JPH0218836B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、安定なβ―Ｄ―ガラクトシダーゼ
（以下、「β―Gal.」と略称することもある。）含
有凍結乾燥物の製造法に関するものである。 β―Gal.は乳糖をガラクトースとグルコースと
に加水分解する酵素であるが、また最近では診断
試薬、特に酵素免疫測定法（以下、「EIA」と略
称することもある。）における標識用酵素として
その重要性が増加してきた。 しかしながらβ―Gal.は溶液状態においては単
独（遊離状態）の場合にも、また他の成分（例え
ば免疫活性物質）と結合している場合にも不安定
で、特に実際に使用する1μg／ml以下の低濃度の
場合には極端に不安定で、従つて測定用試薬の品
質が維持され難く安定した結果が得られない。更
にβ―Gal.の酵素活性は、凍結乾燥した場合で
も、著しく低下することもよく知られている。 本発明者らは、かかる欠点に鑑み、β―Gal.を
安定化させる方法を得る目的で鋭意研究したとこ
ろ、β―Gal.と糖または糖アルコールとを含有す
る水性組成物の凍結乾燥物が所期の目的を達成す
ることを見い出し、これに基づいてさらに研究し
た結果、本発明を完成した。 本発明は、β―Ｄ―ガラクトシダーゼまたはこ
れと免疫活性物質との結合体および糖または糖ア
ルコールを含有する水性組成物中、β―Ｄ―ガラ
クトシダーゼまたはβ―Ｄ―ガラクトシダーゼと
して１ml当たり100pg〜10μgを、糖または糖アル
コールを0.2〜5w／ｖ％の濃度で含有してなる該
水性組成物を凍結乾燥に付すことを特徴とする標
識用凍結乾燥物の製造法である。 本発明において用いられるβ―Ｄ―ガラクトシ
ダーゼは、いずれの由来のものでもよいが、入手
し易くかつ０―ニトロフエニル―β―Ｄ―ガラク
トピラノシドや４―メチルウンベリフエリル―β
―Ｄ―ガラクトピラノシドのような合成基質に対
して高い比活性を有する大腸菌由来のβ―Gal.が
好ましく用いられる。 β―Gal.は単独でもよいが、免疫活性物質と結
合した結合状態のものであつてもよい。該免疫活
性物質としては、抗原、抗体および薬物等のハプ
テンがあげられる。抗原としては、ホルモン〔膵
グルカゴン（以下、「PG」と略称する。）、そのフ
ラグメントペプチド、インシユリン、そのフラグ
メントペプチド、副甲状腺ホルモン、カルシトニ
ン、副腎皮質ホルモン、成長ホルモンヒト絨毛性
ゴナドトロビン（以下、「hCG」と略称する。）、
そのフラグメントペプチド、黄体ホルモン、甲状
腺刺激ホルモン等〕、タンパク質〔IgG、IgA、
IgM、IgE、α―フエトプロテイン、CEA等〕お
よびウイルス抗原（風疹ウイルスHA抗原、セン
ダイウイルスHA抗原等）などが挙げられる。抗
体としては、従来既知の方法でウサギ、ラツト、
モルモツト、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物やニワト
リ、アヒル、鵞鳥等の鳥類に抗原や次に述べるハ
プテン等を免疫して得られた抗体（抗PG抗体、
抗hCG抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgE抗
体等）が挙げられる。ハプテンとしては、ステロ
イド、ビタミン、カテコールアミン等の他に抗生
物質を始めとする薬物（ペニシリン、セフアロス
ポリン、β―アドレナリン作働薬等）等が挙げら
れる。 上記hCGのブラグメントペプチドとしては一般
式 Ｈ―R₁―Pro―Ser―Asp―Thr―Pro―Ile―
Leu―Pro―Gln―OH 〔式中、R₁は で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされるペプ
チドが挙げられる。 上記PGのフラグメントペプチドとしては一般
式 Ｈ―R₂―Phe―Val―Gln―Trp―Leu―R₃―
Asn―Thr―OH 〔式中、R₂は で示されるペプチドの10位のAspを含む１〜10個
の部分ペプチド鎖を、R₃はMetまたはNleを、そ
れぞれ表わす。〕で表わされるペプチドが挙げれ
ら、上記インシユリンのフラグメントペプチドと
しては一般式 Ｈ―R₄―Gly―Phe―Phe―R₅―OH 〔式中、R₄は

【式】で示される３位 のArgを含む１〜３個の部分ペプチド鎖を、R₅は

【式】で示されるペプ チドの１位のTyrを含む１〜５個の部分ペプチド
鎖を、それぞれ表わす。〕で表わされるペプチド
が挙げられる。 上記hCGのフラグメントペプチドにおけるR₁
で示される のペプチドの14位のGlyを含む１ないし14個の部
分ペプチド鎖としては、たとえばGly、Pro―
Gly、Leu―Pro―Gly、Arg―Leu―Pro―Gly、
Ser―Arg―Leu―Pro―Gly、Pro―Ser―Arg―
Leu―Pro―Gly、Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―
Pro―Gly、Pro―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―
Pro―Gly、Leu―Pro―ser―Pro―Ser―Arg―
Leu―Pro―Gly、Ser―Leu―Pro―Ser―Pro―
Ser―Arg―Leu―Pro―Gly、Pro―Ser―Leu―
Pro―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―Gly、
Pro―Pro―Ser―Leu―Pro―Ser―Pro―Ser―
Arg―Leu―Pro―Gly、Pro―Pro―Pro―Ser―
Leu―Pro―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―
Gly、Ala―Pro―Pro―Pro―Ser―Leu―Pro―
Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―Glyなどが挙
げられる。 上記PGのフラグメントペプチドにおけるR₂で
示される のペプチドの10位のAspを含む１〜10個の部分ペ
プチド鎖としては、たとえばAsp、Gln―Asp、
Ala―Gln―Asp、Arg―Ala―Gln―Asp、Arg―
Arg―Ala―Gln―Asp、Ser―Arg―Arg―Ala―
Gln―Asp、Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―
Asp、Leu―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala―Gln―
Asp、Tyr―Leu―Asp―Ser―Arg―Arg―Ala
―Gln―Asp、β―Ala―Tyr―Leu―Asp―Ser
―Arg―Arg―Ala―Gln―Aspなどが挙げられ
る。 上記インシユリンのフラグメントペプチドにお
けるR₄で示される

【式】のペプチド の３位のArgを含む１ないし３個の部分ペプチド
鎖としては、たとえばArg、Glu―Arg、Gly―
Glu―Argなどが挙げられる。またR₅で示される

【式】のペプチドの１ 位のTyrを含む１ないし５個の部分ペプチド鎖と
しては、たとえばTyr、Tyr―Thr、Tyr―Thr
―Pro、Tyr―Thr―Pro―Lys、Tyr―Thr―Pro
―Lys―Thrなどが挙げられる。 上記した種々のペプチドは、ペプチド合成の公
知の常套手段で製造しうる。固相合成法、液相合
成法のいずれによつてもよいが、液相合成法が有
利な場合が多い。そのようなペプチド合成の手段
としては、たとえば“The Peptides”、第１巻
（1966）、Schro¨der and Lubke著、Academic
Press、New York、U.S.A.あるいは“ペプチド
合成”、泉屋ら著、丸善株式会社（1975年）に記
載された方法、たとえばアジド法、クロライド
法、酸無水物法、混合無水物法、DCC法、活性
エステル法、ウツドワード試薬Ｋを用いる方法、
カルボジイミダゾール法、酸化還元法、DCC／
アデイテイブ（例、HONB、HOBt、HOSu）法
などがあげられる。 β―Gal.と免疫活性物質との結合の形態として
は、共有結合があげられる。結合方法としては、
種々の公知の方法に従えばよく、たとえばクリニ
カ・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）
第81巻第１項（1977年）に記載された方法すなわ
ちｍ―マレイミドベンゾイル―Ｎ―ハイドロキ
シ・スクシンイミドを使用して、β―Gal.のスル
フヒドリル基と免疫活性物質のアミノ基とを架橋
結合させる方法、０，0′―フエニレン・ジマレイ
ミドを使用して、β―Gal.のスルフヒドリル基と
免疫活性物質のスルフヒドリル基を架橋結合させ
る方法、グルタルアルデヒドを使用してβ―Gal.
