JPH0138800B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0138800B2 JPH0138800B2 JP60505413A JP50541385A JPH0138800B2 JP H0138800 B2 JPH0138800 B2 JP H0138800B2 JP 60505413 A JP60505413 A JP 60505413A JP 50541385 A JP50541385 A JP 50541385A JP H0138800 B2 JPH0138800 B2 JP H0138800B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- epo
- column
- erythropoietin
- buffer
- precipitate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/834—Urine; urinary system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/30—Signal or leader sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
請求の範囲
１ イオン交換樹脂クロマトグラフイー、ゲル
過及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフイー
のうち、少くとも１つの処理工程を経たとき
280nｍでの吸光度単位あたり少なくとも80000IU
の比活性を有するヒトエリトロポエチンを逆相−
HPLC処理に付することによつて得ることができ
る物質であつて、次の性質を有する均質なヒトエ
リトロポエチン。 (a) 逆相−HPLCで単一ビークとして移動 (b) SDS−PAGEにおける約34000ダルトンの分
子量、および (c) 280nｍでの吸光度単位あたり少なくとも
160000IUの比活性。 明細書 赤血球（Erythrocyte）は、哺乳類動物組織に
酸素を供給するという重要な役割を果たしてい
る。赤血球は骨髄中の赤芽細胞（erythroblast）
の成熟および分化によつて産生される。エリトロ
ポエチン（erythropoietin：EPOとも呼ばれる）
は、天然には哺乳動物中の赤血球形成を刺激する
糖タンパク質である。 例えば種々の貧血症のような、ある臨床状態に
おいては、赤血球の水準は好しくない程に低い。
外因的に投与されたEPOは、上記状態の臨床的
処置のための治療用薬剤としての可能性を有す
る。治療用に使用するためには、EPOが均質で
あることが高度に要求される。残念なことに、外
因性EPOは、有効利用性が低くしかも不均質で
あるため、実用化されていない。 エリトロポエチン関連物質のこれまでの調製法
は、一般的に、高いEPO水準を示す患者の尿を
濃縮および精製によるものであつた。例えば、米
国特許3865801；4303650および4397840を参照の
こと。特に、EPOはミヤケ（Miyake）他著、J.
Biol.Chem.、252：5558（1977）に記述された方
法によつて再生不良性貧血症患者の尿から精製さ
れた。この文献の記述は本明細書の一部として含
まれる。上記方法によつて精製されたEPOは、
電気泳動で単一のバンドとして移動するので、均
質であると考えられてきた。 発明者は、今、ミヤケらの方法によつて産生さ
れた上述の均質だと考えられるEPOの構造が
30000〜70000ダルトンの範囲の数種のポリペプチ
ド成分から成ることを発見した。 本発明は、初めて均質なEPO組成物を与える
ものである。発明者は、ミヤケ型の方法によつて
完全に精製されていないエリトロポエチン溶液を
逆相高速液体クロマトグラフイー（reverse
phaase high performance liquid
chromatography）にかけ、EPOタンパク質を溶
出させることにより、上記の組成物を調製した。
発明者は上述のように産生された均質なEPOを、
(a)実質的に表１で示されるアミノ酸配列、(b)逆相
HPLCで単一のピークとなる泳動、(c)SDS−
PAGEで約34000ダルトンを示す分子量、(d)280n
ｍにおける吸光度単位あたり少なくとも
120000IUの比活性、によつて特徴づけた。 比活性は、正式には「IU／ml／280nｍにおけ
る吸光度単位」で示されるが、便宜上、「IU」と
いう標準的な形で単に表わされる。 図面および表の簡単な説明 第１図は、本発明に従つて逆相高速液体クロマ
トグラフイーによつて処理されたEPO組成物の
溶出挙動を、時間に対して280nｍでのフラクシ
ヨンの吸光度で示したものである。 表１は、DNA配列から導かれたもので、その
分泌リーダー配列を含むヒトEPOタンパク質の
アミノ酸配列である。 均質なEPOを入手できることにより、対応す
るヒト遺伝子を“探り出す（fish out）”プロー
ブの造成を可能にする為の手法として知られてい
る技術によつてアミノ酸構造の配列決定を可能に
し、それによつて組み換えDNA技術によるEPO
産生を促進するであろう。 実際に、本発明のEPOの使用により得られた
塩基配列情報に基ずくEPO産生の為の実用可能
な組換えDNA方法は、本出願とともに係属中で
あり、同一人に譲渡されている1985年１月３日出
願の米国特許出願第688622号および1985年１月22
日出願の米国特許出願第693258号に記述されてい
る。 ミヤケらの方法は、フエノールｐ−アミノサリ
チル酸でEPO粗調製液を処理することによりあ
らゆるタンパク分解酵素を不活性化することを含
む。上記タンパク分解酵素は、加熱などの他の手
段によつても不活性化することができる。ミヤケ
らの述べた精製工程には、エタノール沈殿、
DEAE−アガロース分画化、スルホプロピル−セ
フアデツクスクロマトグラフイー、ゲル過およ
びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフイーが
含まれる。上記操作によつて得られた“精製され
た”EPO組成物は、280nｍにおける吸光度単位
あたり少なくとも約50000IU、望ましくは少なく
とも約80000IUのEPO in vivo比活性を有すると
報告されている。（上記のように、以前の手法に
よれば“純純な”EPOは約80000IUのin vivo比
活性を有すると考えられた）。 発明者は“精製された”ミヤケEPO構造が不
均質であることを見いだした。上記構成物を逆相
高速液体クロマトグラフイー（Ｒ−Ｐ HPLC）
によつてさらに処理することにより、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）による分析で約34000ダルトンの
分子量を示す均質なEPOが得られた。 本発明での使用に望ましい逆相HPLCカラム
