JPS62501701A - 均質なエリトロポエチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 均質なエリトロポエチン 赤血球（Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　）は、哺乳類動物組織に酸素を供給するとい う重要ガ役割を果たしている。赤血球は骨髄中の赤芽細胞（ｇｒｙｔｈｒｏｂｌ ａｓｔ　）の成熟および分化によって産生される。エリトロポエチン（ｇｒｙｔ ）５ｒｏｐｏｉ−ｅｔｉｎ：ＥＰＯとも呼ばれる）は、天然には捕乳動物中の赤 血球形成を刺激する糖タンパク質である。

例えば種々の貧血症のような、ある臨床状態においては、赤血球の水準は好しく ない程に低い。外因的に投与されたＥＰＯは、上記状態の臨床的処置のだめの治 療用薬剤としての可能性を有する。治療用に使用するためには、ＥＰＯが均質で あることが高度に要求される。残念なことに、外因性ＥＰＯは、有効利用性が低 くしかも不均質であるため、実用化されていない。

エリトロポエチン関連物質のこれまでの調製法は、一般的に、高いＥＰＯ水準を 示す患者の尿の濃縮および精製によるものであった。例えば、米国特許３，８６ ５，８０１；４．３０３，６５０および４，３９７，８４０を参照のこと。特に 、ＥＰＯはミャケ（Ｍｉｙａ＆ｇ）他著、Ｊ、　Ｅｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、　。

２５２：５５５８（１９７７）に記述された方法によって再生不良性貧血症患者 の尿から精製された。この文献の記述は本明細書の一部として含まれる。上記方 法によって精製されたＥＰＯは、電気泳動で単一のバンドとして移動するので、 均質であると考えられてきた。

発明者は、今、ミャケらの方法によって産生された上述の均質だと考えられるＥ ＰＯの構造が３０，０００〜７０．０００ダルトンの範囲の数種のポリペプチド 成分から成ることを発見した。

本発明は、初めて均質なＥＰＯ組成物を与えるものである。発明者は、ミャケ型 の方法によって完全に精製されていないエリトロポエチン溶液を逆相高速液体ク ロマトグラフィー（ｒａｖｅτｓｇ　ｐｈａａｓｇ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍ ａｎｃｅｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｒｎａｔｏｇｒａｐｈｙ　）にかけ、Ｂ’ＰＯ タンパク質を溶出させることにより、上記の組成物を調製した。発発者は上述の ように産生された均質なＥＰＯを、（α）実質的に表１で示されるアミノ酸配列 、（ｂ１逆相ＨＰＬＣで単一のピークとなる泳動、（ｃ、ｌ５Ｄｓ−ＰＡＧＦ： で約３４，０００ダルトンを示す分子量、（ｄ１２８０　ｎｔｎにおける吸光度 単位あたり少なくとも１２０，０００１１．ｒの比活性、によって特徴づけた。

第１図は、本発明に従って逆相高速液体クロマトグラフィーによって処理された ＥＰＯ組成物の溶出挙動を、時間に対して２８０　ｎｍでのフラクションの吸光 度で示したものである。

表１は、その分泌リーダー配列を含むヒトＥＰＯタンパク質のアミノ酸配列であ る。

均質なＥＰＯを入手できることにより、対応するヒト遺伝子を１探り出す（ｆｉ ｓｈ　ｏｓｔ　）”プローブの造成を可能にする為の手法として知られている技 術によってアミノ酸構造の配列決定を可能にし、それによって組み換えＤＮＡ技 術によるｇｐｏ産生を促進するであろう。

実際に、本発明のＥＰＯの使用により得られた塩基配列情報に基ず（ＥＰＯ産生 の為の実用可能な組換えＤＮＡ方法は、本出願とともに係属中であり、同一人に 譲渡されている１９８５年１月３日出願の米国特許出願第６８８．６２２号およ び１９８５年１月２２日出願の米国特許出願第６９３，２５８号に記述されてい る。