のアミノ基と免疫活性物質のアミノ基を架橋結合
させる方法、カルボジイミドを用いてβ―Gal.の
アミノ基もしくはカルボキシル基と免疫活性物質
のカルボキシル基もしくはアミノ基とをペプチド
結合させる方法等が挙げられる。 本発明における糖としては、たとえば単糖類と
して５炭糖のアラビノース、キシロース、リボー
スなどが、６炭糖のグルコース、フラクトース、
マンノース、ガラクトース、ラムノースなどが２
糖類としてマルトース、セロビオース、トレハロ
ース、ゲンチオビオース、乳糖、シヨ糖などが、
３糖類としてラフイノース、マルトトリオースな
どが挙げられる。糖アルコールとしては、炭素数
５の単糖アルコールとしてキシリトールなどが、
炭素数６の単糖アルコールとしてソルビトール、
マンニトール、イノシトールなどが挙げられる。
なかでも、アラビノース、マンニトール、イノシ
トール、シヨ糖、ラフイノースが好ましく、特に
シヨ糖が最も好ましく用いられる。また、糖また
は糖アルコールは、これらの混合物を使用しても
よい。 更に本発明におけるβ―Gal.含有水性組成物に
は、糖または糖アルコールの他にアルブミンを含
有させてもよく、さらにアルブミンとマグネシウ
ムおよび／またはカルシウムイオン生成物質を含
有させてもよい。これにより凍結乾燥の操作中に
生ずる酵素活性の低下と、また免疫活性物質との
結合体の場合には免疫活性の低下を防ぎ、凍結乾
燥後の形状を良くすることができる。上記アルブ
ミンとしてはたとえばヒト血清アルブミン、ウマ
血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒツジ血
清アルブミン等の血清アルブミンなどが挙げら
れ、好ましくはウシ血清アルブミンが用いられ
る。マグネシウムおよび／またはカルシウムイオ
ン生成物質としては、マグネシウムおよび／また
はカルシウムイオンを生じうる化合物ならどのよ
うなものでもよいが、通常マグネシウム塩およ
び／またはカルシウム塩があげられ、好ましくは
塩化マグネシウム、塩化カルシウムが挙げられ
る。 本発明の組成物において、β―Gal.の含有量
は、１通常、該水性組成物中１ml当り100pg〜
10μg（もしくは３マイクロ単位〜0.3ミリ単位）で
ある。また糖類の含有量は、通常、該水性物中の
濃度が0.2〜5W／Ｖ％である。アルブミンの含有
量は、通常、該水性組成物中の濃度が0.01〜
5W／Ｖ％、好ましくは0.1〜1W／Ｖ％である。
マグネシウムもしくは／ならびにカルシウムイオ
ン生成物質は、該水性組成物中のイオン濃度が
0.0001〜0.1M／、好ましくは0.0001〜
0.001M／である。 水成組成物を調製する場合、各物質の添加順序
は特に限定されない。 該水性組成物の凍結乾燥物は常法、例えば約−
30℃ないし約−50℃で該水性組成物を凍結させ、
ついで約10℃ないし約20℃の温度で減圧下で氷を
昇華させる方法で作られる。凍結乾燥後、窒素ガ
スシール又は減圧密栓することは、カビ・細菌等
の混入による腐敗、劣化を防止するためにより好
ましいことである。窒素ガスシールは、通常、凍
結乾燥物を十分に窒素ガスで置換した後、窒素ガ
ス気流下で密栓することにより行われる。また減
圧密栓は、通常、凍結乾燥物を減圧下（例えば10
〜0.01mmHg）で密栓することにより行なわれる。 このようにして得られたβ―Gal.および糖また
は糖アルコールを含有する水性組成物の凍結乾燥
物は、β―Gal.の酵素活性がほとんど失なわれて
いないので、試薬として有用である。 またこのようにして得られたβ―Gal.と免疫活
性物質との結合体および糖または糖アルコールを
含有する水性組成物の凍結乾燥物は、診断試薬と
して有用であり、特にβ―Gal.が比較的安価で高
い比活性を有していることからEIA用の測定試薬
として有用である。かかるEIAでは、酵素と結合
した抗原を一定量の抗体と共に定量すべき検液中
の抗原に加え、競争的に結合させ、抗体に結合も
しくは非結合の酵素活性を測定する競争結合法、
あるいは固相上の抗体もしくは抗原に検液中の抗
原もしくは抗体を反応させ、固相に結合した酵素
活性を測定するサンドイツチ法が用いられ、また
種々の変法が使用される〔クリニカ・キミカ・ア
クタ（Clinica Chimica Acta）第81巻第１項
（1977年）〕。 上記競争結合法による酵素免疫測定法として
は、(1)未知量の抗原を含有する被検試料に抗原―
酵素結合体の一定量および不溶性の形をした抗体
の一定量を加え、液相中の抗原―酵素結合体また
は固相中の反応した抗原―酵素結合体について酵
素活性を測定することによつて検液中の抗原を定
量する方法〔フエブス・レターズ（FEBS
Letters）15巻232頁（1971年）参照〕、(2)抗原含
有検液に抗原―酵素結合体の一定量および溶解性
の抗体の一定量を加え、競争的に結合させたの
ち、最初の抗体に対する不溶性の第２抗体〔たと
えば、ウサギを用いて抗体を調製した時は抗ウサ
ギイムノグロプリンＧ（IgG）抗体〕の一定量を
加え、上記(1)と同様に液相または固相中の酸素活
性を測定し検液中の抗原を定量する方法〈上記フ
エブス・レターズ参照〉、および(3)上記(2)と同様
に抗原含有検液に抗原―酵素結合体の一定量およ
び溶解性の抗体の一定量を加え、競争的に結合さ
せたのち、第２抗体と第２抗体が抗動物IgG抗体
の時は正常動物血清との一定量を加えて沈澱を生
ぜしめ、(1)と同様に液相または固相中の酸素活性
を測定し、検液中の抗原を定量する方法〔クリニ
カ・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）
第67巻283頁（1976年）〕に適用できる。いずれの
方法においても、液相中の酵素活性を測定する場
合は検液中に存在する夾雑物により酵素活性の測
定が妨害されることがあるので、固相の活性を測
定するのが有利である。また再現性および感度の
点からは、微量の抗体の使用で測定の可能な「二
重抗体法」、即ち(2)および(3)の方法がより好まし
く用いられる。 たとえば、hCGの測定にあたり、次の試薬から
なるhCGの酵素免疫測定用キツトを用いるのが好
ましい。 不溶化した第２抗体を使用する定量法のための
試験用セツトは、主として (1) 抗hCG抗体の、反応系に加えたペプチド―β
―Gal.の一定量を結合する（好ましくは、約５
〜100％を結合する）部分、 (2) ペプチド―β―Gal.（本発明の凍結乾燥物）
の一定量（好ましくは、約0.1〜500μUの酵素
活性を有する部分）、 (3) ０〜500IU標準hCG、 (4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（好ましくはPH６〜９のリン酸緩衝
液）、 (5) 不溶性の形をした一定量（上記(1)の第１抗体
のすべてを結合し得る量）の抗動物IgG結合担
体（担体としてはたとえば、セルロース、セフ
デツクス、セフアロース、ポリスチレン球、シ
リコン片、ガラス球などが挙げられる）、 (6) 一定量（好ましくは、１〜100μg）の酵素基
質、 (7) (5)の第２抗体結合担体の洗浄および(6)の酵素
基質の溶解に用いる緩衝液（好ましくはリン酸
緩衝液または炭酸緩衝液）、 (8) 酵素反応の停止に用いる緩衝液（好ましくは
炭酸緩衝液または希カセイソーダ水溶液）。 また、上記のキツトは、たとえば下記の方法に
より使用するのが好ましい。 試薬(1)10〜300μlに試薬(4)100〜500μlと標準
hCGもしくは被検試料５〜100μlとを添加し、次
いで試薬(2)10〜300μlを加えたのち、０〜40℃で
反応させる。１〜72時間反応後、一定量の試薬(5)
を加え十分撹拌し、更に０〜40℃で0.5〜24時間
反応させる。反応終了後、試薬(7)で第２抗体結合
担体を洗浄し、次いで試薬(6)10〜1000μlを加えて
酵素反応を開始する。20〜40℃で0.5〜24時間反
応させたのち、試薬(8)１〜５mlを添加して反応を
停止させる。反応液中の吸光度もしくは螢光強度
を測定し、検液中のhCG濃度を決定する。 上記サンドイツチ法による免疫化学的測定法と
しては、未知量の抗原を含む被検液に担体上に保
持された過剰量の抗体を加えて反応させ（第１反
応）、次に標識剤で標識した過剰量の抗体の一定
量を加えて反応させる（第２反応）。担体上に保
持された標識剤もしくは担体上に保持されなかつ
た標識剤の活性を測定する。第１反応、第２反応
は同時に行なつてもよいし時間をずらして行なつ
てもよい。 一般にサンドイツチ法を用いる免疫化学的測定
法において、第１反応および第２反応で用いられ
ている抗体は、同一の抗血清から調製されてい
る。しかしながら、抗原を特異的に測定するサン
ドイツチ法による本発明の免疫化学的測定方法に
おいて、抗原に類似した化学構造を有する蛋白ホ
ルモンとの交差反応による測定誤差を無くすため
には、第一反応で用いる抗体と第二反応で用いる
抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない２種の
抗体であり、該抗体のうち一方は抗原に特異的に
反応する抗体が用いられる。 たとえば、上記サンドイツチ法によるhCGの免
疫化学的測定法に用いられる定量用キツトとして
は、主として (1) 担体上に保持された抗体 (2) β―Gal.により標識化された抗体（本発明の
凍結乾燥物） (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(1)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝剤であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH６〜９のリン酸緩
衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。） (5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝剤であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) 酵素基質（好ましくは４―メチルウンベリフ
エリル―β―Ｄ―ガラクトシドまたはオルトニ
トロフエニル―β―Ｄ―ガラクトシド）、酵素
基質の溶解に用いる緩衝液（好ましくはリン酸
緩衝液）および酵素反応停止に用いる緩衝液
（好ましくは炭酸緩衝液またはグリシン緩衝液）
が挙げられる。 また、上記(1)と(2)とは、あらかじめ混合してあ
るものでもよい。 上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。 標準hCGもしくは被検液約10〜200μlに試薬(4)
を加えて希釈し、一定量の試薬(1)、次いで試薬(2)
を約10〜300μlを加えたのち、約０〜40℃で反応
させる。約１〜24時間反応後、試薬(5)で洗浄し担
体上に結合している標識剤の活性を測定する。基
質液約10〜1000μlを加えて約20〜40℃で約0.5〜
24時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反
応液中の吸光度を測定する。 以下に、実施例、参考例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制