は、C4炭素鎖（ブチル）基が結合したものであ
る。市販されている例としては、マサチユーセツ
ツ州サウスボロのネスト・グループ社から入手可
能な、Ｃ−４ヴアイダツク（Vydac）カラムがあ
る。推奨される溶離液は、0.01％から1.0％、望
ましくは0.1％のトリフルオロ酢酸中０％から95
％のアセトニトリル勾配を約100分間以上にわた
つてかけたものである。勿論、他の溶離液も使用
可能である。 本発明に従つて精製を行なつた場合、280nｍ
での吸光度単位あたり少なくとも120000IUの比
活性を持つEPO組成物が得られる。望ましい実
施例においては少なくとも160000IUの比活性を
持つものが得られる。ここで用いた“吸光度単
位”は、およそ１mlあたり１mgタンパク質であ
る。 ヒト由来の、分泌性リーダー配列を含むEPO
タンパク質のアミノ酸配列は、表１に示されてい
る。成熟EPOタンパク質はアラビア数字“１”
で示される“アラニン（Ala）”残基から開始す
る。分泌性リーダー配列は、成熟EPOタンパク
質に先立ち、数字“−27”で示される“メチオニ
ン（MET）”残基から始まるポリペプチド配列で
ある。上記DNA塩基配列はEPOタンパク質をプ
ロセツシングし、リーダー配列を除去し、成熟タ
ンパク質を培地中に分泌することが可能な細胞内
で発現できる。 本発明にかかる均質なヒトEPOのＮ末端アミ
ノ酸配列のアミノ酸７個は、遺伝子から推定され
るアミノ酸配列を示す表１のアラビア数字「１」
で示される「アラニン（Ala）」残基から開始さ
れるアミノ酸配列と一致していることが確認され
ている。 例えば種々の貧血症の治療などの臨床上の使用
においては、EPOの量は、治療が行われる症状
の程度、選択された投与経路、EPOの比活性に
もちろん依存し、最終的には医師の診察によつて
決定されるであろう。 EPOは治療される症状に適したいかなる経路
によつても投与できる。EPOは血流中に注射す
ることが望ましい。 本発明の調剤には、上述の活性EPOタンパク
質とともに、１種以上の製薬上許容される担体、
および、必要に応じて他の治療成分を含む。担体
は、調剤の際の他の成分と相容性であり、被投与
者に対して有毒ではないという意味において“許
容性”でなければならない。 非経口的投与に適した処方としては、非経口的
に受容可能な無菌的担体、例えば治療的有効量の
EPOを含有する水から構成されることが便利で
ある。そして、溶液は等張であることが望まし
い。 以下に述べる実施例は本発明の産物の調製法を
説明したものであるが、本発明は産物それ自体に
係る発明であり、下記実施例の調製法に限定され
ない。 実施例 再生不良性貧血患者由来のエリトロポエチン粗
調製液は透析によつて濃縮した。タンパク分解酵
素は80℃で５分間熱処理することにより不活性化
した。粗調製濃縮液は次に上記ミヤケ
（Miyake）らの方法によつて精製した。 Ａ エタノール沈殿 280nｍでの吸光度単位当り約50から100IUの
濃度であり、約100000IUのEPO活性を含有す
るバツチを、４℃においてリン酸緩衝溶液
（PBS）で50mlに希釈した。12.5mlの10M LiCl
を加えた。無水エタノール（62.5ml）を４℃に
おいて攪拌しながらゆつくり加え、添加が完了
してから30分間攪拌を続けた。羽毛状の沈殿物
を10分間沈降させた後−15゜で10分間21000×ｇ
の遠心によつて分離した。ペレツト状沈澱物は
10mlの50％エタノール、1M LiClで３回洗浄
し、上清は保存した。洗浄した沈殿物は20mlの
PBSに溶解し、不透明な溶液（50％沈殿物）
を得た。 保存し、いつしよにした上清に67mlの無水エ
タノールをゆつくり加えた。30分間攪拌を続
け、15分間沈降させた。沈殿物は上記のように
集め、10mlの65％エタノール、0.7M LiClで２
度洗浄し、上清は保存した。洗浄した沈殿物は
20mlのPBSに溶解した（65％沈殿物）。 保存しておいた上清に、96mlのエタノールを
ゆつくり加え、攪拌を30分間続け、その後沈殿
物を4゜で14時間沈降させた。沈殿物を10mlの75
％エタノール、0.5M LiClで２度洗浄し、上清
は保存した。沈殿物は20mlのPBSに溶解した
（75％沈殿物）。 上清を合わせたものは、540mlの無水アルコ
ールを加えることにより、90％エタノールと
し、30分間攪拌し、−20゜で48時間放置後に沈殿
物を集め、50mlの冷水に溶解して直後に凍結さ
せた。 Ｂ DEAE−アガロース分画化 90％エタノール沈殿物の水溶液はアミコン
UM−10限外過膜（Amicon UM−
10ultrafilter、アミコン社製、分画分子量：
10000、材質：高分子電解質ポリエレクトロラ
イト）で約５mlに濃縮し、次いで、0.01Mトリ
ス、PH7.0で25mlとし、その50μを分取した。
100から200メツシユのDEAE−アガロースを減
圧下で脱気し、0.01Mトリス、PH7.0に懸濁し、
9.2×直径2.5cmのカラムに充てんした（充てん
床体積45ml）。ゲルは1.5リツトルの0.01Mトリ
ス、PH6.9で洗浄した；充てん床体積（ml）に
対する添加吸光度単位の割合は6.65であつた。
試料は40分間にわたつてカラムに添加し、150
滴毎のフラクシヨンを集めた。カラムは211ml
の0.01Mトリス、PH７で洗浄し、次に以下の緩
衝液で溶出させた：366mlの0.01Mトリス、PH
7.0、５ｍＭ CaCl2；270mlの0.01Mトリス、
PH7.0、17ｍＭ CaCl2；194mlの0.01Mトリス、
PH7.0、３ｍＭ CaCl2；および65mlの0.1M
CaCl2。 カルシウムを含有しない緩衝液を使用した場
合、一貫性のない結果が得られ、活性にかなり
の損失が見られるため、上記工程以後、ヒドロ
キシルアパタイトカラムで使用するものを除
き、分画化においては全ての緩衝液にカルシウ
ムを添加した。精製の次の工程のため、顕著な
量のEPO活性を有するDEAEアガロースカラ
ムからの溶出液が選択された。 Ｃ スルホプロピル−セフアデツクスクロマトグ
ラフイー DEAE−アガロースカラムからの溶出液（17
ｍＭ CaCl2）を脱塩し、UM−10限外過膜
で濃縮し、次に２リツトルの５ｍＭ CaCl2、
PH7.5に対して一晩透析した。以下に述べる試
料分離の際には、30mlの透析された溶液を
0.1M HClの滴下によつてPH4.50とした。生じ
た少量の沈殿物は遠心によつて分離し、５mlの
５ｍＭ CaCl2、PH4.5で洗浄した。洗浄液は保
存しておいた上清とともに、５ｍＭ CaCl2、
PH4.50で緩衝化したスルホプロピル−セフアデ
ツクスカラム（15.0×2.5cm直径、充てん床体
積78.3ml）に通した。充てん床体積に対する吸
光度単位の比率は2.47であつた。上記比率が低
い値であることは、スルホプロピル−セフアデ
ツクスでの最適分画化のために望ましい。例え
