JPS6126558B2 - - Google Patents
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- JPS6126558B2 JPS6126558B2 JP52020663A JP2066377A JPS6126558B2 JP S6126558 B2 JPS6126558 B2 JP S6126558B2 JP 52020663 A JP52020663 A JP 52020663A JP 2066377 A JP2066377 A JP 2066377A JP S6126558 B2 JPS6126558 B2 JP S6126558B2
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- amino
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q2337/20—Coumarin derivatives
- C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
本発明は、酵素活性測定用のけい光性基質また
はその合成中間体として有用な新規７−グリシル
プロリルミノ−４−メチルクマリンに関する。 本発明者は、簡便で高感度の測定が可能な酵素
の新しい基質を得るために鋭意研究を重ねた結
果、構造式 で示される７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリン（分子を構成するグリシンのｄ−ア
ミノ基が保護されているものをも含む）の合成に
成功し、さらにこの新規化合物が、簡便で高感度
の測定が可能な、酵素例えばすでに本発明者が見
出しているＸ−プロリルジペプチジルアミノペプ
チダーゼ即ちＸ−Ｌ−プロリンＰ−ニトロアニリ
ド（Ｘは中性、酸性或いは塩基性アミノ酸）に作
用しＮ−末端Ｘ−Ｌ−プロリン及びＰ−ニトロア
ニリンに分解遊離せしめる酵素のけい光性基質お
よび／またその合成中間体となることを見出し本
発明を完成するに至つた。 本発明の化合物は塩酸、硫酸等の鉱酸あるいは
酢酸、Ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の酸付
加塩の形であつてもよい。 このような酸付加塩から遊離形のものを得るに
は、酸付加塩をアルカリで中和すればよい。 本発明の７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリンは、それを構成するグリシンのアミ
ノ基が保護されているものをも含む。 アミノ基の保護基としては、カルボベンゾキシ
基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ｔ−アミル
オキシカルボニル基、トリチル基、Ｐ−ニトロカ
ルボベンゾキシ基、ホルミル基、トリフルオルア
セチル基、フタロイル基等ペプチドの合成に慣用
されているアミノ基の保護基やベンゾイル基、ア
セチル基、トシル基の保護基をあげることができ
る。なお、上記保護基による保護方法あるいは保
護されたものの保護基の脱離方法は、例えばそれ
ぞれペプチド合成の際にアミノ基の保護方法ある
いは脱離方法として慣用されている手段を適宜選
択利用して行うことができる。 本発明の目的化合物は例えばＮ−保護−グリシ
ルプロリンと７−アミノ−４−メチルクマリン
（MCA）を反応せしめることにより製造すること
ができる。この場合Ｎ−保護の保護基としてはも
ちろん上述したものが採用できる。反応において
はトリメチルアミン、トリエチルアミン等トリア
ルキルアミン、ピリジン等の有機塩基の存在下ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCCD）、Ｎ−
エチル−N′−３−ジメテルアミノプロピル−カ
ルボジイミド（WSCI）、クロル蟻酸イソブチル
等のクロル蟻酸エステル等で縮合させるとよい。
この縮合反応はジメチルホルムアミド（DMF）
クロロホルム、ジクロルメタン、エチル酢酸エス
テルやジオキサン、テトラヒドロフラン
（THF）等の不活性溶媒を用いることもできる。 このようにして得られた縮合物から、そのアミ
ノ基の保護基を脱離するには、脱離方法として上
記慣用手段を適宜選択利用すればよい。例えば、
接触的水素化方法を利用すればよい。 また分子を構成するプロリンがＬ−体又はＤ−
体のいずれか一方のものである目的化合物を製造
するには、目的化合物の製造反応に用いる出発原
料のグリシルプロリンに目的とする光学活性体を
採用してもよいし、目的化合物のDL−体を製造
してこれを常法の光学分割に付してもよい。 試料溶液と７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ
−４−メチルクマリンを接触せしめ、次いで７−
アミノ−４−メチルクマリンを定量することによ
り試料溶液中の酵素Ｘ−プロリルジペプチジルア
ミノペプチダーゼ活性を測定することができる。
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンは試料溶液中にＸ−プロリルジペプチジ
ルアミノペプチダーゼが存在すればその量に比例
してグリシル−Ｌ−プロリンと７−アミノ−４−