限するものでないことはいうまでもない。 以下の参考例において薄層クロマトグラフイー
は、特に記載のない場合、メルク社製シリカゲル
プレート60F₂₅₄を用い、下記の展開溶媒を用い
る。 Rf¹：クロロホルム：メタノール＝95：５ Rf²：クロロホルム：メタノール：酢酸＝ ９：１：0.5 Rf³：酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水＝ 60：20：６：10 Rf⁴：ｎ―ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝ 30：20：６：24 Rf⁵：酢酸エチル：ｎ―ブタノール：酢酸：水
＝ １：１：１：１ Rf⁶：ｎ―ブタノール：酢酸：水＝ 12：３：５ 本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC―IUB Commission on
Biological Nomencltureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Ala：アラニン Pro：プロリン Ser：セリン Leu：ロイシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ile：イソロイシン Gln：グルタミン Glu：グルタミン酸 Ｚ：ベンジルオキシカルボニル OBu^t：ｔ―ブチルエステル HONB：Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボルネン
―２，３―ジカルボキシイミド ONB：Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボルネン―
２，３―ジカルボキシイミド・エステル DMF：Ｎ，N′―ジメチルホルムアミド DCC：Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド DMSO：ジメチルスルホキシド THF：テトラヒドロフラン HOBt：１―ヒドロキシ―ベンゾトリアゾール OSu：Ｎ―ヒドロキシスクシンイミドエステル ECDI：１―エチル―３―（３―ジメチルアミ
ノプロピル）―カルボジイミド CMCT：１―シクロヘキシル―３―（２―モ
ルホリノエチル）―カルボジイミド・メト―
パラ―トルエンスルホネート GLA：グルタルアルデヒド ｍ―MBHS：メタ―マレイミドベンゾイル―
Ｎ―ハイドロキシスクシンイミドエステル ｐ―MCHS：パラ―マレイミドメチルシクロ
ヘキサン―１―カルボキシル―Ｎ―ハイドロ
キシスクシンイミドエステル 参考例 １ hCG―βC末端フラグメントペプチド（123―
145）の製造： (a) Ｚ―Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ―Gln―
OBu^t12.5ｇをメタノール500mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒として接触還元する。解媒をろ
去し、溶媒を留去したのち、残留物を酢酸エチ
ル300mlに溶解する。これにＺ―Pro―OH9.7
ｇとHONB8.4ｇ、DCC8.8ｇより合成したＺ―
Pro―ONBの酢酸エチル溶液200mlを加え５時
間かきまぜる。反応液を0.2N―塩酸、４％―
炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥する。酢酸エチルを留去し、残
留物に石油ベンジンと少量のエーテルを加え結
晶とし、さらに同じ溶媒系で再結晶する。 収量13.1ｇ（81.5％）、融点86―88℃、〔α〕²⁶ _D
―64.8゜（ｃ＝0.5、メタノール）、Rf¹0.42、
Rf²0.73。 元素分析 C₂₂H₃₁C₆N₃：計算値Ｃ 60.95；
Ｈ 7.21；Ｎ 9.69、分析値：Ｃ 61.04；Ｈ
7.20；Ｎ 9.49。 (b) Ｚ―Leu―Pro―Gln―OBu^tの構造：Ｚ―
Pro―Gln―OBu^t13ｇをメタノール500mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒とし、水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物を酢酸エチル300mlに溶解し、Ｚ―Leu―
OH7.9ｇ、HONB6.5ｇ、DCC6.8ｇとから合成
したＺ―Leu―ONBの酢酸エチル溶液を加え、
５時間かきまぜる。反応液を0.2N―塩酸、４
％―炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去する。残留
物に石油ベンジンを加え粉末としてろ取する。 収量 10.6ｇ（66.2％）、融点74―77℃、
〔α〕²³ _D−81.4゜（ｃ＝0.6、メタノール）、Rf¹0.38
、
Rf²0.66。 元素分析 C₂₈H₄₂O₇N₄：計算値：Ｃ
61.52；Ｈ 7.74；Ｎ 10.25.分析値：Ｃ
61.61；Ｈ 7.94；Ｎ 9.92。 (c) Ｚ―Ile―Leu―Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ
―Leu―Pro―Gln―OBu^t10.6ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として接
触還元したのちメタノールを留去し、残留物を
酢酸エチル300mlに溶解する。これにＺ―Ile―
OH5.1ｇ、HONB4.2ｇ、DCC4.4ｇから合成し
たＺ―Ile―ONBの酢酸エチル―ジオキサン混
合溶液（１：１）200mlを加え16時間かきまぜ
る。反応液より溶媒を留去し、残留物を酢酸エ
チル400mlに溶解し、0.2N―塩酸、４％―炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。溶媒を留去し、残留物に石油
ベンジンを加え粉末としてろ取する。 収量 12.1ｇ（94.5％）、融点78―80℃（分
解）、〔α〕²³ _D―87.0゜（ｃ＝0.42、メタノール）、
Rf¹0.23、Rf²0.67。 元素分析 C₃₄H₅₃O₈N₅計算値：Ｃ 61.89；
Ｈ 8.10；Ｎ 10.62.分析値：Ｃ 62.35；Ｈ
8.31；Ｎ 10.16。 (d) Ｚ―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―OBu^tの製
造：Ｚ―Ile―Leu―Pro―Gln―OBu^t12ｇをメ
タノール500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒
とし、水素気流中で還元したのち、触媒をろ
去、溶媒を留去する。残留物をDMF100mlに溶
解し、さらにＺ―Pro―OH4.7ｇ、HOBt3.0ｇ
を加え、０℃に冷却し、DCC4.3ｇを加え０℃
で４時間、室温で10時間かきまぜる。析出物を
ろ去し、溶媒を留去したのち、残留物を酢酸エ
チル400mlに溶解し、0.2N―塩酸、４％―炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥する。溶媒を留去し、残留物にエー
テルを加えて加温し、上清をのぞいたのち、さ
らにエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量 12.6ｇ（91.5％）、融点83―87℃（分
解）、〔α〕²³ _D―121.0゜（ｃ＝0.5、メタノール）、
Rf¹0.31、Rf²0.84。 元素分析 C₃₉H₆₀O₉N₆計算値：Ｃ 61.88；
Ｈ 7.99；Ｎ 11.10.分析値：Ｃ 62.04；Ｈ
8.21；Ｎ 10.70。 (e) Ｚ―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―
OBu^tの製造：Ｚ―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln
―OBu^t12.5ｇをメタノール500mlに溶解しパラ
ジウム黒を触媒として、水素気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留
物をDMF100mlに溶解する。この溶液に、Ｚ―
Thr―OH4.2ｇ、HOBt2.7ｇを加えて溶解し、
０℃に冷却する。次にDCC3.7ｇを加え０℃で
４時間、室温で８時間かきまぜたのち、析出物
をろ去する。溶媒を留去し残留物を酢酸エチル
400mlに抽出し、0.2N―塩酸、４％―炭酸水素
ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリウム
で乾燥する。溶媒を留去し、残留物にエーテル
を加え粉末としてろ取する。 収量 11.8ｇ（86.8％）、融点101―105℃、
〔α〕²³ _D―124.3゜（ｃ＝0.58、メタノール）．
Rf¹0.20、Rf²0.68。 元素分析 C₄₃H₆₇O₁₁N₇計算値：Ｃ
60.19；Ｈ 7.87；Ｎ 11.43.分析値：Ｃ
59.54；Ｈ 7.91；Ｎ 11.19 (f) Ｚ―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―Leu―
Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ―Thr―Pro―Ile
―Leu―Pro―Gln―OBu^t11.8ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を
留去し、残留物をDMF100mlに溶解する。これ
にＺ―Asp（OBu^t）―OH4.5ｇとHOBt2.3ｇを
加え溶解し０℃に冷却する。DCC3.2ｇを加え
０℃で４時間、室温で10時間かきまぜ、析出物
をろ去し、溶媒を留去する。残留物に酢酸エチ
ル150mlを加え析出するゲル状物をろ取し、酢
酸エチルとエーテルから結晶化し、エーテルで
ろ取する。 収量 12.15ｇ（85.9％）、融点94―96℃（分
解）、〔α〕²¹ _D―109.1゜（ｃ＝0.59、メタノール）、
Rf¹0.13、Rf²0.47。 元素分析 C₅₁H₈₀O₁₄N₈・H₂O計算値：Ｃ
58.49；Ｈ 7.89；Ｎ 10.70.分析値：Ｃ
58.60；Ｈ 8.07；Ｎ 10.71。 (g) Ｚ―Ser―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―
Leu―Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ―Asp
（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―
OBu^t12ｇをメタノール500mlに溶解し、パラジ
ウム黒を触媒として、水素気流中で還元する。
触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留物を
Ｚ―Ser―OH2.93ｇ、HOBt2.0ｇとともに
DMF100mlに溶解し、０℃に冷却する。これに
DCC2.8ｇを加え０℃で４時間、室温で12時間
かきまぜ、析出物をろ去し、溶媒を留去する。
残留物を酢酸エチル500mlに溶解し、0.2N―塩
