JPH0141159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規ポリペプチド、その製造法およ
び製剤に関する。 本発明者らは広く微生物の培養物中に血液凝固
抑制能を有する物質を探索していたところ、スト
レプトバーチシリウム属に属する菌株が培養物中
に強い血液凝固抑制作用を持つた３種類の物質を
生成蓄積する事実を発見し、これらのそれぞれを
単離することに成功した。これら３種類の物質は
血液の凝固反応を強く抑制する作用と以下に詳し
く述べるプロテアーゼに対する抑制作用ならびに
物性とにより特徴づけられるポリペプチドであ
り、本発明者らによつて初めて見いだされた新規
な物質である。 本発明者らは、これら３種類のポリペプチドを
ストレプトバーチシリウム属の菌株の産生する血
液凝固抑制物質（Streptoverticillium
anticoagulant（SAC―））であることからこれら
をポリペプチドSAC―，SAC―およびSAC
―と呼称し、さらに鋭意研究の末、本発明を完
成した。 本発明は、(1)ポリペプチドSAC―，SAC―
，SAC―またはそれらの２種以上の混合物、
(2)ストレプトバーチシリウム属に属しポリペプチ
ドSAC―，SAC―，SAC―またはそれら
の２種以上を生産する菌を培地に培養し、培養物
中にポリペプチドSAC―，SAC―，SAC―
またはそれらの２種以上を生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とするポリペプチド
SAC―，SAC―，SAC―またはそれらの
２種以上の混合物の製造法および(3)ポリペプチド
SAC―，SAC―，SAC―またはそれらの
２種以上を含有する血液凝固抑制剤に関する。 本明細書においては、ポリペプチドSAC―
を単に「SAC―」と、ポリペプチドSAC―
を単に「SAC―」と、ポリペプチドSAC―
を単に「SAC―」とそれぞれ略称することも
ある。 本発明の方法において用いうる微生物として
は、ストレプトバーチシリウム
（Streptoverticillium）属に属し、SAC―，
SAC―，SAC―またはそれらの２種以上を
生産する能力を有するものであればいずれをも利
用しうるが、有利に用いられる菌の例としては例
えばストレプトバーチシリウム・シンナモネウ
ム・サブスピーシーズ・シンナモネウム（S.
cinnamoneum subsp.cinnamoneum）、ストレプ
トバーチシリウム・ヒロシメンセ（S.
hiroshimense）、ストレプトバーチシリウム・シ
ンナモネウム・ホルマ・アザコルタ（S.
cinnamoneum f.azacoluta）、ストレプトバーチ
シリウム・グリセオカルネウム（S.
griseocarneum）、ストレプトバーチシリウム・
バーチシルム・サブスピーシーズ・バーチシルム
（S.verticillum subsp.verticillum）などの種
（species）に属する菌が挙げられる。その代表株
としては、ストレプトバーチシリウム・シンナモ
ネウム・サブスピーシーズ・シンナモネウムIFO
12852、ストレプトバーチシリウム・ヒロシメン
セIFO 3839、ストレプトバーチシリウム・シン
ナモネウム・ホルマ・アザコルタIFO 12363、ス
トレプトバーチシリウム・グリセオカルネウム
IFO 3387、ストレプトバーチシリウム・バーチ
シルム・サブスピーシーズ・バーチシルムIFO
13864などが挙げられる。 上記IFO 12852，IFO 3839，IFO 12363および
IFO 3387株は、財団法人発酵研究所に寄託され、
該発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチヤーズ
第６版1978年（Institute for Fermentation
Osaka，List of Cultures，1978，Sixth
Edition）に掲載されている。また、IFO 13864
株は、上記発酵研究所に寄託され、発酵研究所発
行のリサーチ・コミユニケーシヨンズNo.10，1981
年（Institute for Fermentation Osaka，
Research Communications，No.10，1981）に掲
載されている。 上記微生物が発酵研究所に寄託された日を以下
に示す。

【表】 IFO 12852株は、ジ・アメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（The American Type
Culture Collection）（米国）に受託番号ATCC
11874および23897として寄託され、該コレクシヨ
ン発行のカタログ・オブ・ストレインズ第14
版、1980年（The American Type Culture
Collection，Catalogue of Strains，Fourteenth
Edition，1980）に掲載されている。 また、IFO 12363およびIFO 3387株は、米国
農務省ノーザン・ユーテイライゼイシヨン・リサ
ーチ・アンド・デベロプメント・デイビジヨン
（Northern Utilization Research and
Development Division，U.S.Department of
Agriculture）にNRRL Ｂ―1699およびNRRL
Ｂ―1068としてそれぞれ寄託されている。 ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム・
サブスピーシーズ・シンナモネウムの菌学的性質
は、インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・シ
ステマテイツク・バクテリオロジー
（International Journal of Systematic
Bacteriology）第18巻279頁1968年に記載されて
いる。 ストレプトバーチシリウム・ヒロシメンセの菌
学的性質は、インターナシヨナル・ジヤーナル・
オブ・システマテイツク・バクテリオロジー
（International Journal of Systematic
Bacteriology）第18巻69頁1968年に記載されて
いる。 ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム・
ホルマ・アザコルタの菌学的性質は、ジオナー
レ・デイ・ミクロビオロジア（Giornale di
Microbiologia）第17巻１頁1969年に記載されて
いる。 ストレプトバーチシリウム・グリセオカルネウ
ムの菌学的性質は、ジヤーナル・オブ・バクテリ
オロジー（Journal of Bacteriology）第62巻487
頁1951年に記載されている。 ストレプトバーチシリウム・バーチシルム・サ
ブスピーシーズ・バーチシルムの菌学的性質は、
特公昭34―2598号公報に記載されている。 一般に、ストレプトバーチシリウム属菌は、そ
の性状が変化しやすく、たとえばＸ線照射、紫外
線照射、放射線照射、人工変異剤（例、ニトロソ
グアニジン、エチレンイミンなど）を用いる人工
変異手段などで容易に変異し得る。このような変
異株であつても、SAC―，SAC―，SAC―
またはそれらの２種以上を、生産する能力を有
するものはすべて本発明の方法に使用し得る。 本発明の方法においては、まずストレプトバー
チシリウム属に属しSAC―，SAC―，SAC
―またはそれらの２種以上を生産する菌が培地
に培養される。培地は液状でも固状でもよいが、
通常は液体培地による振盪培養または通気撹拌培
養が有利である。培地は該生産菌が生育して培地
中に該ポリペプチドを蓄積しうるものであればど
のようなものでもよい。すなわち、炭素源として
は、たとえばグルコース、ラクトース、グリセリ
ン、澱粉、シユークロース、デキストリン、糖
蜜、有機酸類など、窒素源としては、たとえばペ
プトン、カザミノ酸〔デイフコ社（米国）製〕、
Ｎ―Ｚ―アミンＡ〔シエフイールド社（米国）製〕
などの蛋白加水分解物、肉エキス、酵母エキス、
大豆粕、コーン・ステイープ・リカー、アミノ酸
類、アンモニウム塩、硝酸塩その他の各種有機あ
るいは無機窒素化合物が用いられる。無機塩とし
ては、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナ
トリウムなどを添加してもよく、また菌の生育を
促進する目的でビタミン類、核酸関連化合物など
を添加してもよい。培養方法および培養条件によ
つては、シリコン、ポリプロピレングリコール誘
導体、大豆油などの消泡剤を加えることが該ポリ
ペプチドの蓄積量を増大させるのに効果的な場合
もある。培養に当たつてはあらかじめ小規模な前
培養を行なつて得られる培養物を新しい培地に接
種することが望ましい。培養温度、培養期間、培
地の液性などの培養条件は、SAC―，SAC―
，SAC―またはそれらの２種以上の蓄積量
が最大となるように適当に選択、調節されるが、
多くの場合、これらの条件として好気的条件下に
約20〜37℃で約１〜６日間の培養でよく、またこ
の間培地の液性をPH約４〜9.5に保つのがよい。 本発明の生産菌を培養して得られる培養物中に
はSAC―，SAC―，SAC―またはそれら
の２種以上が生成蓄積される。液体培地を用いて
培養した場合、主としてその液状部分に該ポリペ
プチドが生成蓄積されるので、培養液を一旦過
あるいは遠心して菌体を除去したあとの液ある
いは上清液からこれらを分離するのがよいが、菌
体を除去することなく培養液から直接該ポリペプ
チドを分離するようにしてもよい。培養物からの
該ポリペプチドの分離・精製はSAC―，SAC
―またはSAC―の物理化学的特性にもとづ
いて種々の方法を組み合わせることにより容易に
行ないうる。すなわち、たとえば硫酸アンモニウ
ムなどの沈澱剤の添加による沈澱、PH約９〜10で
の等電点沈澱、アセトンなど水と容易に混和しう
る有機溶媒の添加による沈澱、各種セフアデツク
スなどゲル過担体を用いるゲル過、メンブレ
ン・フイルターなどを用いる限外過、CM（カ
ルボキシメチル）―セルロース、CM―セフアデ
ツクスなどのイオン交換体によるイオン交換クロ
マトグラフイー、セロフアン膜などを用いる透析
処理、両性担体などを用いる等電点電気泳動など
が有効に用いられる。これら以外にも、SAC―
，SAC―またはSAC―の特性にもとづい
た精製手段が全て適宜に使用できることはいうま
でもない。これらの手段を適当に組み合わせて使
用することにより、SAC―，SAC―，SAC
―またはそれらの２種以上の混合物を培養物中
から得ることができる。 後述の実施例１で得られた該ポリペプチド
SAC―，SAC―およびSAC―の理化学的
性質すなわち性状、元素分析値、分子量〔アンド
リウス氏によるゲル過法｛バイオケミカル・ジ
ヤーナル（Biochemical Journal）第91巻222頁
1964年｝、SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）―ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（ネイチヤー第
227巻680頁1970年）および6M塩酸グアニジン―
ゲル過法（蛋白質・核酸・酵素第18巻367頁
1973年）により測定した。〕、比旋光度、紫外線吸
収スペクトル、赤外線吸収スペクトル、構成アミ
ノ酸（200倍量（Ｖ／Ｗ）の４％チオグリコール
酸を含む6N塩酸中110℃で24時間加水分解したの
ち常法に従つてアミノ酸分析した。なお、シスチ
ンは過ギ酸酸化したのち同様に加水分解し、アミ
ノ酸分析によりシステイン酸として定量した。）、
アミノ末端アミノ酸〔ダンシル―エドマン法（分
析化学第23巻565頁1974年）あるいはエドマン分
解法（ユーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオ
ケミストリー第８巻189頁1969年）により分析し
た。〕、カルボキシ末端アミノ酸〔ヒドラジン分解
法（ビユレタン・オブ・ザ・ケミカル・ソサエテ
イ・オブ・ジヤパン第25巻214頁1952年）により
分析した。〕、等電点〔焦点電気泳動法（アクタ・
ケミカ・スカンジナビカ第20巻820頁1966年）に
より測定した。〕、溶解性および呈色性、を以下に
記述する。 １ SAC―の理化学的性質 (1) 性状 白色粉末 (2) 元素分析値（％） C49.68±3.0，H7.08±0.5， N16.11±1.0，S1.44±0.3 (3) 分子量 17000±2000（アンドリウス氏法による）、11000
±2000（SDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法および6M塩酸グアニジン―ゲル過法に
よる）。 (4) 比旋光度（〔α〕²¹ _D） −62.5±5.0（0.001N塩酸中）。 (5) 紫外線吸収スペクトル 第１図に示す如く、本物質は280nm付近に吸
収極大をもち、250nm付近に吸収極小をもつ典
型的な蛋白質の吸収スペクトルを示している。 (6) 赤外線吸収スペクトル 第２図に示す如く、主な吸収帯（波数）は次
の通りである。 3270cm^-1，2950cm^-1，1650cm^-1，1540cm^-1，
1450cm^-1，1400cm^-1，1240cm^-1。 (7) 構成アミノ酸 アラニン（13.6±2.9）、グリシン（10.9±
2.3）、グルタミン酸（10.5±2.2）、スレオニン
（10.1±2.1）、バリン（6.9±1.5）、ロイシン
（6.2±1.3）、アスパラギン酸（5.8±1.3）、アル
ギニン（6.2±1.4）、リジン（5.5±1.2）、フエ
ニルアラニン（5.0±1.0）、プロリン（4.3±
0.9）、セリン（4.9±1.0）、イソロイシン（2.8
±0.6）、ヒスチジン（1.5±0.5）、メチオニン
（0.9±0.3）、チロシン（0.9±0.2）、トリプトフ
アン（1.8±0.4）およびシスチン（1.8±0.4）
の各アミノ酸が認められた。ここにおいて、カ
ツコの中の数字はモル％を表わす。 (8) アミノ末端アミノ酸 セリン (9) カルボキシ末端アミノ酸 フエニルアラニン (10) 等電点 9.5付近ないし10付近 (11) 溶解性 水、希塩酸およびアンモニア水に可溶、アセ
トン、エチルアルコール、クロロホルム、ジエ
チルエーテル、ヘキサンに難溶ないし不溶。水
溶液中硫酸アンモニウム70％飽和でほぼ完全に
沈澱した。 (12) 呈色性 ペプチド反応（ハイポクロライト試薬）陽
性、銅―フオリン反応 陽性。 ２ SAC―の理化学的性質 (1) 性状 白色粉末 (2) 元素分析値（％） C49.68±3.0，H6.87±0.5， N16.56±1.0，S1.46±0.3。 (3) 分子量 17000±2000（アンドリウス氏法による）、
11000±2000（SDS―ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法および6M塩酸グアニジン―ゲル過
法による）。 (4) 比旋光度（〔α〕²¹ _D） −65.2±5.0（0.001N塩酸中）。 (5) 紫外線吸収スペクトル 第３図に示す如く、本物質は280nm付近に吸
収極大をもち、250nm付近に吸収極小をもつ典
型的な蛋白質の吸収スペクトルを示している。 (6) 赤外線吸収スペクトル 第４図に示す如く、主な吸収帯（波数）は次
の通りである。 3270cm^-1，2950cm^-1，1650cm^-1，1540cm^-1，
1450cm^-1，1400cm^-1，1240cm^-1。 (7) 構成アミノ酸 アラニン（13.7±2.9）、グリシン（11.1±
2.3）、グルタミン酸（10.6±2.2）、スレオニン
（10.1±2.1）、バリン（6.9±1.5）、ロイシン
（5.4±1.3）、アスパラギン酸（5.9±1.3）、アル
ギニン（6.6±1.4）、リジン（5.7±1.2）、フエ
ニルアラニン（5.0±1.0）、プロリン（4.5±
0.9）、セリン（3.8±1.0）、イソロイシン（2.9
±0.6）、ヒスチジン（1.5±0.5）、メチオニン
（1.1±0.3）、チロシン（1.0±0.2）、トリプトフ
アン（1.9±0.4）およびシスチン（1.9±0.4）
の各アミノ酸が認められた。ここにおいて、カ
ツコの中の数字はモル％を表わす。 (8) アミノ末端アミノ酸 チロシン (9) カルボキシ末端アミノ酸 フエニルアラニン (10) 等電点 9.5付近ないし10付近 (11) 溶解性 水、希塩酸およびアンモニア水に可溶、アセ
トン、エチルアルコール、クロロホルム、ジエ
チルエーテル、ヘキサン等の有機溶媒に難溶な
いし不溶。水溶液中硫酸アンモニウム70％飽和
でほぼ完全に沈澱した。 (12) 呈色性 ペプチド反応（ハイポクロライト試薬）陽
性、銅―フオリン反応 陽性。 ３ SAC―の理化学的性質 (1) 性状 白色粉末 (2) 元素分析値（％） C49.96±3.0，H7.13±0.5， N16.38±1.0，S1.47±0.3。 (3) 分子量 17000±2000（アンドリウス氏法による）、
11000±2000（SDS―ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法および6M塩酸グアニジン―ゲル過
法による）。 (4) 比旋光度（〔α〕²¹ _D） −61.7±5.0（0.001N塩酸中） (5) 紫外線吸収スペクトル 第５図に示す如く、本物質は280nm付近に吸
収極大をもち、250nm付近に吸収極小をもつ典
型的な蛋白質の吸収スペクトルを示している。 (6) 赤外線吸収スペクトル 第６図に示す如く、主な吸収帯（波数）は次
の通りである。 3270cm^-1，2950cm^-1，1650cm^-1，1540cm^-1，
1450cm^-1，1400cm^-1，1240cm^-1。 (7) 構成アミノ酸 アラニン（14.3±2.9）、グリシン（11.3±
2.3）、グルタミン酸（10.9±2.2）、スレオニン
（9.9±2.1）、バリン（7.2±1.5）、ロイシン（5.7
±1.3）、アスパラギン酸（6.2±1.3）、アルギニ
ン（6.2±1.4）、リジン（5.5±1.2）、フエニル
アラニン（4.9±1.0）、プロリン（4.4±0.9）、
セリン（3.8±1.0）、イソロイシン（2.9±0.6）、
ヒスチジン（1.5±0.5）、メチオニン（1.1±
0.3）、チロシン（0.1±0.1）、トリプトフアン
（1.9±0.4）およびシスチン（2.0±0.4）の各ア
ミノ酸が認められた。ここにおいて、カツコの
中の数字はモル％を表わす。 (8) アミノ末端アミノ酸 アラニン (9) カルボキシ末端アミノ酸 フエニルアラニン (10) 等電点 9.5付近ないし10付近 (11) 溶解性 水、希塩酸およびアンモニア水に可溶、アセ
トン、エチルアルコール、クロロホルム、ジエ
チルエーテル、ヘキサン等の有機溶媒に難溶な
いし不溶。水溶液中硫酸アンモニウム70％飽和
でほぼ完全に沈澱した。 (12) 呈色性 ペプチド反応（ハイポクロライト試薬）陽
性、銅―フオリン反応 陽性。 以上SAC―，SAC―およびSAC―の理
化学的性質を述べたが、次にそれらの血液凝固抑
制作用およびプロテアーゼに対する抑制作用につ
いて詳述する。 １ 血液凝固抑制作用 SAC―，SAC―およびSAC―の血液凝
固抑制能は部分トロンボプラスチン時間法
（partial thromboplastin time（PTT））により
測定した。測定に用いた材料と方法は次の通りで
ある。 (1) 材料 (a) ヒト血漿：乾燥ヒト血漿「プラスマ」（日本
製薬株式会社製）を蒸留水に溶解して用いた。 (b) リン脂質溶液：PTT試薬〔「北研」、ウサギ
脳（北里研究所製）〕のバイアルに蒸留水2.5ml
を加えて溶解したのち、この溶解液をさらに
0.15Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で10倍に希
釈して用いた。 (c) 試料溶液：SAC―，SAC―またはSAC
―を0.15Mトリス―塩酸緩衝液（PH8.0）に
種々の濃度となるように溶解して用いた。 (2) 測定法 あらかじめ37℃に保温したガラス小試験管
（6.5×55mm）にヒト血漿100μをとり、リン脂質
溶液10μ、試料溶液90μを加えて37℃で３分
間保温したのち、0.25M塩化カルシウム溶液100μ
を添加して直ちにストツプウオツチを始動さ
せ、ひき続き37℃の恒温水槽中に保つて、ときど
き振りまぜながらフイブリンが析出するまでの時
間を測定した。試料の血液凝固抑制能は試料溶液
の代わりに生理食塩水を添加した時のヒト血漿の
凝固時間を２倍に延長させるのに必要なSAC―
，SAC―またはSAC―の濃度（μｇ／ml）
で示した。 以上の測定法で求めた結果は第１表に示される
通りである。

【表】 第１表から明らかなように、SAC―，SAC
―およびSAC―は、顕著な血液凝固抑制作
用を有していることが分かる。 ２ プロテアーゼに対する抑制作用 SAC―，SAC―およびSAC―の種々の
プロテアーゼに対する抑制能は次のようにして測
定した。 (1) プロテアーゼ類 (a) サブチリシン〔シグマ社（米国）製、
Carlsberg、結晶〕 (b) サーモライシン〔メルク社（西ドイツ）製、
結晶〕 (c) トリプシン（シグマ社製、ウシ、結晶、タイ
プ） (d) キモトリプシン（シグマ社製、ウシ、結晶、
タイプ） (e) 膵臓カリクレイン〔バイエル社（西ドイツ）
製、ブタ、40生物学的単位／１管〕 (f) プラスミン：ヒトプラスミノゲン（日本製薬
株式会社製）溶液（0.4カゼイン単位／ml、下
記緩衝液(e)）とウロキナーゼ（株式会社ミドリ
十字社製）溶液（100国際単位／ml、生理食塩
水）とを等量混合したのち37℃で30分間反応さ
せプラスミノゲンを完全に活性化した。 (2) 基質類 (a) カゼイン（メルク社製、ハンマーステンカゼ
イン） (b) Ｄ―プロリル・フエニルアラニル・アルギニ
ル―Ｐ―ニトロアニリド（Ｓ―2302）〔ABカ
ビ社（スエーデン）製〕 (c) Ｄ―バリル・ロイシル・リジル―Ｐ―ニトロ
アニリド（Ｓ―2251）（ABカビ社製） (3) 緩衝液 (a) 0.05Mトリス―塩酸緩衝液（PH8.5） (b) 0.05Mトリス―塩酸緩衝液（PH8.0） (c) 0.05Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.5） (d) 0.05Mトリス―塩酸緩衝液―0.012M塩化ナ
トリウム（PH7.4） (e) 0.15Mトリス―塩酸緩衝液（PH7.4） (4) 測定法 (a) サブチリシン―カゼイン系：試薬管内にサブ
チリシン溶液（21.2μｇ／ml、緩衝液(a)）0.25
ml、緩衝液(a)0.5mlおよび種々の濃度のSAC―
，SAC―あるいはSAC―溶液（緩衝液
(a)）0.25mlをとり、室温で10分間反応させたの
ち、カゼイン溶液（２％、緩衝液(a)）1.0mlを
加え、よく混和して37℃で20分間反応させた。
1.7M過塩素酸溶液2.0mlを加えて反応を止め、
室温に30分間放置したのち、紙で過して得
られた液の275nmにおける吸光度を測定し
た。5.3μｇのサブチリシンの活性を50％抑制す
るのに必要な量を求めてID₅₀値とした。 (b) サーモライシン―カゼイン系：試験管内にサ
ーモライシン溶液（9.6μｇ／ml、緩衝液(b)）
0.25ml、緩衝液(b)0.5mlおよび種々の濃度の
SAC―，SAC―あるいはSAC―溶液
（緩衝液(b)）0.25mlをとり、室温で10分間反応
させたのち、カゼイン溶液（２％、緩衝液(b)）
1.0mlを加え、残存するカゼイン分解活性を上
記サブチリシン―カゼイン系の場合と同様にし
て測定した。2.4μｇのサーモライシンの活性を
50％抑制するのに必要な量を求めてID₅₀値とし
た。 (c) トリプシン―カゼイン系：試験管内にトリプ
シン溶液（39.2μｇ／ml，0.0025M塩酸―0.02M
塩化カルシウム溶液）0.25ml、緩衝液(c)0.5ml
および種々の濃度のSAC―，SAC―ある
いはSAC―溶液（緩衝液(c)）0.25mlをとり、
室温で10分間反応させたのち、カゼイン溶液
（２％、緩衝液(c)）1.0mlを加え、残存するカゼ
イン分解活性を上記サブチリシン―カゼイン系
の場合と同様にして測定した。9.8μｇのトリプ
シンの活性を50％抑制するのに必要な量を求め
てID₅₀値とした。 (d) キモトリプシン―カゼイン系：試験管内にキ
モトリプシン溶液（36.8μｇ／ml、緩衝液(c)）
0.25ml、緩衝液(c)0.5mlおよび種々の濃度の
SAC―，SAC―あるいはSAC―溶液
（緩衝液(c)）0.25mlをとり、室温で10分間反応
させたのち、カゼイン溶液（２％、緩衝液(c)）
1.0mlを加え、残存するカゼイン分解活性を上
記サブチリシン―カゼイン系の場合と同様にし
て測定した。9.2μｇのキモトリプシンの活性を
50％抑制するのに必要な量を求めてID₅₀値とし
た。 (e) 膵臓カリクレイン―Ｓ―2302系：試験管内に
膵臓カリクレイン溶液（２生物学的単位／ml、
緩衝液(c)）0.1ml、緩衝液(c)0.28mlおよび種々
の濃度のSAC―，SAC―あるいはSAC―
溶液（緩衝液(c)）0.1mlをとり、室温で10分
間反応させたのち、Ｓ―2302溶液（4mM、蒸
留水）0.02mlを加え、よく混和して37℃で30分
間反応させた。50％酢酸0.05mlを加えて反応を
止め、405nmにおける吸光度を測定した。0.2
生物学的単位の膵臓カリクレインの活性を50％
抑制するのに必要な量を求めてID₅₀値とした。 (f) プラスミン―Ｓ―2251系：試験管内にプラス
ミン溶液0.1ml、種々の濃度のSAC―，SAC
―あるいはSAC―溶液（緩衝液(d)）0.1ml
および緩衝液(d)0.28mlをとり、室温で10分間反
応させたのち、Ｓ―2251溶液（3mM、蒸留水）
0.02mlを加えよく混和して37℃で30分間反応さ
せた。50％酢酸0.05mlを加えて反応を止め、
405nmにおける吸光度を測定した。0.02カゼイ
ン単位のプラスミンの活性を50％抑制するのに
必要な量を求めてID₅₀値とした。 以上の測定法で求めた結果は第２表に示される
通りである。

【表】 (注) ＞は以上を表わす。
第２表から明らかなように、SAC―，SAC
―およびSAC―は、顕著なプロテアーゼ活
性抑制能を有していることが分かる。 SAC―の毒性はきわめて低く、たとえばマ
ウスにおける急性毒性試験において腹腔内注射で
0.5ｇ／Kg、静脈内注射で0.5ｇ／Kgとなる量を投
与しても死亡例を認めなかつた。SAC―およ
びSAC―の毒性も同程度と考えられる。 SAC―，SAC―およびSAC―は、この
ように毒性がきわめて低く、しかも強力な血液凝
固抑制作用を有しているので、血液凝固抑制剤と
して哺乳動物（例、マウス、ラツト、家兎、犬、
人など）の血栓症や播種性血管内凝固症候群など
の予防あるいは治療を目的として使用し得る。こ
の目的には上記３種の化合物の１種を単独で用い
ることもできるし、また、２種または３種の混合
物として用いることもできる。 該ポリペプチドの投与量は、有効に血液凝固を
抑制し得る量であればよく、たとえば、対象動
物、投与経路、剤型などにより変動し得る。一般
に、１日の投与量が約0.1ないし20mg／Kgとなる
量を投与する。投与回数は１日１回ないし６回の
範囲で適宜選択され得る。 該ポリペプチドの投与にあたつては、通常の手
段によつて、たとえば、錠剤、顆粒剤、カプセル
剤、液剤などの剤型にして経口的に、または注射
剤などにして非経口的に投与することができる。
上記経口例えば錠剤を製造する際には、結合剤
（例、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース、マクロゴールな
ど）、崩壊剤（例、デンプン、カルボキシメチル
セルロースカルシウムなど）、賦形剤（例、乳糖、
デンプンなど）、滑沢剤（例、ステアリン酸マグ
ネシウム、タルクなど）などを適宜配合すること
ができる。 また、非経口製剤、たとえば注射剤を製造する
際には、等張化剤（例、ブドウ糖、Ｄ―ソルビト
ール、Ｄ―マンニトール、塩化ナトリウムなど）、
防腐剤（例、ベンジルアルコール、クロロブタノ
ール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安
息香酸プロピルなど）、緩衝剤（例、リン酸塩緩
衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）などを適宜配
合することができる。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。 実施例 １ ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム・
サブスピーシーズ・シンナモネウムIFO 12852株
を３本の200ml容三角フラスコ内のグルコース0.5
％、極東粉末ブイヨン（極東製薬株式会社製）２
％，PH7.0の液体培地50mlに接種して28℃で５日
間回転振盪培養し、この培養液をさらに上記液体
培地500mlの入つた６本の２容坂口フラスコに
20mlずつ移して28℃で５日間往復振盪培養して培
養液3100mlを得た。この培養液を遠心し、得られ
た培養上清液3000mlに硫酸アンモニウムの結晶
1308ｇを飽和度が70％となるように４℃で撹拌し
ながら加えたのち、さらに４℃で一夜放置した。
生じた沈澱を遠心により集め、この沈澱物を
10mMリン酸緩衝液（PH7.0）300mlに溶解したの
ち、同緩衝液に対し４℃で２日間透析して、硫酸
アンモニウムを除いた。透析内液400mlを10mM
リン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化したCM―セフア
デツクスＣ―50カラム（5.0×50cm）に吸着させ、
同緩衝液700mlでカラムを洗浄したのち、ミキシ
ングチエンバーには10mMリン酸緩衝液（PH7.0）
2500mlを入れ、リザーバーには0.36M塩化ナトリ
ウムを含む同緩衝液2500mlを入れて直線濃度勾配
溶出法により血液凝固抑制作用を有するポリペプ
チドを溶出した。緩衝液の電導度が28ミリモー付
近でカラムから溶出された活性画分を集め凍結乾
燥したのち、蒸留水40mlに溶解し、20mMトリス
塩酸緩衝液（PH8.0）で平衡化したセフアデツク
スＧ―75カラム（4.6×96cm）を用いてゲル過
した。活性画分を集め20mMトリス―塩酸緩衝液
（PH8.0）で平衡化したCM―セルロースカラム
（4.1×91cm）に吸着させ、同緩衝液500mlでカラ
ムを洗浄したのち、ミキシングチエンバーには
20mMトリス―塩酸緩衝液（PH8.0）5500mlを入
れ、リザーバーには0.095M塩化ナトリウムを含
む同緩衝液5500mlを入れて直線濃度勾配溶出法に
より該ポリペプチドを溶出した。該ポリペプチド
はこのCM―セルロースカラムクロマトグラフイ
ーにより３つの溶出画分にわかれて溶出された。
カラムからの溶出順序によりそれぞれの該ポリペ
プチドをSAC―，SAC―およびSAC―と
呼称した。最初の溶出液5560mlを除いたあとの溶
出画分480mlにSAC―が溶出され、次いで溶出
液420mlを除いたあとの溶出画分220mlにSAC―
が溶出され、さらにつづいて溶出液780mlを除
いたあとの溶出画分480mlにSAC―が溶出され
た。それぞれの活性画分を凍結乾燥し、少量の蒸
留水に溶解したのち25mM重炭酸アンモニウム溶
液（PH7.9）で平衡化したセフアデツクスＧ―25
カラム（4.1×75cm）により脱塩した。活性画分
を集め凍結乾燥して、SAC―，SAC―およ
びSAC―の白色粉末標品233mg，148mgおよび
75mgをそれぞれ取得した。得られた最終標品はい
ずれも分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PH4.3）およびSDS―ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で単一バンドを示した。また、前記記載の
方法によりヒト血液凝固抑制能を測定した結果、
部分トロンボプラスチン時間を２倍に延長させる
のに必要なSAC―，SAC―およびSAC―
の濃度はそれぞれ4.0μｇ／ml，3.6μｇ／mlおよび
4.2μｇ／mlであつた。 実施例 ２ ストレプトバーチシリウム・ヒロシメンセIFO
3839株を１本の200ml容三角フラスコ内のグルコ
ース1.0％、ポリペプトン（大五栄養化学株式会
社製）1.0％、肉エキス0.7％、塩化ナトリウム0.3
％、リン酸第二カリウム0.2％，PH7.0の液体培地
50mlに接種して28℃で５日間回転振盪培養し、こ
の培養液をさらに上記液体培地500mlの入つた１
本の２容坂口フラスコに移して28℃で５日間往
復振盪培養して培養液530mlを得た。この培養液
を遠心し、得られた培養上清液500mlを凍結乾燥
したのち、蒸留水40mlに溶解して、20mMトリス
―塩酸緩衝液（PH8.0）で平衡化したセフアデツ
クスＧ―25カラム（4.8×64cm）を用いてゲル
過した。最初の溶出液420mlを除いたあとの溶出
画分160mlを集め20mMトリス―塩酸緩衝液（PH
8.0）で平衡化したCM―セルロースカラム（2.1
×22cm）に吸着させ、同緩衝液30mlでカラムを洗
浄したのち、ミキシングチエンバーには20mMト
リス―塩酸緩衝液（PH8.0）400mlを入れ、リザー
バーには0.1M塩化ナトリウムを含む同緩衝液400
mlを入れて直線濃度勾配溶出法により血液凝固抑
制作用を有するポリペプチドを溶出した。最初の
溶出液400mlを除いたあとの溶出画分50mlに血液
凝固抑制能を有するポリペプチドが溶出された。
上記と同一条件下で実施したカラムクロマトグラ
フイーにおいて、実施例１で得たSAC―の溶
出位置はここで得たポリペプチドのそれと一致し
た。したがつて、ここで得たポリペプチドは、
SAC―であることが分かつた。 実施例 ３ ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム・
ホルマ・アザコルタIFO 12363株を実施例２と同
様に培養して得た培養液約500mlから実施例２と
同一の操作により血液凝固抑制作用を有するポリ
ペプチドを精製した。CM―セルロースカラムク
ロマトグラフイーで最初の溶出法460mlを除いた
あとの溶出画分50mlとその後の画分50mlに血液凝
固抑制能を有するポリペプチドがそれぞれ溶出さ
れた。上記と同一条件下で実施したカラムクロマ
トグラフイーにおいて、実施例１で得たSAC―
およびSAC―の溶出位置はここで得たポリ
ペプチドのそれらとそれぞれ一致した。したがつ
て、ここで得たポリペプチドはSAC―および
SAC―であることが分かつた。 実施例 ４ ストレプトバーチシリウム・グリセオカルネウ
ムIFO 3387株を実施例２と同様に培養して得た
培養液約500mlから実施例２と同一の操作により
血液凝固抑制作用を有するポリペプチドを精製し
た。CM―セルロースカラムクロマトグラフイー
で最初の溶出液510mlを除いたあとの溶出画分50
mlに血液凝固抑制能を有するポリペプチドが溶出
された。上記と同一条件下で実施したカラムクロ
マトグラフイーにおいて、実施例１で得たSAC
―の溶出位置はここで得たポリペプチドのそれ
と一致した。したがつて、ここで得たポリペプチ
ドはSAC―であることが分かつた。 実施例 ５ ストレプトバーチシリウム・バーチシルム・サ
ブスピーシーズ・バーチシルムIFO 13864株を実
施例２と同様に培養して得た培養液約500mlから
実施例２と同一の操作により血液凝固抑制作用を
有するポリペプチドを精製して、３種類のポリペ
プチドを取得した。 上記と同一条件下で実施したカラムクロマトグ
ラフイーにおいて、実施例１で得たSAC―，
SAC―およびSAC―の溶出位置はここで得
たポリペプチドのそれらとそれぞれ一致した。し
たがつて、ここで得たポリペプチドは、SAC―
，SAC―およびSAC―であることが分か
つた。 実施例 ６ SAC―500mg、乳糖800mgおよびデンプン230
mgを混合し、これにヒドロキシプロピルメチルセ
ルロースのアルコール溶液を適量加えながら練合
し、これを湿式造粒して乾燥する。得られる造粒
物に結晶セルロース200mgおよびステアリン酸マ
グネシウム10mgを加え混合後１錠180mgの錠剤に
打錠する。得られる錠剤をアセトンおよびエチル
アルコールの混液に溶解したヒドロキシプロピル
メチルセルロースフタレートおよび酸化チタンを
用い常法に従いフイルムコーテイングして１錠
200mg中SAC―50mgを含有する腸溶錠を作製す
る。 実施例 ７ SAC―150mg，Ｄ―ソルビトール５ｇ、パラ
オキシ安息香酸メチル200mgおよびパラオキシ安
息香酸プロピル20mgを注射用蒸留水に溶解して全
量を100mlとする。この溶液を孔径0.2μｍのメン
ブレンフイルターを用いて無菌過し、無菌操作
で内容量２mlのアンプルに充填し、熔封して注射
剤を作製する。 実施例 ８ SAC―500mg、乳糖900mgおよび結晶セルロ
ースを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロ
ースおよびマクロゴール6000のイソプロピルアル
コール溶液を適量加えながら練合し、これを0.8
mmスクリーン付造粒機で押し出し造粒後乾燥して
円柱状の顆粒とする。得られる顆粒をアセトンお
よびエチルアルコールの混液に溶解したセルロー
スアセテートフタレイトを用い常法に従いコーテ
イングし顆粒300mg中SAC―50mgを含有した腸
溶顆粒を作製する。 実施例 ９ SAC―150mgおよびＤ―マンニトール５ｇを
注射用蒸留水に溶解して全量を100mlとする。こ
の溶液を孔径0.2μｍのメンブレンフイルターを用
いて無菌過し、無菌操作で内容量２mlのバイヤ
ルに充填し、無菌的に凍結乾燥して用時溶解型注
射剤を作製する。 実施例 10 実施例８と同様の担体および方法に従つて、顆
粒300mg中にSAC―50mgを含有する腸溶顆粒を
作製する。得られる腸溶顆粒を１号カプセルに
300mgずつカプセル充てん機により充てんして腸
溶顆粒を充てんしたカプセル剤を作製する。 実施例 11 SAC―100mg、塩化ナトリウム９ｇおよびベ
ンジルアルコール９ｇを注射用蒸留水に溶解して
全量を1000mlとする。この溶液を孔径0.2μｍのメ
ンブレンフイルターを用いて無菌過し、無菌操
作で内容量50mlのバイヤルに充てんしてゴム施栓
を行ないアルミキヤツプで巻じめをして注射剤を
作製する。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図および第５図はそれぞれ実施例
１で得られたポリペプチドSAC―，SAC―
およびSAC―の紫外線吸収スペクトルを、第
２図、第４図および第６図はそれぞれ実施例１で
得られたポリペプチドSAC―，SAC―およ
びSAC―の赤外線吸収スペクトル（KBr法）
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の共通性質(A)および固有性質(B)を有するポ
   リペプチドSAC―，SAC―，SAC―また
   はそれらの２種以上の混合物： (A) (a) 分子量： 11000±2000（SDS―ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法および6M塩酸グアニジン―ゲ
   ル過法による）、 (b) 紫外線吸収スペクトル： 280nm付近に吸収極大をもち、250nm付近
   に吸収極小をもつ、 (c) 赤外線吸収スペクトル（KBr法）： 主な吸収波数（cm^-1）；3270，2950，1650，
   1540，1450，1400，1240， (d) 溶剤に対する溶解性： 可溶；水、希塩酸、アンモニア水、難溶な
   いし不溶；アセトン、エチルアルコール、ク
   ロロホルム、ジエチルエーテル、ｎ―ヘキサ
   ン、 (e) 呈色反応： 陽性；ペプチド反応（ハイポクロライト試
   薬）、銅―フオリン反応、 (f) 物質の色： 白色 (g) Ｃ末端アミノ酸： フエニルアラニン (h) 等電点： 9.5付近ないし10付近、 (B) (1) ポリペプチドSAC― (a) 元素分析（％）： Ｃ 49.68±3.0 Ｈ 7.08±0.5 Ｎ 16.11±1.0 Ｓ 1.44±0.3 (b) 比旋光度： 〔α〕²¹ _D―62.5±5.0（0.001N塩酸中） (c) Ｎ末端アミノ酸： セリン (2) ポリペプチドSAC―： (a) 元素分析（％）： Ｃ 49.68±3.0 Ｈ 6.87±0.5 Ｎ 16.56±1.0 Ｓ 1.46±0.3 (b) 比旋光度： 〔α〕²¹ _D―65.2±5.0（0.001N塩酸中） (c) Ｎ末端アミノ酸： チロシン (3) ポリペプチドSAC―： (a) 元素分析（％） Ｃ 49.96±3.0 Ｈ 7.13±0.5 Ｎ 16.38±1.0 Ｓ 1.47±0.3 (b) 比旋光度： 〔α〕²¹ _D―61.7±5.0（0.001N塩酸中） (c) Ｎ末端アミノ酸： アラニン。 ２ ストレプトバーチシリウム属に属しポリペプ
   チドSAC―，SAC―，SAC―またはそれ
   らの２種以上を生産する菌を培地に培養し、培養
   物中にポリペプチドSAC―，SAC―，SAC
   ―またはそれらの２種以上を生成蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とするポリペプチド
   SAC―，SAC―，SAC―またはそれらの
   ２種以上の混合物の製造法。 ３ ポリペプチドSAC―，SAC―，SAC―
   またはそれらの２種以上を含有する血液凝固抑
   制剤。