ば、充てん床体積に対する吸光度単位比が10以
上の場合には、ほとんど全ての活性が流出分画
に見いだされる。以下の緩衝液をカラムの展開
に使用した。注入液は、５ｍＭ酢酸カルシウ
ム、PH4.50、固有伝導率＝1.075μmhocm-1を使
用した。溶出緩衝液は：7.5ｍＭ酢酸カルシウ
ム、PH4.70、固有伝導率＝2.100μmhocm-1：15
ｍＭ酢酸カルシウム、PH5.25、固有伝導率＝
2.100μmhocm-1：15ｍＭ酢酸カルシウム、
0.01Mトリス、PH7.24、固有伝導率＝
11.500μmhocm-1を用いた。カラムは4゜で0.4
ml／min.で流し、200滴ずつの分画を集めた。
280nｍでの吸光度を測定し、適当なプールを
得た後、プールされた溶液を中和し（溶出後１
時間以内）、分析に使用するため一部を採取し、
−20゜で保存した。 Ｄ ゲル過 スルホプロピル−セフアデツクスカラム分画
から得られた12.5ｍＭおよび15ｍＭ酢酸カルシ
ウム溶出液は２つの独立したバツチとして同じ
ゲルカラムにかけた。プールした溶液は、カラ
ムに流すのに先立ち、アミコンUM−２限外
過膜（アミコン社製、分画分子量：2000、材
質：高分子電解質ポリエレクトロライト）で約
５mlに濃縮し、10ｍＭ CaCl2、10ｍＭトリ
ス、PH6.87で緩衝化した。セフアデツクスＧ−
100ゲルは減圧下で脱気し、カラムに試料を流
す前に、同じ緩衝液で緩衝化した。エリトロポ
エチン画分のための使用に先立ち、分子量既知
のマーカーで、カラム（100×2.5cm直径）を調
べた。孔隙容積は135mlであり、ウシ血清アル
ブミンモノマーは224ml、オブアルブミンは258
ml、およびチトクロームは368mlで溶出した。
42cmの静水頭（hydrostatic head）を持つマリ
オツテびん（Mariotte bottle）によつて21か
ら22mlの緩衝液をカラムに通過させた際に、サ
ンプルをカラムの底部に加えた。各フラクシヨ
ンは4.1ml（120滴）ずつ集め、プールを作製し
た。プールした液は限外過によつて濃縮し、
その一部をアツセイした。 Ｅ ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフイー ヒドロキシルアパタイトは単位重力下でカラ
ム（6.1×1.5cm直径）に充填し、500mlの水で、
次いで400mlの0.5ｍＭリン酸緩衝液、PH7.1、
伝導率＝69μmhocm-1（緩衝液）で、流速を
0.3ml／min.に維持する蠕動ポンプ（peristaltic
pump）の使用により洗浄した。緩衝液洗浄
後、カラム長は3.4cm、充填床体積は6.0mlであ
つた。注入する試料は、濃縮液に水を加えるこ
とによりアミコンDM−５限外過膜（アミコ
ン社製、分画分子量：5000、材質：高分子電解
質ポリエレクトロライト）で濃縮脱塩し、過
膜の洗浄液を４℃で20分間6000×ｇで遠心し
た。少量の不溶性ペレツトは0.5ｍＭリン酸、
PH7.1で１回洗浄し、洗浄液は上清に加えた。
試料の一部をアツセイのために分取し、残りの
試料（22ml）をカラムに加えた。充てん床体積
（ml）に対する吸光度単位比は1.82であつた。
供給緩衝液は、流出液Ａが0.005以下になるま
でポンプでカラムに通し（149ml）、以下の溶出
手順を実施した：緩衝液、１ｍＭリン酸（PH
7.1、固有伝導率＝131μmhocm-1、150ml（フラ
クシヨン））；緩衝液、２ｍＭリン酸（PH
6.9、固有伝導率＝270μmhocm-1、220ml（フラ
クシヨンＡおよびＢ））、緩衝液、３ｍＭ
リン酸（PH6.9、固有伝導率＝402μmhocm-1、
84ml（フラクシヨン））；緩衝液、0.1Mリ
ン酸（PH6.8、固有伝導率＝9.6μmhocm-1、134
ml（フラクシヨン））。 EPO含有画分はアミコンDM−５限外過膜
を用いて濃縮し、一部はアツセイし、濃縮液は
凍結保存した。アツセイにより、280nｍ吸光
度単位あたりEPO比活性が83000IUであること
が示された。このin vitroでの比活性は、ミヤ
ケ他著、J.Biol.Chem.、252：5558（1977）のin
vivo比活性に相当する。 Ｆ 逆相HPLC レムリ（Laemmli）、英国、Nature、227：
680〜685頁（1970）による、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）で分析した結果、ヒドロキシルアパ
タイトカラムから得られた物質は、約
34000MWを主要成分とするおよそ70000MWか
ら30000MWの範囲の数種のポリペプチド成分
から成ることが示された。10ｍＭリン酸緩衝液
PH7.0中に10ml以下の容量で得られた上記EPO
調製液を、以下に述べるＲ−Ｐ HPLCにかけ
た。 EPO調製液は不完全凍結乾燥により10倍に
濃縮した。約200マイクロリツトルの上記濃縮
物質を、C4炭素基結合型Ｒ−Ｐ HPLCカラム
（市販例としてはＣ−４ヴアイダツクカラム
（Ｃ−4Vydac、ヴアイダツク社製：ブチル基結
合シリカベースカラム））（25×0.45cm、セパレ
ーシヨン・グループ）に注入し、表２に示した
勾配条件でＲ−Ｐ HPLCによつて分画化し
た。
過及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフイー
のうち、少くとも１つの処理工程を経たとき
280nｍでの吸光度単位あたり少なくとも80000IU
の比活性を有するヒトエリトロポエチンを逆相−
HPLC処理に付することによつて得ることができ
る物質であつて、次の性質を有する均質なヒトエ
リトロポエチン。 (a) 逆相−HPLCで単一ビークとして移動 (b) SDS−PAGEにおける約34000ダルトンの分
子量、および (c) 280nｍでの吸光度単位あたり少なくとも
160000IUの比活性。 明細書 赤血球（Erythrocyte）は、哺乳類動物組織に
酸素を供給するという重要な役割を果たしてい
る。赤血球は骨髄中の赤芽細胞（erythroblast）
の成熟および分化によつて産生される。エリトロ
ポエチン（erythropoietin：EPOとも呼ばれる）
は、天然には哺乳動物中の赤血球形成を刺激する
糖タンパク質である。 例えば種々の貧血症のような、ある臨床状態に
おいては、赤血球の水準は好しくない程に低い。
外因的に投与されたEPOは、上記状態の臨床的
処置のための治療用薬剤としての可能性を有す
る。治療用に使用するためには、EPOが均質で
あることが高度に要求される。残念なことに、外
因性EPOは、有効利用性が低くしかも不均質で
あるため、実用化されていない。 エリトロポエチン関連物質のこれまでの調製法
は、一般的に、高いEPO水準を示す患者の尿を
濃縮および精製によるものであつた。例えば、米
国特許3865801；4303650および4397840を参照の
こと。特に、EPOはミヤケ（Miyake）他著、J.