酸、４％―炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、
無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち、溶媒を留去
する。残留物に酢酸エチルとエーテルを加え粉
末としてろ取する。 収量 11.7ｇ（90.0％）、融点111―115℃
（分解）、〔α〕²¹ _D―112.3゜（ｃ＝0.63、メタノー
ル）、Rf¹0.06、Rf²0.31。 元素分析 C₅₄H₈₅O₁₆N₉H₂O計算値：Ｃ
57.17；Ｈ 7.73；Ｎ 11.11.分析値：Ｃ
57.34；Ｈ 7.77；Ｎ 11.14。 (h) Ｚ―Pro―Ser―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―
Ile―Leu―Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ―Ser
―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro―
Gln―OBu^t11.6ｇをメタノール500mlに溶解し、
パラジウム黒を触媒として水蒸気流中で還元す
る。触媒をろ去し、溶媒を留去したのち、残留
物を、Ｚ―Pro―ONB4.3ｇとともにDMF100
mlに溶解し、室温で16時間かきまぜる。溶媒を
留去し残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、
0.2N―塩酸、４％―炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥したの
ち、溶媒を留去する。残留物にエーテルを加え
粉末としてろ取する。 収量 11.1ｇ（88.1％）、融点117―120℃、
〔α〕²¹ _D―119.2゜（ｃ＝0.61、メタノール）、
Rf²0.45。 元素分析 C₅₉H₉₂O₁₇N₁₀H₂O計算値：Ｃ
57.54；Ｈ 7.69；Ｎ 11.38.分析値：Ｃ
57.44；Ｈ 7.69；Ｎ 11.38。 (i) Ｚ―Gly―Pro―Ser―Asp（OBu^t）―Thr―
Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ
―Pro―Ser―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―
Leu―Pro―Gln―OBu^t10ｇをメタノール500ml
に溶解し、パラジウム黒を触媒として、水素気
流中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を留去
する。残留物をＺ―Gly―ONB4ｇとともに
DMF80mlに溶解し室温で12時間かきまぜる。
溶媒を留去し残留物を酢酸エチル500mlに溶解
し、0.2N―塩酸、４％―炭酸水素ナトリウム
水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し溶
媒を留去する。残留物をメタノール180mlに溶
解し、抱水ヒドラジン4.5mlを加え、室温で16
時間かきまぜたのち溶媒を留去する。残留物を
酢酸エチル500mlに溶解し、水洗ののち無水硫
酸ナトリウムで乾燥し溶媒を留去する。残留物
にエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量 7.35ｇ（70.2％）、融点131―135℃
（分解）、〔α〕²² _D―119.4゜（ｃ＝0.35、メタノー
ル）、Rf²0.27。 元素分析 C₆₁H₉₅O₁₈N₁₁H₂O計算値：Ｃ
56.86；Ｈ 7.59；Ｎ 11.96.分析値：Ｃ
56.65；Ｈ 7.68；Ｎ 12.02。 (j) Ｚ―Leu―Pro―OBu^tの製造：Ｚ―Pro―
OBu^t20.2ｇをメタノール800mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元する。
触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留物を酢酸エ
チル300mlに溶解し、Ｚ―Leu―OSu26.3ｇを加
え16時間かきまぜる。反応液を0.2N―塩酸、
４％―炭酸水素ナトリウム水、水で洗い、無水
硫酸ナトリウムで乾燥し溶媒を留去して、油状
物を得る。 収量 27.6ｇ（100％）、Rf¹0.71、Rf²0.78。 (K) Ｚ―Arg（NO₂）―Leu―Pro―OBu^tの製
造：Ｚ―Leu―Pro―OBu^t13.8ｇをメタノール
500mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として、
水素気流中で還元し、触媒をろ去し、溶媒を留
去する。残留物とＺ―Arg―（NO₂）―
OH11.7ｇ、HOBt6.7ｇをDMF200mlに溶解し、
０℃に冷却する。これにDCC7.5ｇを加え０℃
で４時間室温で12時間かきまぜ析出物をろ去
し、溶媒を留去する。残留物を酢酸エチル600
mlに抽出し、0.2―塩酸、４％―炭酸水素ナト
リウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾
燥し、溶媒を留去する。残留物を放置し、折出
する結晶をエーテルでろ取したのち、メタノー
ルより再結晶する。 収量 12.4ｇ（60.6％）、融点170―172℃、
〔α〕²⁶ _D―67.8゜（ｃ＝0.48、メタノール）、
Rf³0.77。 元素分析 C₂₉H₄₅O₈N₇計算値：Ｃ 56.20；
Ｈ 7.32；Ｎ 15.82、分析値：Ｃ 55.79；Ｈ
7.16；Ｎ 15.85。 (l) Ｚ―Ser―Arg―Leu―Pro―OBu^tの製造：
Ｚ―Arg（NO₂）―Leu―Pro―OBu^t12.3ｇをメ
タノール500mlに溶解し、6N―塩酸6.6mlを加
えたのち、パラジウム黒を触媒として水素気流
中で還元し、触媒をろ去したのち溶媒を留去す
る。残留物をトリエチルアミン2.8mlとともに
DMF100mlに溶解し、析出するトリエチルアミ
ン・塩酸塩をろ去する。ろ液にＺ―Ser―
OH4.8ｇとHONB5.4ｇを加え０℃に冷却し、
DCC4.95ｇを加え０℃で４時間、室温で16時間
かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を留去した
のち、残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、食
塩飽和の水でよく洗い。無水硫酸ナトリウムで
乾燥し、溶媒を留去し、アメ状の残留物を得
る。Rf³0.53。 (m) Ｚ―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―OBu^tの
製造：Ｚ―Ser―Arg―Leu―Pro―OBu^t10.5ｇ
を6N―塩酸３mlとともにメタノール500mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をDMF100mlに溶解し、トリエチルアミン
2.52mlを加えて中和する。析出するトリエチル
アミン塩酸塩をろ去したのちＺ―Pro―
ONB8.4ｇを加え室温で16時間かきまぜ、溶媒
を留去し、残留物に酢酸エチル300mlと食塩飽
和の水300mlを加えてよくふりまぜる。静置の
のち水層に沈澱してくる油状物を集め、これに
エーテルを加え粉末とする。次にこの粉末をメ
タノールに溶解し、不溶物をろ去したのち溶媒
を留去し、再びエーテルを加えて粉末としてろ
取する。 収量 8.45ｇ（70.8％）、融点115―120℃
（分解）、〔α〕²² _D―84.7゜（ｃ＝0.53、メタノー
ル）、Rf³0.41。 元素分析 C₃₇H₅₈O₉N₈・HCl・H₂O計算
値：Ｃ 54.63；Ｈ 7.56；Ｎ 13.78；Cl
4.36。分析値：Ｃ 54.50；Ｈ 7.70；Ｎ
14.11；Cl 4.21。 (n) Ｚ―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―
OBu^tの製造：Ｚ―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro
―OBu^t3.8ｇをメタノール200mlに溶解し、パ
ラジウム黒を触媒として水素気流中で還元し、
触媒をろ去したのち溶媒を留去し、残留物を
DMF30mlに溶解する。この溶液に、Ｚ―Ser―
OH1.37ｇ、HONB1.24ｇとDCC1.30ｇとから
合成したＺ―Ser―ONBのDMF溶液（10ml）
を加え室温で16時間かきまぜる。析出物をろ去
したのち溶媒を留去し、残留物に酢酸エチル１
mlとアセトニトリル１mlを加えて溶解し、次に
エーテルを加えて沈澱とし、さらに粉末にして
ろ取する。この粉末をRf³の溶媒と酢酸エチル
を１：１で混合した溶媒２mlに溶解し、同じ溶
媒で充填したシリカゲルカラム（5.6×9.0cm）
に付し、同じ溶媒で展開する。365ml〜746mlの
区分を集め溶媒を留去し、残留物にエーテルを
加え粉末としてろ取する。 収量 2.12ｇ（50.2％）、融点130―135℃
（分解）、〔α〕²² _D―83.5゜（ｃ＝0.38、メタノー
ル）、Rf³0.34。 元素分析 C₄₀H₆₃O₁₁N₉・HCl・H₂O計算
値：Ｃ 53.35；Ｈ 7.39；Ｎ 14.00；Cl
3.94。分析値：Ｃ 53.67；Ｈ 7.45；Ｎ
13.72；Cl 3.52。 (o) Ｚ―Ser―Leu―Pro―OBu^tの製造：Ｚ―
Leu―Pro―OBu^t13.8ｇをメタノール700mlに
溶解し、パラジウム黒を触媒とし、水素気流中
で還元する。触媒をろ去し溶媒を留去し、残留
物をＺ―Ser―OH7.9ｇ、HONB8.9ｇとともに
アセトニトリル200mlに溶解し、０℃に冷却す
る。次にDCC7.5ｇを加え０℃で４時間、室温
で16時間かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を
留去し、残留物を酢酸エチル500mlに抽出し、
0.2―塩酸、４％―炭酸水素ナトリウム水、水
で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を
留去して油状物17ｇを得る。これをクロロホル
ムとメタノールの混合溶媒（200：３）15mlに
溶解し、同じ溶媒で充填したシリカゲルカラム
（5.4×20cm）に付し、同じ溶媒で展開する。
1300〜2100mlの部分を集め溶媒を留去し油状物
を得る。 収量 12.2ｇ（73.1％）、Rf¹0.38、Rf²0.69。 (p) Ｚ―Ser―Leu―Pro―Ser―Pro―Ser―Arg
―Leu―Pro―OBu^tの製造：Ｚ―Ser―Pro―
Ser―Arg―Leu―Pro―OBu^t1.0ｇをＮ―塩酸
1.2mlとともにメタノール60mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒として水素気流中で還元し、触
媒をろ去したのち溶媒を留去し、残留物を
DMF20mlに溶解する。Ｚ―Ser―Leu―Pro―
OBu^t700mgをトリフルオロ酢酸７mlに溶解し、
50分ののち溶媒を留去し、残留物にエーテルと
石油エーテル（１：２）の混合溶媒を加えて洗
い、洗液を除き、残つた油状物を真空ポンプ下
の減圧で粉末となるまでに乾燥したのち、直に
先のDMF溶液に、HONB407mlとともに加え
て溶解し、０℃に冷却する。PCC466mgをこれ
に加え、０℃で６時間、室温で16時間かきまぜ
析出物をろ去し、溶媒を留去する。残留物を
Rf³と酢酸エチル（４：１）の混合溶媒５mlに
溶解し、同じ溶媒で充填したシリカゲルカラム
（3.6×9.0cm）に付し、同じ溶媒で溶出し、333
〜572mlの区分を集め、溶媒を留去したのち残
留物にエーテルを加え粉末としてろ取する。 収量 450mg（33.8％）、融点110―120℃（分
解）、〔α〕²⁴ _D―106.6゜（ｃ＝0.31、メタノール）、
Rf⁵0.71。 (q) Ｚ―Pro―Pro―OBu^tの製造：Ｚ―Pro―
OBu^t10.1ｇをメタノール500mlに溶解し、パラ
ジウム黒を触媒とし、水素気流中で還元し、触
媒をろ去し、溶媒を留去し残留物をＺ―Pro―
OH8.47ｇ、HOBt5.4ｇとともに酢酸エチル300
mlに溶解し、０℃に冷却する。次にDCC7.5ｇ
を加え０℃で４時間、室温で12時間かきまぜ析
出物をろ去する。ろ液を0.2―塩酸、４％炭酸
水素ナトリウム水、水で洗い、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、溶媒を留去する。残留物の結晶
をエーテルでろ取する。 収量 9.85ｇ（74.1％）、融点94―96℃、
〔α〕²² _D―116.9゜（ｃ＝0.54、メタノール）、
Rf¹0.58、Rf²0.72。 元素分析 C₂₂H₃₀O₅N₂計算値：Ｃ 65.65；
Ｈ 7.51；Ｎ 6.96。分析値：Ｃ 65.42；Ｈ
７，38；Ｎ 7.20。 (r) Ｚ―Pro―Pro―Pro―OBu^tの製造：Ｚ―
Pro―Pro―OBu^t９ｇをメタノール300mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として、水素気流中
で還元し、触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をＺ―Pro―OH5.6ｇ、HOBt3.63ｇととも
に、酢酸エチル250mlに溶解し、０℃に冷却す
る。次にDCC5.1ｇを加え０℃で６時間、室温
で16時間かきまぜ、析出物をろ去する。ろ液を
0.2N―塩酸、４％―炭酸水素ナトリウム水、
水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒
を留去する。析出する結晶をエーテルでろ取す
る。 収量 9.6ｇ（85.9％）、融点155―157℃、
〔α〕²² _D―176.0゜（ｃ＝0.55、メタノール）、
Rf¹0.40、Rf²0.69。 元素分析 C₂₇H₃₇O₆N₃・１／2H₂O計算値：
Ｃ 63.76；Ｈ 7.53；Ｎ 8.26。分析値：Ｃ
63.77；Ｈ 7.53；Ｎ 8.62。 (s) Ｚ―Ala―Pro―Pro―Pro―OBu^tの製造：
Ｚ―Pro―Pro―Pro―OBu^t５ｇをメタノール
200mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元し、触媒をろ去ののち溶媒を留
去し、残留物をＺ―Ala―OH2.23ｇ、
HOBt1.62ｇとともにDMF20mlに溶解し、０℃
に冷却する。この溶液にDCC2.27ｇを加え、０
℃で４時間、室温で12時間かきまぜ、析出物を
ろ去する。溶媒を留去し、残留物を３mlの２％
メタノール／クロロホルムに溶解し、同じ溶媒
で充填したシリカゲルカラム（3.7×10.5cm）
に付し、同じ溶媒で展開する。170〜380mlの区
分を集め溶媒を留去し、油状物4.05ｇ（71.0
％）を得る。Rf¹0.33、Rf²0.67。 (t) Ｚ―Ala―Pro―Pro―Pro―Ser―Leu―Pro
―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―OBu^tの
製造：Ｚ―Ser―Leu―Pro―Ser―Pro―Ser―
Arg―Leu―Pro―OBu^t400mgをＮ―塩酸0.8ml
とともにメタノール80mlに溶解し、パラジウム
黒を触媒とし、水素気流中で還元する。触媒を
ろ去し、溶媒を留去し、残留物をDMF10mlに
溶解し、トリエチルアミン0.11mlで中和し、析
出するトリエチルアミン・塩酸塩をろ去する。
Ｚ―Ala―Pro―Pro―Pro―OBu^t233mgをトリ
フルオロ酢酸２mlに溶解する。50分後に溶媒を
留去し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ
取し、乾燥する。これをHONB122mgとともに
先のDMF溶液に加えて溶解し、０℃に冷却す
る。この溶液にDCC140mgを加え、０℃で６時
間、室温で12時間かきまぜ、析出物をろ去し溶
媒を留去する。残留物にエーテルを加え粉末と
してろ取し、アセトニトリルと酢酸エチルとか
ら再沈澱精製する。 収量 430mg（82.1％）、融点152―155℃（分
解）、〔α〕²⁴ _D―153.6゜（ｃ＝0.45、メタノール）、
Rf³0.10、Rf⁵0.54。 元素分析 C₇₂H₁₁₂O₁₉N₁₆・HCl・H₂O計算
値：Ｃ 55.42；Ｈ 7.43；Ｎ 14.37；Cl2.27。
分析値：Ｃ 56.21；Ｈ 7.54；Ｎ 14.04；Cl
2.30 (u) Ｚ―Ala―Pro―Pro―Pro―Ser―Leu―Pro
―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―Gly―
Pro―Ser―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―
Leu―Pro―Gln―OBu^tの製造：Ｚ―Gly―Pro
―Ser―Asp（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―Leu―
Pro―Gln―OBu^t363mgをメタノール30mlに溶
解し、パラジウム黒を触媒として水素気流中で
還元する。触媒をろ去し、溶媒を留去し、残留
物をDMF10mlに溶解する。Ｚ―Ala―Pro―
Pro―Pro―Ser―Leu―Pro―Ser―Pro―Ser
―Arg―Leu―Pro―OBu^t430mgをトリフルオ
ロ酢酸３mlに溶解し、45分間室温に置く。溶媒
を留去し残留物にエーテルを加え粉末としてろ
取し、乾燥後、HONB103mgとともに、先の
DMF溶液に加えて溶解し、０℃に冷却する。
次にDCC118mgを加え、０℃で６時間、室温で
40時間かきまぜる。析出物をろ去し、溶媒を留
去し、残留物にエーテルを加え粉末としてろ取
し、さらにDMFとエーテルから再沈澱精製す
る。 収量 700mg（95.5％）、融点120―125℃（分
解）、〔α〕²³ _D127.7゜（ｃ＝0.12、メタノール）、
Rf⁵0.62、Rf⁶0.44。 元素分析 C₁₂₁H₁₉₁O₃₄N₂₇・HCl・2H₂O計
算値：Ｃ 53.12；Ｈ 7.80；Ｎ 14.94；Cl
1.40。分析値：Ｃ 53.39；Ｈ 7.62；Ｎ
15.10；Cl 1.54。 (v) Ｈ―Ala―Pro―Pro―Pro―Ser―Leu―Pro
―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―Gly―
Pro―Ser―Asp―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro
―Gln―OH〔hCG―β Ｃ未満フラグメントペ
プチド（123―145）〕の製造：Ｚ―Ala―Pro―
Pro―Pro―Ser―Leu―Pro―Ser―Pro―Ser
―Arg―Leu―Pro―Gly―Pro―Ser―Asp
（OBu^t）―Thr―Pro―Ile―Leu―Pro―Gln―
OBu^t580mgをＮ―塩酸0.45mlとともにメタノー
ル50mlに溶解し、パラジウム黒を触媒として水
素気流中で還元する。触媒をろ去し、溶媒を留
去し、残留物に水１mlを加え、再び留去したの
ち残留物を90％―トリフルオロ酢酸水10mlに溶
解し、室温に60分置く。溶媒を留去し、残留物
に水10mlを加えて溶解し、アンバーライトIRA
―410（酢酸型）の樹脂カラム（１×５cm）に付
し、溶出液を集める。樹脂を水50mlでよく洗
い、洗液を先の溶出液と合して凍結乾燥し、白
色粉末360mgを得る。次にこれをＮ―酢酸で充
填したセフアデツクスLH―20のカラム（２×
83cm）に付し同じ溶媒で展開する。70〜100ml
の区分を集め凍結乾燥し、さらに同じカラムで
再クロマトグラフイーに付し、目的物を含む区
分を集めて凍結乾燥し、白色粉末を得る。 収量 185mg（35.2％）、〔α〕²³ _D―194.5゜（ｃ＝
0.13、0.1N―酢酸）、Rf⁵0.06、Rf⁴（セルロー
ス）0.78。 アミノ酸分析値（理論値）Arg1.00(1)、
Asp1.00(1)、Thr1.00(1)、Ser3.74(4)、Glu1.03
(1)、Pro9.59(9)、Gly0.98(1)、Ala0.94(1)、
Ile0.95(1)、Leu2.97(3)、平均回収率79.3％。 参考例 ２ hCG―β Ｃ末端フラグメントペプチド（130
―145）の製造：Ｚ―Gly―Pro―Ser―Asp
（OBu^t）―Thr―Pro―Gln―OBu^t2.16ｇをメタ
ノール100mlに溶解し、パラジウム黒を触媒とし、
水素気流中で還元する。触媒をろ去し、溶媒を留
去し、残留物をDMF25mlに溶解する。この溶液
に、Ｚ―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―Pro―
OBu^t1.5ｇをTFA処理して得たＺ―Ser―Pro―
Ser―Arg―Leu―Pro―OHとHONB1.22ｇを加
え０℃に冷却する。次にDCC701mgを加え、０℃
で６時間、室温で40時間かきまぜ、析出物をろ去
し、溶媒を留去する。残留物に酢酸エチルとエー
テルを加え沈澱としてろ取する。これをRf³の溶
媒５mlに溶解し、同じ溶媒で充填ししたシリカゲ
ルカラム（5.7×９cm）に付し、同じ溶媒で展開
する。534―914mlの区分を集め溶媒を留去し、残
留物にエーテルを加えてろ取する。 収量 1.1ｇ（33.9％）、Rf³0.20。次にこの保護
ペプチドの一部70mgをメタノール10mlに溶解しパ
ラジウム黒を触媒として、水素気流中で還元し、
触媒をろ去、溶媒を留去する。残留物を90％
TFA1mlに溶解し、60分後に溶媒を留去し、残留
物に水３mlを加えて溶解する。この水溶液をアン
バーライトIRA―410（酢酸型）のカラム（１×１
cm）に通し凍結乾燥する。次にこれをＮ―酢酸
0.5mlに溶解し、Ｎ―酢酸で充填したセフアデツ
クスLH―20のカラムに付し、同じ溶媒で展開す
る。目的物〔Ｈ―Ser―Pro―Ser―Arg―Leu―
Pro―Gly―Pro―Ser―Asp―Thr―Pro―Ile―
Leu―Pro―Gln―OH（hCG―β Ｃ末端フラグ
メントペプチド（130―145）〕を含有する区分を
集め凍結乾燥し、白色粉末を得る。 収量 22mg（36.1％）、〔α〕²³ _D―159.3゜（ｃ＝
