ｇ、HOBt3.63ｇととも
に、酢酸エチル250mlに溶解し、０℃に冷却す
る。次にDCC5.1ｇを加え０℃で６時間、室温
で16時間かきまぜ、析出物をろ去する。ろ液を
0.2N−塩酸、４％−炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を留去する。析出する結晶をエーテルでろ取す
る。 収量9.6ｇ（85.9％）、融点155−157℃、〔α〕
22 D−176.0゜（ｃ＝0.55、メタノール）、Rf10.40、
Rf20.69。 元素分析C27H37O6N3・ 1/2H2O計算値：
C63.76；H7.53；N8.26。分析値：C63.77；
H7.53；N8.62。 (s) Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−OButの製造：
Ｚ−Pro−Pro−Pro−OBut５ｇをメタノール
200mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元し、触媒をろ去ののち溶媒を留
去し、残留物をＺ−Ala−OH2.23ｇ、
HOBt1.62ｇとともにDMF20mlに溶解し、０℃
に冷却する。この溶液にDCC2.27ｇを加え、０
℃で４時間、室温で12時間かきまぜ、析出物を
ろ去する。溶媒を留去し、残留物を３mlの２％
メタノール／クロロホルムに溶解し、同じ溶媒
で充填したシリカゲルカラム（3.7×10.5cm）
に付し、同じ溶媒で展開する。170〜380mlの区
分を集め溶媒を留去し、油状物4.05ｇ（71.0
％）を得る。Rf10.33、Rf20.67。 (t) Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OButの
製造：Ｚ−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−
Arg−Leu−Pro−OBut400mgをＮ−塩酸0.8ml
とともにメタノール80mlに溶解し、パラジウム
黒を触媒とし、水素気流中で還元する。触媒を
ろ去し、溶媒を留去し、残留物をDMF10mlに
溶解し、トリエチルアミン0.11mlで中和し、析
出するトリエチルアミン・塩酸塩をろ去する。
Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−OBut233mgをトリ
フルオロ酢酸２mlに溶解する。50分後に溶媒を
留去し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ
取し、乾燥する。これをHONB122mgとともに
先のDMF溶液に加えて溶解し、０℃に冷却す
る。この溶液にDCC140mgを加え、０℃で６時
間、室温で12時間かきまぜ、析出物をろ去し溶
媒を留去する。残留物にエーテルを加え粉末と
してろ取し、アセトニトリルと酢酸エチルとか
ら再沈澱精製する。 収量430mg（82.1％）、融点152−155℃（分
解）、〔α〕24 D−153.6゜（ｃ＝0.45、メタノール）、
Rf30.10、Rf50.54。 元素分析C72H112O19N16・HCl・H2O計算
値：C55.42；H7.43；N14.37；Cl2.27。分析
値：C56.21；H7.54；N14.04；Cl2.30。 (u) Ｚ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu
−Pro−Gln−OButの製造：Ｚ−Gly−Pro−
Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro
−Gln−OBut363mgをメタノール30mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒として水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を
DMF10mlに溶解する。Ｚ−Ala−Pro−Pro−
Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg
−Leu−Pro−OBut430mgをトリフルオロ酢酸
３mlに溶解し、45分間室温に置く。溶媒を留去
し残留物にエーテルを加え粉末としてろ取し、
乾燥後、HONB130mgとともに、先のDMF溶
液に加えて溶解し、０℃に冷却する。次に
DCC118mgを加え、０℃で６時間、室温で40時
間かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を留去
し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ取
し、さらにDMFとエーテルから再沈澱精製す
る。 収量700mg（95.5％）、融点120−125℃（分
解）、〔α〕23 D−127.7゜（ｃ＝0.12、メタノール）、
Rf50.62、Rf60.44。 元素分析C121H191O34N27・HCl・2H2O計算
値：C53.12；H7.80；N14.94；Cl1.40。分析
値：C53.39；H7.62；N15.10；Cl1.54。 (v) Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro
−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro
−Gln−OH〔ペプチド（）…hCG−β（123−
145）Ｃ末端ペプチド部分の製造：Ｚ−Ala−
Pro−Pro−Pro−Ser−Leu−Pro−Ser−Pro
−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−Pro−Ser−
Asp（OBut）−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro−Gln
−OBut580mgをＮ−塩酸0.45mlとともにメタノ
ール50mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として
水素気流中で還元する。触媒をろ去し、溶媒を
留去し、残留物に水１mlを加え、再び留去した
のち残留物を90％−トリフルオロ酢酸水10mlに
溶解し、室温に60分置く。溶媒を留去し、残留
物に水10mlを加えて溶解し、アンバーライト
IRA−410（酢酸型）の樹脂カラム（１×５cm）
に付し、溶出液を集める。樹脂を水50mlでよく
洗い、洗液を先の溶出液と合して凍結乾燥し、
白色粉末390mgを得る。次にこれをＮ−酢酸で
充填したセフアデツクスLH−20のカラム（２
×83cm）に付し同じ溶媒で展開する。70〜100
mlの区分を集め凍結乾燥し、さらに同じカラム
で再クロマトグラフイーに付し、目的物を含む
区分を集めて凍結乾燥し、白色粉末を得る。 収量185mg（35.2％）、〔α〕23 D−194.5゜（ｃ＝
0.13、0.1N−酢酸）、Rf50.06、Rf4（セルロー
ス）0.78。 アミノ酸分析値（理論値）Arg1.00(1)、
Asp1.00(1)、Thr1.00(1)、Ser3.74(4)、Glu1.03
(1)、Pro9.59(9)、Gly0.98(1)、Ala0.94(1)、
