JPH0775570A - 新規メタロエンドペプチダ−ゼｆ、その製造法及びそれを有効成分とする薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は新規な蛋白分解酵素、その製造法及び
それを有効成分とする薬剤に関する。 【構成】ストレプトミセス属に属する菌株より得られ
た、新規メタロエンドペプチダーゼＦ及び該酵素を有効
成分とする肝臓疾患予防治療剤、障害された神経細胞の
賦活予防剤、エイズ予防治療剤を提供する。当該薬剤は
ウイルス性肝炎にも効果を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な蛋白分解酵素、そ
の製造法及びそれを有効成分とする薬剤に関する。更に
詳細には新規メタロエンドペプチダーゼＦ、該酵素をス
トレプトミセス属に属する菌株から製造する方法及び該
酵素を有効成分とする肝臓疾患予防治療剤、障害された
神経細胞の賦活予防剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】肝臓の疾患については既によく知られて
いるが、殊に近年、ウイルス性肝炎およびアルコール性
肝炎が増加傾向を示し、社会問題となっている。最近の
学説にもうたわれているように、急性肝炎から慢性肝炎
へ、慢性肝炎から肝硬変へ、肝硬変から肝臓癌へ移行す
る例が増加している。特にウイルス性肝炎の肝臓癌への
移行率は非常に高いものとなっている。

【０００３】従来より、肝臓疾患予防治療剤としては様
々な薬剤が開発されている。又ある種の蛋白分解酵素が
肝臓疾患予防治療剤として有効であるとの報告もされて
いる（特開昭61-293927 号、特公平1-56050 号）。

【０００４】特にウイルス性肝炎の治療剤としては、従
来ではインターフェロンの注射療法が唯一の治療法とさ
れている。がしかし、副作用が劇しく入院治療によらね
ばならず、高価で、しかも有効率は約40％である。

【０００５】また、障害された神経細胞による疾患、例
えば急性感音性難聴（突発性難聴）、慢性神経性難聴、
顔面神経麻痺、難治性口内炎、舌炎等にはステロイドホ
ルモンが有効とされているが、神経性難聴（老人性難聴
を含む）、神経性耳鳴、反回神経麻痺、眼底血管障害、
嗅覚−味覚障害等については治療方法がない。

【０００６】これらの疾患に対して有効な薬剤として、
本発明者の発明に係るある種の中性プロテアーゼおよび
プロナーゼを有効成分とする薬剤も報告されている（特
開平2-292226）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、既存の
肝臓疾患予防治療剤には、上記したようにこれらの肝臓
疾患に対して有効なものは少なく、そしてまた、上記の
蛋白分解酵素の肝臓疾患予防治療剤の効果も充分に満足
できるものではない。

【０００８】また、障害された神経細胞の賦活予防薬と
しての上記の中性プロテアーゼおよびプロナーゼを有効
成分とした薬剤の効果も必ずしも充分に満足できるもの
ではない。

【０００９】従って、より有効なこれらの症状に対する
薬剤を開発することが求望されていた。即ち、肝臓の障
害をできるだけ初期に治癒し、癌化を予防するのが目下
の急務であって、人命を救う上で極めて大切なことであ
る。特に現状では、ウイルス性肝炎に対しては有効な内
服薬は知られていない。更に、新たな障害された神経細
胞の賦活予防剤の開発も切望されていた。

【００１０】更に、ＨＩＶ感染によるエイズ発病には効
果的な予防治療剤の開発が急務であるが、未だ優れた報
告が見られない。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは広く自然界
に新規な蛋白分解酵素を求め、長年研究を重ねてきた結
果、新たに土壌より分離した１菌株が新規な蛋白分解酵
素を産生することを初めて見いだした。

【００１２】そして、本菌株がストレプトミセス属に属
する新種であることを知ると共に、本菌株を培養し、培
養物中にメタロエンドペプチダーゼを産生せしめ、これ
を採取することにより本発明を完成した。

【００１３】更に、当該メタロエンドペプチダーゼが新
規なメタロエンドペプチダーゼであることを知ると共
に、該酵素が肝臓の各種疾患の予防および治療、とりわ
けウイルス性肝炎にも有効であり、更に障害された神経
細胞賦活予防剤としても有効であることを見いだした。

【００１４】更に、この新規なメタロエンドペプチダー
ゼによれば、驚くべきことに、エイズの予防および治療
に著効があることを見いだした。

【００１５】本発明はこれらの知見に基づくものであ
る。即ち、本発明は新規なメタロエンドペプチダーゼ、
その製造法及びそれを有効成分とする薬剤に関する発明
である。

【００１６】本発明において使用され、新たに土壌から
発見、分離された本菌株の菌学的性質は下記の通りであ
る。 (a) 形態 胞子形成菌糸の分枝法及び形態：単純分枝で直線状又は
波状（Rectus Flexibilis タイプ） 胞子の数：10胞子以上 胞子の大きさ：約0.8μ×1.2〜2.4μ 鞭毛胞子：無 胞子のう：無

【００１７】(b) 各培地における生育状態 （括弧内の番号は（株）日本色彩社：Today's COLOR/30
0 第16版の色番号） (1) シュクロース・硝酸塩寒天培地 生育度 ：弱 表面 ：気菌糸の形成は弱く、白色 裏面 ：黄味白 拡散性色素 ：無 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地 生育度 ：中程度 表面 ：気菌糸の形成は中程度、白色 裏面 ：黄味白〜淡黄茶（ 106〜99〜111 ） 拡散性色素 ：無 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地 生育度 ：中程度 表面 ：気菌糸の形成は良好で、白から黄味白色
（92） 裏面 ：淡黄茶（99）〜黄土色（89） 拡散性色素 ：黄土（89）〜淡黄褐色（73） (4) スターチ・無機塩寒天培地 生育度 ：中程度 表面 ：気菌糸の形成は中程度で、白〜黄味白色
（92） 裏面 ：黄茶（73） 拡散性色素 ：黄土（89）〜淡黄褐色（73） (5) チロシン寒天培地 生育度 ：中程度 表面 ：気菌糸の形成は良好で、白〜黄味白色
（92） 裏面 ：黄茶（73） 拡散性色素 ：黄土（89）〜淡黄褐色（73） (6) 栄養寒天培地 生育度 ：中程度 表面 ：気菌糸の形成は弱〜中程度で、白〜黄味
白色（92） 裏面 ：淡黄茶（99〜111 ） 拡散性色素 ：黄土（89）〜淡黄褐色（73） (7) イースト・麦芽寒天培地 生育度 ：良好 表面 ：気菌糸の形成は良好で白〜黄味白色（9
2） 裏面 ：黄茶（73） 拡散性色素 ：黄土（89）〜淡黄褐色（73） (8) オートミール寒天培地 生育度 ：弱 表面 ：気菌糸の形成は弱く、白色 裏面 ：淡黄茶（99）〜淡黄褐色（73） 拡散性色素 ：黄土（89）〜淡黄褐色（73）