メチルクマリンに分解遊離する。ここでEx380n
ｍ、Em460nｍのけい光下でその７−アミノ−４
−メチルクマリンのけい光強度を測定することに
より高感度の酵素活性を測定できる。すなわち、
７−アミノ−４−メチルクマリンは分解遊離前の
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンの30倍という相対けい光強度を示すこと
を見出したことにより上記測定を可能とした。 本発明者は体内に特に体液例えば血清、唾液に
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンに作用してグリシル−Ｌ−プロリンと７
−アミノ−４−メチルクマリンに分解するジペプ
チジルアミノペプチダーゼの一種である酵素、Ｘ
−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼが存
在することを見出し、さらに体液中、特に血清中
の当該酵素活性を前記７−グリシル−Ｌ−プロリ
ルアミノ−４−メチルクマリンを基質として正常
人並びに各種疾患に罹つている患者につき測定し
たところ、正常人であれば男女間に、特に若年層
の男女間に若干有意な差は認められるがほぼ一定
であるにもかかわらず、肝臓並びに隣接臓器の疾
患例えば急性及び慢性肝炎、肝硬変或いは胆管ガ
ンにあつては当該酵素活性が増加していること、
さらに驚くべきことに癌例えば胃癌、膵癌にあつ
ては活性が低下していることを見出し、本酵素活
性を測定することは疾患診断時に癌診断に大変役
立つことを認めた。殊に、従来よい診断方法のな
い、胃癌の肝転移の診断に極めて有力な方法であ
る。 さらに、７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−
４−メチルクマリンは本酵素活性測定用基質とし
て発癌性等の問題を惹起することのない安全な物
質であり、また基質として不可欠な各種条件即ち
酵素作用を受けた基質量の測定の容易さ、安定
性、酵素量及び接触反応時間に対する直線性等を
全て満足するものであることを確認し、医学上重
要な意義を有する本酵素活性測定法を確立した。 基質としての７−グリシル−Ｌ−プロリルアミ
ノ−４−メチルクマリンは遊離体として使用され
るのみならず、酵素反応を阻害しない酸との付加
塩、例えばＰ−トルエンスルホン酸、塩酸、臭化
水素酸との塩の形で測定系に導入することもでき
る。 酵素活性の測定方法は格別に困難なく行うこと
ができる。例えば、まず初めに基質溶液を調製す
るのであるが、先述の如く７−グリシル−Ｌ−プ
ロリルアミノ−４−メチルクマリンの適当な濃度
の溶液を調製する。基質の水溶解性が低い場合に
は界面活性剤等の溶解促進物質を用いるのが有利
である。基質溶液のPHは使用する基質の種類によ
り異るが、本酵素による加水分解速度並びに基質
の酵素以外の要因による分解（即ち基質安定性）
等を考慮し、実験的に容易に最適値を求めること
ができる。通常PHは中性付近より詳しくは６〜９
付近が選択される。 測定は前記基質溶液と試料溶液を混合せしめ、
30〜45℃にて基質量及び試料溶液中のグリシルプ
ロピルジペプチジルアミノペプチダーゼの量に応
じ適当時間反応させた後、酵素活性を常法により
失活せしめ遊離７−アミノ−４−メチルクマリン
を上述の如く定量することにより本酵素活性を高
感度に知ることができる。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プロリン
1.53ｇ（５ミリモル）およびトリエチルアミン
0.7ml（５ミリモル）のTHF溶液30mlに−５〜−
10℃冷却下クロル蟻酸イソブチル585mg（５ミリ
モル）を加え10分間かきまぜた後これに７−アミ
ノ−４−メチルクマリン875mg（５ミリモル）の
DMF溶液20mlを加え同温度で30分次いで室温で
４時間かきまぜた。 反応混合物より溶媒を減圧下留去し残渣に酢酸
エチル75mlを加え１規定塩酸、水、５％重炭酸ナ
トリウム水溶液、水の順で洗浄した後、酢酸エチ
ル層を無水芒硝で乾燥した。酢酸エチルを減圧留
去後得られた粗生成物をシリカゲル（50ｇのカラ
ムクロマトグラフイー（溶出溶媒、ベンゼン：酢
酸エチル＝１：２、酢酸エチルのみ）で精製し、
次に酢酸エチル（10ml）−ｎ−ヘキサン（30ml）
で再沈し、７−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル
−Ｌ−プロリル）アミノ−４−メチルクマリン
1.4ｇ（収率60％）を得た。 融点：107.5〜113.5℃〔α〕１８ Ｄ−116.1゜（Ｃ＝
１、DMF） この結晶は薄層クロマトグラフイー（クロロホ
ルム：メタノール：酢酸＝95：５：３）で単一ス
ポツト（Rf＝0.65）を与えた。 元素分析 測定値 Ｃ 62.49％、Ｈ 5.81％、Ｎ 8.96％ C25H25N3O6・H2Oとしての計算値 Ｃ 62.36％、Ｈ 5.65％、Ｎ 8.73％ ７−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プ
ロリル）アミノ−４−メチルクマリン464mg（１
ミリモル）を80％酢酸10mlとメタノール50mlに溶
解し、これに10％Pd−C50mgを加え４時間水素ガ
スを通じて接触還元を行い７−グリシル−Ｌ−プ