Ile0.95(1)、Leu2.97(3)、平均回収率79.3％。 参考例 ２ Ｈ−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−Gly−
Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−Pro
−Gln−OH〔以下、ペプチド（）と称する。〕
〔hCG−β（130−145）Ｃ末端ペプチド部分〕の
製造 Ｚ−Gly−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro
−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut2.16ｇをメタノー
ル100mlに溶解し、パラジウム黒を触媒とし、水
素気流中で還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去
し、残留物をDMF25mlに溶解する。この溶液に、
Ｚ−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OBut1.5
ｇをトリフルオロ酢酸処理して得たＺ−Ser−
Pro−Ser−Arg−Leu−Pro−OHとHONB1.22
ｇを加え０℃に冷却する。次にDCC701mgを加
え、０℃で６時間、室温で40時間かきまぜ、析出
物をろ去し、溶媒を留去する。残留物に酢酸エチ
ルとエーテルを加え沈澱としてろ取する。これを
Rf3の溶媒５mlに溶解し、同じ溶媒で充填したシ
リカゲルカラム（5.7×９cm）に付し、同じ溶媒
で展開する。534−914mlの区分を集め溶媒を留去
し、残留物にエーテルを加えてろ取する。 収量1.1ｇ（33.9％）、Rf30.20。 次にこの保護ペプチドの一部70mgをメタノール
10mlに溶解しパラジウム黒を触媒として、水素気
流中で還元し、触媒をろ去、溶媒を留去する。残
留物を90％−トリフルオロ酢酸１mlに溶解し、60
分後に溶媒を留去し、残留物に水３mlを加えて溶
解する。この水溶液をアンバーライトIRA−410
（酢酸型）のカラム（１×１cm）に通し凍結乾燥
する。次にこれをＮ−酢酸0.5mlに溶解し、Ｎ−
酢酸で充填したセフアデツクスLH−20のカラム
に付し、同じ溶媒で展開する。目的物を含有する
区分を集め凍結乾燥し、白色粉末を得る。 収量22mg（36.1％）、〔α〕23 D−159.3゜（ｃ＝0.15
、
0.1N−酢酸）、Rf50.15。 アミノ酸分析（理論値）Arg−1.01(1)、
Asp1.01(1)、Thr0.93(1)、Ser2.57(3)、Glu0.96(1)、
Pro4.85(5)、Gly1.00(1)、Ile0.96(1)、Leu2.04(2)、
平均回収率81.1％。 参考例 ３ Ｈ−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH〔以下、ペプチド（）
と称する。〕〔hCG−β（136−145）Ｃ末端ペプ
チド部分〕の製造 Ｚ−Gly−Pro−Ser−Asp（OBut）−Thr−Pro
−Ile−Leu−Pro−Gln−OBut150mgを90％トリ
フロオロ酢酸2.5mlに溶解し、室温に60分置く。
次に溶媒を留去し、残留物を50％−酢酸30mlに溶
解しパラジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元
する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を水
10mlに溶解し、アンバーライトIRA−410（酢酸
型）のカラム（１×３cm）に付し、次に樹脂を水
でよく洗う。溶出液と洗液を合して凍結乾燥す
る。これをＮ−酢酸で充填したセフアデツクス
LH−20のカラム（２×83cm）に付し、同じ溶媒
で溶出する。90〜105mlの区分を集めて凍結乾燥
し、白色粉末を得る。 収量70mg（57.9％）、〔α〕19 D−150.5゜（ｃ＝0.2
、
0.1N−酢酸）、Rf50.29、Rf4（セルロース）0.55。 アミノ酸分析値：Asp1.02(1)、Thr0.98(1)、
Ser0.92(1)、Glu1.04(1)、Pro3.17(3)、Gly0.99(1)、
Ile0.99(1)、Leu1.00(1)。平均回収率82.6％。 参考例 ４ 抗体の製造 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／mg
のhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これにフ
ロインドの完全アジユバント（Freund′s
complete adjuvant、“免疫の生化学”、橘ら著、
共立出版株式会社（1967年））１mlを加えてよく
混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射する。以上の操作
を３週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血し
パイロツトアツセイを実施する。その結果、hCG
−βのＣ末端ペプチド（）、（）および（）
にも親和性をもつ抗hCG抗体を得る。 参考例 ５ 特異抗hCG抗体の製造 参考例１で得られたペプチド（）５mgを
0.5M NaClを含む0.1M NaHCO38mlに溶解し、
予めＮ／1000HClで洗浄したブロムシアン活性化
セフアロース4B（フアルマシア・フアイン・ケミ
カルズ社製）１ｇに加え、５℃で一夜撹拌した。
反応終了後同じ0.5M NaClを含む0.1MNaHCO3
で十分に洗浄し、次いでHClでPH８に調整した
0.5Mエタノールアミン10mlを添加して室温で１
時間反応させた後、(1)1M NaClを含む0.1M酢酸
緩衝液（PH4.0）、(2)1M NaClを含む0.1Mホウ酸
緩衝液（PH8.0）および(3)0.15M NaClを含む
0.02Mホウ酸緩衝液（PH8.0）で順次洗浄しカラ
ムに充填した。 参考例４で得られた抗hCG血清８mlを1.5ｇの
無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈澱させ、得ら
れたγ−グロブリン画分を上記のペプチド（）
結合セフアロース4Bカラム（0.9×４cm）に付し
た。 0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、hLH、hFSHおよび
hTSHと交差反応する抗hCG抗体を除去した。次
いで0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（PH2.3）で溶
出することによつてhCG−βC末端ペプチドと強
い親和性をもつ特異抗hCG抗体を得た（蛋白量
1.8mg）。 以下、本抗体の物性について述べる。 本抗体は最終希釈濃度80nｇ／mlで、約2μU
の酵素活性を有するhCG−酵素標識体の約95％
を結合する能力を有する。 本抗体の抗原結合活性の至適PHは６−９であ
る。 本抗体は冷蔵保存で１年以上安定である。 分子量は約15万で約３％の糖を含む。 PH２−12の水性溶媒に易溶である。 電気泳動においては、陰極側に移動するγ−
グロブリン分画に属する。 紫外吸収スペクトルは第１図参照。 アミノ酸分析値は第１表を参照。 他の物性は免疫グロブリンＧの物性（“医科
免疫学”、第61頁、菊地ら著、南江堂（1976
年））と同じである。
【表】
【表】
ミノ酸のモル数
実施例 １ (1) 抗hCG−βC末端フラグメントペプチド抗体
の製造 参考例１で調製されたペプチド（）〔hCG
−β（123−145）Ｃ末端ペプチド部分〕25mgお
よび牛チログロブリン（BTGと略称する）50
mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.3）４mlに溶解
し、５％GLA水溶液４mlを加えて室温で３時
間撹拌後、４℃で透析（水２×４）し凍結乾
燥して免疫原を得た。このhCG−βC末端ペプ
チド（123−145）−BTG縮合物1.5mgを生理食
塩水0.75mlに溶解し、これにフロインドの完全
アジユバント（Freund′s complete adjuvant）
0.75mlを加えてよく混和し、乳剤を作り、これ
をウサギの両大腿部筋肉内および背部皮下数ケ
所に注射した。以上の操作を４週おきに４回行
ない最終免疫後１週間で採血し、遠心分離して
抗血清を採取し抗hCG−βC末端ペプチド（123
−145）血清F5Cを得た。 次いで抗血清F5Cを常法により硫酸アンモニ
ウム塩析させて得たγ−グロブリン画分を２mg
のhCGを結合させたセフアロース4Bカラム
（直径0.9cm、長さ４cm）に付した。 0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシ
ン−塩酸緩衝液（PH2.3）で溶出することによ
つて、hCGに親和性の高い特異抗体F5CSを調
製した。 (2) 抗体結合固相の調製 ポリスチレンボール（直径6.4mm、Precision
Plastics Ball Co.Cicago、U.S.A.）300個に
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.7）50mlを加え56℃
に加温した。次に上記(1)で調製したF5CS2mgを
加えて56℃で２時間インキユベートした。0.1
％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
洗浄したのち、用時まで冷所保存した。 (3) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体複
合体の調製法 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／
mgのhCG1mgを上記(1)の方法でウサギに免疫し
て得られた抗hCG血清について、硫酸アンモニ
ウム塩析し、５mgのペプチド（）を結合させ
たセフアロース4Bカラム（直径0.9cm、長さ４
cm）のアフイニテイ−クロマトグラフイーで素
通りする画分抗体T7CSを調製した。T7CS4mg
を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）２mlに溶解し、
400μｇのｍ−MBHSを含むTHF200μを添加
して30℃で30分間反応させた。反応混合液を
0.02Mリン酸緩衝液で平衝させたセフアデツク
スＧ−25（直径0.9cm、長さ55cm）に通し、過剰
の試薬とマレイミド化抗体とを分離した。得ら
れたマレイミド化抗体溶液0.5mlを0.02Mリン
酸食塩緩衝液（PH7.5）に希釈したβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ溶液（１mg／ml）0.3mlに徐々
に添加し、時々振り混ぜながら５℃で１夜反応
させた。反応終了後、0.02Mリン酸食塩緩衝液
（PH7.0）を用いるセフアロース6Bのカラムク
ロマトグラフイーで精製し、酵素活性ならびに
抗体活性を有するフラクシヨンを分取し、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体複合体を
得た。 (4) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、１ｍＭ
MgCl2を含む0.1Mリン酸緩衝液400μにhCG、
hCG−α、hCG−β、hLH、hFSH、hTSHの
標準溶液100μを加え、上記(2)で製造した抗
hCG−βC末端ペプチド（123−145）抗体結合
ポリスチレンボール１球、上記(3)で製造したβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体液
100μを加えて室温で２時間反応させた。反
応終了後、ポリスチレンボールを0.1M NaCl、
１ｍＭ MgCl2を含む0.05Mリン酸緩衝液で３
回洗浄したのち、酵素基質液（0.1％牛血清ア
ルブミン、0.1％NaN3、0.1M NaClおよび１
ｍＭ MgCl2を含むPH7.0の0.02Mリン酸緩衝液
に溶解した20μｇ／mlの４−メチルウンベリフ
エリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液）
400μを加え37℃で２時間反応させた。励起
波長365nｍで450nｍにおける螢光強度を測定
した。それぞれの標準曲線を第２図に示した。
第２図中、●はhCGの、×はhCG−βの、□は
hCG−αの、〇はhLHの、△はhFSHの、〓は
hTSHの標準曲線をそれぞれ表わす。 このように本発明の測定方法は、hCGおよび
hCG−βにのみ特異的に反応しhCG−α、
hLH、hFSH、hTSHとは全く交差反応を示さ
なかつた。 実施例 ２ (1) アルカリホスフアターゼ標識抗hCG抗体複合
体の調製法 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.8）に希釈したアル
カリホスフアターゼ溶液（0.5mg／ml）１mlに
実施例１(3)で得られた抗hCG抗体（T7CS）２
mgを溶解する。次いで２％GLA溶液0.1mlを加
えて室温で60分間反応させたのち、0.02Mリン
酸食塩緩衝液（PH6.8）に対して１夜透析する。
更にセフアデツクスＧ−200のカラムで分画し、
アルカリフオスフアターゼ標識抗hCG抗体複合
体を得た。 (2) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、0.1M
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液400μにhCG、
hCG−α、hCG−β、hLH、hFSH、hTSHの
標準液100μを加え、実施例１(2)で製造した
抗hCG−βC末端ペプチド（123−145）抗体結
合ポリスチレンボール１球加えて室温で１時間
反応させた。次にポリスチレンボールを0.1M
リン酸緩衝液で洗浄後、実施例２(1)で製造した
アルカリホスフアターゼ標識抗hCG複合体液
100μを加えて室温で１時間反応させた。反
応終了後、ポリスチレンボールをリン酸緩衝液
で洗浄し、酵素基質液〔１ｍＭ MgCl2を含む
0.05M炭酸緩衝液（PH9.8）に溶解した２mg／
mlのパラ−ニトロフエニルリン酸〕500μを
加え37℃で１夜反応させる。反応終了後405n
ｍにおけるパラ−ニトロフエノールの吸収強度
を測定し、それぞれの標準曲線を得た。第２図
と同様の関係が認められた。hCGおよびhCG−
βのみに特異的に反応しhCG−α、hLH、
hFSH、hTSHとは全く交差反応を示さなかつ
た。 実施例 ３ (1) 131I標識抗hCG抗体の調製法 1.5mCiのNa 131Iに0.25Mリン酸緩衝液（PH
7.5）20μを加え、実施例１(3)で得られた抗
hCG抗体（T7CS）10μｇをリン酸緩衝液20μ
にとかしたものを加える。これにクロラミン
T20μｇを、リン酸緩衝液20μにとかしたもの
を加え、室温で30秒間振り混ぜたのち、直ちに
メタ重亜硫酸ナトリウム120μｇをリン酸緩衝
液50μにとかしたものを加え、更にヨウ化カ
リウム溶液（10mg／ml）0.4mlを加えてから反
応混合物をセフアデツクスＧ−75で精製して
131I標識抗hCG抗体を得た。 (2) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、0.1M
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液400μにhCG、
hCG−α、hCG−β、hLH、hFSH、hTSHの
標準溶液100μを加え、実施例１(2)で製造し
た抗hCG−βC末端ペプチド（123−145）抗体
結合ポリスチレンボール１球、実施例３(1)で製
造したヨウ素標識抗hCG溶液100μを加えて
室温で２時間反応させた。反応終了後、0.1M
NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液で洗浄したの
ち、ポリスチレンボールを他の試験管に移し放
射活性をウエルカウンターで測定し、それぞれ
の標準曲線を得た。第２図と同様の関係が認め
られた。hCGおよびhCG−βのみ特異的に反応
しhCG−α、hLH、hFSH、hTSHとは全く交
差反応を示さなかつた。 実施例 ４ (1) 抗hCG−α抗体結合固相の調製 hCG−α〔ベーリンガマンハイム（西ドイツ）
製〕100μｇを実施例１(1)の方法でウサギに免
疫し、産生した抗hCG−α血清を硫酸アンモニ
ウム塩析し、蒸留水に対して透析後、200μｇ
のhCG−β〔ベーリンガマンハイム（西ドイツ）
製〕を結合させたセフアロース4Bカラムを用
いるアフイニテイークロマトグラフイーで素通
りする画分を得た〔抗hCG−αの抗体
（F9CS）〕。 抗hCG−α（F9CS）２mgを0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.0）２mlに溶解し実施例１(3)の方法で
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG−α抗体
複合体を得た。 (2) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、１ｍＭ
MgCl2、0.1M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液
400μにhCG、hCG−α、hCG−β、hLH、
hFSH、hTSHの標準溶液100μを加え、実施
例１(2)で製造した抗hCG−βC末端ペプチド
（123−145）抗体結合ポリスチレンボール１球、
実施例４(1)で製造したβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ標識抗hCG−α抗体溶液100μを加えて室
温で２時間反応させた。反応終了後ポリスチレ
ンボールを0.1M NaCl、１ｍＭ MgCl2を含
む0.05Mリン酸緩衝液で洗浄したのち、酵素反
応を行ない螢光強度を測定した。それぞれの標
準曲線を第３図に示した。 第３図中、●はhCGの、×はhCG−βの、□
はhCG−αの、〇はhLHの、△はhFSHの、〓
はhTSHの標準曲線をそれぞれ表わす。 このように本発明の測定方法は、hCGにのみ
特異的に反応しhCG−α、hCG−β、hLH、
hFSH、hTSHとは全く交差反応を示さなかつ
た。 実施例 ５ (1) 西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗hCGの抗
体複合体の調製 仲根らの方法〔“Journal of
Histochemistry and Cytochemistry”、第22
巻（1974年）、第1084頁〕に従つて行なつた。
７mgの西洋わさびパーオキシダーゼを１mlの
0.3M重炭酸ナトリウム溶液（PH8.1）にとか
し、0.1mlの１％１−フルオロ２，４−ジニト
ロベンゼンを加えて室温で１時間反応させた。
次に0.06M NaIO41mlを加えて室温で30分間撹
拌したのち、0.16Mエチレングリコール水溶液
１mlを加えて室温で１時間放置した。0.01M炭
酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）に対して１夜透
析したのち、参考例５で得られた特異hCG抗体
1.8mgの0.01M炭酸緩衝液（PH9.5）１mlを加え
て室温で３時間反応させてから５mgのNaHB4
を加えて４℃で１夜反応させた。0.15M NaCl
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.1）に対して
４℃で１夜透析した後、セフアデツクスＧ−
200のカラムクロマトグラフイーで分画し西洋
わさびパーオキシダーゼ標識抗hCG複合体を得
た。 (2) 抗体結合固相の調製 ポリスチレンボール（直径6.4mm、Precision
Plastics Ball Co.、Cicago、U.S.A.）300個に
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.7）50mlを加え56℃
に加温した。次に実施例１(3)で調製した
T7CS2.5mgを加えて56℃で２時間インキユベー
トした。 0.1％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で洗浄したのち、用時まで冷所保存した。 (3) 測定 ３％正常ウサギ血清を含む0.1Mリン酸緩衝
液にhCG、hCG−α、hCG−β、hLH、
hFSH、hTSHの標準液100μを加え、実施例
５(2)で製造した抗hCG抗体結合ポリスチレンボ
ール１球を加えて室温で１時間反応させた。次
にポリスチレンボールを0.1Mリン酸緩衝液で
洗浄後、実施例５(1)で製造した西洋わさびパー
オキシダーゼ標識特異抗hCG抗体溶液100μ
を加えて室温で２時間反応させた。反応終了
後、ポリスチレンボールをリン酸緩衝液で洗浄
し、これに４−アミノアンチピリン244mg／ｄ
、フエノール800mg／ｄと30％過酸化水素
水30μ／ｄとを含む基質溶液（PH7.0のリン
酸緩衝液で溶解）２mlを加えて室温で1.5時間
反応させたのち、20％NaN3液25μを添加し
て反応を停止させ、507nｍにおける吸光強度
を測定し、それぞれの標準曲線を得た。第２図
と同様の関係が認められhCGおよびhCG−βの
みに特異的に反応し、hCG−α、hLH、
hFSH、hTSHには全く交差反応を示さなかつ
た。 参考例 ６ hCGの免疫化学的測定用キツトおよびhCGの測
定 下記のhCG免疫化学的測定用キツトを用い、下
記の操作法に従つて正常人および妊娠の尿もしく
は血清中のhCG濃度を測定した。結果は第２表に
示される。 hCGの免疫化学的測定キツト (1) 実施例１で得られる１個あたり6.7μｇの抗
hCG−βC末端フラグメントペプチド抗体で感
作した直径6.4mmのポリスチレンボール。 (2) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体複
合体の約400μUの酵素活性を有する部分。 (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる、５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、１ｍ
Ｍ MgCl2を含むPH7.4の0.1Mリン酸緩衝液。 (5) 20μｇ４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ
−ガラクトシド。 (6) (5)の酵素基質の溶解に用いる、0.1％牛血清
アルブミン、0.1％NaN3、１ｍＭ MgCl2を含
むPH7.0の0.02Mリン酸緩衝液。 (7) (1)のポリスチレンボールの洗浄に用いる
0.1M NaCl、１ｍＭ MgCl2を含むPH7.0の
0.05Mリン酸緩衝液。 (8) PH10.5の0.1M炭酸緩衝液。 操作法 標準hCGもしくは被検試料100μに試薬(4)
400μ、試薬(1)１個、試薬(2)100μとを添加し、
室温で反応させる。２時間反応後、試薬(7)でポリ
スチレンボールを洗浄し、次いで試薬(5)400μ
を加えて酵素反応を開始する。37℃で２時間反応
させたのち、試薬(8)2.5mlを添加して反応を停止
させる。反応液中の螢光強度を測定し、検液中の
hCG濃度を決定する。 上記方法により、正常人および妊婦の尿もしく
は血清中のhCG濃度を測定した。結果は第２表に
示されている。
実施例 １ (1) 抗hCG−βC末端フラグメントペプチド抗体
の製造 参考例１で調製されたペプチド（）〔hCG
−β（123−145）Ｃ末端ペプチド部分〕25mgお
よび牛チログロブリン（BTGと略称する）50
mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.3）４mlに溶解
し、５％GLA水溶液４mlを加えて室温で３時
間撹拌後、４℃で透析（水２×４）し凍結乾
燥して免疫原を得た。このhCG−βC末端ペプ
チド（123−145）−BTG縮合物1.5mgを生理食
塩水0.75mlに溶解し、これにフロインドの完全
アジユバント（Freund′s complete adjuvant）
0.75mlを加えてよく混和し、乳剤を作り、これ
をウサギの両大腿部筋肉内および背部皮下数ケ
所に注射した。以上の操作を４週おきに４回行
ない最終免疫後１週間で採血し、遠心分離して
抗血清を採取し抗hCG−βC末端ペプチド（123
−145）血清F5Cを得た。 次いで抗血清F5Cを常法により硫酸アンモニ
ウム塩析させて得たγ−グロブリン画分を２mg
のhCGを結合させたセフアロース4Bカラム
（直径0.9cm、長さ４cm）に付した。 0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシ
ン−塩酸緩衝液（PH2.3）で溶出することによ
つて、hCGに親和性の高い特異抗体F5CSを調
製した。 (2) 抗体結合固相の調製 ポリスチレンボール（直径6.4mm、Precision
Plastics Ball Co.Cicago、U.S.A.）300個に
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.7）50mlを加え56℃
に加温した。次に上記(1)で調製したF5CS2mgを
加えて56℃で２時間インキユベートした。0.1
％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
洗浄したのち、用時まで冷所保存した。 (3) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体複
合体の調製法 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／
mgのhCG1mgを上記(1)の方法でウサギに免疫し
て得られた抗hCG血清について、硫酸アンモニ
ウム塩析し、５mgのペプチド（）を結合させ
たセフアロース4Bカラム（直径0.9cm、長さ４
cm）のアフイニテイ−クロマトグラフイーで素
通りする画分抗体T7CSを調製した。T7CS4mg
を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）２mlに溶解し、
400μｇのｍ−MBHSを含むTHF200μを添加
して30℃で30分間反応させた。反応混合液を
0.02Mリン酸緩衝液で平衝させたセフアデツク
スＧ−25（直径0.9cm、長さ55cm）に通し、過剰
の試薬とマレイミド化抗体とを分離した。得ら
れたマレイミド化抗体溶液0.5mlを0.02Mリン
酸食塩緩衝液（PH7.5）に希釈したβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ溶液（１mg／ml）0.3mlに徐々
に添加し、時々振り混ぜながら５℃で１夜反応
させた。反応終了後、0.02Mリン酸食塩緩衝液
（PH7.0）を用いるセフアロース6Bのカラムク
ロマトグラフイーで精製し、酵素活性ならびに
抗体活性を有するフラクシヨンを分取し、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体複合体を
得た。 (4) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、１ｍＭ
MgCl2を含む0.1Mリン酸緩衝液400μにhCG、
hCG−α、hCG−β、hLH、hFSH、hTSHの
標準溶液100μを加え、上記(2)で製造した抗
hCG−βC末端ペプチド（123−145）抗体結合
ポリスチレンボール１球、上記(3)で製造したβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体液
100μを加えて室温で２時間反応させた。反
応終了後、ポリスチレンボールを0.1M NaCl、
１ｍＭ MgCl2を含む0.05Mリン酸緩衝液で３
回洗浄したのち、酵素基質液（0.1％牛血清ア
ルブミン、0.1％NaN3、0.1M NaClおよび１
ｍＭ MgCl2を含むPH7.0の0.02Mリン酸緩衝液
に溶解した20μｇ／mlの４−メチルウンベリフ
エリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液）
400μを加え37℃で２時間反応させた。励起
波長365nｍで450nｍにおける螢光強度を測定
した。それぞれの標準曲線を第２図に示した。
第２図中、●はhCGの、×はhCG−βの、□は
hCG−αの、〇はhLHの、△はhFSHの、〓は
hTSHの標準曲線をそれぞれ表わす。 このように本発明の測定方法は、hCGおよび
hCG−βにのみ特異的に反応しhCG−α、
hLH、hFSH、hTSHとは全く交差反応を示さ
なかつた。 実施例 ２ (1) アルカリホスフアターゼ標識抗hCG抗体複合
体の調製法 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.8）に希釈したアル
カリホスフアターゼ溶液（0.5mg／ml）１mlに