Biol.Chem.、252：5558（1977）に記述された方
法によつて再生不良性貧血症患者の尿から精製さ
れた。この文献の記述は本明細書の一部として含
まれる。上記方法によつて精製されたEPOは、
電気泳動で単一のバンドとして移動するので、均
質であると考えられてきた。 発明者は、今、ミヤケらの方法によつて産生さ
れた上述の均質だと考えられるEPOの構造が
30000〜70000ダルトンの範囲の数種のポリペプチ
ド成分から成ることを発見した。 本発明は、初めて均質なEPO組成物を与える
ものである。発明者は、ミヤケ型の方法によつて
完全に精製されていないエリトロポエチン溶液を
逆相高速液体クロマトグラフイー（reverse
phaase high performance liquid
chromatography）にかけ、EPOタンパク質を溶
出させることにより、上記の組成物を調製した。
発明者は上述のように産生された均質なEPOを、
(a)実質的に表１で示されるアミノ酸配列、(b)逆相
HPLCで単一のピークとなる泳動、(c)SDS−
PAGEで約34000ダルトンを示す分子量、(d)280n
ｍにおける吸光度単位あたり少なくとも
120000IUの比活性、によつて特徴づけた。 比活性は、正式には「IU／ml／280nｍにおけ
る吸光度単位」で示されるが、便宜上、「IU」と
いう標準的な形で単に表わされる。 図面および表の簡単な説明 第１図は、本発明に従つて逆相高速液体クロマ
トグラフイーによつて処理されたEPO組成物の
溶出挙動を、時間に対して280nｍでのフラクシ
ヨンの吸光度で示したものである。 表１は、DNA配列から導かれたもので、その
分泌リーダー配列を含むヒトEPOタンパク質の
アミノ酸配列である。 均質なEPOを入手できることにより、対応す
るヒト遺伝子を“探り出す（fish out）”プロー
ブの造成を可能にする為の手法として知られてい
る技術によつてアミノ酸構造の配列決定を可能に
し、それによつて組み換えDNA技術によるEPO
産生を促進するであろう。 実際に、本発明のEPOの使用により得られた
塩基配列情報に基ずくEPO産生の為の実用可能
な組換えDNA方法は、本出願とともに係属中で
あり、同一人に譲渡されている1985年１月３日出
願の米国特許出願第688622号および1985年１月22
日出願の米国特許出願第693258号に記述されてい
る。 ミヤケらの方法は、フエノールｐ−アミノサリ
チル酸でEPO粗調製液を処理することによりあ
らゆるタンパク分解酵素を不活性化することを含
む。上記タンパク分解酵素は、加熱などの他の手
段によつても不活性化することができる。ミヤケ
らの述べた精製工程には、エタノール沈殿、
DEAE−アガロース分画化、スルホプロピル−セ
フアデツクスクロマトグラフイー、ゲル過およ
びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフイーが
含まれる。上記操作によつて得られた“精製され
た”EPO組成物は、280nｍにおける吸光度単位
あたり少なくとも約50000IU、望ましくは少なく
とも約80000IUのEPO in vivo比活性を有すると
報告されている。（上記のように、以前の手法に
よれば“純純な”EPOは約80000IUのin vivo比
活性を有すると考えられた）。 発明者は“精製された”ミヤケEPO構造が不
均質であることを見いだした。上記構成物を逆相
高速液体クロマトグラフイー（Ｒ−Ｐ HPLC）
によつてさらに処理することにより、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）による分析で約34000ダルトンの
分子量を示す均質なEPOが得られた。 本発明での使用に望ましい逆相HPLCカラム
は、C4炭素鎖（ブチル）基が結合したものであ
る。市販されている例としては、マサチユーセツ
ツ州サウスボロのネスト・グループ社から入手可
能な、Ｃ−４ヴアイダツク（Vydac）カラムがあ
る。推奨される溶離液は、0.01％から1.0％、望
ましくは0.1％のトリフルオロ酢酸中０％から95
％のアセトニトリル勾配を約100分間以上にわた
つてかけたものである。勿論、他の溶離液も使用
可能である。 本発明に従つて精製を行なつた場合、280nｍ
での吸光度単位あたり少なくとも120000IUの比
活性を持つEPO組成物が得られる。望ましい実
施例においては少なくとも160000IUの比活性を
持つものが得られる。ここで用いた“吸光度単
位”は、およそ１mlあたり１mgタンパク質であ
る。 ヒト由来の、分泌性リーダー配列を含むEPO
タンパク質のアミノ酸配列は、表１に示されてい
る。成熟EPOタンパク質はアラビア数字“１”
で示される“アラニン（Ala）”残基から開始す
る。分泌性リーダー配列は、成熟EPOタンパク
質に先立ち、数字“−27”で示される“メチオニ
ン（MET）”残基から始まるポリペプチド配列で
ある。上記DNA塩基配列はEPOタンパク質をプ
ロセツシングし、リーダー配列を除去し、成熟タ
ンパク質を培地中に分泌することが可能な細胞内
で発現できる。 本発明にかかる均質なヒトEPOのＮ末端アミ
ノ酸配列のアミノ酸７個は、遺伝子から推定され
るアミノ酸配列を示す表１のアラビア数字「１」
で示される「アラニン（Ala）」残基から開始さ
れるアミノ酸配列と一致していることが確認され
ている。 例えば種々の貧血症の治療などの臨床上の使用
においては、EPOの量は、治療が行われる症状
の程度、選択された投与経路、EPOの比活性に
もちろん依存し、最終的には医師の診察によつて
決定されるであろう。 EPOは治療される症状に適したいかなる経路
によつても投与できる。EPOは血流中に注射す
ることが望ましい。 本発明の調剤には、上述の活性EPOタンパク
質とともに、１種以上の製薬上許容される担体、
および、必要に応じて他の治療成分を含む。担体
は、調剤の際の他の成分と相容性であり、被投与
者に対して有毒ではないという意味において“許
容性”でなければならない。 非経口的投与に適した処方としては、非経口的
に受容可能な無菌的担体、例えば治療的有効量の
EPOを含有する水から構成されることが便利で
ある。そして、溶液は等張であることが望まし
い。 以下に述べる実施例は本発明の産物の調製法を
説明したものであるが、本発明は産物それ自体に
係る発明であり、下記実施例の調製法に限定され
ない。 実施例 再生不良性貧血患者由来のエリトロポエチン粗
調製液は透析によつて濃縮した。タンパク分解酵
素は80℃で５分間熱処理することにより不活性化
した。粗調製濃縮液は次に上記ミヤケ
（Miyake）らの方法によつて精製した。 Ａ エタノール沈殿 280nｍでの吸光度単位当り約50から100IUの
濃度であり、約100000IUのEPO活性を含有す
るバツチを、４℃においてリン酸緩衝溶液
（PBS）で50mlに希釈した。12.5mlの10M LiCl
を加えた。無水エタノール（62.5ml）を４℃に
おいて攪拌しながらゆつくり加え、添加が完了
してから30分間攪拌を続けた。羽毛状の沈殿物
を10分間沈降させた後−15゜で10分間21000×ｇ
の遠心によつて分離した。ペレツト状沈澱物は
10mlの50％エタノール、1M LiClで３回洗浄
し、上清は保存した。洗浄した沈殿物は20mlの
PBSに溶解し、不透明な溶液（50％沈殿物）
を得た。 保存し、いつしよにした上清に67mlの無水エ
タノールをゆつくり加えた。30分間攪拌を続
け、15分間沈降させた。沈殿物は上記のように
集め、10mlの65％エタノール、0.7M LiClで２
度洗浄し、上清は保存した。洗浄した沈殿物は
20mlのPBSに溶解した（65％沈殿物）。 保存しておいた上清に、96mlのエタノールを
ゆつくり加え、攪拌を30分間続け、その後沈殿
物を4゜で14時間沈降させた。沈殿物を10mlの75
％エタノール、0.5M LiClで２度洗浄し、上清
は保存した。沈殿物は20mlのPBSに溶解した
（75％沈殿物）。 上清を合わせたものは、540mlの無水アルコ
ールを加えることにより、90％エタノールと
し、30分間攪拌し、−20゜で48時間放置後に沈殿
物を集め、50mlの冷水に溶解して直後に凍結さ
せた。 Ｂ DEAE−アガロース分画化 90％エタノール沈殿物の水溶液はアミコン
UM−10限外過膜（Amicon UM−
10ultrafilter、アミコン社製、分画分子量：
10000、材質：高分子電解質ポリエレクトロラ
イト）で約５mlに濃縮し、次いで、0.01Mトリ
ス、PH7.0で25mlとし、その50μを分取した。
100から200メツシユのDEAE−アガロースを減
圧下で脱気し、0.01Mトリス、PH7.0に懸濁し、
9.2×直径2.5cmのカラムに充てんした（充てん
床体積45ml）。ゲルは1.5リツトルの0.01Mトリ
ス、PH6.9で洗浄した；充てん床体積（ml）に
対する添加吸光度単位の割合は6.65であつた。
試料は40分間にわたつてカラムに添加し、150
滴毎のフラクシヨンを集めた。カラムは211ml
の0.01Mトリス、PH７で洗浄し、次に以下の緩
衝液で溶出させた：366mlの0.01Mトリス、PH
7.0、５ｍＭ CaCl2；270mlの0.01Mトリス、
PH7.0、17ｍＭ CaCl2；194mlの0.01Mトリス、
PH7.0、３ｍＭ CaCl2；および65mlの0.1M
CaCl2。 カルシウムを含有しない緩衝液を使用した場
合、一貫性のない結果が得られ、活性にかなり
の損失が見られるため、上記工程以後、ヒドロ
キシルアパタイトカラムで使用するものを除
き、分画化においては全ての緩衝液にカルシウ
ムを添加した。精製の次の工程のため、顕著な
量のEPO活性を有するDEAEアガロースカラ
ムからの溶出液が選択された。 Ｃ スルホプロピル−セフアデツクスクロマトグ
ラフイー DEAE−アガロースカラムからの溶出液（17
ｍＭ CaCl2）を脱塩し、UM−10限外過膜
で濃縮し、次に２リツトルの５ｍＭ CaCl2、
PH7.5に対して一晩透析した。以下に述べる試
料分離の際には、30mlの透析された溶液を
0.1M HClの滴下によつてPH4.50とした。生じ
た少量の沈殿物は遠心によつて分離し、５mlの
５ｍＭ CaCl2、PH4.5で洗浄した。洗浄液は保
存しておいた上清とともに、５ｍＭ CaCl2、
PH4.50で緩衝化したスルホプロピル−セフアデ
ツクスカラム（15.0×2.5cm直径、充てん床体
積78.3ml）に通した。充てん床体積に対する吸
光度単位の比率は2.47であつた。上記比率が低
い値であることは、スルホプロピル−セフアデ
ツクスでの最適分画化のために望ましい。例え
ば、充てん床体積に対する吸光度単位比が10以