ミャケらの方法は、フェノールｐ−アミノサリチル酸でＥＰＯ粗調製液を処理す ることによりあらゆるタンパク分解酵素を不活性化することを含む。上記タンパ ク分解酵素は、加熱などの他の手段によっても不活性化することができる。ミャ クらの述べた精製工程には、エタノール沈殿、ＤＥＡＥ−アガロース分画化、ス ルホプロピル−セファデックスクロマトグラフィー、ゲル濾過およびヒドロキシ ルアパタイトクロマトグラフィーが含まれる。上記操作によって１与られた”精 製された″ＥＰＯ組成物は、２８０　ｎｍにおける吸光度単位あたり少なくとも 約５０，０００１Ｕ、望ましくは少なくとも約ｓｏ、ｏｏ。

ＩＵのＥＰＯ比活性を有すると報告されている。（上記のように、以前の手法に よれば”純粋な”ＥＰＯは約８０．０００１　Ｕの比活性を有すると考えられた ）。

発明者は“精製された”ミャケＥＰＯ構造が不均質であることを見いだした。上 記構成物を逆相高速液体クロマトグラフィーＣＲ−ｐ　ｎｐｒ、ｃ）によってさ らに処理することにより、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気 泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析で約３４．０００ダルトンの分子量を示す 均質なＥＰＯが得られた。

本発明での使用に望ましい逆相ＨＰＬＣカラムはｓ　Ｃ４突素頌（ブチル）基が 結合したものである。市販されている例としては、マザチューセツツ州すウスボ ロのネスト・グループ社から入手可能な、Ｃ−４ヴアイダツク（Ｖｙｄａｃ　） カシムがある。Ｃ３炭素鎖基あるいはＣ１ａ炭素釦基のような他の炭素鎖基を持 つような別の逆相カラムも使用可能である。推奨される溶離液は、０．０１％か ら１．０％、望ましくは０．１％のトリフルオロ酢酸中０％から９５％のアセト ニトリル勾配を約１００分間以上にわたってかけたものである。勿論、他の凝離 液も使用可能である。

本発明に従って精製を行なった場合、２８０％ｍでの吸光度単位あたり少なくと も１２０，０００１びの比活性を持つＥＰＯｇ成物が得られる。望ましい実施例 においては少なくとも１６０，０００７Ｕの比活性を持つものが得られる。ここ で用いた６吸元度単位”は、およそ１ｍ７！あたり１〜タンパク質である。

ヒト由来の、分泌性リーダー配列を含むＥＰＯタンパク質のアミノ酸配列は、表 １に示されている。成熟ＥＰＯタンパク質はアラビア数字″ｌ”で示される６ア ラニン（Ａｌａ）″残基から開始する。分泌性リーダー配列は、成熟ＥＰＯタン パク質に先立ち、数字″−２７″で示される“メチオニン（ＭＥＴ）”残基から 始まるポリペプチド配列である。上記ＤＮＡ塩基配列はＥＰＯタンパク質をプロ セッシングし、リーダー配列を除去し、成熟タンパク質を培地中に分泌すること が可能な細胞内で発現できる。

例えば種々の貧血症の治療などの臨床上の使用においては、ＥＰＯの量は、治療 が行われる症状の程度、選択された投与経路、ｇｐｏの比活性にもちろん依存し 、最終的には医師の診察によって決定されるであろう。

ＥＰＯは治療される症状に適したいかなる経路によっても投与できる。ＥＰＯは 血流中に注射することが望ましい。

本発明の調剤には、上述の活性ＥＰＯタンパク質とともに、Ｌ種以上の製薬上許 容される担体、および、必要に応じて他の治療成分を含む。担体は、調剤の際の 他の成分と相容性てあり、被投与者に対して有毒ではないという意味において６ 許容性”でなければならない。

非経口的投与に適した処方としては、非経口的に受容可能な無菌的担体、例えば 治療的有効量のＥＰＯを含有する水から構成されることが便利である。そして、 溶液は等張であることが望ましい。

以下に述べる実施例は本発明の産物の調製法を説明したものである。

実施例 再生不良性貧血患者由来の工ＩＪ　）ロボエチン粗調製液は透析によって濃縮し た。タンパク分解酵素は８０℃で５分間熱処理することにより不活性化した。粗 調製濃縮液は次に上記ミャケ（Ｍａｙα＆ｇ）らの方法によって精製した。

Ａ、エタノール沈殿 ２８０　ｎｍでの吸光度単位当り約５０から１００ＩＵの濃度であり、約１００ ，０ＯＯＩＵのＥＰＯ活性を含有するバッチを、４℃においてリン酸緩衝溶液（ ＰＢＳ）で５０−に希釈した。１２．５艷の１０　Ｍ　ＬｉＣ１を加えた。

無水エタノール（６２，５ｒｄ）を４℃において撹拌しながらゆっくり加え、添 加が完了してから３０分間撹拌を続けた。羽毛状の沈殿物を１０分間沈降させた 後−１５゜で１０分間２１，０００ＸＬ？の遠心によって分離した。ペレット状 沈澱物は１０−の５０％エタノール、ＩＭＬｉＣＬで３回洗浄し、上清は保存し た。洗浄した沈殿物は２０ｄのＰＢＳに溶解し、不透明な溶液（５０％沈殿物） を得た。

保存し、いっしょにした上清に６７−の無水エタノールをゆっくり加えた。３０ 分間撹拌を続け、１５分間沈降させた。沈殿物は上記のように集め、１０１艷の ６５％エタノール、０．７　Ｍ　ＬｉＣＬで２度洗浄し、上清は保存した。洗浄 した沈殿物は２０ｍ１のＰＢＳに溶解した（６５％沈殿物）。

保存しておいた上清に、９６−のエタノールをゆっくり加え、撹拌を３０分間続 け、その後沈殿物を４°で１４時間沈降させた。沈殿物を１０ｍ１の７５％エタ ノール、０．５　Ｍ　ＬｉＣ１で２度洗浄し、上清は保存した。沈殿物は２０　 ｎｉｌのＰＢＳに溶解した（７５％沈殿物）。

上清を合わせたものは、５４０−の無水アルコールを加えることにより、９０％ エタノールとし、３０分間撹拌し、−２０°で４８時間放置後に沈殿物を集め、 ５０ｎ！の冷水に溶解して直後に凍結させた。

Ｅ、ＤＥＡＥ−アガロース分画化 ９０％エタノール沈殿物の水溶液はアミコンＵＭ−１０限外濾過膜（Ａｍｉｃｏ ｎＵＭ−１（Ｊ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ）で約５ｍｌに濃縮し、次いで、０． ０１Ａ／）リス、ｐＨ７，（Ｉで２５−とし、その５０μｔを分取した。１００ から２００メツシユのＤＥＡＥ−アガロースを減圧下で脱気し、０．０１Ｍ　ト リス、ｐＨ７，０に懸濁し、９．２×直径２．５ｃｍのカラムに充てんした（充 てん比体積４５　ｍｌ、　）。ゲルは１５リツトルの０．ＯＩＡ／トリス、ｐＨ ６，９で洗浄した；充てん比体積（＋＋＋／）ｔｃ対する添加吸光度単位の割合 は６．６５であった。試料は１１０分間にわたってカラムに添加し、１５０滴毎 のフラクションを集めた。カラムは２１１　ｍｌの０．０ＩＡｆ　ト！Ｊス、ｐ Ｈ７で洗浄し、次に以下の緩衝液で溶出させた＝３６６−の０．０１Ａｆ）リス 、ｐＨ７，０，５ｍｕ　ＣａＣ１ｔ　：　２７０　ｍｌの０．０１Ａｆ）リス、 ｐＨ７，０。

１７　ｔｎＡｆ　ＣａＣ１，２：　１９４　ｍｌの０．０１Ｍ）リス、ｐＨ７， ０，３ｍＡ／　ＣａＣｌ２　；および６５ｒｎｌ！の０．　Ｉ　Ｍ　ＣａＣｌ２ ゜カルシウムを含有しない緩衝液を使用した場合、一貫性のない結果が得られ、 活性にかなりの損失が見られるため、上記工程以後、ヒドロキシルアパタイトカ ラムで使用するものを除き、分画化においては全ての緩衝液にカルシウムを添加 した。精製の次の工程のため、顕著な量のＥＰＯ活性を有するＤＥＡＥアガロー スカラムからの溶出液が選択された。

