JPH02227144A - 陰イオン交換体及びそれを充填した糖類分離用液体クロマトグラフィー用カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、水酸基と陰イオン交換基を有し、機械的強度
及び化学的安定性にすぐれた陰イオン交換体並びに該陰
イオン交換体を充填した糖類分離用液体クロマトグラフ
ィー用カラムに間する。

〔従来の技術〕

糖類は、自然界、生体内などに広く分布しており、その
存在状態も多様である。＊ｉは単１ａ類として遊離の状
態で自然に存在するばかりでな（、いくつかの単糖が結
合してできるオリゴＩ！類から数種類の単糖類が非常に
たくさん結合したデンプン　やセルロースのような多糖
類まで様々な分子形のものが存在する。単Ｉｉ類には、
水酸基とカルボ二基を有するケトースと、水酸基とアル
デヒド基を有するアルドースが有り、またそれぞれのグ
ループには、水酸基の配位等が異なる数多くの立体異性
体が存在する。

液体クロマトグラフィーは糖の分離分析に適しており、
汎用されている。液体クロマトグラフィーを用いて単糖
類や単糖が二分子結合してできる三糖類等の比較的低分
子量の糖を分離分析する方法としては、例えばスルホン
酸基等の陽イオン交換基を有するポリスチレンゲルに対
イオンとして金属イオンを導入したゲルを充填剤として
、水又は水と水溶性有機溶媒の混合液を溶離液として分
離する方法が挙げられる（“バイオテクノロジー分野に
おける液体クロマトグラフィーエ業化技術総合資料集成
゛°左右田健二監修、２００頁、ＮＴＳ、特開昭５９−
１６２９５３号公報参照）。

この方法は単Ｉｉ類の分離分析に適するが、陽イオン交
換樹脂に結合した金属イオンが脱離し易く、比較的耐久
性が乏しい欠点を有する。また、カラム温度を８０゛Ｃ
程度の高温に保つ必要があり取り扱い難いという欠点を
有する。

他の方法としては、充填剤としてたとえば四級アンモニ
ウム塩基等の陰イオン交換基を有する架橋ポリスチレン
樹脂より成る充填剤を用い、溶離液としてホウ酸緩衝液
を用い、緩衝液の濃度を段階的又は連続的に変化させる
グラジェント法で分離する方法を挙げる事ができる（“
バイオテクノロジー分野における液体クロマトグラフィ
ーエ業化技術総合資料集成”左右田健二監修、１９７頁
、ＮＴＳ参照）。

この方法は単糖類や三糖類の分離能はすぐれているが、
グラジェントを用いるために操作が繁雑で、また分離に
長時間を要するという欠点がある。

更に他の方法としては、シリカゲルにアミノプロピル基
等のアミノ基を導入した充填剤を用い、溶離液として水
とア七ト二トリル等の水溶性有機溶媒の混合液を用いる
方法を挙げる事ができる〔小泉、他、澱粉科学、３４．
３０８　（８７）参照〕。

この方法は一定組成の溶離液を用いる為に操作が簡便で
、かつカラム温度も４０°Ｃ程度で有り、比較的取り扱
いやすい。しかしながら、アミノ基を有するシリカゲル
充填剤は耐久性が乏しいという欠点を有する。

また、アミノ基を存する陰イオン交換体として特開昭６
０−１５０８３９号公報に記載のものがあるが、この公
報に記載の陰イオン交換体は、主としてタンパク質やペ
プチドの分離分析を目的とするものであって、低分子量
の１！類の分離・分析には適していない。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述の如く、従来の分離分析方法は、操作が繁雑で長時
間を要したり、分離に用いる充填剤の耐久性が乏しく、
使用中に劣化したり、従って長期に渡って再現性良い結
果が得られがたいという欠点が有った。

そこで本発明者らはかかる従来技術の欠点を克服すべ（
鋭意検討の結果、化学的安定性に優れ、かつ強度が大で
、グルコースやキシロース等の単Ｉｉ類や、シュクロー
ス、マルトース等の三糖類などの低分子量の糖の分離能
に優れた充填剤を開発し、本発明をなすに至った。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち本発明は、ビニルアルコール単位と架橋性単量
体単位を有し、重合体重量当たりのビニルアルコール単
位に由来する水酸基量が０．５〜４、０ｍｅｑ／ｇ、陰
イオン交換基量が０．０２〜５．０　ｍｅｑ／ｇ、保持
し得る水の量が０．５〜４．０ｇ／ｇの架橋共重合体で
あって、架橋性単量体単位の割合（Ｘ）が０．４５≦Ｘ
≦０．８の範囲にある事を特徴とする陰イオン交換体並
びに該陰イオン交換体を充填してあることを特徴とする
糖類分析用液体クロマトグラフィーカラムを提供する。

ａ＋ｎｂ ここで、ａは架橋共重合体中の架橋性単量体単位を除く
単量体単位のモル分率、ｂは架橋性単量体単位のモル分
率、ｎは架橋性単量体１分子が有するエチレン性二重結
合の数である。） 本発明の陰イオン交換体は重合体重量当たりビニルアル
コール単位に由来する水酸基を０．５〜４、０　ｍｅｑ
　／　Ｈの範囲で含む。水酸基をこの範囲で含むことに
より、陰イオン交換体は適度な親水性を有する。該イオ
ン交換体を用いてｔａ類を分離する場合には、水溶性有
機溶媒と水の混合溶媒を溶離液として用いる。有機溶媒
と水の混合の混合比率が変わると溶離液の極性が変化す
るが、本発明の陰イオン交換体は適度な親水性を有し、
溶媒の極性が変化しても膨潤、収縮が少ないので好まし
い、水酸基の量は実用的には０．５〜３．　０ｍｅｑ　
／　ｇの範囲である。

水酸基の量は、水酸基を無水酢酸と反応させて消費した
無水酢酸の量又は架橋陰イオン交換体の重量変化を測定
することにより求めることができる。乾燥架橋陰イオン
交換体１ｇがｌ　ｓｍｏｌの無水酢酸と反応した時の水
酸基の量を１ｍｅｑ／ｇとする。

陰イオン交換体が一級又は二級のアミノ基を保有する場
合は、−級又は二級のアミノ基も無水酢酸と反応するの
で、反応した無水酢酸量から別途求めたイオン交換基の
量を差し引くことによって水酸基の量を求めることがで
きる。

陰イオン交換体が三級アミノ基を保有する場合、三級ア
ミノ基は無水酢酸と反応しないので、消費した無水酢酸
量から直接求めることができる。

陰イオン交換体中の陰イオン交換基は０．０２〜５．０
の範囲で存在する。陰イオン交換基がこの範囲で存在す
る事により、該陰イオン交換体はＩｉ類を分離する能力
を有し、かつ液体クロマトグラフィー用充填剤として十
分な強度を有する。陰イオン交換基は実用的には０．１
〜１．５　ｓｅｑ　／　ｇの範囲である。

陰イオン交換基の量は通常のイオン交換樹脂の交換容量
の測定方法で求め得る（参考“イオン交換−理論と応用
への手引−Ｒ，Ｗ、Ｇｒｉｍｓｈａｗ　ａｎｄＣ，Ｅ、
Ｈａｒｌａｎｄ著、黒田他訳、７８頁、丸善）。

本発明の陰イオン交換体のイオン交換基としては、−級
アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基等を挙げること
ができる。これらのイオン交換基の１種類が単独で陰イ
オン交換体の中に存在してもよく、又、２種類以上が存
在してもかまわない。

本発明の陰イオン交換体は架橋構造を有する。

本発明における架橋単位としては、エチレン性二重結合
および／またはアセチレン性三重結合を二つ以上有する
架橋剤より誘導される架橋単位を挙げる事ができる。エ
チレン性二重結合および／またはアセチレン性三重結合
を二つ以上有する架橋剤より誘導される架橋単位とは、
該架橋剤が重合または共重合によって形成する構造を現
す、架橋剤の例としては、モノ及びポリエチレングリコ
ールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメ
タクリレート等のポリメタクリレート類、ジビニルアジ
ペート、ジビニルフタレート等のポリ不飽和アルコール
エステル類、ジビニルエーテル等のポリ不飽和エーテル
、トリアリルイソシアヌレート等のトリアジン環を有す
る架橋剤を挙げる事ができるが、好ましい例としてトリ
アリルイソシアヌレート、トリアリルシアヌレートを挙
げる事ができる。

本発明に係る陰イオン交換体を形成する全単量体単位中
の架橋性単量体単位の割合（Ｘ）は０．４５≦Ｘ≦０．
８０）の範囲にあ真喝好ましい。

ここで、ａは架橋共重合体中の架橋性単量体単位を除く
単量体単位のモル分率、ｂは架橋性単量体単位のモル分
率、ｎは架橋性単量体１分子が有するエチレン性二重結
合の数である。）架橋性単量体単位がこの範囲にあるこ
とにより、Ｉｉ類の分離能と充填剤としての強度との双
方を満足する陰イオン交換体を得ることができる。

陰イオン交換体から得られる充填剤の分離能と強度をバ
ランスさせるためには、保水量を適正な範囲に保つこと
が必要である。従来、水酸基と陰イオン交換基を有する
架橋アガロースや架橋デキストランから得られる充填剤
は、前述のように含水量が高くて機械的強度が小さく、
その傾向はポアサイズの大きい充填剤で特に大であった
。本発明の陰イオン交換体から得られる充填剤はイアサ
イズにかかわらず含水量が０．５〜４．０ｇ／ｇ、好ま
しくは０．５〜３．０ｇ／ｇの範囲にあり、高速液体ク
ロマトグラフィー用充填剤にも用い得る十分な強度を有
する。陰イオン交換体の保水量は、陰イオン交換体重量
当りの量で表わされ、水中で十分膨潤させた共重合体を
フィルター付の遠沈管に入れ、共重合体表面の付着水を
遠心分離したのち共重合体を乾燥して、乾燥前後の重量
変化から求めることができる。

本発明の陰イオン交換体の形状は特に限定されることは
なく、使用方法に応じて粒状、膜状、糸状、塊状等任意
の形状をとり得る。液体クロマトグラフィー用充填剤と
して用いる場合は粒状又は球状が好ましい、その場合の
粒径は特に限定されないが、通常は重量平均粒径で１〜
５００ｐｍの範囲にある。高速液体クロマトグラフィー
用充填剤として用いる場合は、１〜２０Ｊ１１１、更に
実用的には３〜１５＃ｌＩの範囲にあるのが好ましい。

本発明の陰イオン交換体を用いて糖を分離、分析する場
合には、上記の陰イオン交換体を例えばステンレススチ
ール製のカラムに充填して用いる。

カラム径は目的に応じて選択すれば良いが、分析を目的
とする場合には内径３ｆｆＩ１１〜１０ｍｍ、長さ５ｃ
ｍ〜１００ＣＩの範囲が好ま”しい。

本発明の陰イオン交換体を用いて糖を分離、分析する方
法としては上記のようにして調整した分離カラムを用い
て、水やアセトニトリル等の有機溶媒又は、それらの混
合液を溶離液として用いて行うことができる。その場合
、例えば溶離液の組成、カラム温度、カラムのサイズ等
を変えることによって、Ｉ！類の分離状況を調節するこ
とが出来る。

次に、本発明の陰イオン交換体の製造法の一例を示す。

本発明の陰イオン交換体は、例えばカルボン酸ビニルエ
ステルと架橋性単量体よりなる共重合体のエステル基の
一部をケン化又はエステル交換せしめた後、水酸基の一
部とハロゲノカルボン酸ハライドやエピクロルヒドリン
等を反応させ、次いでアンモニアや各種アミンを反応さ
せることによって得ることができる。

ここでカルボン酸ビニルエステルとは、重合可能なカル
ボン酸ビニルエステル基を一つ以上有する化合物のこと
で、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉
草酸ビニルおよびピバリン酸ビニルの中から選ばれ、単
独又は２種以上の組合わせで用いられる。なかでも重合
やエステル交換又はケン化および入手の容易さから酢酸
ビニルやプロピオン酸ビニルを使用するのが特に好まし
い。

架橋性単量体としては、トリアジン環を有する架橋性単
量体を挙げることができるが、その中でもトリアリルイ
ソシアヌレートを好ましい架橋剤として挙げることがで
きる。

カルボン酸ビニルエステルとトリアジン環を有する架橋
性単量体よりなる共重合体を得るための重合は、懸濁重
合、塊状重合あるいは乳化重合等の通常の重合方法によ
ることができる。液体クロマトグラフィー用充填剤を得
る場合は懸濁重合が好ましい。

なお、カルボン酸ビニルエステルやトリアジン環を有す
る架橋性単量体以外の単量体を、共重合体の物性にほと
んど影響しない程度に併用し共重合させることは本発明
の陰イオン交換体を得るうえで何ら支障ない。

又、カルボン酸ビニルエステルとトリアジン環を有する
架橋性単量体とを共重合させる際に、単量体を溶解する
有機溶媒の１種又はそれ以上を単量体に加えることによ
り得られる共重合体にパーマネントイアを形成させると
共にそのボアの重量、孔径あるいは孔径分布を制御する
。単量体を溶解する有機溶媒の具体例としては、トルエ
ン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ヘプタン、オクタ
ン、シクロヘキサン、デカリン等の脂肪族炭化水素類、
酢酸ｎ−ブチル、酢酸１ｓｏ−ブチル、酢酸ｎ−ヘキシ
ル、アジピン酸ジオクチル等の脂肪族エステル類、フタ
ル酸ジメチル、フタル酸ジオクチル、安息香酸メチル等
の芳香族エステル類、ブタノール、ヘプタツール、オク
タツール等のアルコール類等をあげることができる。懸
濁重合する場合は水に溶解しに（い溶媒を用いるのが好
ましい。これらの有機溶媒の使用量には特に限定はない
が、例えば、単量体１００重量部に対して２０〜３００
重量部の範囲で用いられる。特に機械的強度を必要とす
る高速液体クロマトグラフィー用充填剤の製造に際して
は、有機溶媒の量は３０〜１００重量部の範囲にあるの
が好ましい。

陰イオン交換体の孔径や孔径分布を制御するために、あ
るいは陰イオン交換体の柔軟性を増すために、単量体混
合物に溶解する線状重合体やゴムを単量体混合物に添加
してもよい、単量体混合物に溶解する線状重合体やゴム
としては、たとえばポリ酢酸ビニル、ポリスチレン、ク
ロロプレンゴム、ブタジェンゴム等をあげることができ
、これらは単量体１００重量部に対して２０重量部以下
、好ましくは１０重量部以下で用いられる。

重合に際して用いられる開始剤の種類や量は、重合方法
に合わせて任意に選び得る０通常の懸濁重合や塊状重合
では一般的なラジカル重合開始剤、たとえば２．２１−
アブビスイソブチロニトリル、２．２′−アゾビス−（
２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系の開始剤
や、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル等の過酸化物
系の開始剤を用いることができる。

重合によって得られた共重合体のエステル交換又はケン
化反応は、水やアルコール又はその混合液を溶媒として
酸又はアルカリを用いて行なわれる。ケン化率のコント
ロールは反応溶媒、反応温度又は反応時間を変えること
より適当な条件を選び得る。

ケン化および／又はエステル交換によって得られたゲル
に陰イオン交換基を導入する方法としては、以下の方法
を挙げることができる。

即ち、ケン化及び／又はエステル交換によって得られた
ゲルの水酸基に例えばハロゲノカルボン酸ハライドやエ
ピクロルヒドリン、ブタンジオールジビニルエーテル等
を反応させ、次いでアンモニア、エチルアミン等の一級
アミン、ジエチルアミン等の二級アミンを反応させるこ
とによって、それぞれイオン交換基として一級アミノ基
、二級アミノ基、三級アミノ基を有するゲルを得ること
が出来る。

〔実施例〕

以下、実施例に従って、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するも
のでないことはいうまでもない。

酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート１４
５ｇ　（Ｘ＝０．６）　、酢酸ｎブチル１７０ｇ及び２
．２アゾビスイソブチロニトリル７ｇよりなる均一混合
液と、少量のポリビニルアルコールおよびリン酸ナトリ
ウムを溶解した水１４００−とを還流冷却器、窒素導入
管及び撹拌器を備えた５１の三つロフラスコに入れ十分
撹拌した。次いで、窒素気流下で撹拌しつつ、６０°Ｃ
で１６時間重合を行って粒状重合体を得た。該重合体を
濾過、洗浄し、アセトン抽出した後乾燥した。ついで該
重合体をカセイソーダ６０ｇを溶解した水３２と共に、
還流冷却器、窒素導入管及び撹拌器を備えた５Ｐの三つ
ロフラスコに入れ、窒素気流下１５°Ｃで２０時間撹拌
して該重合体のケン化反応を行った後、濾過、水洗、更
に乾燥した。ケン化によって得られた重合体の水酸基の
密度は１．７　ｓ＋ｅｑ　／　ｇであった。

ついで該重合体ヲ）ルエン３．５Ｌ１−ブロモブタノイ
ルクロライド２３０　ｇ　、ピリジン２００ｇと共に、
還流冷却器、窒素導入管及び撹拌器を備えた１０ｆの三
つロフラスコに入れ窒素気流下１５°Ｃで２０時間撹拌
して１−ブロモブタノイル基を該重合体に導入した。

ついで該重合体をエタノール、アセトンで洗浄し乾燥し
た。その後、該重合体をジメチルスルホオキサイド３．
７２．２８％アンモニア水９００ｄと共に、還流冷却器
、窒素導入管及び撹拌器を備えた１０２の三つロフラス
コに入れ、窒素気流下２０℃で２０時間撹拌して一級ア
ミノ基を該重合体に導入した。該重合体を洗浄、乾燥し
た後、分級して粒子径５μの陰イオン交換体を得た。該
陰イオン交換体のアミノ基の量は０．４　ｍｅｑ　／　
ｇ陰イオン交換体、水酸基の密度は１．１　ｍｅｑ　／
　ｇ陰イオン交換体、保水量は１．３ｇ／ｇ陰イオン交
換体であった。

イオン　　　の 該陰イオン交換体を内径６閣及び長さ１５０閣のステン
レスカラムに充填し、該充填カラムを用いて下記条件で
ラムノース、キシロース、フルクトース、グルコース、
シュクロース及びラクトースの混合物を分析し、第１図
のクロマトグラムを得た。第１図に示すように、本発明
の陰イオン交換体によって、６種類の糖が良・好に分離
できた。

圀五条作 溶離液 流速 カラム恒温槽温度 潤崖撒送之入±人 ＨＰＬＣポンプ 検出器 ８０％アセトニトリル １、０　ｄ／ａ＋１ｎ ４０°Ｃ ８８０ＰＩＪ　（日本分光工業■製） 屈折率計Ｓｔ！−５１（昭和電工 ■製） ＳＩＣ−７０００８（システムインス ツルメンツ製） データ処理装置 スｍ 実施例１のケン化重合体をジメチルスルホオキサイド２
．５４！、エピクロルヒドリン１２００ｇ、　　１０規
定カセイソーダ１３０ｄとともに、還流冷却器、窒素導
入管及び撹拌器を備えた５１の三つロフラスコに入れ、
窒素気流下３０℃で２０時間反応した。ついで該重合体
を濾過、洗浄した。濾過、洗浄した該重合体を２８％ア
ンモニア水２．５２と共に還流冷却器、窒素導入管及び
撹拌器を備えた５１の三つロフラスコに入れ窒素気流下
６０°Ｃで２０時間撹拌してアミノ基を該重合体に導入
した。

該重合体を洗浄、乾燥した後、分級して粒子径５−の陰
イオン交換体を得た。該陰イオン交換体のアミノ基の量
は０．５　ｌ１ｅｑ　／　ｇ陰イオン交換体、水酸基の
密度は１．５　ｍｅｑ　／　ｇ陰イオン交換体、保水量
は１．４ｇ／ｇ陰イオン交換体であった。

イオン六　　の 該陰イオン交換体を実施例１と同様にステンレスカラム
に充填し、該充填カラムを用いて実施例１と同様の条件
でフルクトース、グルコース、シュクロース及びラクト
ースの混合物を分析し、第２図のりｂマドグラムを得た
。第２図に示すように、本発明の陰イオン交換体を用い
れば、４種類の糖が良好に分離できた。

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の陰イオン交換体は硬質で
あり、カラムに充填してＩｉ類の分離用充填剤として用
いた場合、溶離液を高流速で流すことができ迅速分析が
可能である。また、本発明の陰イオン交換体は化学的に
安定であり、長期に渡って再現性良い結果を得ることが
出来る。また、本発明の陰イオン交換体は高度に架橋し
ており、かつ適度の親水性を有するため、溶離液の極性
の変化による膨潤、収縮が少なく、Ｉ！類の分離に好適
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において得られたクロマトグラムであ
り、ピークＡはラムノース、ピークＢはキシロース、ピ
ークＣはフルクトース、ピークＤはグルコース、ピーク
Ｅはシュクロース、ピークＦはラクトースである。 第２図は実施例２において得られたクロマトグラムであ
り、ピークＡはフルクトース、ピークＢはグルコース、
ピークＣはシュクロース、ピークＤはラクトースである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビニルアルコール単位と架橋性単量体単位を有し、
   重合体重量当たりのビニルアルコール単位に由来する水
   酸基量が０．５〜４．０ｍｅｑ／ｇ、陰イオン交換基量
   が０．０２〜５．０ｍｅｑ／ｇ、保持し得る水の量が０
   ．５〜４．０ｇ／ｇの架橋共重合体であって、架橋性単
   量体単位の割合（Ｘ）が０．４５≦Ｘ≦０．８の範囲に
   ある事を特徴とする、陰イオン交換体。 （但し Ｘ＝ｎｂ／（ａ＋ｎｂ） ここで、ａは架橋共重合体中の架橋性単量体単位を除く
   単量体単位のモル分率、ｂは架橋性単量体単位のモル分
   率、ｎは架橋性単量体１分子が有するエチレン性二重結
   合の数を示す。） ２、特許請求の範囲第１項記載の陰イオン交換体を充填
   してあることを特徴とする糖類分離用液体クロマトグラ
   フィーカラム。