上の場合には、ほとんど全ての活性が流出分画
に見いだされる。以下の緩衝液をカラムの展開
に使用した。注入液は、５ｍＭ酢酸カルシウ
ム、PH4.50、固有伝導率＝1.075μmhocm-1を使
用した。溶出緩衝液は：7.5ｍＭ酢酸カルシウ
ム、PH4.70、固有伝導率＝2.100μmhocm-1：15
ｍＭ酢酸カルシウム、PH5.25、固有伝導率＝
2.100μmhocm-1：15ｍＭ酢酸カルシウム、
0.01Mトリス、PH7.24、固有伝導率＝
11.500μmhocm-1を用いた。カラムは4゜で0.4
ml／min.で流し、200滴ずつの分画を集めた。
280nｍでの吸光度を測定し、適当なプールを
得た後、プールされた溶液を中和し（溶出後１
時間以内）、分析に使用するため一部を採取し、
−20゜で保存した。 Ｄ ゲル過 スルホプロピル−セフアデツクスカラム分画
から得られた12.5ｍＭおよび15ｍＭ酢酸カルシ
ウム溶出液は２つの独立したバツチとして同じ
ゲルカラムにかけた。プールした溶液は、カラ
ムに流すのに先立ち、アミコンUM−２限外
過膜（アミコン社製、分画分子量：2000、材
質：高分子電解質ポリエレクトロライト）で約
５mlに濃縮し、10ｍＭ CaCl2、10ｍＭトリ
ス、PH6.87で緩衝化した。セフアデツクスＧ−
100ゲルは減圧下で脱気し、カラムに試料を流
す前に、同じ緩衝液で緩衝化した。エリトロポ
エチン画分のための使用に先立ち、分子量既知
のマーカーで、カラム（100×2.5cm直径）を調
べた。孔隙容積は135mlであり、ウシ血清アル
ブミンモノマーは224ml、オブアルブミンは258
ml、およびチトクロームは368mlで溶出した。
42cmの静水頭（hydrostatic head）を持つマリ
オツテびん（Mariotte bottle）によつて21か
ら22mlの緩衝液をカラムに通過させた際に、サ
ンプルをカラムの底部に加えた。各フラクシヨ
ンは4.1ml（120滴）ずつ集め、プールを作製し
た。プールした液は限外過によつて濃縮し、
その一部をアツセイした。 Ｅ ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフイー ヒドロキシルアパタイトは単位重力下でカラ
ム（6.1×1.5cm直径）に充填し、500mlの水で、
次いで400mlの0.5ｍＭリン酸緩衝液、PH7.1、
伝導率＝69μmhocm-1（緩衝液）で、流速を
0.3ml／min.に維持する蠕動ポンプ（peristaltic
pump）の使用により洗浄した。緩衝液洗浄
後、カラム長は3.4cm、充填床体積は6.0mlであ
つた。注入する試料は、濃縮液に水を加えるこ
とによりアミコンDM−５限外過膜（アミコ
ン社製、分画分子量：5000、材質：高分子電解
質ポリエレクトロライト）で濃縮脱塩し、過
膜の洗浄液を４℃で20分間6000×ｇで遠心し
た。少量の不溶性ペレツトは0.5ｍＭリン酸、
PH7.1で１回洗浄し、洗浄液は上清に加えた。
試料の一部をアツセイのために分取し、残りの
試料（22ml）をカラムに加えた。充てん床体積
（ml）に対する吸光度単位比は1.82であつた。
供給緩衝液は、流出液Ａが0.005以下になるま
でポンプでカラムに通し（149ml）、以下の溶出
手順を実施した：緩衝液、１ｍＭリン酸（PH
7.1、固有伝導率＝131μmhocm-1、150ml（フラ
クシヨン））；緩衝液、２ｍＭリン酸（PH
6.9、固有伝導率＝270μmhocm-1、220ml（フラ
クシヨンＡおよびＢ））、緩衝液、３ｍＭ
リン酸（PH6.9、固有伝導率＝402μmhocm-1、
84ml（フラクシヨン））；緩衝液、0.1Mリ
ン酸（PH6.8、固有伝導率＝9.6μmhocm-1、134
ml（フラクシヨン））。 EPO含有画分はアミコンDM−５限外過膜
を用いて濃縮し、一部はアツセイし、濃縮液は
凍結保存した。アツセイにより、280nｍ吸光
度単位あたりEPO比活性が83000IUであること
が示された。このin vitroでの比活性は、ミヤ
ケ他著、J.Biol.Chem.、252：5558（1977）のin
vivo比活性に相当する。 Ｆ 逆相HPLC レムリ（Laemmli）、英国、Nature、227：
680〜685頁（1970）による、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS
−PAGE）で分析した結果、ヒドロキシルアパ
タイトカラムから得られた物質は、約
34000MWを主要成分とするおよそ70000MWか
ら30000MWの範囲の数種のポリペプチド成分
から成ることが示された。10ｍＭリン酸緩衝液
PH7.0中に10ml以下の容量で得られた上記EPO
調製液を、以下に述べるＲ−Ｐ HPLCにかけ
た。 EPO調製液は不完全凍結乾燥により10倍に
濃縮した。約200マイクロリツトルの上記濃縮
物質を、C4炭素基結合型Ｒ−Ｐ HPLCカラム
（市販例としてはＣ−４ヴアイダツクカラム
（Ｃ−4Vydac、ヴアイダツク社製：ブチル基結
合シリカベースカラム））（25×0.45cm、セパレ
ーシヨン・グループ）に注入し、表２に示した
勾配条件でＲ−Ｐ HPLCによつて分画化し
た。
【表】
EPOの生物学的活性は3H−チミジンアツセ
イ（クリスタル（Kristal）著、Exp.
Hematol.11：649−60（1983））あるいはCFU
−Ｅアツセイ（ベルシユ（Bersch）他著、In
vitro Aspects of Erythropoiesis、M.J.マー
フイ（Murphy）編、ニユーヨーク：スプリン
ガー−ヴエルロツツ（Springer−Verloz
（1978））のいずれかで測定した。 タンパク質ピークは280nｍにおけるUV吸収
によつて検出された。上記分画化方法は典型的
な溶出挙動は第１図に示す。EPOの均質性は、
Ｒ−Ｐ HPLC後の種々のピークのSDS−
PAGEおよびＮ末端アミノ酸配列分析により確
認された。第１図に下線で示したピークは、勾
配マーカー（ベツクマン・インストルメンツ社
製、モデル421：２種および３種溶媒の高精密
度組成比コントローラー）について53％の読み
と同時に溶出した。上記物質はSDS−PAGEで
約34000MWの単一のバンドとして流動し、ヒ
トEPOの配列として既に報告されている、単
一の末端アミノ酸配列：Ala、Pro、Pro、
Arg、Leu、Ile、Cysを得た。上記の約
34000MWのＲ−Ｐ HPLCフラクシヨンのみ
がin vitroでのあらゆる顕著な生物学的活性を
示した。この生物学的活性は、in vivoにおい
ても保持される。Ｒ−Ｐ HPLCによつて溶出
されたEPOタンパク質は、ヒドロキシルアパ
タイトカラムから溶離された物質（ステツプ
Ｅ）の約２倍の純度であつた。
イ（クリスタル（Kristal）著、Exp.
Hematol.11：649−60（1983））あるいはCFU
−Ｅアツセイ（ベルシユ（Bersch）他著、In
vitro Aspects of Erythropoiesis、M.J.マー
フイ（Murphy）編、ニユーヨーク：スプリン
ガー−ヴエルロツツ（Springer−Verloz
（1978））のいずれかで測定した。 タンパク質ピークは280nｍにおけるUV吸収
によつて検出された。上記分画化方法は典型的
な溶出挙動は第１図に示す。EPOの均質性は、
Ｒ−Ｐ HPLC後の種々のピークのSDS−
PAGEおよびＮ末端アミノ酸配列分析により確
認された。第１図に下線で示したピークは、勾
配マーカー（ベツクマン・インストルメンツ社
製、モデル421：２種および３種溶媒の高精密
度組成比コントローラー）について53％の読み
と同時に溶出した。上記物質はSDS−PAGEで
約34000MWの単一のバンドとして流動し、ヒ
トEPOの配列として既に報告されている、単
一の末端アミノ酸配列：Ala、Pro、Pro、
Arg、Leu、Ile、Cysを得た。上記の約
34000MWのＲ−Ｐ HPLCフラクシヨンのみ
がin vitroでのあらゆる顕著な生物学的活性を
示した。この生物学的活性は、in vivoにおい
ても保持される。Ｒ−Ｐ HPLCによつて溶出
されたEPOタンパク質は、ヒドロキシルアパ
タイトカラムから溶離された物質（ステツプ
Ｅ）の約２倍の純度であつた。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/690,853 US4677195A (en) | 1985-01-11 | 1985-01-11 | Method for the purification of erythropoietin and erythropoietin compositions |
| US690853 | 1985-01-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501701A JPS62501701A (ja) | 1987-07-09 |
| JPH0138800B2 true JPH0138800B2 (ja) | 1989-08-16 |
Family
ID=24774236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60505413A Granted JPS62501701A (ja) | 1985-01-11 | 1985-11-27 | 均質なエリトロポエチン |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4677195A (ja) |
| EP (1) | EP0209539B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62501701A (ja) |
| AT (1) | ATE76412T1 (ja) |
| AU (1) | AU584032B2 (ja) |
| BR (1) | BR1100044A (ja) |
| DE (1) | DE3586104D1 (ja) |
| HK (1) | HK105793A (ja) |
| MX (1) | MX9203128A (ja) |
| SG (1) | SG93893G (ja) |
| WO (1) | WO1986004068A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142288A1 (ja) | 2006-06-07 | 2007-12-13 | The University Of Tokushima | エリスロポエチンを用いた虚血性疾患の治療 |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4900811A (en) * | 1983-07-21 | 1990-02-13 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same |