【００１８】(c) 生理的性質 (1) 生育温度範囲：６℃で生育する。45℃で生育しな
い。28〜32℃で最も良く生育する。 (2) ゼラチンの液化：陽性 (3) スターチの加水分解：陽性 (4) 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化：中性〜微アルカリ性
となりペプトン化する。 (5) メラニン色素の生成 チロシン寒天培地（ISP培地No.７）：陰性 ペプトン・イースト鉄寒天培地（ ISP培地No.6）：陽性 (6) Tween 80の分解：陽性 (7) 硝酸塩の還元性：陽性 (8) 硫化水素の生成：陽性 (9) エラスチンの分解：陽性 (10)キサンチンの分解：陽性 (11)アルブチンの分解：陽性 (12)食塩耐性（７％）：陽性 （10％）：陽性 （13％）：陰性

【００１９】(d) 炭素源の同化性 アラビノース：陰性〜弱陽性 キシロース：陽性 グルコース：陽性 フラクトース：陽性 シュクロース：陰性 イノシトール：陰性 ラムノース：陰性〜弱陽性 ラフィノース：陰性 マンニット：陽性 ガラクトース：陽性 サリシン：陽性

【００２０】以上の菌学的性質について、 R. E. Buchanan and N. E. Gibbons(eds.): Berge
y's Manual of Determinative Bacteriology 8th ed.,
Williams and Wilkins Co., Baltimore(1974) E. B. Shiriling and D. Gottlied: Int. J. Syst.
Bacteriol., vol.16,313(1966); vol.18, 69, 279(196
8); vol.19, 391(1969); vol.22, 265(1972) E. Kuster: Simple working key for the classifi
cation and identification of named taxa included i
n the International Streptomyces Project. Int. J.
Syst. Bacteriol., col.22, 139(1972) 等を参照して同定した。本菌は胞子形成菌糸が単純分枝
で、Rectus Flexibilisタイプであり、白色から黄味白
色であること、裏面及び拡散性色素が黄土から淡黄褐色
で顕著な色調ではないこと、メラニン色素を生成するこ
と及び炭素源の同化パターンから近縁菌として、Strept
omyces albolongus, S. aureomonopodiales, S. cavour
ensis, S. cyaneofuscatus, S. griseobrunneus があ
る。しかしながら、表１に示すように本菌株はこれらの
既知菌種とは完全に一致しない。

【００２１】

【表１】

【００２２】表中で、Ａは S. albolongus、Ｂは S. au
reomonopodiales、Ｃは S. cavourensis、Ｄは S. cyan
eofuscatus、Ｅは S. griseobrunneusを示し、RFは Rec
tusFlexibilisタイプを示す。

【００２３】従って、本菌株をストレプトミセス・エス
ピー No.8017と命名した。なお本菌株は工業技術院生命
工学工業技術研究所に、FERM P-13687として寄託されて
いる。

【００２４】本菌株を利用して、新規なメタロエンドペ
プチダーゼを製造するためには、当該微生物が良好に生
育し、酵素を順調に生産するために必要な栄養源を含有
する合成培地又は天然培地中でこれを培養する。

【００２５】その培養形態としては液体培養、固体培養
いずれも可能であるが工業的には深部通気攪拌培養を行
うのが有利であり、又使用する培養源としては一般に微
生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその
他の微量栄養源の他、ストレプトミセス属に属する微生
物の利用できる栄養源であれば全て使用できる。

【００２６】培地の炭素源としてはブドウ糖、麦芽糖、
果糖、水飴、ショ糖、グリセリン、デキストリン、澱粉
等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独で又は組合せ
て用いられ、窒素源としては無機窒素源、有機窒素源の
いずれも使用可能であり、無機窒素源としては硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化
アンモニウム等が挙げられ、又有機窒素源としては大豆
粉、脱脂大豆粕、米糠、小麦フスマ、トウモロコシフス
マ、ミルクおよびそれらの酸あるいはアルカリ分解物を
はじめコーンステイープリカー、ペプトン、肉エキス、
カゼイン、アミノ酸、乾燥酵母、酵母エキス等が挙げら
れ、無機塩及び微量栄養素としてはリン酸、マグネシウ
ム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタ
ミン、非イオン界面活性剤、消泡剤等の菌の生育や本酵
素の生産を促進するものであれば必要に応じて使用でき
る。

【００２７】培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育
し本酵素が産生する範囲であれば良く、好ましくは15〜
40℃であり、培養時間は条件により異なるが本酵素が最
も産生される時間まで培養すれば良く、通常２〜12日程
度である。

【００２８】本酵素は液体培養では菌体内及び培養液中
の何れにも生産されるので、培養終了後、菌体抽出液又
は培養液より固形分を除いた培養ろ液より採取され、且
つ、菌体抽出液又は培養ろ液より通常酵素精製に用いら
れる方法を使用して精製され得る。