ロリルアミノ−４−メチルクマリンを生成せしめ
た。 反応混合物より触媒を別後液にＰ−トルエ
ンスルホン酸の１水和物190mg（１ミリモル）加
えてそのまま凍結乾燥した。残渣に水50mlを加え
さらに凍結乾燥して得た白色粉末465mgをエタノ
ール（10ml）−エーテル（50ml）で再沈を行い、
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンのＰ−トルエンスルホン酸塩400mg（７
−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プロリ
ル）アミノ−４−メチルクマリンよりの収率：
77.4％）を得た。融点：182.0〜188.5℃。 〔α〕２０ Ｄ＝−111.0゜（Ｃ＝１、酢酸） この結晶は次に示す如く薄層クロマトグラフイ
ーで単一スポツトを与えた。 ｎ−ブタノール：酢酸：水：＝４：１：５
Rf＝0.4 ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝15：
10：３：12 Rf＝0.7 元素分析 測定値 Ｃ 54.08％、Ｈ 5.44％、Ｎ 7.58％ C24H27O7N3S・３／２H2Oとしての計算値 Ｃ 54.53％、Ｈ 5.72％、Ｎ 7.95％ ７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチ
ルクマリンＰ−トルエンスルホン酸塩（GIy−
Pro−MCA Tosylate）を水に２ミリモル濃度と
なるように溶解し基質溶液とした。ヒト顎下腺よ
り均一に精製したＸ−プロリルジペプチジルアミ
ノペプチダーゼを酵素液として用いて次の表に示
す操作を順次行い、次いで同様の操作をインキユ
ベート時間を変化させて行つた。けい光分析によ
り反応時間と生成した７−アミノ−４−メチルク
マリン量と関係を求めた。
はその合成中間体として有用な新規７−グリシル
プロリルミノ−４−メチルクマリンに関する。 本発明者は、簡便で高感度の測定が可能な酵素
の新しい基質を得るために鋭意研究を重ねた結
果、構造式 で示される７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリン（分子を構成するグリシンのｄ−ア
ミノ基が保護されているものをも含む）の合成に
成功し、さらにこの新規化合物が、簡便で高感度
の測定が可能な、酵素例えばすでに本発明者が見
出しているＸ−プロリルジペプチジルアミノペプ
チダーゼ即ちＸ−Ｌ−プロリンＰ−ニトロアニリ
ド（Ｘは中性、酸性或いは塩基性アミノ酸）に作
用しＮ−末端Ｘ−Ｌ−プロリン及びＰ−ニトロア
ニリンに分解遊離せしめる酵素のけい光性基質お
よび／またその合成中間体となることを見出し本
発明を完成するに至つた。 本発明の化合物は塩酸、硫酸等の鉱酸あるいは
酢酸、Ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の酸付
加塩の形であつてもよい。 このような酸付加塩から遊離形のものを得るに
は、酸付加塩をアルカリで中和すればよい。 本発明の７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリンは、それを構成するグリシンのアミ
ノ基が保護されているものをも含む。 アミノ基の保護基としては、カルボベンゾキシ
基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ｔ−アミル
オキシカルボニル基、トリチル基、Ｐ−ニトロカ
ルボベンゾキシ基、ホルミル基、トリフルオルア
セチル基、フタロイル基等ペプチドの合成に慣用
されているアミノ基の保護基やベンゾイル基、ア
セチル基、トシル基の保護基をあげることができ
る。なお、上記保護基による保護方法あるいは保
護されたものの保護基の脱離方法は、例えばそれ
ぞれペプチド合成の際にアミノ基の保護方法ある
いは脱離方法として慣用されている手段を適宜選
択利用して行うことができる。 本発明の目的化合物は例えばＮ−保護−グリシ
ルプロリンと７−アミノ−４−メチルクマリン
（MCA）を反応せしめることにより製造すること
ができる。この場合Ｎ−保護の保護基としてはも
ちろん上述したものが採用できる。反応において
はトリメチルアミン、トリエチルアミン等トリア
ルキルアミン、ピリジン等の有機塩基の存在下ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCCD）、Ｎ−
エチル−N′−３−ジメテルアミノプロピル−カ
ルボジイミド（WSCI）、クロル蟻酸イソブチル
等のクロル蟻酸エステル等で縮合させるとよい。
この縮合反応はジメチルホルムアミド（DMF）
クロロホルム、ジクロルメタン、エチル酢酸エス
テルやジオキサン、テトラヒドロフラン
（THF）等の不活性溶媒を用いることもできる。 このようにして得られた縮合物から、そのアミ
ノ基の保護基を脱離するには、脱離方法として上
記慣用手段を適宜選択利用すればよい。例えば、
接触的水素化方法を利用すればよい。 また分子を構成するプロリンがＬ−体又はＤ−
体のいずれか一方のものである目的化合物を製造
するには、目的化合物の製造反応に用いる出発原
料のグリシルプロリンに目的とする光学活性体を