| US5242798A (en) * | 1983-07-21 | 1993-09-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides corresponding to portions of proteinoids translated from brain-specific mRNAs, receptors, methods and diagnostics using the same |
| KR850004274A (ko) * | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| UA29377C2 (uk) * | 1984-09-19 | 2000-11-15 | Новартіс Аг | Спосіб отримання білка з активністю колонієстимулювального фактора гранулоцитів та макрофагів(gm-csf) приматів |
| US5322837A (en) * | 1985-01-11 | 1994-06-21 | Genetics Institute, Inc. | Homogeneous erythropoietin compositions and methods of using same |
| IL79176A (en) * | 1985-06-20 | 1992-06-21 | Kirin Amgen Inc | Process for the recovery of erythropoietin from a fluid |
| JPH0764742B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1995-07-12 | ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド | Ａｉｄｓ型疾患治療用組成物 |
| EP0253331B1 (en) * | 1986-07-15 | 1994-10-19 | Kowa Co. Ltd. | Thrombin-binding substance and process for its preparation |
| US4954437A (en) * | 1986-09-15 | 1990-09-04 | Integrated Genetics, Inc. | Cell encoding recombinant human erythropoietin |
| US4965251A (en) * | 1987-04-03 | 1990-10-23 | The Board Of Regents Of The University Of Washington | Pulse treatment of hemoglobinopathies with erythropoietin |
| DE3924746A1 (de) * | 1989-07-26 | 1991-01-31 | Behringwerke Ag | Erythropoietin (epo)-peptide und dagegen gerichtete antikoerper |
| US6932968B1 (en) | 1989-07-26 | 2005-08-23 | Dade Behring Marburg Gmbh | Erythropoietin (EPO) peptides and antibodies directed against these |
| FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US6153407A (en) * | 1992-07-28 | 2000-11-28 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Erythropoietin DNA having modified 5' and 3' sequences and its use to prepare EPO therapeutics |
| US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
| US5548064A (en) * | 1993-05-24 | 1996-08-20 | Biotech Australia Pty Limited | Vitamin B12 conjugates with EPO, analogues thereof and pharmaceutical compositions |
| US5773569A (en) * | 1993-11-19 | 1998-06-30 | Affymax Technologies N.V. | Compounds and peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5830851A (en) * | 1993-11-19 | 1998-11-03 | Affymax Technologies N.V. | Methods of administering peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US5919758A (en) * | 1994-03-22 | 1999-07-06 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Modified polypeptides with altered biological activity |
| US5580853A (en) * | 1994-03-22 | 1996-12-03 | New England Deaconess Hospital | Modified polypeptides with increased biological activity |
| US5747446A (en) * | 1994-03-22 | 1998-05-05 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Modified polypeptides with increased biological activity |
| US5888774A (en) * | 1994-12-19 | 1999-03-30 | Cangene Corporation | Recombinant DNA molecules and expression vectors for erythropoietin |
| IL117849A (en) * | 1995-04-14 | 2002-07-25 | Lepetit Spa | Chromatographic process for clearing glycoproteins |
| IL118201A (en) * | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
| US5981716A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Gruppo Lepettit, S.P.A. | Process for the purification of proteins |
| EP0752474A1 (en) | 1995-07-07 | 1997-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid coding for CMP-N-acetyl-neuraminic acid hydroxylase and its use for the production of modified glycoproteins |
| KR100400637B1 (ko) * | 1996-02-06 | 2004-03-10 | 씨제이 주식회사 | 생물학적으로유용한펩타이드 |
| US6632648B1 (en) | 1996-05-14 | 2003-10-14 | Elan Drug Delivery Limited | Methods of terminal sterilization of fibrinogen |
| US6004808A (en) * | 1996-06-21 | 1999-12-21 | Aurora Biosciences Corporation | Promiscuous G-protein compositions and their use |
| US5952226A (en) * | 1996-11-05 | 1999-09-14 | Modex Therapeutiques | Hypoxia responsive EPO producing cells |
| US5985214A (en) | 1997-05-16 | 1999-11-16 | Aurora Biosciences Corporation | Systems and methods for rapidly identifying useful chemicals in liquid samples |
| USRE40911E1 (en) | 1998-04-22 | 2009-09-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| US6696411B1 (en) * | 1998-04-22 | 2004-02-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine erythropoietin gene and recombinant protein |
| BR9905868A (pt) * | 1998-11-06 | 2001-01-23 | Bio Sidus S A | Procedimento de cultivo massivo de células de mamìfero para a obtenção de eritropoetina humana, recombinante e a eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| US6777205B1 (en) | 1998-11-06 | 2004-08-17 | Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. | Host cells expressing recombinant human erythropoietin |