【００２９】例えば、エタノール、アセトン、イソプロ
ピルアルコール等の有機溶媒による処理、硫安、食塩等
による塩析、透析、限外ろ過法、ＳＰセルロース、ＣＭ
セルロース、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥセルロース等
を用いたイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー、及びブチールトヨパー
ル、オクチールセルロファイン、フェニールセルロファ
イン等を用いた疎水クロマトグラフィー、サイズ排除ク
ロマトグラフィー、キレートセルロファイン等のキレー
ト担体を用いた金属キレートアフィニティークロマトグ
ラフィー、オクタデシールシランを結合させたシリカゲ
ル担体を用いる逆相分配クロマトグラフィー、抗体を結
合させたアフィニテイークロマトグラフィー、基質類似
物質を結合させたアフィニティークロマトグラフィー、
ゲルろ過、吸着剤、等電点分画等の方法が使用でき、更
に又、これらの方法を適当に組合せる事により本酵素の
精製度が上る場合は適宜組合せて行う事ができる。

【００３０】そして、これらの方法によって得られる酵
素は安定化剤として各種の塩類、糖類、蛋白質、脂質、
界面活性剤等を加え或いは加えることなく、限外ろ過濃
縮、逆浸透濃縮、減圧濃縮、真空乾燥、凍結乾燥、噴霧
乾燥等の方法により液状又は固形の酵素標品を得ること
ができる。

【００３１】こうして精製された本酵素は、次のような
物理化学的性質を有する。 (1) 作用：ミルクカゼイン、卵白アルブミン、牛血清ア
ルブミン等のタンパク質及びブラジキニン、アンジオテ
ンシンII等のペプチドのペプチド結合に作用する。 (2) 基質特異性：合成基質のカルボベンゾキシアラニル
ロイシンアミド（Z-Ala-Leu-NH₂ ）、カルボベンゾキシ
グリシルロイシンアミド（Z-Gly-Leu-NH₂ ）及びカルボ
ベンゾキシグリシルフェニルアラニンアミド（Z-Gly-Ph
e-NH₂ ）のアミド結合部位、ピログルタミルフェニルア
ラニルロイシンパラニトロアニリド（Pyr-Phe-Leu-pNA
）、カルボベンゾキシアラニルアラニルロイシンパラ
ニトロアニリド（Z-Ala-Ala-Leu-pNA ）及びカルボベン
ゾキシグリシルグルシルロイシンパラニトロアニリド
（Z-Gly-Gly-Leu-pNA ）のロイシンパラニトロアニリド
結合部位の各々に特異的に作用する。 (3) 至適pH： 8.5〜9.0 （図１に示される。） (4) 至適温度：65〜70℃（図２に示される。） (5) pH安定範囲： 3.0〜9.5 （図３に示される。） (6) 温度安定範囲：65〜80℃（図４に示される。） (7) 安定化：本酵素はカルシウムイオン存在下で安定化
される。 (8) 阻害剤の影響：本酵素はＥＤＴＡ（Ethylene diami
ne tetraacetic acid 2Na ・ H₂O ）によって強く阻害さ
れ、そして、オルトフェナンスロリン（o-Phenanthroli
ne）及びホスホラミドン〔N-( α-rhamnopyranosyloxy
hydroxyphosphinyl)-Leu-L-Typ・2Na ・2H₂O〕によっても
阻害されるが、モノヨード酢酸及びヨードアセトアミド
によっては阻害されない。 (9) 分子量：約38,000（ＳＤＳ電気泳動法による。） (10)等電点：約4.9 (11)アミノ酸組成：表２に示される。

【００３２】

【表２】

【００３３】(12)配位金属：Zn（１原子／分子） (13)本酵素の活性測定法：5mM酢酸カルシウムを含む50m
M HEPES（N-2-Hydroxyethyl piperazine-N'-2-ethanesu
lfonic acid）緩衝液（pH7.3）1.95mlおよび酵素液1.0m
lを試験管に入れ、37℃で５分間予熱する。これに基質5
0μl を加えて10分間反応させ、反応停止液0.5mlを加え
て、波長405nm で吸光度を測定し、この条件で１分間に
１マイクロモルの基質を分解する酵素量を１単位とす
る。尚、基質はカルボベンゾキシグリシルグルシルロイ
シンパラニトロアニリド（Z-Gly-Gly-Leu-pNA ）30mgを
２mlのジメチルホルムアミドに溶解して調製し、反応停
止液はジオキサンと酢酸を７：３の割合に混合し調製す
る。

【００３４】上記の物理化学的性質を有する本酵素は、
金属分析から酵素蛋白１分子中に亜鉛元素１個を配位す
ること及び阻害剤のＥＤＴＡ、オルトフェナンスロリン
及びホスホラミドンによって阻害されることから典型的
なメタロエンドペプチダーゼであることが分かる。

【００３５】そして又、本酵素は、合成基質のピログル
タミルフェニルアラニルロイシンパラニトロアニリド
（Pyr-Phe-Leu-pNA ）及びカルボベンゾキシグリシルグ
ルシルロイシンパラニトロアニリド（Z-Gly-Gly-Leu-pN
A ）に対する基質特異性に関して、通常の典型的メタロ
エンドペプチダーゼのサーモライシンの作用部位とは表
３で示されるように全く異なっている。

【００３６】

【表３】

【００３７】尚、表中のZ は、カルボベンゾキシの略で
あり、Pyr は、ピログルタミン酸の略であり、OPは、オ
ルソフェナンスリンの略であり、矢印はペプチドの切断
箇所を示す。

【００３８】また、本酵素と公知のストレプトミセス属
由来のメタロエンドペプチダーゼ、即ち文献１：〔講談
社発行、森原和之著；金属タンパク質の化学−メタロプ
ロテイナーゼ（299−306頁）〕及び文献２：特公平２−
23532号に記載のものについて、それぞれの基質特異
性、至適pH、安定pH範囲及び安定温度範囲の各物理化学
的性質を比較すると表４に示すとおりである。