採用してもよいし、目的化合物のDL−体を製造
してこれを常法の光学分割に付してもよい。 試料溶液と７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ
−４−メチルクマリンを接触せしめ、次いで７−
アミノ−４−メチルクマリンを定量することによ
り試料溶液中の酵素Ｘ−プロリルジペプチジルア
ミノペプチダーゼ活性を測定することができる。
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンは試料溶液中にＸ−プロリルジペプチジ
ルアミノペプチダーゼが存在すればその量に比例
してグリシル−Ｌ−プロリンと７−アミノ−４−
メチルクマリンに分解遊離する。ここでEx380n
ｍ、Em460nｍのけい光下でその７−アミノ−４
−メチルクマリンのけい光強度を測定することに
より高感度の酵素活性を測定できる。すなわち、
７−アミノ−４−メチルクマリンは分解遊離前の
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンの30倍という相対けい光強度を示すこと
を見出したことにより上記測定を可能とした。 本発明者は体内に特に体液例えば血清、唾液に
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンに作用してグリシル−Ｌ−プロリンと７
−アミノ−４−メチルクマリンに分解するジペプ
チジルアミノペプチダーゼの一種である酵素、Ｘ
−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼが存
在することを見出し、さらに体液中、特に血清中
の当該酵素活性を前記７−グリシル−Ｌ−プロリ
ルアミノ−４−メチルクマリンを基質として正常
人並びに各種疾患に罹つている患者につき測定し
たところ、正常人であれば男女間に、特に若年層
の男女間に若干有意な差は認められるがほぼ一定
であるにもかかわらず、肝臓並びに隣接臓器の疾
患例えば急性及び慢性肝炎、肝硬変或いは胆管ガ
ンにあつては当該酵素活性が増加していること、
さらに驚くべきことに癌例えば胃癌、膵癌にあつ
ては活性が低下していることを見出し、本酵素活
性を測定することは疾患診断時に癌診断に大変役
立つことを認めた。殊に、従来よい診断方法のな
い、胃癌の肝転移の診断に極めて有力な方法であ
る。 さらに、７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−
４−メチルクマリンは本酵素活性測定用基質とし
て発癌性等の問題を惹起することのない安全な物
質であり、また基質として不可欠な各種条件即ち
酵素作用を受けた基質量の測定の容易さ、安定
性、酵素量及び接触反応時間に対する直線性等を
全て満足するものであることを確認し、医学上重
要な意義を有する本酵素活性測定法を確立した。 基質としての７−グリシル−Ｌ−プロリルアミ
ノ−４−メチルクマリンは遊離体として使用され
るのみならず、酵素反応を阻害しない酸との付加
塩、例えばＰ−トルエンスルホン酸、塩酸、臭化
水素酸との塩の形で測定系に導入することもでき
る。 酵素活性の測定方法は格別に困難なく行うこと
ができる。例えば、まず初めに基質溶液を調製す
るのであるが、先述の如く７−グリシル−Ｌ−プ
ロリルアミノ−４−メチルクマリンの適当な濃度
の溶液を調製する。基質の水溶解性が低い場合に
は界面活性剤等の溶解促進物質を用いるのが有利
である。基質溶液のPHは使用する基質の種類によ
り異るが、本酵素による加水分解速度並びに基質
の酵素以外の要因による分解（即ち基質安定性）
等を考慮し、実験的に容易に最適値を求めること
ができる。通常PHは中性付近より詳しくは６〜９
付近が選択される。 測定は前記基質溶液と試料溶液を混合せしめ、
30〜45℃にて基質量及び試料溶液中のグリシルプ
ロピルジペプチジルアミノペプチダーゼの量に応
じ適当時間反応させた後、酵素活性を常法により
失活せしめ遊離７−アミノ−４−メチルクマリン
を上述の如く定量することにより本酵素活性を高
感度に知ることができる。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プロリン
1.53ｇ（５ミリモル）およびトリエチルアミン
0.7ml（５ミリモル）のTHF溶液30mlに−５〜−
10℃冷却下クロル蟻酸イソブチル585mg（５ミリ
モル）を加え10分間かきまぜた後これに７−アミ
ノ−４−メチルクマリン875mg（５ミリモル）の
DMF溶液20mlを加え同温度で30分次いで室温で
４時間かきまぜた。 反応混合物より溶媒を減圧下留去し残渣に酢酸
エチル75mlを加え１規定塩酸、水、５％重炭酸ナ
トリウム水溶液、水の順で洗浄した後、酢酸エチ
ル層を無水芒硝で乾燥した。酢酸エチルを減圧留
去後得られた粗生成物をシリカゲル（50ｇのカラ
ムクロマトグラフイー（溶出溶媒、ベンゼン：酢
酸エチル＝１：２、酢酸エチルのみ）で精製し、
次に酢酸エチル（10ml）−ｎ−ヘキサン（30ml）
で再沈し、７−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル
−Ｌ−プロリル）アミノ−４−メチルクマリン
1.4ｇ（収率60％）を得た。 融点：107.5〜113.5℃〔α〕１８ Ｄ−116.1゜（Ｃ＝