| JO2291B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
| US6703480B1 (en) | 1999-11-24 | 2004-03-09 | Palani Balu | Peptide dimers as agonists of the erythropoientin (EPO) receptor, and associated methods of synthesis and use |
| EP2213743A1 (en) | 2000-04-12 | 2010-08-04 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU2002233230B2 (en) | 2000-12-20 | 2007-02-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Erythropoietin conjugates |
| PE20021017A1 (es) * | 2001-04-03 | 2002-11-24 | Pharmacia Corp | Composicion parenteral reconstituible |
| EP1453857B1 (en) * | 2001-11-28 | 2014-08-13 | Sandoz AG | Chromatographic purification of recombinant human erythropoietin |
| WO2005003296A2 (en) | 2003-01-22 | 2005-01-13 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU2002364586A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Delta Biotechnology Limited | Albumin fusion proteins |
| AU2004238868B2 (en) * | 2003-05-12 | 2010-01-21 | Affymax, Inc. | Peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| CN1820024B (zh) * | 2003-05-12 | 2011-06-22 | 阿费麦克斯公司 | 新的聚(乙二醇)修饰的化合物及其用途 |
| ATE428727T1 (de) | 2003-05-12 | 2009-05-15 | Affymax Inc | Neue, an den erythropoietinrezeptor bindende peptide |
| US7919118B2 (en) * | 2003-05-12 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Spacer moiety for poly (ethylene glycol) modified peptide based compounds |
| ATE469654T1 (de) | 2003-12-30 | 2010-06-15 | Augustinus Bader | Verwendung des erythropoietins zur regeneration von lebergewebe |
| JP2008519858A (ja) * | 2004-11-11 | 2008-06-12 | アフィーマックス・インコーポレイテッド | エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド |
| WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US7919461B2 (en) * | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| EP1978030A4 (en) | 2006-01-18 | 2009-12-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | PROCESS FOR REMOVING SIALIC ACID AND METHOD FOR PRODUCING ASIALOERYTHROPOIETIN |
| JP5553506B2 (ja) * | 2006-03-22 | 2014-07-16 | 中外製薬株式会社 | エリスロポエチン溶液製剤 |
| PL2054074T3 (pl) | 2006-08-04 | 2015-03-31 | Prolong Pharmaceuticals Llc | Zmodyfikowana erytropoetyna |
| WO2008065372A2 (en) | 2006-11-28 | 2008-06-05 | Nautilus Biotech, S.A. | Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment |
| DE102008002210A1 (de) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Erythropoietin |
| CN102164954B (zh) | 2008-09-23 | 2018-04-06 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 促红细胞生成素的纯化 |
| EA022396B1 (ru) | 2009-09-23 | 2015-12-30 | Ратиофарм Гмбх | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин |
| WO2012097256A1 (en) * | 2011-01-14 | 2012-07-19 | University Of Tennessee Research Foundation | Therapeutic compositions and methods for disorders associated with neuronal degeneration |
| US10066001B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-09-04 | Apotex Inc. | Enhanced liquid formulation stability of erythropoietin alpha through purification processing |
| WO2017169978A1 (ja) * | 2016-03-31 | 2017-10-05 | 株式会社カネカ | 精製されたネコ由来エリスロポエチンの製造方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3033753A (en) * | 1959-08-31 | 1962-05-08 | Wilfrid F White | Erythropoietic factor purification |
| US4254095A (en) * | 1978-04-27 | 1981-03-03 | Research Corporation | Radioimmunoassay for erythropoietin |
| US4377482A (en) * | 1978-04-28 | 1983-03-22 | Salk Institute For Biological Studies | Mobile phase for liquid chromatography |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| JPS5653696A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-13 | Ajinomoto Co Inc | Isolation of erythropoietin by adsorption |
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| JPS57149228A (en) * | 1981-03-11 | 1982-09-14 | Ajinomoto Co Inc | Novel erythropoietin and its preparation |
| US4558005A (en) * | 1982-09-13 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Monoclonal anti-erythropoietin |
| US4558006A (en) * | 1983-02-04 | 1985-12-10 | Kirin-Amgen, Inc. | A.T.C.C. HB8209 and its monoclonal antibody to erythropoietin |
| JPH0686480B2 (ja) * | 1983-02-21 | 1994-11-02 | 雪印乳業株式会社 | エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体 |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| IT1185503B (it) * | 1984-01-11 | 1987-11-12 | Univ New York | Cloni di odna di eritropietina umana |
| US4568488A (en) * | 1984-01-11 | 1986-02-04 | Lee Huang Sylvia | Reverse immunoaffinity chromatography purification method |
| IL77081A (en) * | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | Dna sequence encoding human erythropoietin process for the preparation thereof and a pharmaceutical composition of human erythropoietin |