【００３９】

【表４】

【００４０】表４より明らかなように本酵素は、従来よ
り知られているストレプトミセス属由来のメタロエンド
ペプチダーゼとは全く異なっていることが判る。

【００４１】それ故、本発明者らは、本酵素を新規酵素
であるとしてメタロエンドペプチダーゼＦ（以下「本酵
素」という）と命名した。

【００４２】更に、本発明者らは本酵素を生産する菌株
を他のストレプトミセス属に求めたところ、ストレプト
ミセス・アウレウス(Streptomyces aureus) 、ストレプ
トミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、スト
レプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hyg
roscopicus）、ストレプトミセス・コエリカラ（Strept
omyces coelicolor ）、ストレプトミセス・リモサス
（Streptomyces rimosus）、ストレプトミセス・ファエ
オクロモゲンス（Streptomyces phaeochromogens）、ス
トレプトミセス・カエスピトサス（Streptomyces caesp
itosus）、ストレプトミセス・カリフォルニカス（Stre
ptomyces californicus ）、ストレプトミセス・ガルテ
ィエリ（Streptomyces galtieri ）、ストレプトミセス
・オリボクロモゲネス（Streptomyces olivochromogene
s ）に属する菌株も本酵素を生産する事を見いだした。

【００４３】より具体的にはストレプトミセス・アウレ
ウス IAM 0092 、ストレプトミセス・グリセウス・サブ
エスピー・グリセウス IFO 3430 、ストレプトミセス・
グリセウス・サブスピーシス・ソルイファシェンス IFO
13689、ストレプトミセス・グリセウス・サブエスピー
・クレトサス IFO 13457、ストレプトミセス・グリセウ
ス・サブエスピー・ロドクロアス IFO 3358 、ストレプ
トミセス・ハイグロスコピカス IFO 3192 、ストレプト
ミセス・コエリカラ IAM 1023 、ストレプトミセス・リ
モサス IFO 3226 、ストレプトミセス・ファエオクロモ
ゲンス IFO 3105、ストレプトミセス・カエスピトサス
IFO 13490、ストレプトミセス・カリフォルニカス HUT
6110 、ストレプトミセス・ガルティエリ IFO 13366、
ストレプトミセス・オリボクロモゲネス IFO 3178等が
挙げられる。これらの微生物を上記と同様に培養し、精
製して本酵素を取得することができる。

【００４４】そして、更に、本酵素は、起炎物質である
ブラヂキニンに強力に作用する消炎酵素でもあるので、
消炎作用を有する酵素のプロナーゼ、セアプローゼ、セ
ラチオペプチダーゼ、キモトリプシン等において、肝臓
疾患に対する予防治療効果があることが報告されている
ことから、本発明者らは、本酵素についても、肝臓疾患
予防治療効果を有するか否かを種々試験し、検討した。

【００４５】その結果、本酵素は、後記の試験例、実施
例に示されるとおり、ウイルス性肝炎を含む慢性肝炎の
予防及び治療に優れた効果を有することが判明した。更
に、本酵素は上記の作用を有すると共に障害された神経
細胞の賦活作用をも有することを認めた。

【００４６】突発性難聴、顔面神経麻痺、難治性口内
炎、舌炎などの治療剤として使用されるステロイドホル
モンは、劇的な効果を示すが、一方副作用が劇しく長期
内服（投与）は困難であることもよく知られている。本
発明の予防治療剤は、このステロイドホルモンが示す全
ての慢性炎症疾患に対する卓越した有効性を有し、しか
もステロイドホルモンの示す激しい副作用を全く示さな
いことは特記すべきことである。

【００４７】本発明者らによって開発された上記のよう
な予防治療効果を有する本酵素は、医薬の投与に一般に
使用されている投与方法、即ち経口的投与、例えば、錠
剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤など、また、非経口的投
与、例えば、注射剤、坐剤、軟膏、エアゾール剤などが
用いられ、さらには他の薬剤、例えば、他の肝臓薬、腎
臓薬、抗生物質、免疫賦活剤、抗腫瘍剤、関節リウマチ
剤、ステロイドホルモン剤等と併用できる。

【００４８】そして、錠剤を作製する場合の剤型として
は、本酵素のpH安定範囲はきわめて広く、酵素の安定性
維持の目的で腸溶顆粒や腸溶錠にする必要は特にない。

【００４９】しかし、胃溶製剤では酵素の溶解が速く、
溶解した酵素液が拡散し、濃度が薄くなるため、胃内で
の拡散防止の目的で腸溶製剤にすることが好ましい。

【００５０】本酵素を有効成分として含有する薬剤の各
種疾患に対する投与方法としては食後に内服せしめる方
法がより一般的である。更に、その投与方法としては、
錠剤であれば、１日１〜３回１〜２錠づつ、食後内服せ
しめ、２週間内服後、２週間中止し、又２週間内服後、
２週間中止というように内服と中止を繰り返す投与方
法。或いは、同様に３週間内服後、２週間中止し、３週
間内服後、２週間中止を繰り返す方法が効果を示す場合
もある。本発明においてはこのような薬剤の投与方法を
離脱方法と称する。

【００５１】本酵素の投与量は、疾病度、投与法、剤型
などによって異なるが、経口投与の場合は、成人一人当
たり、１日、 300〜9000単位で目的を達することができ
る。

【００５２】本酵素のＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性肝炎等
の予防治療剤としての作用メカニズムは不明であるが、
吸収された本酵素が障害部位の肝臓に極めて多量に移行
し、かつ障害部位の組織には浮腫の消退、円形細胞の浸
潤、血管の新生、線維素の溶解、酸性多糖類の増加など
が認められ、肝臓の慢性炎症像、すなわち退行変性や異
常増殖などに治癒反応が惹起促進されていることが認め
られる。

【００５３】又、本酵素の投与により、Ｂ型、Ｃ型肝炎
のHBS抗原、インデックスやHCV 抗体PCR 定量、RNA を
下降せしめ通常に戻すと共にGOT 、GPT 、γ-GTP等の肝
機能検査の異常値が改善するのが認められた。

【００５４】以下に本発明を試験例及び実施例にて具体
的に説明するが、本発明は、これによって何等制限され
るものではない。試験例１ マウスにおける単回投与毒性試験 1.静脈内投与：４週令の Slc:ddY系雄性マウスに、実施
例５で得られた本酵素精製物の乳糖希釈品（0.5単位／m
g）を４，８または16mg／４ml／kgを投与し、対照群に
は注射用生理食塩液を同じ割合で投与した。 2.経口投与 ：約４時間絶食したマウスにステンレス製
経口ゾンデを用いて500，1000及び2000mg／kgを強制経
口投与（対照群には注射用水を同じ割合で投与）し、飼
料は投与３時間後より与えた。 3.観察項目 ：投与当日は投与後 5時間まで、投与後３
日間は１日２回（午前、午後）、それ以後は１日１回投
与後14日間観察した。観察期間中の死亡例については、
発見後できるだけ速やかに、生存例については約４時間
の絶食後、全例について腹腔および胸腔内諸臓器の剖検
を行った。

【００５５】結果 急性毒性： 静脈内投与のLD50は８〜16mg／kgであり、
経口投与のLD50は2000mg／kgを越えることが分かった。 体重： 体重に対する影響はいずれの投与方法、投与群
にも認められなかった。 剖検： 本酵素に起因した変化は認められなかった。

【００５６】試験例２ ラット抗カラゲニン足浮腫作
用試験 ５週令のSlc:Wistar系雄性ラットに生理食塩液に溶解し
た後記実施例５で得られた本酵素精製物の乳糖希釈品
（0.5単位／mg）を１匹あたり0.4,0.8,２または４mg／
４ml／kgを尾静脈内投与（対照群には生理食塩液４ml／
kgを尾静脈内投与）し、直ちに生理食塩液に懸濁した２
％(W／V)κ−カラゲニン 0.05 mlを後肢足蹠皮下に注入
し、κ−カラゲニン注入１時間前および注入３，４およ
び５時間後に処置足蹠第一関節の毛の生え際まで水につ
けてその排積容積を天秤を用いて重量に変換した。

【００５７】この操作を１個体につき連続して３回行な
い、その平均値をその個体の値とし、下記の計算式より
各時間の浮腫率を算出し、浮腫率と０〜５時間の浮腫率
−時間曲線下面積（AUC ）について、対照群と投与群の
比較を行い、実験で得られた各測定値について、平均値
および標準偏差を算出し、t検定を行なった。

【００５８】

【式１】

【００５９】その結果は、表５に示される。

【００６０】

【表５】

【００６１】表５中のa)は、反応曲線下面積（Area und
er the curve）を示し、＊印は、*:P<0.05、**:P<0.01
、***:p<0.001 でそれぞれ有効であることを示す。

【００６２】表５より、明かなように0.8mg／kg以上の
投与群において、有意なラット足浮腫抑制作用が認めら
れた。

【００６３】試験例３ 四塩化炭素肝炎モデルに対す
る作用テスト ５週令のSlc:Wistar系雄性ラットに後記の実施例５で得
られた本酵素精製物の乳糖希釈品（0.5 単位／mg）を１
日１回７日間、１、２または４mg／kg尾静脈内投与し、
その最終投与30分後、オリブ油と等量混合した四塩化炭
素を１ml／kg（四塩化炭素として0.5ml ／kg）腹腔内投
与し、四塩化炭素投与24時間後、エ−テル麻酔下に腹大
動脈より採血し、GOT及びGPTを測定し、また、肝の外側
左葉を採取して病理組織学的検査を行った結果を表６及
び７に示す。

【００６４】なお、試験で得られた各測定値について
は、各群の平均値および標準偏差を算出しStudentある
いはAspin−Welchのt検定を用いて、また、病理組織学
的検査では症状の程度をスコア付けしたのち、Wilcoxon
の順位検定を用いた(Score,-:0,+:1,++:2,+++:3)。

【００６５】表中a)は、平均±標準偏差を示すものであ
り、＊は、p<0.05で有効であることを示す。

【００６６】

【表６】

【００６７】表６より明らかなように、本酵素精製物の
乳糖希釈品の２mg／kg投与群においてGOTの平均値の低
下が認められ、又本酵素精製物の乳糖希釈品の１及び４
mg／kg投与群においてGPT の平均値の低下が認められ、
更に本酵素精製物の乳糖希釈品の２mg／kg投与群では有
意な低下が認められた。

【００６８】

【表７】

【００６９】表中a)は、平均±標準偏差を示すものであ
り、＋は、p<0.1 で有効であることを示す。

【００７０】表７より明かなように、病理組織学的所見
の結果、本酵素精製物の乳糖希釈品の１，２及び４mg／
kgのいずれの投与群でも四塩化炭素による肝小葉中心部
および中間体における脂肪変性の低下傾向が認められ
た。

【００７１】

【実施例】実施例１ ミクニペプトン20g 、澱粉20g 、グリセリン５ml、酵母
エキス（DFC ）２g 、リン酸二カリウム２g 、食塩３g
、水1000mlの培地組成からなる培地50mlを500ml 容の
坂口フラスコに入れ120 ℃、20分間加熱し滅菌した。こ
れにストレプトミセス・エスピーNo.8017（FERM P-1368
7）を接種し、25℃で６日間振盪培養した。培養液を濾
過し、本酵素の活性を測定したところ17.6単位／mlであ
った。

【００７２】実施例２ 実施例１ に準じ操作し、ストレプトミセス・アウレウス
IAM 0092 を接種し25℃で６日間振盪培養した。培養液
を濾過し、本酵素の活性を測定したところ2.5単位／ml
であった。

【００７３】実施例３ 実施例１ に準じ操作し、ストレプトミセス・グリセウス
・サブエスピー・グリセウス IFO 3430 を接種し、25℃
で６日間培養した。培養液を濾過し活性を測定したとこ
ろ0.4 単位／mlであった。