１、DMF） この結晶は薄層クロマトグラフイー（クロロホ
ルム：メタノール：酢酸＝95：５：３）で単一ス
ポツト（Rf＝0.65）を与えた。 元素分析 測定値 Ｃ 62.49％、Ｈ 5.81％、Ｎ 8.96％ C25H25N3O6・H2Oとしての計算値 Ｃ 62.36％、Ｈ 5.65％、Ｎ 8.73％ ７−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プ
ロリル）アミノ−４−メチルクマリン464mg（１
ミリモル）を80％酢酸10mlとメタノール50mlに溶
解し、これに10％Pd−C50mgを加え４時間水素ガ
スを通じて接触還元を行い７−グリシル−Ｌ−プ
ロリルアミノ−４−メチルクマリンを生成せしめ
た。 反応混合物より触媒を別後液にＰ−トルエ
ンスルホン酸の１水和物190mg（１ミリモル）加
えてそのまま凍結乾燥した。残渣に水50mlを加え
さらに凍結乾燥して得た白色粉末465mgをエタノ
ール（10ml）−エーテル（50ml）で再沈を行い、
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンのＰ−トルエンスルホン酸塩400mg（７
−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プロリ
ル）アミノ−４−メチルクマリンよりの収率：
77.4％）を得た。融点：182.0〜188.5℃。 〔α〕２０ Ｄ＝−111.0゜（Ｃ＝１、酢酸） この結晶は次に示す如く薄層クロマトグラフイ
ーで単一スポツトを与えた。 ｎ−ブタノール：酢酸：水：＝４：１：５
Rf＝0.4 ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝15：
10：３：12 Rf＝0.7 元素分析 測定値 Ｃ 54.08％、Ｈ 5.44％、Ｎ 7.58％ C24H27O7N3S・３／２H2Oとしての計算値 Ｃ 54.53％、Ｈ 5.72％、Ｎ 7.95％ ７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチ
ルクマリンＰ−トルエンスルホン酸塩（GIy−
Pro−MCA Tosylate）を水に２ミリモル濃度と
なるように溶解し基質溶液とした。ヒト顎下腺よ
り均一に精製したＸ−プロリルジペプチジルアミ
ノペプチダーゼを酵素液として用いて次の表に示
す操作を順次行い、次いで同様の操作をインキユ
ベート時間を変化させて行つた。けい光分析によ
り反応時間と生成した７−アミノ−４−メチルク
マリン量と関係を求めた。
【表】
380nｍ／460nｍにおけるけい光強度をそれぞ
れ測定（Ex／Em）し、酵素により生成した
MCAの量は、次式により求めた。 Ｅ−Ｃ／Ｓ−Ｂ×3nmol 結果を次表に示した。
れ測定（Ex／Em）し、酵素により生成した
MCAの量は、次式により求めた。 Ｅ−Ｃ／Ｓ−Ｂ×3nmol 結果を次表に示した。
【表】
以上の結果から、本基質は反応時間に対し比例
して（直線関係に）MCAを生成せしめることが
わかる。 次に、上記の実験を酵素液量を各種変化せしめ
て行い37℃、30分間インキユベーシヨンした後の
けい光強度を同様に測定して、酵素により生成し
たMCAの量を求めた。結果を次に示した。
して（直線関係に）MCAを生成せしめることが
わかる。 次に、上記の実験を酵素液量を各種変化せしめ
て行い37℃、30分間インキユベーシヨンした後の
けい光強度を同様に測定して、酵素により生成し
たMCAの量を求めた。結果を次に示した。
【表】
【表】
上記の結果から明らかな通り、本基質は使用酵
素量に比例して（直線関係に）MCAを与えるこ
とが確認された。 試料溶液に本基質を上記の方法に準じて作用せ
しめて生成するMCA量を測定し標準関係と比較
すれば、試料溶液中の目的とする酵素の量を正確
に測定でき、故に前述のような病気の診断に役立
つことがわかる。 正常ヒトの脳脊髄液、血清及び唾液について上
記同様にしてMCA量を求め、酵素活性（I.U.／
１ml酵素液）を求めた。結果を次に示した。
素量に比例して（直線関係に）MCAを与えるこ
とが確認された。 試料溶液に本基質を上記の方法に準じて作用せ
しめて生成するMCA量を測定し標準関係と比較
すれば、試料溶液中の目的とする酵素の量を正確
に測定でき、故に前述のような病気の診断に役立
つことがわかる。 正常ヒトの脳脊髄液、血清及び唾液について上
記同様にしてMCA量を求め、酵素活性（I.U.／
１ml酵素液）を求めた。結果を次に示した。
【表】
血清中のＸ−プロリルジペプチジルアミノペプ
チダーゼ活性は前記のように肝疾患や胃癌の診断
上有意義であるが、本物質を基質として用いれ
ば、１μｌ以下の血清で超微量測定が可能であ
る。また、脳脊髄液中の本酵素活性は本物質と用
いる測定法によつて始めて測定が可能となり、酵
素の存在が発見された。唾液中の本酵素活性も本
物質を基質として用いれば測定容易であり、血清
の代りに唾液を用いる酵素検査法にも応用可能で
ある。
チダーゼ活性は前記のように肝疾患や胃癌の診断
上有意義であるが、本物質を基質として用いれ
ば、１μｌ以下の血清で超微量測定が可能であ
る。また、脳脊髄液中の本酵素活性は本物質と用
いる測定法によつて始めて測定が可能となり、酵