-
1985
- 1985-01-11 US US06/690,853 patent/US4677195A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-27 WO PCT/US1985/002358 patent/WO1986004068A1/en not_active Ceased
- 1985-11-27 JP JP60505413A patent/JPS62501701A/ja active Granted
- 1985-11-27 MX MX9203128A patent/MX9203128A/es unknown
- 1985-11-27 DE DE8686900400T patent/DE3586104D1/de not_active Revoked
- 1985-11-27 AT AT86900400T patent/ATE76412T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-11-27 EP EP86900400A patent/EP0209539B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-27 AU AU51911/86A patent/AU584032B2/en not_active Ceased
-
1993
- 1993-08-11 SG SG93893A patent/SG93893G/en unknown
- 1993-10-07 HK HK1057/93A patent/HK105793A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-09-17 BR BR1100044-9A patent/BR1100044A/pt active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BIOL CHEM * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007142288A1 (ja) | 2006-06-07 | 2007-12-13 | The University Of Tokushima | エリスロポエチンを用いた虚血性疾患の治療 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE76412T1 (de) | 1992-06-15 |
| US4677195A (en) | 1987-06-30 |
| MX9203128A (es) | 1992-07-01 |
| JPS62501701A (ja) | 1987-07-09 |
| WO1986004068A1 (en) | 1986-07-17 |
| EP0209539A1 (en) | 1987-01-28 |
| HK105793A (en) | 1993-10-15 |
| EP0209539A4 (en) | 1988-07-29 |
| DE3586104D1 (en) | 1992-06-25 |
| EP0209539B1 (en) | 1992-05-20 |
| AU584032B2 (en) | 1989-05-11 |
| SG93893G (en) | 1994-02-25 |
| AU5191186A (en) | 1986-07-29 |
| BR1100044A (pt) | 2000-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0138800B2 (ja) | ||
| RU2179034C2 (ru) | ЛЕЧЕНИЕ В СЛУЧАЕ ДЕФИЦИТА α-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А | |
| EP0061138B1 (en) | Angiotropins of leukocytes and inflamed tissue: a new class of natural chemotropic protein mitogens for specific induction of directional growth of blood vessels, neovascularization of tissues and morphogenesis of blood vessel patterns, process for their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
| EP0458959B1 (en) | Novel platelet-derived growth factor b chain analogs and method for homogeneous production thereof | |
| JP2798413B2 (ja) | ヒト神経成長因子 | |
| BG65449B1 (bg) | Еритропоетинови производни | |
| JPS63169995A (ja) | β−インターフェロンの回収及び精製方法 | |
| EP0061141B1 (en) | Chemokinesins and chemotaxins of leukocytes and inflamed tissues: natural mediator proteins for reversible promotion of random and directional locomotion (chemokinesis and chemotaxis) for accumulation of specific leukocyte types, process of their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
| US5322837A (en) | Homogeneous erythropoietin compositions and methods of using same | |
| Kniep et al. | Purification of the T lymphocyte growth factor interleukin‐2 from culture media of human peripheral blood leukocytes (buffy coats) | |
| WO1993021224A1 (en) | Ultrapure human epidermal growth factor | |
| EP0061139B1 (en) | Mitogens of leukocytes and inflamed tissues: natural leukopoietic proteins for specific induction of proliferation and differentiation of leukocytes, process for their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
| EP0446931A1 (en) | Human ciliary neuronotrophic factor, DNA sequence encoding the factor, and production of the factor by recombinant technology | |
| US6087123A (en) | Metal-containing ribonucleotide polypeptides | |
| Lee-Huang | A new preparative method for isolation of human erythropoietin with hydrophobic interaction chromatography | |
| EP0061140B1 (en) | Chemorecruitins of leukocytes and inflamed tissues: a new class of natural leukopoietin proteins for chemorecruitment of specific leukocyte types from the bone marrow into blood circulation (leukocytosis and leftward shift reactions), process for their biotechnical preparation and pharmaceutical compositions | |
| JPH02502640A (ja) | Ｇｍ‐ｃｓｆの精製 | |
| KR930701475A (ko) | 사람의 거핵구-집락 촉진 인자(hMeg-CSF) 및 그것의 생산방법 | |
| US4552761A (en) | Method for influencing the immune systems of mammals using leukorecruitin | |
| WO1987007617A1 (en) | A novel protein, neuroleukin | |
| CA2113815A1 (en) | Purification of recombinant ciliary neurotrophic factor and c-terminal truncated ciliary neurotrophic factor and methods for treating peripheral nerve damage | |
| Kamis et al. | {BLR 1792} Amgen-Epo-Genetics Institute-Ortho: Round Two: Genetics Institute Sues Ortho Over Reissued Erythropoietin Patent | |
| EP0475719A2 (en) | Platelet derived growth regulating peptide | |
| KR970007196B1 (ko) | 재조합 효모로부터 미드카인을 정제하는 방법 | |
| KR950004015B1 (ko) | 재조합 종양괴사인자(TNF-α)의 개선된 정제방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |