JPH0140953B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はビニルアルコール単位を含む全多孔質
ゲルによつて形成された高分離能を有する高速液
体クロマトグラフイーカラムおよびそれを用いる
分析法に関し、更に詳しくは均一かつ高密度のゲ
ル床が、高い親水性および強度を有するビニルア
ルコール単位を含む全多孔質ゲルによつて形成さ
れた充填カラムであり、水系溶離液を用いるゲ
ル・パーミエーシヨン・クロマトグラフイー分離
を第一義的な分離機構とする高分離能の高速液体
クロマトグラフイーカラムおよびそれを用いる分
析法に関する。 液体クロマトグラフイーは液状の混合物を液状
のままで分離できるのでガスクロマトグラフイー
のようにガス化する必要もなく、目的とする物質
を何ら変化させることなく分離でき、化学・生化
学・薬学等広い分野で利用されている。液体クロ
マトグラフイーは分離の機構によつて、ゲル・パ
ーミエーシヨン・クロマトグラフイー（以下
GPCと略称する）・分配クロマトグラフイー・吸
着クロマトグラフイー・イオン交換クロマトグラ
フイー等に分類されるが、近年の著しい高速化の
進歩および広い分野にわたる普及の中にあつて、
水に溶解する溶質を水溶液を溶離液として溶質分
子の大きさにしたがつて分離するところのいわゆ
る水溶媒系GPCカラムに対する高性能化が強く
要請されている。従来よく用いられている水溶媒
系GPCカラムにテキストランゲル、アガロース
ゲル等を充填してなるものがある。しかしこれら
のカラムはゲルが軟質であるために高速処理がで
きない。これらのカラムより高速処理の可能なカ
ラムにポリエチレングリコールジメタクリレート
ゲル、ポリビニルアセテートゲル等を充填したカ
ラムがあるが、分離能、処理流速ともに十分なも
のは得られていない。また特開昭52−138077号公
報に提案されるゲル、すなわち酢酸ビニルとジエ
チレングリコールジメタアクリレート等を共重合
した後ケン化し、さらにエピクロルヒドリンで後
架橋して得たゲルを充填してなるカラムも粒径が
300〜400メツシユと大きいこともあり、高流速処
理における十分な分離については開示されていな
い。比較的高速処理が可能で分離能も改善された
カラムに多孔性シリカゲルの表面に化学処理をし
て溶質の吸着を防止したゲルを充填したものがあ
り広く用いられている。しかしながらこのカラム
はゲルの骨格が無機質であるため、GPCゲルと
して重要なゲルの微細孔径の再現性ある制御が難
かしく好適な微細孔径の範囲も狭くなり、またゲ
ル床の高密化が難かしく耐久性に不安を生じる。
さらに溶離液のPHが３〜９に現定され、かつその
PH域においても微量のシリカが溶出液中に溶出し
てくる欠点を有する。 一方、高性能の充填カラムの獲得に際して、ゲ
ル床の形成状態がきわめて重要な要件となる。す
なわち高密度のゲル床が均一に形成されなければ
ならない。このような均一、高密充填を試みたカ
ラムに特開昭53−60290号公報がある。この考案
は大粒径のゲルと小粒径のゲルを均一に混合して
ゲル床の高密度化をはかつたものであるが、大粒
径のゲルを混在させるために理論段相当高（以下
HETPと略称する）が必然的に大きくなるとい
う欠点があり不満足である。 上記従来カラムの欠点は用いるゲルの基礎特性
とゲル床の形成状態の両面にあるが、高分離能で
かつ高速処理ならびに耐久性の秀れたカラムを完
成するためにはこの両者を同時に解決しなければ
ならない。まずゲル側の特性として、分離に支障
をきたすような溶質の吸着がなく（換言すると非
イオン性で親水性の高い化学構造を持ち）微細孔
の孔径および孔量が好適な範囲に制御され、高い
分離を発揮し得る微小な粒子径を有し、高速処理
に耐える強度を有するものでなければならない。
他方カラム側の特性については一言で述べると高
密度のゲル床が均一に形成されているということ
が必要である。 本発明者らは上記の考えによつて充填カラムを
構成する諸因子について総合的に検討し、従来の
カラムの欠点を改良して高分離能で高速処理なら
びに耐久性を有する高性能の液体クロマトグラフ
イーカラムを完成した。 本発明に従えば、カラム内容積に対する流出液
の流量の比が１以上の間、ゲルスラリーのカラム
内流速を0.2〜1.5ｍ／hrに調整し、ゲル床１ｍあ
たりの最大昇圧速度を１分間あたり60Kg／cm²以下
とし、かつ平均昇圧速度を１時間あたり２〜80
Kg／cm²として、ビニルアルコール単位を含む全多
孔質ゲルのスラリーをカラムに充填してゲル床を
形成した、ビニルアルコール単位を含む全多孔質
ゲルの充填密度Pdが0.66以上の高密充填床からな
り、本文中に定義したHETP／Dpで示されるゲ
ル床の均一度が2.0〜4.0である高速液体クロマト
グラフイーカラムおよびそれを用いて血液成分を
分析する血液成分の分析法が提供される。 本発明を構成するゲルは架橋された全多孔質の
ポリマーゲルであつて、適当量のビニルアルコー
ル単位の存在によつて十分な親水性を持たせてい
る。ビニルアルコールの存在量はクロマトグラフ
イー実行時の溶質の相違、たとえば糖類のように
ゲルに対する吸着性の低いものと蛋白質、アミノ
酸等のように吸着性の高いものによつて異なる
が、好適なビニルアルコールの存在量を水酸基密
度として示すと３〜15meq／ｇ、好ましくは４〜
10meq／ｇが適当である。なお、たとえばカルボ
キシル基のようなイオン性の親水基は溶質の吸着
等の悪影響を及ぼさない程度であれば存在してい
ても支障がない。水酸基密度はゲルをピリジン溶
媒中で無水酢酸と反応させて水酸基と反応して消
費された無水酢酸の量を測定することによつて求
められ、乾燥ゲル１ｇ当りの水酸基の当量数で表
示するものである。また本発明に用いるゲルは微
細孔構造の保持および高速処理が可能な機械的強
度を有するための十分な架橋が必要であり、架橋
部分の構造は加水分離し難いものが好ましい。す
なわちエーテル基、エステル基、イソシアヌレー
ト環またはシアヌレート環を架橋部分に含むゲル
が良い。 ゲルの基礎特性において、微細孔量の調整すな
わち保水量（以下Wrと呼称する）の調整も肝要
である。Wrの大きいゲルは分離能の点で有利に
なり得るが機械的強度の低下あるいは充填ゲル床
の不均一化の危険性がWrの増加に連れ増大して
くる。本発明カラムにおけるゲルのWrは0.8〜2.0
ml／ｇが好ましく、1.0〜1.8ml／ｇがさらに好適
である。このようなゲルを用いると高密度で均一
なゲル床の形成が容易になり、また分離に必要な
微細孔量も十分確保でき高速処理かつ高分離様の
カラムを獲得する要件がより充足される。なおこ
こで言うWrは「ゲルクロマトグラフイー」（武内
次夫、森定雄、講談社）に記載の方法、すなわち
一定量の乾燥ゲルを過剰の水に膨潤し遠心分離器
にかけて粒子間の水を除き、残りの膨潤ゲルと乾
燥ゲルとの秤量差から乾燥ゲル１ｇ当りの溶媒量
に換算する方法を用い、遠心分離の条件として槽
内温度10℃、回転数3000rpm、遠心分離時間60分
間で測定し、ml／ｇの単位で表示する。 液体クロマトグラフイーカラムにおいてゲルの
粒子径は処理可能な通液流速と分離能に対して相
反する作用因子であることが知られている。本発
明カラムにおいて、ゲルの粒子径は平均径として
６〜20μｍが好ましく、８〜15μｍがさらに好ま
しい。本発明のカラムは比較的小粒子径のゲルを
用いて分離能を最大限に発揮させ、一方の高速処
理は高密度のゲル床の形成によつて達成し、両性
能を満足させるものである。ゲルの平均径（以下
Dpと呼称する）はコールターカウンター（米国
コールターエレクトロニクス社）を用いて測定
し、粒子径ｄの表われる頻度をｎとすれば次式に
よつて求められる。 Dp＝Σnd⁴／Σnd³ ゲル床の均一度の尺度は、GPC分離機構にお
いてはクロマトグラフイー実行の条件を基準化す
ることによつてHETPをDpで除した還元理論段
相当高（reduced height equivalent to ａ
theoretical plate）HETP／Dpが相対的な均一
度の目安になる。本発明者らの検討によると従来
広く用いられている定圧充填法、すなわち高圧ポ
ンプを用いてゲルスラリーを一気にカラム内に導
入する方法で作製したカラムのゲル床は、きわめ
て不均一になつていることが判明した。このよう
にして作製したカラムは充填操作時、充填液の流
出側に位置するゲル床のHETP／Dpが他部に比
べて著しく大きくなり不均一なゲル床を形成して
いる。定圧充填法等で比較的均一なゲル床が形成
できるのは、ゲル床の充填密度が0.6前後までで
あり、充填密度を高めていくと顕著に上記の不均
一状態が増大する。 本発明のカラムはゲルおよびカラム作製の両面
より上記の問題を解消して、高密度で均一なゲル
床を形成している。本発明のカラムは下記に定義
するHETP／Dpを2.0〜4.0、好ましくは2.5〜3.5
にしなければならない。HETP／Dpが4.0以上で
は分離能の低下への影響が大きくなり、2.0以下
のカラムは高分離能が期待されるが確実性高く作
製することが著しく困難になる。HETPはクロ
マトグラフイー実行の溶離液条件や溶質種等によ
つてその値を異にするので、本発明で言う
HETPはカラム内の全てのVi中に浸透するエチ
レングリコールを選び、その１％水溶液のエチレ
ングリコールを溶質として蒸留水を溶離液、温度
25℃、溶離液流速（空塔速度として）1.5ｍ／hr
で実行して得られる値と規定する。 本発明カラムにおけるゲル床の充填密度はゲル
のWrとの関連で調和をはかることが肝要であり、
そうすることによつてHETP／Dpを損なうこと
のない高密充填が達成される。つまり、本発明カ
ラムは〔Vi／Vo〕を1.0〜2.0、好ましくは1.2〜
1.8にすることが望ましい。Voはゲル粒子間の空
隙容量（Void volume）の略号であり、Viはゲ
ル粒子内部容量（Inner volume）の略号である。
ゲルの密度をｄ、充填密度をPdとすると〔Vi／
Vo〕とPdならびにWrの相関は 〔Vi／Vo〕＝（ｄ・Wr／ｄ・Wr＋１）・（Pd／１−Pd） で表わされ、上記３因子の２因子が定まることに
よつて残る１因子が自動的に定まることは言うま
でもない。Viはカラム内に保有するゲルの乾燥
重量ａにWrを乗じて求め、Voは、カラムの空塔
容積をVt、ゲルの基質容積Vg＝ａ／ｄとして、
Vo＝Vt−（Vi＋Vg）より求められる。またPdは
１−（Vo／Vt）で算出した値である。なお一般
に知られたVoの算出法にゲルの排除限界分子量
より分子量の大きな高分子物質を充填カラムに展
開しそのクロマトグラムの溶出溶量をVoとする
方法もあるが、この方法は展開する高分子物質の
分子量分布やゲル床の形成状態の影響を受けて著
しく誤差を生じることがあるので好ましくない。
本発明カラムにおいて〔Vi／Vo〕が1.2〜1.8の
範囲内で充填密度を0.66以上にすると高速処理お
よびその耐久性にいつそうの効果が発揮される。 次に本発明の好適なカラムについて実施態様例
を交えてさらに詳細に説明する。まず用いるゲル
の製造法については全多孔質のポリビニルアルコ
ール粒子に架橋剤を反応する方法がある。たとえ
ば、アジピン酸ジビニルに酢酸ブチルのようなポ
ーラス化剤とラジカル重合開始剤を加えて水中で
懸濁重合した後、メタノール中で反応して水酸基
を生成させ、ポリビニルアルコール粒子を得る。
その後アセトンとジメチルスルホオキシド液中で
エピクロルヒドリンを反応して架橋することによ
り所望のゲルを得ることができる。このような方
法で得られるゲルに関するさらに詳細は特願昭54
−140421号明細書（昭和54年11月１日出願に記載
されている。 本発明カラムに適用するゲルの別の製造法とし
ては、カルボン酸ビニルエステルと架橋性単量体
を共重合し、その後エステル交換等の反応を行う
方法がある。架橋性単量体としては２個以上のオ
レフイン基を有するトリアリルイソシアヌレート
のようなイソシアヌレート環を有する単量体、あ
るいはトリアリルシアヌレートのようなシアヌレ
ート環を有する単量体、またはジエチレングリコ
ールジビニルエーテル等のジビニルエーテル類、
またはジエチレングリコールジメタクリレート等
のポリエチレングリコールポリメタクリレート類
等がある。中でもトリアリルイソシアヌレートは
カルボン酸ビニルエステルとの共重合性が良いの
みならず、得られたゲルの強度あるいは微細孔径
ならびに微細孔量の調節が容易である等に秀れた
特徴があり好適である。このようなゲルならびに
その製造法に関する詳細は特願昭55−85243号明
細書（昭和55年６月25日出願）および特願昭55−
183703号明細書（昭和55年12月26日出願）に記載
されているが、たとえばトリアリルイソイシアヌ
レートと酢酸ビニルの単量体を架橋度が0.24〜
0.30の範囲内で適当に調整し、酢酸ブチルのよう
なポーラス化剤とラジカル重合開始剤を加えて懸
濁重合し得られた全多孔質共重合体をNaoHメタ
ノール溶液中でエステル交換またはケン化して得
ることができる。ビニルアルコール単位量の最終
的な調整はエステル交換またはケン化反応の過程
で反応率を調整することで容易に制御できる。な
お前記の架橋度Ｘは Ｘ＝（W₂／M₂×３）／（W₁／M₁＋W₂／M₂×３） M₁：カルボン酸ビニルエステルの分子量 M₂：トリアリルイソシアヌレートの分子量 W₁：重合に用いたカルボン酸ビニルエステ
ルの重量 W₂：重合に用いたトリアリルイソシアヌレ
ートの重量 で求めた値である。 本発明のカラムは、水溶液中にゲルを分散させ
て充填ポンプ等で送液しながら充填する湿式充填
法であるが、本発明においては充填時、ゲル床に
急激な圧力あるいは液流の負荷を与えないことが
肝要である。充填装置は一般に用いられるもので
何ら支障がなく、通常本体カラムの一端にゲルス
ラリーを投入するためのパツカーが連結され、別
に設けた充填用ポンプからの送液パイプがパツカ
ーに接続され、パツカーの上部はゲルスラリーを
投入後充填時の圧力負荷に耐える密封機構が施さ
れている。 本発明カラムの充填方法の要点を大きく区分す
ると １ ゲルスラリーを造り充填器内に移し充填器を
加圧できる状態に置く工程、 ２ 充填液を通液してゲル床に圧力負荷を加える
工程、 ３ 充填液の流速を上昇させてゲル床の充填密度
を調節する工程となる。 ゲルスラリーの調整に際しては、本体カラムに
充填されるゲル量の1.1〜４倍量のゲルに通常充
填液と同じ分散媒溶液を加えてスラリーを造る。
スラリー濃度は容積換算で３〜30％程度が適当で
ある。ゲルスラリーは充填操作の直前に超音波等
を用いて十分に分散させる配慮が望ましい。ゲル
スラリーを充填器内に移した後、充填器全体は充
填時の圧力負荷に耐える状態にセツトする。 前記２の工程はスラリー状態のゲルをゲル床に
変えていく工程であつて、従来法にない工夫が成
されている。即ち、充填液のカラム内流速は、通
液開始時より通液量がカラム内容積に対して１以
上の間、0.2〜1.5ｍ／hrに保持して充填初期に生
じるゲル床の不均一化を防止する。流速が0.2
ｍ／hr以下では操作能率が低下するのみならず形
成されるゲル床の充填密度が小さくなり品質安定
性に悪影響を及ぼす。流速が1.5ｍ／hr以上では、
前記のゲル床不均一化の防止が不十分になる。ま
た通液量が１倍未満では形成されるゲル床の長さ
が不足するため、均一なゲル床を再現性良く得る
ことが難しくなる。 前記３の工程は、ゲル床の均一性を維持した状
態で充填密度を高めるために行う工程であり、充
填液の流速を段階的または連続的に上昇させるこ
とによつて達成する。即ち、充填液の流速上昇を
ゲル床１ｍあたりの最大昇圧速度を１分間あたり
60Kg／cm²以下、好ましくは40Kg／cm²で、かつゲル
床１ｍあたりの平均昇圧速度を１時間あたり２〜
80Kg／cm²で連続または断続的に昇圧する。最大昇
圧速度が60Kg／cm²を越えるとゲル床の充填密度に
不均一性が生じ好ましくない。平均昇圧速度が２
Kg／cm²以下では操作能率が低下し、80Kg／cm²以上
では充填密度の不均一化が生じる危険性が増す。
この昇圧操作は、ゲル床の充填密度が目的とする
値に達したところで停止し、必要によりその後昇
圧時の圧力を越えない適当な流速で充填液を流し
て平衡操作を行い、本体カラムを充填器から取り
はずし、カラムの先端を孔径２〜10μｍのフイル
ターを有するエンドフイツテイングで固定する。
昇圧操作の終了時点は予じめ充填密度と圧力また
は流速の相関を求めておくことによつて容易に知
ることができる。充填液としては、水あるいは各
種水容液が用いられる。 上記のように、本発明のカラムは、湿式充填法
においてゲルスラリーからゲル床形成時および充
填密度の上昇操作を適正化しかつ制御することに
よつて高密度で均一なゲル床を得ることに成功し
たものである。 本発明のカラムはゲル床の両端を孔径２〜10μ
ｍのフイルターを有するエンドフイツテイングで
十分に固定した円筒状のカラムであり、その材質
はステンレス、ガラス、ポリエチレン等溶離液の
種類あるいは使用圧力等によつて使い分ける。カ
ラムのサイズは特に限定されるものではないが内
径４〜50mm、長さ100〜600mmのものが好適であ
る。 本発明カラムの実用において溶離液の種類は、
主として水および各種の緩衝液および塩類を含有
する水溶液等が好適であるが、従来より行われて
いる極性溶媒を用いる分配クロマトグラフイーあ
るいは上記水溶液にアルコール類等の有機溶媒を
適当に加えてGPCと分配クロマトグラフイーの
相乗分離等に用いることを妨たげるものではな
い。 本発明のカラムは水、水溶液中に溶解する各種
イオン性あるいは非イオン性の溶質を高能率に分
離、分析できる高速液体クロマトグラフイーカラ
ムであるが、特に従来から多くの関係者より要請
されていた血液成分の分離、分析に有効である。
本発明カラムを用いて血液成分の分離、分析を行
うとき、たとえばアルブミン以上の高分子量の溶
質の分析にあたつては排除限界分子量（デキスト
ラン基準）が10万以上、数百万のカラムを用い、
アルブミン以下100程度にいたる低分子量の溶質
の分析にあたつては排除限界分子量（デキストラ
ン基準）が10万以下のカラムを用い、0.05〜
0.5M／ｌの各種緩衝液あるいは塩水溶液あるい
は両者を組合せた水溶液等を溶離液にして試料を
展開し紫外分光光度計を検出器として分離検出す
ると良い。 以上のように本発明のカラムは水溶液中に溶存
する各種の溶質相互の分離、分析を高速処理で高
分離能かつカラムの高耐久性を同時に満足させる
ものであり、さらにこれまで困難であつた血液成
分等の分離、分析をも可能にするものである。 以下、実施例によつてされに詳しく説明する。 実施例 １ アジピン酸ジビニル（純度99％以上）80ｇ、酢
酸ｎ−ブチル200ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度
500）6.4ｇおよびび２，２′−アゾビスイソブチ
ロニトリル１ｇの混合液を懸濁安定剤を含む水溶
液1.2中で撹拌して造粒後、70℃で20時間撹拌
しながら懸濁重合した。得られた粒子を別、洗
浄後、水酸化ナトリウム32ｇをメタノール１中
に含む反応液中で40℃で24時間反応した。反応後
別した粒子をメタノール、アセトンの順に洗浄
し、次いでジメチルスルホオキシド350ml、アセ
トン350ml、エピクロルヒドリン37ｇおよび水酸
化ナトリウム16ｇよりなる反応液中で50℃で24時
間反応した。反応後の粒子は熱水、アセトンの順
に洗浄した後、エピクロルヒドリンを含む新たな
上記反応液を用い再度同上の条件で反応および洗
浄操作を繰り返した。その後IN水酸化ナトリウ
ム水溶液と共に80℃で24時間加熱撹拌した後水で
洗浄してゲルを得た。このゲルは水酸基密度が
9.1meq／ｇ、Wrが1.75ml／ｇ、Dpが12.3μｍで
あつた。 次にこのゲル10ｇ（乾燥重量あたり）をとり蒸
留水100ml中で一夜浸漬後、超音波洗浄器
（BRANSON Ｂ−12型）で10分間分散させ、内
径7.5mm、長さ500mmのカラムに接続した内容積10
mlのパツカー中に投入した。パツカーを密封後蒸
留水を充填液にして、流速1.0ml／分で60分間通
液し、その後最大昇圧速度20Kg／cm²／分、平均昇
圧速度20Kg／cm²／時で充填液の流量を増し、カラ
ム入口圧力が85Kg／cm²になつた時点で圧力を一定
にしてさらに３時間充填液を流した後、パツカー
を取りはずしてエンドフイツテイングを取付けカ
ラムを得た。このカラムはHETP／Dp3.3、
〔Vi／Vo〕1.54およびデキストランの排除限界分
子量が約200万であつた。 0.2M／lNa₂SO₄を含む0.05M／ｌリン酸緩衝液
（PH6.7）を溶離液にし、流速1.0ml／分下で市販
のチログロブリン、アルブミン、ミオグロビンお
よびフエニルアラニンの混合液を上記カラムによ
つて展開したところ、各溶質は分子量の大きい順
番に溶出し、良好な分離を示した。この分離クロ
マトグラムを第１図に示す。なお分析時間は約20
分間であつた。 実施例 ２ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアスレー
ト32.2ｇ（Ｘ＝0.25）、酢酸ｎ−ブチル100ｇなら
びに２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.3ｇ
の混合液を懸濁安定剤を含む水溶液800ml中で撹
拌して造粒した後、65℃で18時間、さらに75℃で
５時間加熱撹拌して懸濁重合を行い粒状共重合体
を得た。次に過、抽出後NaOH47ｇならびに
メタノール２からなる溶液中で15℃で20時間エ
ステル交換反応を行つた後、分級してDp9.8μｍ
のゲルを得た。このゲルは水酸基密度が
7.3meq／ｇでWrが1.58ml／ｇであつた。 次にこのゲル各々７ｇ（乾燥重量当り）を３つ
に分けて採り、0.2M／Na₂SO₄水溶液100ml中
に各々一夜浸漬して膨潤させた後、超音波ホモジ
ナイザー（日本精機製作所製US−300型）を用い
て５分間分散させ、内径7.5mm及び長さ250mmのス
テンレスカラム、内径が同じで長さが100mmのプ
レカラム、内容積100mlのパツカーの順序に接続
され、予じめ0.2M／Na₂SO₄水溶液でパツカー
出口まで満たしたパツカーに、ゲルスラリーを
各々投入した。パツカー密封後パツカー上部に設
けた充填液供給口より0.2M／Na₂SO₄水溶液を
各々0.5ml／分で60分間通液しゲルスラリーをカ
ラム内に導入しゲル床を形成させた。次いで最大
昇圧速度５Kg／cm²／分及び平均昇圧速度５Kg／
cm²／時で充填液の流量を段階的に増し、カラムの
入口圧力が各々26Kg／cm²、46Kg／cm²及び57Kg／cm²
に到達後同一圧力で２時間充填液を流し続けた。
その後パツカーとプレカラムを取りはずしエンド
フイツテイングでゲル床を固定し各々のカラムを
得た。これらのカラムを用いて種々の基礎及び実
用性能を観測し、良好な結果を得た。まずこれら
のカラムにおいて本発明要件に関連の大きい基礎
特性を第１表に示す。

【表】 またこれらのカラムのデキストラン基準の排除
限界分子量はいずれも約３万であつた。 次にカラムNo.１を用いて、0.3M／NaClなら
びに0.1M／リン酸ナトリウムを含むPH7.0の水
溶液を溶離液として市販のγ−グロブリン、牛血
清アルブミン、卵白アルブミン、ミオグロビンの
回収率を測定し、いずれもほゞ100％の回収率を
得た。またこれらの蛋白質はすべての分子量の大
きい順に溶出し、較正曲線が直線性を示した。 カラムNo.２を用いて、蒸留水を溶離液にして溶
離液の流速1.0ml／分、温度15℃で１％エチレン
グリコール100μ（１mg）を800回注入してクロ
マトグラムをとり、HETPの経時変化を観たと
ころHETPは24.5〜25.6μｍの範囲で安定してお
りカラムの劣化現象は全く認められなかつた。 カラムNo.３に0.2M／Na₂SO₄水溶液を1.2
ml／分の流速で240時間連続通液し、その後
HETPを測定したところ、HETPは32.9μｍ
（HETP／Dpとして3.36）と良好な特性を保持し
ており、カラムの劣化現象は全く認められなかつ
た。 実施例 ３ 実施例２で作製したカラムNo.１とカラムNo.２を
連結し、0.1M／リン酸ナトリウムならびに
0.3M／NaClを含むPH7.0の水溶液を溶離液にし
て、流速1.0ml／分で紫外分光光度計の波長
250nmを検出器として人血清の分離分析を行つ
た。得られたクロマトグラムを第２図ａ及びｂに
示す。図中〔ａ〕は健康人、〔ｂ〕は腎不全疾患
者のクロマトグラムを示すものであり、また同一
図上の二種類のクロマトグラムは検出器の感度を
変え血清中の大量成分と微量成分を同時に観測し
たものである。これらのクロマトグラムより、本
発明のカラムがきわめて高分機能であり、血液成
分のように非常に多種の溶質が混合した試料の分
離、分析においても大きな効果を発揮することが
判る。 比較例 １ 実施例２で得られたゲル10ｇを採り、実施例２
と同じ膨潤および分散操作を行つた後、内径7.5
mm、長さ500mmのカラムに接続されたパツカーに
ゲルを投入した。次いでカラム入口圧力を70Kg／
cm²一定にしてゲルスラリーをカラム内に導入する
と共に４時間上記圧力を保持して充填液を通液し
た後、エンドフイツテイングでゲル床を固定して
カラムを作製した。このカラムはHETP／Dpが
7.1であつた。 次にこのカラムに実施例３と同一の分析条件お
よび試料（腎不全疾患者の血清）で分離を試み
た。得られたクロヤトグラムを第３図に示す。こ
のクロマトグラムは前記第２図の〔ｂ〕に示され
る本発明カラムのクロマトグラムと比べて著しく
分離が劣つている。 実施例 ４ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ、酢酸ｎ−ブチル70ｇならびに2′2アゾ
ビスイソブチロニトリル3.3ｇの混合液を実施例
２と同様の操作で重合およびエステル交換および
分級してDp9.4μｍのゲルを得た。このゲルは水
酸基密度が7.1meq／ｇでWrが1.20ml／ｇであつ
た。次にこのゲル13ｇを採り実施例１と同様の操
作で内径7.5mm、長さ500mmのステンレスカラムに
充填しカラムを得た。このカラムはHETP／Dp
が2.75で〔Vi／Vo〕が1.55のものである。 このカラムを用いて実施例２と同様に腎不全疾
患者の血清分析を、溶離液流速のさらに高いとこ
ろまで試みた。得られたクロマトグラムを第４図
に示す。図中〔ａ〕は流速1.0ml／分、〔ｂ〕は流
速2.0ml／分で実行したときのクロマトグラムで
ある。流速2.0ml／分、すなわちLV2.72ｍ／nrと
いう高速処理下で流速1.0ml／分の分離状態とあ
まり違いのない分離性能を示しており、本発明カ
ラムが高速処理と高分離能を同時に満足している
ことが判る。またこのカラムは、同様の血液成分
の分析を流速2.0ml／分で150検体分析した後もカ
ラム作製後の初期性能を保持しており、十分な耐
久性を示した。 実施例 ５ トリアリルイソシアヌレートを架橋剤として架
橋度0.25からなる水酸基密度8.2meq／ｇ、
Wr1.05ml／ｇ及びDp13μｍのゲルを実施例１と
同様の方法で円径7.5mm及び長さ500mmのカラムに
充填し、HETP／Dp3.4及び〔Vi／Vo〕1.20のカ
ラムを得た。このカラムに0.3M／NaCl水溶液
を溶離液にして流速1.0ml／分で農薬製造工程中
の混合物の分離分析を試みた。この混合物はＮ，
N′−ジメチル−４，4′−ビピリジリウム（NQ）
とＮ−メチル−４−（４−ピリジル）ピリジニウ
ム（MQ）およびＮ−メチルピリジニウム（MS）
の各塩化物混合水溶液であり、その分離クロマト
グラムを第５図に示す。本発明のカラムは、この
ような低分子量でかつ電解質相互の分離、分析に
も適用できることが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１のクロマトグラフイ
ーカラムを用いた市販のチログロブリン、アルブ
ミン及びフエニルアラニンの混合液の分離クロマ
トグラムである。第２図〔ａ〕および〔ｂ〕は本
発明の実施例３において実施した人血清の分離分
析によつて得られたクロマトグラムであり、〔ａ〕
は健康人、〔ｂ〕は腎不全症患者のものである。
第３図は比較例１において実施した腎不全症患者
の血清の分離分析によつて得られたクロマトグラ
ムである。第４図は〔ａ〕及び〔ｂ〕は実施例４
のカラムを用いて実施した腎不全症患者の血清の
分離分析によつて得られたクロマトグラムであ
り、〔ａ〕は流速1.0ml／分、〔ｂ〕は流速2.0ml／
分で実施した結果である。第５図は本発明の実施
例５のカラムを用いた農薬製造工程中の混合物の
分離分析によつて得られたクロマトグラムであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カラム内容積に対する流出液の液量の比が１
   以上の間、ゲルスラリーのカラム内流速を0.2〜
   1.5ｍ／hrに調整し、ゲル床１ｍあたりの最大昇
   圧速度を１分間あたり60Kg／cm²以下とし、かつ平
   均昇圧速度を１時間あたり２〜80Kg／cm²として、
   ビニルアルコール単位を含む全多孔質ゲルのスラ
   リーをカラムに充填してゲル床を形成した、ビニ
   ルアルコール単位を含む全多孔質ゲルの充填密度
   Pdが0.66以上の高密充填床からなり、本文中に定
   義したHETP／Dpで示されるゲル床の均一度が
   2.0〜4.0であることを特徴とする高速液体クロマ
   トグラフイーカラム。 ２ カラム内容積に対する流出液の液量の比が１
   以上の間、ゲルスラリーのカラム内流速を0.2〜
   1.5ｍ／hrに調整し、ゲル床１ｍあたりの最大昇
   圧速度を１分間あたり60Kg／cm²以下とし、かつ平
   均昇圧速度を１時間あたり２〜80Kg／cm²として、
   ビニルアルコール単位を含む全多孔質ゲルのスラ
   リーをカラムに充填してゲル床を形成した、ビニ
   ルアルコール単位を含む全多孔質ゲルの充填密度
   Pdが0.66以上の高密充填床からなり、本文中に定
   義したHETP／Dpで示されるゲル床の均一度が
   2.0〜4.0である高速液体クロマトグラフイーカラ
   ムを用いて血液成分を分析することを特徴とする
   血液成分の分析法。