実施例１(3)で得られた抗hCG抗体（T7CS）２
mgを溶解する。次いで２％GLA溶液0.1mlを加
えて室温で60分間反応させたのち、0.02Mリン
酸食塩緩衝液（PH6.8）に対して１夜透析する。
更にセフアデツクスＧ−200のカラムで分画し、
アルカリフオスフアターゼ標識抗hCG抗体複合
体を得た。 (2) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、0.1M
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液400μにhCG、
hCG−α、hCG−β、hLH、hFSH、hTSHの
標準液100μを加え、実施例１(2)で製造した
抗hCG−βC末端ペプチド（123−145）抗体結
合ポリスチレンボール１球加えて室温で１時間
反応させた。次にポリスチレンボールを0.1M
リン酸緩衝液で洗浄後、実施例２(1)で製造した
アルカリホスフアターゼ標識抗hCG複合体液
100μを加えて室温で１時間反応させた。反
応終了後、ポリスチレンボールをリン酸緩衝液
で洗浄し、酵素基質液〔１ｍＭ MgCl2を含む
0.05M炭酸緩衝液（PH9.8）に溶解した２mg／
mlのパラ−ニトロフエニルリン酸〕500μを
加え37℃で１夜反応させる。反応終了後405n
ｍにおけるパラ−ニトロフエノールの吸収強度
を測定し、それぞれの標準曲線を得た。第２図
と同様の関係が認められた。hCGおよびhCG−
βのみに特異的に反応しhCG−α、hLH、
hFSH、hTSHとは全く交差反応を示さなかつ
た。 実施例 ３ (1) 131I標識抗hCG抗体の調製法 1.5mCiのNa 131Iに0.25Mリン酸緩衝液（PH
7.5）20μを加え、実施例１(3)で得られた抗
hCG抗体（T7CS）10μｇをリン酸緩衝液20μ
にとかしたものを加える。これにクロラミン
T20μｇを、リン酸緩衝液20μにとかしたもの
を加え、室温で30秒間振り混ぜたのち、直ちに
メタ重亜硫酸ナトリウム120μｇをリン酸緩衝
液50μにとかしたものを加え、更にヨウ化カ
リウム溶液（10mg／ml）0.4mlを加えてから反
応混合物をセフアデツクスＧ−75で精製して
131I標識抗hCG抗体を得た。 (2) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、0.1M
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液400μにhCG、
hCG−α、hCG−β、hLH、hFSH、hTSHの
標準溶液100μを加え、実施例１(2)で製造し
た抗hCG−βC末端ペプチド（123−145）抗体
結合ポリスチレンボール１球、実施例３(1)で製
造したヨウ素標識抗hCG溶液100μを加えて
室温で２時間反応させた。反応終了後、0.1M
NaClを含む0.05Mリン酸緩衝液で洗浄したの
ち、ポリスチレンボールを他の試験管に移し放
射活性をウエルカウンターで測定し、それぞれ
の標準曲線を得た。第２図と同様の関係が認め
られた。hCGおよびhCG−βのみ特異的に反応
しhCG−α、hLH、hFSH、hTSHとは全く交
差反応を示さなかつた。 実施例 ４ (1) 抗hCG−α抗体結合固相の調製 hCG−α〔ベーリンガマンハイム（西ドイツ）
製〕100μｇを実施例１(1)の方法でウサギに免
疫し、産生した抗hCG−α血清を硫酸アンモニ
ウム塩析し、蒸留水に対して透析後、200μｇ
のhCG−β〔ベーリンガマンハイム（西ドイツ）
製〕を結合させたセフアロース4Bカラムを用
いるアフイニテイークロマトグラフイーで素通
りする画分を得た〔抗hCG−αの抗体
（F9CS）〕。 抗hCG−α（F9CS）２mgを0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.0）２mlに溶解し実施例１(3)の方法で
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG−α抗体
複合体を得た。 (2) 測定 ５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、１ｍＭ
MgCl2、0.1M NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液
400μにhCG、hCG−α、hCG−β、hLH、
hFSH、hTSHの標準溶液100μを加え、実施
例１(2)で製造した抗hCG−βC末端ペプチド
（123−145）抗体結合ポリスチレンボール１球、
実施例４(1)で製造したβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ標識抗hCG−α抗体溶液100μを加えて室
温で２時間反応させた。反応終了後ポリスチレ
ンボールを0.1M NaCl、１ｍＭ MgCl2を含
む0.05Mリン酸緩衝液で洗浄したのち、酵素反
応を行ない螢光強度を測定した。それぞれの標
準曲線を第３図に示した。 第３図中、●はhCGの、×はhCG−βの、□
はhCG−αの、〇はhLHの、△はhFSHの、〓
はhTSHの標準曲線をそれぞれ表わす。 このように本発明の測定方法は、hCGにのみ
特異的に反応しhCG−α、hCG−β、hLH、
hFSH、hTSHとは全く交差反応を示さなかつ
た。 実施例 ５ (1) 西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗hCGの抗
体複合体の調製 仲根らの方法〔“Journal of
Histochemistry and Cytochemistry”、第22
巻（1974年）、第1084頁〕に従つて行なつた。
７mgの西洋わさびパーオキシダーゼを１mlの
0.3M重炭酸ナトリウム溶液（PH8.1）にとか
し、0.1mlの１％１−フルオロ２，４−ジニト
ロベンゼンを加えて室温で１時間反応させた。
次に0.06M NaIO41mlを加えて室温で30分間撹
拌したのち、0.16Mエチレングリコール水溶液
１mlを加えて室温で１時間放置した。0.01M炭
酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）に対して１夜透
析したのち、参考例５で得られた特異hCG抗体
1.8mgの0.01M炭酸緩衝液（PH9.5）１mlを加え
て室温で３時間反応させてから５mgのNaHB4
を加えて４℃で１夜反応させた。0.15M NaCl
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.1）に対して
４℃で１夜透析した後、セフアデツクスＧ−
200のカラムクロマトグラフイーで分画し西洋
わさびパーオキシダーゼ標識抗hCG複合体を得
た。 (2) 抗体結合固相の調製 ポリスチレンボール（直径6.4mm、Precision
Plastics Ball Co.、Cicago、U.S.A.）300個に
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.7）50mlを加え56℃
に加温した。次に実施例１(3)で調製した
T7CS2.5mgを加えて56℃で２時間インキユベー