Ｃ，スルホプロピル−セファデックスクロマトグラフィー ＤＥＡＥ−アガロースカラムからの溶出液（１７ｍＭＣａ　ＣＡ２）を脱塩し、 ＵＭ−１０限外ｐ過膜で濃縮し、次に２リツトルの５　ｍＭＣａＣＬ２、ｐＨ７ ，５に対して一晩透析した。以下に述べる試料分離の際には、３θ−の透析され た溶液を０．１ＭＨＣｌの滴下によってｐＨ４，５０とした。生じた少量の沈殿 物は遠心によって分離し、５ｍｅの５ｍＭＣαＣｔ２、ｐＨ４，５で洗浄した。

洗浄液は保存しておいた上清とともに、５　ｍｕ　ＣａＣ１ｔ、ｐＨ４，５０で 緩衝化したスルホプロピル−セファデックスカラム（１５，ＯＸ２．５ＣｒＩＬ 直径、充てん比体積７８．３ｍ）に通した。充てん比体積に対する吸光度単位の 比率は２，４７であった。

上記比率が低い値であることは、スルホプロピル−セファデックスでの最適分画 化のために望ましい。例えば、充てん床体禎に対する吸光度単位比が１０以上の 場合には、はとんど全ての活性が流出分画に見いだされる。以下の緩衝液をカラ ムの展開に使用した。注入液は、５暫Ａ（酢酸カルシウム、ｐＨ４，５０、固有 伝導率＝１．Ｏ７５μｍｈｏ　ｃＩｎ−’　を使用した。溶出緩衝液は：　７． ５　ｍ　Ｍ酢酸カルシウム、ｐＨ４，７０、固有伝導率＝２．１００μフルｈ。

Ｃｒｎ−’　：　１５　ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ５，２５、固有伝導率＝２． １００μｒｎｈｏ　ｃｍ−’　：　］　５　ｍ　Ａｆ酢酸カルシウム、０、ＯＩ Ａｆ）リス、ｐＨ７，２４、固有伝導率＝１１．５００μｍｈｏ　Ｃｍ−’を用 いた。カラムは４°で０．４　ｖ１７　ｍｉｎ、で流し、２００滴ずつの分画を 集めた。２８０　ｔｘルでの吸光度を測定し、適当なプールを得た後、プールさ れた溶液を中和しく溶出後１時間以内）、分析に使用するため一部を採取し、− ２０°で保存した。

Ｄ、ゲル濾過 スルホプロピル−セファデックスカラム分画から得られた１２．５ｍＭおよび１ ５ＷＬＭ酢酸カルシウム溶出液は２つの独立したバッチとして同じゲルカラムに かけた。

プールした溶液は、カラムに流すのに先立ち、アミコンＵＫ−２限外濾過膜で約 ５ｍ１ＶＣ濃縮し、１０　ｍｕ　ＣａＣｌ２．１０ｆｒＬＭトリス、ｐＨ６，８ ７で緩衝化した。セファデックスＧ−１００ゲルは減圧下で脱気し、カラムに試 料を流す前に、同じ緩衝液で緩衝化した。エリトロポエチン画分のための使用に 先立ち、分子量既昶のマーカーで、カラム（１００Ｘ２．５ｃｍ直径）を調べた 。孔隙容積は１３５−であり、ウシ血清アルブミンモノマーは２２４−、オプア ルプミンは２５８ｍＺ、およびチトクロームは３６８ｒｎＩ！で溶出した。４２ ＣｒｒＬの静水頭（ｈｙｄｒｏｓｔａｔｉｃ五５ａｄ）を持つマリオツテびん（ Ｍａｒｉｏｔｔｅ　ｂｏｔｔｌｅ）　によって２１から２２１ｎ１．の緩衝液を カラムに通過させた際に、サンプルをカラムの底部に加えた。各フラクションは ４．１ｍ／（１２０滴）ずつ集め、プールを作製した。プールした液は限外濾過 によって！！　１．、その一部をアッセイした。

Ｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーヒドロキシルアパタイトは単位 重力下でカラム（６，ｌＸ１．５ｃＩｎ直径）に充填し、５００−　の水で、次 いで４００１ｄの０．５毒Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，１、伝導率＝６９μｍｈｏ ｃｒｌ→（緩衝液Ｉ）で、流速を０．３　ｒｎｌ　／　ｍｉ　ｆ＆、に・維持す る線動ポンプ（ｐｇｒｉｓｔａｌｔｉｃ　ｐｕｒｎｐ）の使用により洗浄した。

緩衝液洗浄後、カラム長は３．４ｃｒｎ、充填床体積は６．０−であった。注入 する試料は、濃縮液に水を加えることによりアミコンＤＭ−５限外濾過膜で濃縮 脱塩し、濾過膜の洗浄液を４℃で２０分間６０００×ｒで遠心した。少量の不溶 性ペレットは０．５ｍＭ’）ンｆｉｌ、ｐＨ７，１で１回洗浄し、洗浄液は上清 に加えた。試料の一部をアッセイのために分取し、残りの試料（２２ｆｎＩりを カラムに加えた。充てん比体積（ｒｎＩりに対する吸光度単位比は１．８２であ った。供給緩衝液は、流出ｇＡが０．００５以下になるまでポンプでカラムに通 しく　１４９ｍ）、以下の溶出手順を実施した：緩衝液■、１　ｍ　Ａｆ　’） ン酸（ｐＨ７，１，固有伝導率＝　１３１　μｍｈｏ　ｃｒｒＬ−”、１５０ｍ ｇ（フラクション■））；緩衝液■、２ｍＭリン酸（ｐＨ６，９、固有伝導率＝ ２７０μｍｈｏｃｆ’、　２２０ｍ１（フラクションＩｆＪＡおよびｍＢ））、 緩衝液■、３ｍＭリン酸（ｐＨ６，９、固有伝導率＝４０２μｍｈｏ　（１ｍ− ’、８４−（フラクショ７１Ｖ　）　）　；緩衝液ｖ、ｏ、ｘＭ＋Ｊｌ！（ｐＨ ６，８、固有伝導率＝　９．６１Ｌｍｈｏ　ＣＩｒＬ−’　％１３４　ｒｓｌ　 （フラクションＶ））。

ＥＰＯ含有画分はアミコンＤＭ−５限外濾過膜を用いて濃縮し、一部はアッセイ し、烏縮液は凍結保存した。

アッセイにより、２８０　ｎｍ吸光度単位あたりＥＰＯ比活性が８３，０００Ｉ Ｕであることが示された。

Ｆ、逆相ＨＰＬＣ レムリ（Ｌａｇｍｍｌ　ｉ　）　、英国、Ｎａｔｕｒｅ　、　１５　：　２２巻 、２５９号６８０〜６８５頁（１９７０）による、ドデシル硫酸ナトリウムポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞で分析した結果、ヒドロキシ ルアパタイトカラムから得られた物質は、約３４，０００　ＭＷを主要成分とす るおよそ７０，０００　ＭＷから３０．ＯＯＯＭＷ　・の乾囲の数種のポリペプ チド成分から成ることが示された。１０　ｍ　ＡＩリン酸緩衝液ｐＨ７，０中に １０ｍ／以下の容ＨＰＬＣにかけた。

ＥＰＯ調製液は不完全凍結乾燥により１０倍に濃縮した。約２００マイクロリツ トルの上記濃縮物質を、Ｃ４炭素基結合型Ｒ−Ｐ　ＩＩＰＬＣカラム（市販例と してはＣ−４ヴアイデツク（Ｃ−４Ｖｙｄｇｃ　）　）　（２５ｘ　Ｏ，４５Ｃ ｒｒＬ。

セパレーション・グループ）に注入し、表２に示し７’ｃ勾配条件でＲ−Ｐ　Ｈ ＰＬＣによって分画化した。

ポンプＡ　Ｏ，１％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液勾配時間（分）　％Ｂ 　継続時間 流速１−／？ルｉｎ。

ＥＰＯは３Ｈ−チミジンアッセイ（クリスタル（Ｋｒｉｓ−ｔａｌ）著、Ｅｚｐ 、　Ｈｅｔｎａｔｏｌ　、　１１　：　６４９　６θ（１９８３））あるいはＣ ＦＵ−Ｅアッセイ（ペルシュ（Ｂｅｒｓｃｈ）他者、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ａｓｐ ｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ、Ｍ、Ｊ、　？−フィ（Ｍｕｒ ｐ！す）編、ニューヨークニスプリ／ガーークエルロツツ（Ｓｐｒｉｎｇｇｒ− Ｖｅｒｌｏｚ　（１９７８）　）のいずれかで定量した。

タンパク質ピークは２８０　ｓｍにおけるＵＶ吸収によって検出された。上記分 画化方法の典型的な溶出挙動は第１図に示す。ＥＰＯの均質性は、Ｒ−Ｐ　ＨＰ ＬＣ後の種々のピークの５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端アミノ酸配列分析により 確認された。第１図に下線で示しだピークハ、勾配マーカー（ベックマン・イン ストルメンツ社、モデ化４２１）について５３％の読みと同時に溶出した。

上記物質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで約３４，０００　ＭＷの単一のバンドとして流動 し、ヒトＥＰＯの配列として既に報告されている、単一の末端アミノ酸配列：　 ＡｌｒＬ、　Ｐｒｏ、　Ｐｒｏ・Ａｒｇ、　Ｉｒｅ、　Ｃｙｓ　を得た。上記の 約３４．ＯＯＯＭＷのＲ−Ｐ　ＨＰＬＣフラクションのみがｉｎ　ｖｉｔｒｏで のあらゆる顕著な生物学的活性を示した。Ｒ−Ｐ　ＩＩＰＬＣによって溶出され たＥＰＯタンパク質は、ヒドロキシルアパタイトカラムから溶離された物質（ス テップＥ）の約２倍の純度であった。

未Ｉ ＡＬＡ　ＴＲＰ　ＬＥＵ　ＴＲＰ　ＬＥＤ　ＬＥＵ　ＬＥＤ　ＳＥＲＬＥＵ　Ｌ ＥＤｌ　１０ Ａ１４　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ、Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ｒｌｅ　Ｃ７！１　、Ａｓｐ　Ｓｅ ｒ　ＡｒｇＨ Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　、１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇ１７　Ｃｙｓ 　ＡｌａＫＩ Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　 、ＡｌａＳＥＲＬＥＤ　ＰＲＯＬＥＵ　ＧＬＹ　ＬＥＤ　ＰＲＯＶＡＬ　ＬＥＵ 　ＧＬＹＶａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ａｌａ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｔｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　 Ａｓｎ　ｌｉｅ　ＴｈｒＴｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ永　Ｉ Ｖｎｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌｎ　ＬｅｕＬ ｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　ＧｌｕＧｌ ｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＰｒｏ 　Ｐｒｏ　Ａｓｐ、Ａｌｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌｎ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉ’ｈｅ　Ｌｅｕ Ｃ説さ） Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　 Ａｌａ　Ｌｅ＋Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌ ｙｓ　Ａｌａ　Ｖｎｌ　５ｅｎｏ　１：！ Ａｒｇ　Ａｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 ＩＩｓ　５ｅＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈ ｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌ：

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）実質的に表１の１から１６６に示された７ミノ酸配列； ｂ）逆相−ＨＰＬＯにおける単一のピークとしての移動； ｃ）８Ｄ８−ＰＡＧＥにおける約３４，０００ダルトンの分子量； ４）２８０ｎｍでの吸光度単位あたり少なくとも１２０，０００ＩＵの比活性； によって特徴づけられる、均質なエリトロポエチン。 ２）比活性が少なくとも１６０，０００ＩＵである、請求の範囲第１項記載の均 質なエリトロポエチン。 ３）非経口的に許容される担体中に請求の範囲第１項記載のエリトロポエチンを 治療上許容される量含有する、貧血治療のための医薬用組成物。 ４）非経口的に許容される担体中に請求の範囲第２項記載のエリトロポエチンを 治療上許容される量含有する、貧血治療のための医薬用組成物。 ５）ａ）逆相−ＨＰＬＣで単一のピークとしての移動；ｂ）ＳＯＳ−ＰＡＧＥに おける約３４，０００グルトンの分子量；および ｃ‘）２８０ｎｍでの吸光度あたり少なくとも１２０，０００ＩＵの比活性； によって特徴づけられる、均質なエリトロポエチン。 ６）比活性が少なくとも１６０，０００ＩＵである、請求の範囲第５項記載の均 質なエリトロポエチン。 ７）非経口的に許容される担体中に請求の範囲第５項記載のエリトロポエチンを 治療上許容される量含有する、貧血治療のための医薬用組成物。 ８）非経口的に許容される担体中に請求の範囲第６項記載のエリトロポエチンを 治療上許容される量含有する、貧血治療のための医薬用組成物。