0.15、0.1N―酢酸）、Rf⁵0.15。 アミノ酸分析（理論値）Arg1.01(1)、Asp1.01
(1)、Thr0.98(1)、Ser2.57(3)、Glu0.96(1)、Pro4.85
(5)、Gly1.00(1)、Ile0.96(1)、Leu2.04(2)、平均回収
率81.1％。 参考例 ３ hCG―βC末端フラグメントペプチド（130―
145）とβ―Gal.との結合体の製造： 参考例２で得られたhCG―βC末端フラグメン
トペプチド（130―145）1.7mgを0.05Mリン酸緩
衝液（PH7.0）0.5mlおよびDMSO0.5mlに溶解し、
この溶液に780μgのｍ―MBHSを含むTHF50μl
を添加して30℃で30分反応させた。反応混合液を
0.02Mリン酸緩衝液（PH6.3）で平衡させたセフ
アデツクスＧ―15カラム（0.9×55cm）に通し、
過剰の試薬とマレイミド化ペプチドとを分離し
た。得られたマレイミド溶液0.5mlを、0.02Mリ
ン酸食塩緩衝液（PH7.5）に希釈したβ―Gal.溶
液（１mg／ml）0.5mlに徐々に添加し、時々振り
混ぜながら５℃で一夜反応させた。 反応終了後0.02Mリン酸食塩緩衝液（PH7.0）
を用いるセフアロース6Bカラムクロマトグラフ
イーで精製し、酵素含有フラクシヨンを分取し
hCG―βC末端フラグメントペプチド（130―145）
とβ―Gal.との結合体を得た。 以下、本結合体の物性について述べる。 本結合体はEIAで用いる合成基質Ｏ―ニトロ
フエニル―β―Ｄ―ガラクトピラノシドや４―
メチルウンベリフエリル―β―Ｄ―ガラクトピ
ラノシドを分解し、それぞれＯ―ニトロフエノ
ールや４―メチルウンベリフエロンを遊離す
る。 合成基質４―メチルウンベリフエリル―β―
Ｄ―ガラクトピラノシドを用いる時、本結合体
のミカエリス定数はもとのβ―Ｄ―ガラクトシ
ダーゼと同じ値を示す。 酵素活性の至適PHは6.5〜7.3である。 酵素活性を有する本結合体の約90％以上が抗
hCG抗体との反応性を有し、その免疫活性は酵
素活性と共に冷蔵保存で４ケ月以上安定であ
る。 分子量は約55万でhCG―βC末端フラグメン
トペプチド（130―145）／酵素のモル比は約９
である。 PH５〜９の水性溶媒に易溶である。 紫外吸収スペクトルは第１図を参照。 アミノ酸分析値は第１表を参照。 他の物性はβ―Gal.の物性（“The
Enzymes”、第７巻（1972年）、第617頁、
Boyer著、Academic Press、New York―
London）と同じである。

【表】 参考例 ４ 特異抗hCG抗体の製造： (1) 抗hCG血清の製造： 人尿より公知の方法で精製した約10000U／
mgのhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これ
にフロインドの完全アジユバンド〔Freund's
complete adijuvant，“免疫の生化学”、橘ら
著、共立出版株式会社（1967年）〕１mlを加え
てよく混和し乳剤を作り、これをウサギの両大
腿部筋肉内および背部皮下数ケ所に注射する。 以上の操作を３週間毎に５回行ない最終免疫
後１週間で採血しパイロツトアツセイを実施す
る。その結果、hCG―βのＣ末端フラグメント
ペプチド（130―145）―酵素結合体と強い親和
性をもつ抗hCG血清を得た。 (2) 特異抗hCG抗体の製造： 参考例１の方法で得られたhCG―βのＣ端フ
ラグメントペプチド（123―145）５mgを
0.5MNaClを含む0.1MNaHCO₃8mlに溶解し、
予めＮ／1000HClで洗浄したブロムシアン活性
化セフアロース4B（フアルマシア・フアイン・
ケミカルズ社製）１ｇに加え、５℃で一夜撹拌
した。反応終了後同じ0.5M NaClを含む0.1M、
NaHCO₃で十分に洗浄し、次いでHClでPH８
に調製した0.5Mエタノールアミン10mlを添加
して室温で１時間反応させた後、(1)1M NaCl
を含む0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）、(2)1M NaCl
を含む0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.0）および(3)
0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）で順次洗浄しカラムに充填した。 上記(1)で述べた抗hCG血清８mlを1.5ｇの無
水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈澱させ、得ら
れたγ―グロブリン画分をＣ端フラグメントペ
プチド（123―145）結合セフアロース4Bカラ
ム（0.9×４cm）に付した。 0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、hLH、甲状腺刺激ホ
ルモンおよび卵胞刺激ホルモンと交叉反応する
抗hCG抗体を除去した。次いで0.17Mグリシン
―塩酸緩衝液（PH2.3）で溶出することによつ
てhCG―βのＣ端ペプチドと強い親和性をもつ
特異抗hCG抗体を得た（蛋白量1.8mg）。 以下、本抗体の物性について述べる。 本抗体は最終希釈濃度80ng／mlで、約2μUの
酵素活性を有するhCG―β―Gal.結合体（参考
例５参照）およびhCG―BC端フラグメントペ
プチド（130―145）―β―Gal.結合体（参考例
３参照）のそれぞれ約95％および約35％を結合
する能力を有する。 本抗体の抗原結合活性の至適PHは６―９であ
る。 本抗体は冷蔵保存で１年以上安定である。 分子量は約15万で約３％の糖を含む。 PH２―12の水性溶媒に易溶である。 電気泳動においては、陰極側に移動するγ―
グロブリン分画に属する。 紫外吸収スペクトルは第２図を参照 アミノ酸分析値は第２表を参照 他の物性は免疫グロブリンＧの物性（“医科
免疫学”、第61頁、菊地ら著、南江堂（1976年）
と同じである。

【表】 参考例 ５ hCGとβ―Gal.との結合体の製造： hCG（約10000IU／mg）１mgを0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.0）１mlに溶解し、これに78μgのｍ―
MBHSを含むTHF50μlを撹拌しながら添加し30
℃で30分反応させた。反応混合物を直ちにセフア
デツクスＧ―25カラム（0.9×55cm）に通して過
剰の試薬を除去した。溶出は0.05Mクエン酸緩衝
液（PH5.5）で行い、マレイミド化hCGを分取す
る。マレイミド化hCG溶液２mlを0.05Mリン酸食
塩緩衝液（PH7.5）に希釈したβ―Gal.溶液（１
mg／ml）0.5mlに滴下し、室温で２時間反応させ
た。反応終了後、コンカナバリンＡ―セフアロー
ス4B（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ社
製）カラム（１×15cm）に通してhCG―β―Gal
結合体を吸着し、次いで0.2Mα―メチルマンノシ
ドを含む0.05Mリン酸食塩緩衝液（PH7.5）で溶
出し、酵素活性と同時にhCG免疫活性を示す画分
をプールした。この活性画分を更に0.02Mリン酸
食塩緩衝液（PH7.0）を用いるセフアロース6Bカ
ラムクロマトグラフイーで精製し、酵素含有フラ
クシヨンを分取しhCG―β―Gal結合体を得た。 参考例 ６ (1) 抗hCG―βC末端フラグメントペプチド（123
―145）抗体の製造： 参考例１で調製されたフラグメントペプチド
〔hCG―βC末端フラグメントペプチド（123―
145）〕25mgおよび牛チログロブリン（BTGと
略称する）50mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.3）
４mlに溶解し、５％GLA水溶液４mlを加えて
室温で３時間撹拌後４℃で透析（水２×４）
し凍結乾燥して免疫原を得た。このhCG―βC
末端フラグメントペプチド（123―145）―
BTG縮合物1.5mgを生理食塩水0.75mlに溶解し、
これにフロインドの完全アジユバント
（Freund's complete adjuvant）0.75mlを加え
てよく混和し、乳剤を作り、これをウサギの両
大腿部筋肉内および背部皮下数ケ所に注射し
た。以上の操作を４週おきに４回行ない最終免
疫後１週間で採血し、遠心分離して抗血清を採
取し抗hCG―βC末端フラグメントペプチド
（123―145）血清F5Cを得た。 次いで抗血清F5Cを常法により硫酸アンモニ
ウムで塩析させて得たγ―グロブリン画分を２
mgのhCGを結合させたセフアロース4Bカラム
（直径0.9cm、長さ４cm）に付した。 0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH
8.0）でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシ
ン―塩酸緩衝液（PH2.3）で溶出することによ
つて、hCGに親和性の高い抗hCG―βC末端フ
ラグメントペプチド（123―145）F5CSを調製
した。 (2) 抗体結合固相の調製 ポリスチレンボール（直径6.4mm、Precision
Plastics Ball Co.Chicago、U.S.A.）300個に
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.7）50mlを加え56℃
に加温した。次に上記(1)で調製したF5CS2mgを
加えて56℃で２時間インキユベートした。0.1
％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で
洗浄したのち、用時まで冷所保存した。 (3) 抗hCG抗体とβ―Gal.との結合体の製造法 人尿より公知の方法で精製した約10000IU／
mgのhCG1mgを上記(1)の方法でウサギに免疫し
て得られた抗hCG血清について、硫酸アンモニ
ウム塩析し、５mgのhCG―βC末端フラグメン
トペプチド（123―145）を結合させたセフアロ
ース4Bカラム（直径0.9cm、長さ４cm）のアフ
イニテイークロマトグラフイーで素通りする画
分抵抗体T7CSを調製した。T7CS4mgを0.05M
リン酸緩衝液（PH7.0）２mlに溶解し、400μgの
ｍ―MBHSを含むTHF200μlを添加して30℃
で30分間反応させた。反応混合液を0.02Mリン
酸緩衝液で平衡させたセフアデツクスＧ―25
（直径0.9cm、長さ55cm）に通し、過剰の試薬と
マレイミド化抗体とを分離した。得られたマレ
イミド化抗体溶液0.5mlを0.02Mリン酸食塩緩
衝液（PH7.5）に希釈したβ―Ｄ―ガラクトシ
ダーゼ溶液（１mg／ml）0.3mlに徐々に添加し、
時々振り混ぜながら５℃で１夜反応させた。反
応終了後、0.02Mリン酸食塩緩衝液（PH7.0）
を用いるセフアロース6Bのカラムクロマトグ
ラフイーで精製し、酵素活性ならびに抗体活性
を有するフラクシヨンを分取し抗hCG抗体とβ
―Gal.との結合体を得た。 参考例 ７ 下記のhCGの酵素免疫測定用キツトを用い、下
記の操作法に従つたEIAで正常人および妊婦の尿
もしくは血清中のhCG濃度を測定した。結果は第
３表に示される。 hCGの酵素免疫測定用キツト (1) 参考例４で得られた特異抗hCG抗体の反応系
に加えたペプチド―β―Ｄ―ガラクトシダーゼ
結合体の酵素活性の約40％を結合する部分。 (2) 実施例３で得られるhCG―β鎖Ｃ末端フラグ
メントペプチド（130―145）―β―Ｄ―ガラク
トシダーゼ結合体の凍結乾燥物の約0.4μUの酵
素活性を有する部分。 (3) Ｏ―100IUの標準人絨毛性ゴナドトロピン。 (4) 上記(1)―(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる、0.15M NaCl、0.5％人血清アルブミン、
0.5％EDTA、0.1％NaN₃を含むPH7.3の0.02M
リン酸緩衝液。 (5) 2.5（Ｗ／Ｖ）％懸濁液抗ウサギIgG結合セル
ロース。 (6) 10μg4―メチルウンベリフエリル―β―Ｄ―
ガラクトシド (7) (5)のセルロースの洗浄および(6)の酵素基質の
溶解に用いる、0.1M NaCl、1mM MgCl₂、
0.1％牛血清アルブミン、0.1％NaN₃を含むPH
7.0の0.02Mリン酸緩衝液。 (8) PH10.5の0.1Mの炭酸緩衝液。 操作法 試薬(1)100μlに試薬(4)250μlと標準hCGもしくは
被検試料50μlとを添加し、次いで試薬(2)100μlを
加えたのち、４℃で反応させる。40時間反応後、
試薬(5)100μl懸濁液を加え十分撹拌し、更に20℃
で４時間反応させる。反応終了後、試薬(7)でセル
ロースを洗浄し、次いで試薬(6)500μlを加えて酵
素反応を開始する。20℃で16時間反応させたの
ち、試薬(8)３mlを添加して反応を停止させる。反
応液中の螢光強度を測定し、検液中のhCG濃度を
決定する。

【表】

【表】 参考例 ８ hCGの免疫化学的測定用キツトおよびhCGの測
定 下記のhCG免疫化学的測定用キツトを用い、下
記の操作法に従つて正常人および妊婦の尿もしく
は血清中のhCG濃度を測定した。結果は第２表に
示される。 hCGの免疫化学的測定キツト (1) 参考例６で得られた１個あたり6.7μgの抗
hCG―βC末端フラグメントペプチド（123―
145）抗体で感作した直径6.4mmのポリスチレン
ボール。 (2) 実施例６で得られるβ―Ｄ―ガラクトシダー
ゼ標準抗hCG抗体結合体の凍結乾燥物の約
400μUの酵素活性を有する部分。 (3) ０〜100IUの標準hCG (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる。５％正常ウサギ血清、0.1％NaN₃、
1mM MgCl₂を含むPH7.4の0.1Mリン酸緩衝液。 (5) 20μg4―メチルウンベリフエリル―β―Ｄ―
ガラクトシド。 (6) (5)の酵素基質の溶解に用いる、0.1％牛血清
アルブミン、0.1％NaN₃、1mM MgCl₂を含む
PH7.0の0.02Mリン酸緩衝液。 (7) (1)のポリスチレンボールの洗浄に用いる
0.1M NaCl、1mM MgCl₂を含むPH7.0の
0.05Mリン酸緩衝液。 (8) PH10.5の0.1M炭酸緩衝液。 操作法 標準hCGもしくは被検試料100μlに試薬(4)
400μl、試薬(1)１個、試薬(2)100μlとを添加し、室
温で反応させる。２時間反応後、試薬(7)でポリス
チレンボールを洗浄し、次いで試薬(5)400μlを加
えて酵素反応を開始する。37℃で２時間反応させ
たのち、試薬(8)2.5mlを添加して反応を停止させ
る。反応液中の螢光強度を測定し、検液中のhCG
濃度を決定する。 上記方法により、検液中のhCG濃度を測定し
た。結果は第４表に示される。

【表】 実施例 １ β―Ｄ―ガラクトシダーゼ（西独・ベーリンガ
ー・マンハイム社製）を下記の緩衝剤（水溶液）
(a)及び(b)に溶解した。溶解液のそれぞれの溶液中
のβ―Gal.濃度は500μg／mlであつた。 (a) ５％（Ｗ／Ｖ）糖または糖アルコール（糖ま
たは糖アルコールの種類は第５表に示す）、0.2
％牛血清アルブミン、0.001M MgCl₂含有
0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）。 (b) (a)と同様であるが糖類を含まないもの。 上記β―Gal.含有水性組成物を−40℃で凍結し
ついで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥し、凍結乾
燥物を得た。その後、室温で２週間放置した。そ
の後、凍結乾燥物を開封し、得られた組成物につ
いてβ―Gal.酵素活性を測定した（基質として４
―メチルウンベリフエリル―β―Ｄ―ガラクトピ
ラノシドを用いて25℃で10分間反応させた）とこ
ろ、第５表の結果を得た。

【表】 値。
上記の結果から明らかなように、β―Gal.含有
水性組成物(a)の凍結乾燥物を開封して得られた組
成物はいずれも初期活性の76％以上の酵素活性を
保持していた。一方、β―Gal.含有水性組成物(b)
の凍結乾燥物を開封して得られた組成物では、酵
素活性は初期のそれの８％に減少していた。 実施例 ２ 膵グルカゴンＣ端フラグメントペプチド（21―
29）とβ―Galとの結合によつて得られた生成物
（特開昭55―39702号公報参照）を下記の緩衝剤
（水溶液）(a)及び(b)に溶解した。それぞれの溶液
中のβ―Gal.濃度は100ng／mlであつた。 (a) ５％（Ｗ／Ｖ）シヨ糖、0.2％牛血清アルブ
ミン、0.001M MgCl₂含有0.05Mリン酸緩衝液
（PH7.0）。 (b) (a)と同様であるがシヨ糖を含まないもの。 上記β―Gal.含有水性組成物を−40℃で凍結し
ついで10℃、10mmHg以下で凍結乾燥後、該凍結
乾燥物を十分に窒素ガス置換し、窒素ガス気流下
で密栓することにより窒素ガスシールを行い、凍
結乾燥物を得た。これをその後10℃にて保存し
た。 20週後凍結乾燥物をそれぞれ開封した。凍結乾
燥物(a)を開封して得られた組成物の酵素活性は殆
んど変化なく、一定の希釈度のその液〔予め決定
しておいた適当な酵素活性（約10μU／ml）を有
する〕100μlを、種々の希釈度の抗血清（N6E：
特開昭55―39702号公報参照）100μl、アンタゴサ
ン（ヘキスト社製、10000単位／ml）50μl、アツ
セイ用緩衝液（0.5％ヒト血清アルブミン）、0.5
％エチレンジアミン、テトラアセテート・ジソジ
ウム・2H₂O、0.1％NaN₃および0.1M NaClを含
む0.02Mリン酸緩衝液（PH7.3）250μlと混ぜ、５
℃で４昼夜保つことにより、凍結乾燥物を開封後
のβ―Ｄ―ガラクトシダーゼ含有水性組成物の酵
素活性をもつ部分を抗血清に結合させる。次に５
％の抗ウサギIgG抗体結合セルローズ懸濁液
100μlを加え更に30℃で４時間反応させる。この
混合物を遠心分離してから沈澱物を洗浄し、酵素
基質液〔0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％NaN₃、
0.1M NaClおよび1mM MgCl₂を含む0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.0）に溶解した20μg／mlの４―メ
チルウンベリフエリル―β―Ｄ―ガラクトピラノ
シド〕500μlに懸濁し、室温で一夜反応させる。
反応終了後、励起波長365nm、螢光波長450nmで
酵素分解の結果遊離した４―メチルウンベリフエ
ロンの螢光強度を測定した。 次に検液中の膵グルカゴンの定量には、上記の
ごとく定めた一定の希釈度の抗血清とβ―Ｄ―ガ
ラクトシダーゼ含有水性組成物とのそれぞれ
100μlを、検液50μl、アンタゴサン50μlおよびア
ツセイ用緩衝液200μlとの混合物に添加して、以
後上記のごとく定量した。 上記の競争結合法を用いたEIAでの測定結果は
第３図に示した（第３図中、―Γ―は凍結乾燥物
(a)を開封して得られた組成物の結果を、―Γ―は
凍結乾燥前のβ―Gal.含有水性組成物の結果をそ
れぞれ表わす。）。第３図から明らかなように、凍
結乾燥物(a)を開封して得られた組成物は、凍結乾
燥前のβ―Gal.含有水性組成物で得られた結果と
同じ測定値が得られた。凍結乾燥物(b)を開封して
得られた組成物の酵素活性は、初期活性の10％以
下で、EIAでの応用は不能であつた。 実施例 ３ 参考例３で得られたhCG―β鎖Ｃ端フラグメン
トペプチド（130―145）とβ―Galとの結合体を
実施例２と同様に処理して凍結乾燥物(a)及び(b)を
得た。 16週後凍結乾燥物をそれぞれ開封した。凍結乾
燥物(a)を開封して得られた組成物の酵素活性は殆
んど変化なく、一定の希釈度のその液〔予め結定
しておいた適当な酵素活性（約20μU／ml）を有
する〕100μlを、種々の希釈度の抗血清（参考例
４で得られた特異抗hCG抗体）100μl、アツセイ
用緩衝液（0.5％ヒト血清アルブミン、0.5％エチ
レンジアミン・テトラアセテート・ジソデイウ
ム・2H₂O、0.1％NaN₃および0.1M NaClを含む
PH7.3の0.02Mリン酸緩衝液）300μlと混ぜ５℃で
２昼夜保つことにより、β―Ｄ―ガラクトシダー
ゼ含有水性組成物の酵素活性をもつ部分を抗血清
に結合させる。次に2.5％の抗ウサギIgG抗体結合
セルロース懸濁液100μlを加え、更に20℃で４時
間反応させる。この混合物を遠心分離してから沈
澱物を洗浄し、酵素基質液（0.1％ウシ血清アル
ブミン、0.1％NaN₃、0.1M NaClおよび1mM
MgCl₂を含むPH7.0の0.02Mリン酸緩衝液に溶解し
た20μg／mlの４―メチルウンベリフエリル―β
―Ｄ―ガラクトピラノシド溶液）500μlに懸濁し
室温で一夜反応させる。反応終了後、励起波長
365nm、螢光波長450nmで酵素分解の結果遊離し
た４―メチルウンベリフエロンの螢光強度を測定
した。 次に検液中のhCGの定量には、上記のごとく定
めた一定の希釈度の抗血清とβ―Ｄ―ガラクトシ
ダーゼ含有水性組成物とのそれぞれ100μlを、検
液50μlおよびアツセイ用緩衝液250μlとの混合物
に添加して、以後上記のごとく定量した。上記の
競争結合法を用いたEIAでの測定結果は第４図に
示した（第４図中、―Γ―は凍結乾燥物(a)を開封
して得られた組成物の結果を、―・―は凍結乾燥
前のβ―Gal.含有水性組成物の結果をそれぞれ表
わす。）。第４図から明らかなように、凍結乾燥物
(a)を開封して得られた組成物は、凍結乾燥前のβ
―Gal.含有水性組成物で得られた結果と同じ測定
値が得られた。凍結乾燥物(b)を開封して得られた
組成物の酵素活性は初期活性の10％以下で、EIA
での応用は不能であつた。 実施例 ４ 参考例５で得られたhCGとβ―Gal.との結合体
を実施例２と同様に処理して凍結乾燥物(a)及び(b)
を得た。 20週後凍結乾燥物をそれぞれ開封した。凍結乾
燥物(a)を開封して得られた組成物の酵素活性は殆
んど変化なく、次いで実施例３で述べた競争結合
法によるEIAでhCGを測定したが、第５図に示し
た（第５図中、―Γ―は凍結乾燥物(a)を開封して
得られた組成物の結果を―・―は凍結乾燥前のβ
―Gal.含有水性組成物の結果をそれぞれ表わ
す。）。第５図に明らかなように凍結乾燥物(a)を開
封して得られた組成物は、凍結乾燥前のβ―Gal.
含有水性組成物で得られた結果と同じ測定値が得
られた。凍結乾燥物(b)を開封して得られた組成物
の酵素活性は初期活性の10％以下で、EIAでの応
用は不能であつた。 実施例 ５ β―アドレナリン作動薬（trans―５―ハイド
ロキシ・メチル―６―ハイドロキシ―２―イソプ
ロピルアミノ―１，２，３，４―テトラハイドロ
ナフタレン―１―オール）とβ―Gal.との結合に
よつて得られた生成物〔Immunopharmacology
第１巻第３頁（1979年）参照〕を実施例２と同様
に処理して凍結乾燥物(a)及び(b)を得た。 12週後凍結乾燥物をそれぞれ開封した。凍結乾
燥物(a)を開封して得られた組成物の酵素活性は殆
んど変化なく、次いで実施例３で述べた競争結合
法によるEIAでβ―アドレナリン作働薬を測定し
たが、その結果は第６図に示した（第６図中、―
Γ―は凍結乾燥物(a)を開封して得られた組成物の
結果を、―・―は凍結乾燥前のβ―Gal.含有水性
組成物の結果をそれぞれ表わす。）。凍結乾燥物(a)
を開封して得られた組成物は、凍結乾燥前のβ―
Gal.含有水性組成物で得られた結果と同じ測定値
が得られた。凍結乾燥物(b)を開封して得られた組
成物の酵素活性は初期活性の10％以下で、EIAで
の応用は不能であつた。 実施例 ６ 参考例６で得られた抗hCG抗体とβ―Gal.との
結合によつて得られた生成物を実施例２と同様に
処理して凍結乾燥物(a)及び(b)を得た。 23週後凍結乾燥物をそれぞれ開封した。凍結乾
燥物(a)を開封して得られた組成物の酵素活性は殆
んど変化なく、一定の希釈度のその液〔予め決定
しておいた適当な酵素活性（約1mU／ml）を有
する〕100μlを５％正常ウサギ血清、0.1％NaN₃、
1mM MgCl₂を含む0.1Mリン酸緩衝液400μl、
hCGを含む検液100μl、抗hCG―βC末端フラグメ
ントペプチド（123―145）抗体結合ポリスチレン
ボール１球（参考例６参照）に加えて室温で２時
間反応させた。反応終了後、ポリスチレンボール
を0.1M NaCl、1mM MgCl₂を含む0.05Mリン酸
緩衝液で３回洗浄したのち、酵素基質液（0.1％
牛血清アルブミン、0.1％、NaN₃、0.1M NaCl
および1mM MgCl₂を含むPH7.0の0.02Mリン酸緩
衝液に溶解した20μg／mlの４―メチルウンベリ
フエリル―β―Ｄ―ガラクトピラノシド溶液）
400μlを加え37℃で２時間反応させた。励起波長
365nm、螢光波長450nmにおける螢光強度を測定
した。上記のサンドイツチ法を用いたEIAでの測
定結果は第７図に示した（第７図中、―Γ―は凍
結乾燥物(a)を開封して得られた組成物の結果を、
―・―は凍結乾燥前のβ―Gal.含有水性組成物の
結果をそれぞれ表わす。）。第７図から明らかなよ
うに、凍結乾燥物(a)を開封して得られた組成物
は、凍結乾燥前のβ―Gal含有水性組成物で得ら
れた結果と同じ測定値が得られた。凍結乾燥物(b)
を開封して得られた組成物の酵素活性は初期活性
の10％以下で、EIAでの応用は不能であつた。 実施例 ７ 抗ヒトIgG抗体〔マイルズ・ラボラトリー社
（米国）製〕とβ―Gal.との結合によつて得られ
た生成物〔Journal of Immunology第116巻第
1554頁（1976年）参照〕を実施例２と同様に処理
して凍結乾燥物(a)及び(b)を得た。 12週後凍結乾燥物を開封した。凍結乾燥物(a)を
開封して得られた組成物の酵素活性は殆んど変化
なく、次いで実施例６で述べたサンドイツチ法に
よるEIAでヒトIgGを測定したがその結果は第８
図に示した。（第８図中、―Γ―は凍結乾燥物(a)
を開封して得られた組成物の結果を、―・―は凍
結乾燥前のβ―Gal.含有水性組成物の結果をそれ
ぞれ表わす。）。第８図から明らかなように凍結乾
燥物(a)を開封して得られた組成物は凍結乾燥前の
β―Gal.含有水性組成物で得られた結果と同じ測
定値が得られた。凍結乾燥物(b)を開封して得られ
た組成物の酵素活性は初期活性の10％以下で、
EIAでの応用は不能であつた。 実施例 ８ 参考例６で得られた抗hCG抗体とβ―Gal.との
結合によつて得られた生成物を、実施例２で示し
た緩衝剤(a)における５％（Ｗ／Ｖ）シヨ糖の代り
に３％（Ｗ／Ｖ）の乳糖もしくはガラクトースを
用いて同様に処理し、凍結乾燥物(a)及び(b)を得
た。 23週後凍結乾燥物を開封した。乳糖もしくはガ
ラクトースを用いて得た凍結乾燥物(a)を開封して
得られた組成物の酵素活性は殆んど変化なく次い
で実施例６で述べたサンドイツチ法によるEIAで
hCGを測定した。結果を第９図に示した（第９図
中、―△―は乳糖を用いて得られた凍結乾燥物(a)
を開封して得られた組成物の結果を、―□―はガ
ラクトースを用いて得られた凍結乾燥物(a)を開封
して得られた組成物の結果を、―・―は凍結乾燥
前のβ―Gal.含有水性組成物の結果を、―×―は
凍結乾燥物(b)を開封して得られた組成物の結果を
それぞれ表わす。）。第９図から明らかなように凍
結乾燥物(a)を開封して得られた組成物は、凍結乾
燥前のβ―Gal.含有水性組成物で得られた結果と
同じ測定値が得られたが、糖類を含まない緩衝剤
を用いて得た凍結乾燥物(b)を開封して得られた組
成物の酵素活性は初期活性の10％以下に減少し、
EIAでの検量線の作成は不能であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はhCG―βC末端フラグメントペプチド
（130―145）とβ―Gal.との結合体の紫外吸収ス
ペクトルを、第２図は特異抗hCG抗体の紫外吸収
スペクトルを、第３図は膵グルカゴンＣ端フラグ
メントペプチド（21―29）とβ―Gal.との結合体
を用いて得られた膵グルカゴン（PG）の標準曲
線を、第４，５図はそれぞれ、hCGとβ―Gal.と
の結合体およびhCG―βC端フラグメントペプチ
ド（130―145）とβ―Gal.との結合体を用いて得
られたhCGの標準曲線を、第６図はβ―アドレナ
リン作働薬とβ―Gal.との結合体を用いて得られ
たβ―アドレナリン作働薬の標準曲線を、第７図
および第９図は抗hCG抗体とβ―Gal.との結合体
を用いて得られたhCGの標準曲線を、第８図は抗
ヒトIgG抗体とβ―Gal.との結合体を用いて得ら
れたヒトIgGの標準曲線をそれぞれ表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ β―Ｄ―ガラクトシダーゼまたはこれと免疫
   活性物質との結合体および糖または糖アルコール
   を含有する水性組成物中、β―Ｄ―ガラクトシダ
   ーゼまたはβ―Ｄ―ガラクトシダーゼとして１ml
   当たり100pg〜10μgを、糖または糖アルコールを
   0.2〜5w／ｖ％の濃度で含有してなる該水性組成
   物を凍結乾燥に付すことを特徴とする標識用凍結
   乾燥物の製造法。 ２ さらに水性組成物にアルブミンを0.01〜
   5w／ｖ％の濃度となるように含有せしめた特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。