トした。 0.1％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で洗浄したのち、用時まで冷所保存した。 (3) 測定 ３％正常ウサギ血清を含む0.1Mリン酸緩衝
液にhCG、hCG−α、hCG−β、hLH、
hFSH、hTSHの標準液100μを加え、実施例
５(2)で製造した抗hCG抗体結合ポリスチレンボ
ール１球を加えて室温で１時間反応させた。次
にポリスチレンボールを0.1Mリン酸緩衝液で
洗浄後、実施例５(1)で製造した西洋わさびパー
オキシダーゼ標識特異抗hCG抗体溶液100μ
を加えて室温で２時間反応させた。反応終了
後、ポリスチレンボールをリン酸緩衝液で洗浄
し、これに４−アミノアンチピリン244mg／ｄ
、フエノール800mg／ｄと30％過酸化水素
水30μ／ｄとを含む基質溶液（PH7.0のリン
酸緩衝液で溶解）２mlを加えて室温で1.5時間
反応させたのち、20％NaN3液25μを添加し
て反応を停止させ、507nｍにおける吸光強度
を測定し、それぞれの標準曲線を得た。第２図
と同様の関係が認められhCGおよびhCG−βの
みに特異的に反応し、hCG−α、hLH、
hFSH、hTSHには全く交差反応を示さなかつ
た。 参考例 ６ hCGの免疫化学的測定用キツトおよびhCGの測
定 下記のhCG免疫化学的測定用キツトを用い、下
記の操作法に従つて正常人および妊娠の尿もしく
は血清中のhCG濃度を測定した。結果は第２表に
示される。 hCGの免疫化学的測定キツト (1) 実施例１で得られる１個あたり6.7μｇの抗
hCG−βC末端フラグメントペプチド抗体で感
作した直径6.4mmのポリスチレンボール。 (2) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗hCG抗体複
合体の約400μUの酵素活性を有する部分。 (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる、５％正常ウサギ血清、0.1％NaN3、１ｍ
Ｍ MgCl2を含むPH7.4の0.1Mリン酸緩衝液。 (5) 20μｇ４−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ
−ガラクトシド。 (6) (5)の酵素基質の溶解に用いる、0.1％牛血清
アルブミン、0.1％NaN3、１ｍＭ MgCl2を含
むPH7.0の0.02Mリン酸緩衝液。 (7) (1)のポリスチレンボールの洗浄に用いる
0.1M NaCl、１ｍＭ MgCl2を含むPH7.0の
0.05Mリン酸緩衝液。 (8) PH10.5の0.1M炭酸緩衝液。 操作法 標準hCGもしくは被検試料100μに試薬(4)
400μ、試薬(1)１個、試薬(2)100μとを添加し、
室温で反応させる。２時間反応後、試薬(7)でポリ
スチレンボールを洗浄し、次いで試薬(5)400μ
を加えて酵素反応を開始する。37℃で２時間反応
させたのち、試薬(8)2.5mlを添加して反応を停止
させる。反応液中の螢光強度を測定し、検液中の
hCG濃度を決定する。 上記方法により、正常人および妊婦の尿もしく
は血清中のhCG濃度を測定した。結果は第２表に
示されている。
第１図は参考例５で得られたhCGに特異的に反
応する抗体の紫外吸収スペクトルを、第２図は実
施例２で得られた標準曲線を、第３図は実施例４
で得られた標準曲線をそれぞれ表わす。
応する抗体の紫外吸収スペクトルを、第２図は実
施例２で得られた標準曲線を、第３図は実施例４
で得られた標準曲線をそれぞれ表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 担体上に保持された抗体、抗原および標識剤
を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定方法に
おいて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合
させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない
２種の抗体であり、該抗体のうち一方が 一般式 Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−Leu−P
ro−Gln−OH ［式中、Ｒは で示されるペプチドの14位のGlyを含む１ないし
14個の部分ペプチド鎖を表わす。］で表わされる
ペプチドとキヤリア用タンパクとをグルタルアル
デヒドの存在下に縮合せしめた縮合生成物を人以
外の温血動物に接種して形成せしめ、これを採取
することにより得られた人絨毛性ゴナドトロピン
に特異的に反応する抗体であることを特徴とする
人絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定方法。 ２ 担体上に保持された抗体と標識剤を結合させ
た抗体とを抗原に同時に反応させる特許請求の範
囲第１項記載の人絨毛性ゴナドトロピンの免疫化
学的測定方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14468980A JPS5767858A (en) | 1980-10-15 | 1980-10-15 | Immunochemical measurement method for human chorionic gonadotropin and production of antibody |
| DE8181108272T DE3174064D1 (en) | 1980-10-15 | 1981-10-13 | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| EP81108272A EP0049898B2 (en) | 1980-10-15 | 1981-10-13 | Method for immunochemical assay and kit therefor |
| CA000387873A CA1181342A (en) | 1980-10-15 | 1981-10-14 | Method for enzyme immunoassay and production of antibody |
| US06/311,327 US4496658A (en) | 1980-10-15 | 1981-10-14 | Method for enzyme immunoassay and production of antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14468980A JPS5767858A (en) | 1980-10-15 | 1980-10-15 | Immunochemical measurement method for human chorionic gonadotropin and production of antibody |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5767858A JPS5767858A (en) | 1982-04-24 |
| JPH0136065B2 true JPH0136065B2 (ja) | 1989-07-28 |
Family