素の存在が発見された。唾液中の本酵素活性も本
物質を基質として用いれば測定容易であり、血清
の代りに唾液を用いる酵素検査法にも応用可能で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 構造式 で示される７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリン。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2066377A JPS53105477A (en) | 1977-02-26 | 1977-02-26 | 7-glycylprolylamono-4-methylcoumarine |
| US05/878,826 US4147692A (en) | 1977-02-26 | 1978-02-17 | Novel dipeptide derivatives, and method of measuring enzymatic activity |
| SE7801997A SE7801997L (sv) | 1977-02-26 | 1978-02-21 | Dipeptidderivat |
| GB7155/78A GB1547747A (en) | 1977-02-26 | 1978-02-22 | Dipeptide derivatives of glycylproline |
| FR7805438A FR2381764A1 (fr) | 1977-02-26 | 1978-02-24 | Nouveaux derives dipeptidiques de la glycyl-prolylamino-7-methyl-4-coumarine et procede pour mesurer l'activite enzymatique |
| DE19782808111 DE2808111A1 (de) | 1977-02-26 | 1978-02-24 | Neue dipeptidderivate und deren verwendung zur messung der enzymatischen aktivitaet |
| US05/943,778 US4191809A (en) | 1977-02-26 | 1978-09-20 | Method of measuring enzymatic activity using novel peptide derivatives |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2066377A JPS53105477A (en) | 1977-02-26 | 1977-02-26 | 7-glycylprolylamono-4-methylcoumarine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS53105477A JPS53105477A (en) | 1978-09-13 |
| JPS6126558B2 true JPS6126558B2 (ja) | 1986-06-20 |
Family
ID=12033434
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2066377A Granted JPS53105477A (en) | 1977-02-26 | 1977-02-26 | 7-glycylprolylamono-4-methylcoumarine |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS53105477A (ja) |
| DE (1) | DE2808111A1 (ja) |
| FR (1) | FR2381764A1 (ja) |
| GB (1) | GB1547747A (ja) |
| SE (1) | SE7801997L (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5524147A (en) * | 1978-08-10 | 1980-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Peptide derivative |
| US4294923A (en) * | 1979-04-23 | 1981-10-13 | Smith Robert E | Substrates and method for determining enzymes |
| US5079144A (en) * | 1982-04-14 | 1992-01-07 | Radiometer Corporate Development Ltd. | Microorganism testing with a hydrolyzable fluorogenic substrate |
| JPS59192099A (ja) * | 1983-04-12 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | 微生物菌数の測定法 |
| US5252484A (en) | 1988-11-29 | 1993-10-12 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Rapid read-out biological indicator |
| US5223401A (en) * | 1988-11-29 | 1993-06-29 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Rapid read-out sterility indicator |
| US5073488A (en) * | 1988-11-29 | 1991-12-17 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Rapid method for determining efficacy of a sterilization cycle and rapid read-out biological indicator |
| DE19735614A1 (de) * | 1997-08-16 | 1999-02-18 | Lothar Dr Seik | Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen). |
| US8043845B2 (en) | 2006-09-20 | 2011-10-25 | American Sterilizer Company | Sterilization indicator |
| US8895239B2 (en) | 2006-09-20 | 2014-11-25 | American Sterilizer Company | Genetically engineered biological indicator |
| US8173388B2 (en) | 2008-09-30 | 2012-05-08 | American Sterilizer Company | Self-contained biological indicator |
| USD608455S1 (en) | 2008-09-30 | 2010-01-19 | American Sterilizer Company | Self-contained biological indicator |
| CN103189523B (zh) | 2010-11-01 | 2016-03-02 | 3M创新有限公司 | 生物灭菌指示器 |
| EP2635699B1 (en) | 2010-11-01 | 2018-03-21 | 3M Innovative Properties Company | Biological sterilization indicator and method of using same |
| BR112013012593A2 (pt) | 2010-11-24 | 2016-09-06 | 3M Innovative Properties Co | métodos e composições para detectar uma atividade biológica |
| US20180237821A1 (en) | 2017-02-23 | 2018-08-23 | Ethicon, Inc. | Apparatus and method to read biological indicator |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3259617A (en) * | 1963-05-24 | 1966-07-05 | Squibb & Sons Inc | Process for purification of peptides |
| JPS5255593A (en) * | 1975-10-30 | 1977-05-07 | Ajinomoto Kk | Measuring method of enzyme activity |
-
1977
- 1977-02-26 JP JP2066377A patent/JPS53105477A/ja active Granted
-
1978
- 1978-02-21 SE SE7801997A patent/SE7801997L/xx unknown
- 1978-02-22 GB GB7155/78A patent/GB1547747A/en not_active Expired
- 1978-02-24 DE DE19782808111 patent/DE2808111A1/de not_active Withdrawn
- 1978-02-24 FR FR7805438A patent/FR2381764A1/fr not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS53105477A (en) | 1978-09-13 |
| GB1547747A (en) | 1979-06-27 |
| DE2808111A1 (de) | 1978-08-31 |
| FR2381764A1 (fr) | 1978-09-22 |
| SE7801997L (sv) | 1978-08-27 |
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