【００７４】実施例４ 実施例１ に準じ操作し、ストレプトミセス・グリセウス
・サブエスピー・ソルイファシェンス IFO 13689、スト
レプトミセス・グリセウス・サブエスピー・クレトサス
IFO 13457、ストレプトミセス・グリセウス・サブエス
ピー・ロドクロアス IFO 3358 、ストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス IFO 3192 、ストレプトミセス・コエ
リカラ IAM 1023 、ストレプトミセス・リモサス IFO 3
226 、ストレプトミセス・ファエオクロモゲンス IFO 3
105 、ストレプトミセス・カエスピトサス IFO 13490、
ストレプトミセス・カリフォルニカス HUT 6110 、スト
レプトミセス・ガルティエリ IFO 13366、ストレプトミ
セス・オリボクロモゲネスIFO 3178をそれぞれ接種し、
25℃で６日間培養し、得られた培養液を濾過し活性を測
定したところ何れの菌株ともそれぞれ約 0.3〜0.4 単位
／mlであった。

【００７５】実施例５ 実施例１ の条件で培養して得た本酵素の粗酵素液1000ml
を用い、10％酢酸でpHを7.0 に調整し、固形硫安を加え
て25％飽和（４℃）にし一夜放置し、生じた沈殿を遠心
分離で除去し、上清に固形硫安を少しづつ加えて60％飽
和（４℃）にし、生じた沈殿を遠心分離で集め、10mlの
精製水に溶かし、セロファンチューブに入れ、低温室で
精製水に対し２日間透析し、透析内液を５mMの酢酸カル
シウムを含む10mMの酢酸緩衝液（pH4.5 ）で平衡化した
ＣＭトヨパールパック650Mカラム（22mmID×20cm、東ソ
ー製）に通し、吸着させた後、カラムの３倍量の平衡化
緩衝液を通しカラムを洗浄し、平衡化緩衝液の食塩濃度
を０から0.5Mまで順次高めてクロマトグラフィーを行っ
た。

【００７６】目的の本酵素は溶出の初期の0.05M 付近で
出てき、その活性画分を集めて５mM酢酸カルシウムに対
して２日間透析し、透析内液を、５mMの酢酸カルシウム
を含む10mMのトリス緩衝液（pH8.0 ）で平衡化したDEAE
トヨパールパック650Mカラム（22mmID×20cm、東ソー
製）に通し、吸着させ、カラムの３倍量の平衡化緩衝液
を通し、カラムを洗浄し、平衡化緩衝液の食塩濃度を０
から0.5Mまで順次高めてクロマトグラフィーを行ない、
活性画分を集めて５mM酢酸カルシウムに対して透析し
た。

【００７７】次に、ホルミールセルロファイン（生化学
工業製）にフェニールアラニール・ロイシンアミドをリ
ガンドとして結合させて調製し、５mM酢酸カルシウムを
含む10mMのHEPES緩衝液(pH7.0) で平衡化したカラム（2
5mmID×25cm) に透析内液を通し、カラムの３倍量の平
衡化緩衝液を通し未吸着の本酵素を洗浄し、0.2%のミル
クカゼインを通し、吸着していた本酵素を溶離し、（本
酵素は２ピークになって溶離し、前側のピークより後側
のピークが大きく活性も高い。）後側のピークを集め、
37℃で２時間加温し混在するカゼインを完全に分解し、
その後、固形硫安を加えて60％飽和にし、一夜低温室に
放置し遠心分離し、沈殿を１mlの上記HEPES緩衝液（pH
7.0 ）に溶かし、TSK ゲルＨＷ65Ｆカラム（20mmID×15
0cm ）を用いてゲル濾過を行った。

【００７８】このようにして得られた本酵素は、アクリ
ルアミドデイスク電気泳動で単一なバンドを示し、TSK
ゲルG3000SWXL カラム（東ソー製）を用いたHPLCにおい
ても分子量34000 のところに単一なピークを示し、その
収量は約15mgで、本酵素１mgあたり400 単位の活性を示
した。

【００７９】実施例６ 実施例５ に準じて得られた本酵素及びコーンスターチを
10:125の割合に混合し、２％ヒドロキシプロピルセルロ
ース水溶液を少しずつ加えて練合機で練り上げた後、押
し出し造粒機で造粒した。得られた細長い顆粒を流動乾
燥し、整粒機にかけてまるめ、20〜30メッシュの篩で分
級した。この顆粒を流動層にいれて常法により、腸溶剤
のヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート2007
31で腸溶性顆粒とした。この腸溶顆粒を２号カプセルに
200mgずつ充填した。

【００８０】実施例７ 実施例５ に準じて得られた本酵素２g、乳糖190g、馬鈴
薯澱粉70g を均一に混合した後、３％ヒドロキシプロピ
ルセルロース水溶液を注加練合する。混合物を整粉し、
この粒状物に対し、0.3％のステアリン酸マグネシウム
を混合して打錠し、錠剤とする。

【００８１】実施例８ 実施例５ に準じて得られた本酵素２g 、乳糖40g を混合
し、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ10g を加え顆
粒に成形した後、酢酸フタール酸セルローズを用い、均
等に被膜し腸溶性顆粒とする。

【００８２】実施例９ ウィッテップゾル H-15 （ダイナマイトノーベル社製）
高級飽和脂肪酸トリグリセリド）S6 157mgとポリオキシ
エチレンラウリルエーテル（日光ケミカルズ社製：BL-2
5 ）325mg を添加し、加温溶融させる。これに実施例５
に準じて得られた本酵素500mg を添加し、分散させ、13
0mgの坐剤型に注入し、固化後、型から分離する。

【００８３】実施例10 ウイルス性肝炎に対する本酵素を有効成分とする薬剤
（以下、本薬剤とする。）の効果（実施例６のカプセル
剤を使用） Ｂ型肝炎患者

【００８４】臨床例１ 男性、57才 (1) 診断名：Ｂ型肝炎、慢性肝炎 (2) 主訴：やや倦怠 (3) 現病歴：約１ヶ月前より、やや倦怠感があるが、食
欲もある。頭痛その他異常なし。 (4) 現症：健康診断でＢ型肝炎といわれて当院に来院、
腹部、著変なし。 (5) 肝臓：表面平滑、觸診にて異常なし。 (6) 肝機能検査：表８の通り。

【００８５】

【表８】

【００８６】(7) 本薬剤による治療：本薬剤を１日６c
p、毎食後２cpづつ内服せしめた。12ヶ月後、Ｂ型肝炎
のHBS 、HBE インデックス、HBE抗体阻害率は正常にな
った。（尚、離脱投与方法を併用した。）

【００８７】Ｃ型肝炎患者臨床例２ 女性、68才 (1) 診断名：Ｃ型肝炎、慢性肝炎 (2) 主訴：全身倦怠、食欲不振 (3) 現病歴：約７ヶ月前より、全身倦怠感及び食欲不振
を訴え、仕事をする気力がなくなった。 (4) 現症：顔色やや蒼白、少し黄色を帯びる。腹部はや
や肥大するが、覆水貯留等の異常は認めず。 (5) エコー検査：レ線検査：両側腎臓、脾臓異常なし。
胆嚢はやや肥大。胆石は認めず。膵臓、大腸、小腸、
胃、十二指腸には著変なし。 (6) 肝臓：表面平滑、肝管腔はやや細くなっているが、
萎縮や限局性の異常像は肝組織には認められない。 (7) 肝機能検査：表９の通り。

【００８８】

【表９】

【００８９】(8) 本薬剤による治療：本薬剤を１日６c
p、毎食後２cpづつ内服せしめた。６ヶ月後、肝機能検
査は正常になり、Ｃ型肝炎のHCV 抗体インデックス、HC
V 抗体ユニット、HCV 抗原PCR 、定量（RNA ）も正常に
なった。

【００９０】その他のＢ型肝炎症例６例、Ｃ型肝炎症７
例の本薬剤の治癒成績の平均値を表10に示した。Ｂ型肝
炎は、HBS 、HBE 抗原インデックスは低下し６例中５例
は正常に戻り、１例もほぼ正常に復した。Ｃ型肝炎はHC
V インデックス、ユニットは、ほぼ正常に復し、７例中
５例はHCV 抗原PCR 定量のRNA は正常、２例もほぼ正常
に復した。Ｃ型肝炎の改善経過を表10、表11及び表12に
示した。

【００９１】

【表１０】

【００９２】

【表１１】

【００９３】

【表１２】

【００９４】実施例11 慢性肝炎に対する本薬剤の効果（実施例６のカプセル剤
を使用） 慢性肝炎患者臨床例３ 男性、55才 (1) 診断名：慢性肝炎、肝硬変 (2) 主訴：食欲不振、右季部やや圧迫感、全身倦怠 (3) 現病歴：４〜５年前から上記症状があり、大病院に
入退院を繰り返していた。 (4) 現症：肝臓はやや肥大し、やや硬い程度であった。
血液検査、肝機能検査、及び超音波診断を行った。 (5) 超音波診断： (6) 肝臓：表面はほぼ平滑であるが、組織はやや萎縮、
肝管腔はやや細くなり、屈折を認めるが管内には異常像
は認められない。肝細胞のバイオプシーにて軽度の肝硬
変と慢性肝炎の像を認めた。肝嚢はやや嚢胞状で胆石は
認めず、総胆管は拡張せず。 (7) その他の臓器：両側腎臓、脾臓は異常なし。膵臓異
常なし。 (8) 肝機能検査：表13の通り

【００９５】

【表１３】

【００９６】(9) 本薬剤による治療：本薬剤を１日６c
p、毎食後２cpづつ内服せしめた。６ヶ月後、肝機能検
査は正常になり、自覚症状も快善した。（尚、離脱投与
方法を併用した。）

【００９７】臨床例４ 男性、71才 (1) 診断名：慢性肝炎 (2) 主訴：全身倦怠、食欲不振 (3) 現病歴：約10ヶ月前より全身倦怠及び食欲不振を訴
え、仕事もできなくなった。 (4) 現症：顔色やや蒼白、少し黄色を帯びる。腹部は異
常なし。 (5) エコー検査：レ線検査：腎臓、脾臓、膵臓、大腸、
小腸、胃、十二指腸には著変なし。 (6) 肝臓：表面平滑、肝管腔はやや細くなっているが、
肝組織には異常を認めず。 (7) 肝機能検査：表14の通り。

【００９８】

【表１４】

【００９９】(8) 本薬剤による治療：本薬剤を１日５c
p、朝食後２cp、昼食後１cp、夕食後２cp内服せしめ、
６ヶ月後、肝機能検査成績は正常になった。

【０１００】実施例12 本薬剤と肝臓疾患予防治療剤としてして効果が認められ
たプロナーゼとの比較各々、慢性肝炎患者20例、肝硬変
患者20例について本薬剤とプロナーゼの効果を比較す
る。その治癒率を表15に示し、慢性肝炎患者20例の肝機
能改善度（Kruskal Wallis Test ）を表16に示す。

【０１０１】

【表１５】

【０１０２】

【表１６】

【０１０３】表14及び表15より明らかなように、対照薬
としてのプロナーゼを使用した場合の慢性肝炎の治癒率
は15％、肝硬変の治癒率は10％程度であるが、本願発明
の本酵素の治癒率は各々85％、73％と非常に高率であり
その効果は絶大である。

【０１０４】また、プロナーゼを使用した患者のは比較
的軽症であった。即ち、検査成績で、GOT 、GPT は60以
下であった。

【０１０５】本願発明の本酵素を用いた患者の治療率は
上記の通り高率で、しかも今回の症例は全てかなり重症
で、GOT 、GPT は何れも100 以上の重症であった。

【０１０６】試験例４ 本酵素とステロイドホルモン
との比較 特開平2-292226記載の方法に従い、プレドニゾロン、Ｎ
ＭＰ₁ と本酵素のカラゲニン浮腫抑制作用、カラゲニン
胸膜炎とChemotaxis、肉芽腫抑制作用を比較測定した。
その結果を表17、図５及び図６に示す。

【０１０７】

【表１７】

【０１０８】実施例13 慢性感音性難聴患者15例（内、耳鳴症状を訴える患者10
例）、急性感音性難聴患者５例（内、耳鳴症状を訴える
患者４名）について、本薬剤を１日５cp（朝２cp、昼１
cp、夕２cp）食後内服せしめた。投与前の聴力検査の結
果と約１ヶ月後の聴力検査の値を図７及び図８に示す。
聴力検査の結果は劇的に快方に向かい、耳鳴も消失或い
は軽減した。その効果は特開平2-292226記載のＮＭＰ₁
と比べ格段に優れたものであった。

【０１０９】実施例14 顔面神経麻痺（18例）、反回神経麻痺（14例）、難治性
口内炎（25例）、舌炎（17例）、味覚障害（20例）、嗅
覚障害（20例）、眼底血管障害（19例）、脳動脈硬化症
兼うつ病（ボケの症状）（８例）の各患者に実施例13と
同様に本薬剤を投与したところ、各々快方に向かい、完
治した症例としては顔面神経麻痺（17例）、反回神経麻
痺（８例）、難治性口内炎（20例）、舌炎（15例）、味
覚障害（17例）、嗅覚障害（19例）、眼底血管障害（10
例）、能動脈硬化症兼うつ病（ボケの症状）（５例）で
あった。以上のように特開平2-292226記載のＮＭＰ₁ と
比べその効果は明らかに優れていた。

【０１１０】実施例15 ＨＩＶ感染者に対する本薬剤の効果（実施例７の錠剤を
使用）臨床例５ 男性、49才 (1) 主訴：咽喉頭部痛、眩暈 (2) 現症：聴力検査、平衡機能検査にて右への眼振方向
優位性を認め、左への歩行偏倚を認めた。 (3) 血液検査：赤血球、白血球、ヘマトクリット、ＧＯ
Ｔ、ＧＰＴ・γＧＴＰ、コレステロール、異常無し、尿
検査、異常無し。 (4) ビールス検査：ＨＢＶ、ＨＣＶ、抗体検査にてＢ型
肝炎、Ｃ型肝炎、異常無し。ＨＩＶ検査、ＥＬＩＳＡ法
にて陽性を認めたので、更にウエスタンブロット法検査
にて確認検査を行った結果、陽性を認めた。 (5) 本薬剤による治療：ＭＥＰ−Ｆを１日６錠、経口投
与、８週間持続投与後３週間中止、更に３週間内服後、
３週間中止を繰り返し、２５週間後、ＥＬＩＳＡ法検査
にて陰性となり、ウエスタンブロット法でも陰性になっ
たので、更に１２週間、内服、中止の療法を繰り返し、
現在も経過観察中。このように、ＭＥＰ−Ｆ投与によ
り、エイズ患者１例に著効を認めた。

【０１１１】

【発明の効果】ストレプトミセス属の産生する本酵素
は、新規なメタロエンドペプチダーゼであり、且つ又、
ウイルス性肝臓疾患を含めた各種の肝臓疾患予防治療作
用や障害された神経細胞の賦活効果を有しているので、
本酵素を有効成分とする該予防治療剤は、有効な薬物療
法が少ないとされている肝臓の各種疾患の治療や神経細
胞障害、更にはエイズの予防治療に卓越した効果を奏す
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適pHを示すグラフである。

【図２】本酵素の至適温度を示すグラフである。

【図３】本酵素のpH安定性を示すグラフである。

【図４】本酵素の温度安定性を示すグラフである。

【図５】本酵素とＭＮＰ₁ 及びプレドニゾロンとの遊走
因子の産生を対比したグラフである。

【図６】本酵素とＭＮＰ₁ 及びプレドニゾロンとの肉芽
腫抑制作用を対比したグラフである。

【図７】実施例13の急性感音性難聴患者のオーディオグ
ラム図を示す。尚、図中−○−は右耳、−×−左耳の結
果を示し。及び’は治療前、及び’は治療後１
ヶ月の時を表す。

【図８】実施例13の慢性感音性難聴患者のオーディオグ
ラム図を示す。尚、図中−○−は右耳、−×−左耳の結
果を示し。及び’は治療前、及び’は治療後１
ヶ月の時を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 藤崎 恭大 兵庫県西宮市殿山町３−28

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の理化学的性質を有するメタロエンド
   ペプチダーゼＦ。 (1) 作用：ミルクカゼイン、卵白アルブミン、牛血清ア
   ルブミン等のタンパク質及びブラジキニン、アンジオテ
   ンシンII等のペプチドのペプチド結合に作用する。 (2) 基質特異性：合成基質のカルボベンゾキシグリシル
   ロイシンアミド（Z-Gly-Leu-NH₂ ）及びカルボベンゾキ
   シグリシルフェニルアラニンアミド（Z-Gly-Phe-NH₂ ）
   のアミド結合部位、ピログルタミルフェニルアラニルロ
   イシンパラニトロアニリド（Pyr-Phe-Leu-pNA ）及びカ
   ルボベンゾキシグリシルグリシルロイシンパラニトロア
   ニリド（Z-Gly-Gly-Leu-pNA ）のロイシンパラニトロア
   ニリド結合部位に特異的に作用する。 (3) 至適pH： 8.5〜9.0 (4) 至適温度：65〜70℃ (5) 安定pH範囲： 3.0〜9.5 (6) 温度安定範囲：65〜80℃
2. 【請求項２】ストレプトミセスに属し、新規メタロエン
   ドペプチダーゼＦ生産能を有する菌株を栄養培地で培養
   し、培養物中に新規メタロエンドペプチダーゼＦを産生
   せしめ、これを採取することを特徴とする新規メタロエ
   ンドペプチダーゼＦの製造法。
3. 【請求項３】新規メタロエンドペプチダーゼＦを有効成
   分として含有してなる肝臓疾患予防治療剤。
4. 【請求項４】新規メタロエンドペプチダーゼＦを有効成
   分として含有してなる障害された神経細胞の賦活予防治
   療剤。
5. 【請求項５】新規メタロエンドペプチダーゼＦを有効成
   分として含有してなるエイズ予防治療剤。