ID=15367964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14468980A Granted JPS5767858A (en) | 1980-10-15 | 1980-10-15 | Immunochemical measurement method for human chorionic gonadotropin and production of antibody |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5767858A (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4666865A (en) * | 1984-01-13 | 1987-05-19 | Centocor, Inc. | Immunoassay for biologically active human interferon-gamma employing unique monoclonal antibodies |
| JPS6117065A (ja) * | 1984-07-04 | 1986-01-25 | Mitsui Toatsu Chem Inc | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの測定試薬 |
| DE3706718A1 (de) * | 1987-03-02 | 1988-09-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vorrichtung zur durchfuehrung einer heterogenen reaktion |
| JPH05232109A (ja) * | 1990-10-04 | 1993-09-07 | Teijin Ltd | ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法 |
| EP0529719A1 (en) * | 1991-08-26 | 1993-03-03 | Merck & Co. Inc. | Assay for evaluating inhibition of PMN elastase by N-Substituted Azetidinones |
| KR100403871B1 (ko) | 2000-08-12 | 2003-11-01 | 휴마시스 주식회사 | 정상 임신과 자궁외 임신을 진단하는 장치 및 이의제조방법 |
| CN117186205A (zh) * | 2022-05-18 | 2023-12-08 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺激素的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH642458A5 (en) * | 1980-04-25 | 1984-04-13 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
-
1980
- 1980-10-15 JP JP14468980A patent/JPS5767858A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5767858A (en) | 1982-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4496658A (en) | Method for enzyme immunoassay and production of antibody | |
| US4517290A (en) | Method for enzyme immunoassay and peptide-enzyme conjugate and antibody therefor | |
| EP0111216A2 (en) | Method for enzyme immunoassay and peptide-enzyme conjugate, its lyophilizate, antibody and kit therefor | |
| JPH0131141B2 (ja) | ||
| JPS63109796A (ja) | 高純度プロコラ−ゲン・ペプチド（３型）の製法 | |
| EP0421392B1 (en) | Anti-hCG-beta core monoclonal antibody, its production and use | |
| JPH0136065B2 (ja) | ||
| US5451527A (en) | HCG peptides for use in antibody purification procedures | |
| EP0109078B1 (en) | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor | |
| WO1997011371A1 (en) | Detection and quantitation of 8-oh-adenine using monoclonal antibodies | |
| JPS6341424B2 (ja) | ||
| JPS6311626B2 (ja) | ||
| JPS6362698B2 (ja) | ||
| EP0158291A2 (en) | A method for purifying carcinoembryonic antigen and a method for producing a carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody | |
| JPH0218836B2 (ja) | ||
| JP2873586B2 (ja) | 抗体およびこれを用いる免疫化学的測定方法 | |
| JPH048748B2 (ja) | ||
| Deftos | Two-site immunoradiometric assay of intact salmon calcitonin | |
| EP0088368A2 (en) | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor | |
| JPH032262B2 (ja) | ||
| JP2507982B2 (ja) | ヒト癌胎児性抗原反応性モノクロ―ナル抗体の製造法 | |
| CA1218300A (en) | Immunochemical assay of human chorionic gonadotropin and reagent therefor | |
| JPS58151558A (ja) | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬 | |
| JP3152429B2 (ja) | 抗ｈＣＧ―βコアモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、該モノクローナル抗体およびその用途 | |
| JPH083490B2 (ja) | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |