JPH0142670B2

JPH0142670B2 -

Info

Publication number: JPH0142670B2
Application number: JP13869882A
Authority: JP
Inventors: Setsuo Kobayashi; Teruo Oomori; Ryotaro Kotani
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1982-08-09
Filing date: 1982-08-09
Publication date: 1989-09-13
Also published as: JPS5928473A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、植物組織培養の技法を用いて、ワサ
ビダイコン属に属する植物の組織培養物からペル
オキシダーゼを分離採取することから成るペルオ
キシダーゼの製造法、更に詳しくは、ワサビダイ
コン属に属する植物体から分離した組織片または
細胞をオーキシン類、サイトカイニン類等の植物
ホルモン類の少なくとも一種を含有する栄養培地
に培養し、得られた培養物よりペルオキシダーゼ
を採取することを特徴とする、ペルオキシダーゼ
の製造法に関するものである。

従来、ペルオキシダーゼは分析用試薬酵素及び
臨床検査キツト用酵素としてはもちろんのこと、
組織化学や細胞化学の分野で蛋白質トレーサーと
して、組織細胞内におけるその取り込みや蛋白質
輸送の研究に広く用いられている。

ペルオキシダーゼはイチジク、サツマイモ、イ
ンゲンマメ、ダイコン、小麦、カブラ、日本ワサ
ビ、ワサビダイコンなど一般に植物界に広く存在
しているが、ワサビダイコン根部のペルオキシダ
ーゼ含量が高いなどの理由により、現在では工業
的生産の目的には、ワサビダイコンが好んで用い
られている。

しかし、ワサビダイコン由来のペルオキシダー
ゼは酸性、中性、及び塩基性アイソザイムなど、
少なくとも７種類以上の酵素から成つており、ペ
ルオキシダーゼ含量及びこれらアイソザイム組成
比は、ワサビダイコンの種類、栽培した土壌の性
質、与えた肥料の種類と量、天候、採取時期など
により著しく変動することが知られている。従つ
て精製されたペルオキシダーゼの品質も必ずしも
一定ではないという欠点を有している。

また、ワサビダイコンは、現在長野県、東北地
方、北海道などごく限られた地域で栽培されてお
り、その生育には20℃前後が適温で収穫には７又
は８ケ月を要する。また、根が深く張る為耕土の
深い、肥沃な、保水性のよい地域にのみ栽培が限
られているのが実情である。

そこで、本発明者らは天候、地域、収穫、時期
等に左右されず、また広い耕地を必要とせず、人
為的に管理された条件下で常に生産性、品質共に
安定したペルオキシダーゼの生産を可能にする方
法について検討した結果、近年とみに進展の著し
い植物組織培養法に先ず着目した。

従来、薬用植物などの細胞、組織を培養して、
その植物に本来特有の薬用成分を生産する研究が
試みられている。しかし、今日までの研究では一
部の植物を除いて、母植物中で生成蓄積していた
目的薬用成分が培養物中では、全く生成されない
か、或いは生成されてもその収量は極めて小さい
場合が多い。

また、たとえ同一の物質であつても、植物の種
類や培養条件の差により、生産性が異なり、母植
物間における生産性の差をそのまま反映するとは
限らないという事実も知られており、どのような
植物にも適用できるという一般的培養条件は未だ
確立されていないのが実情である。

例えば、植物培養細胞中のペルオキシダーゼの
存在については幾つかの文献が既に報告されてい
る。具体的にはタバコ、インゲンマメ、ナデシコ
などの植物組織培養カルスでペルオキシダーゼが
確認されているが、その産生は極めて低く実用的
ではない。

そこで、本発明者らは、このような状況を考慮
しながら、植物組織培養によりペルオキシダーゼ
を生産するにはまず植物材料の選択が重要である
と考え、ペルオキシダーゼを含有することが知ら
れている多種の植物を検討した結果、ワサビダイ
コン属に属する植物が、その培養物中に著量のペ
ルオキシダーゼを生成することを見い出し、本発
明を完成するに至つたものである。

すなわち、本発明はワサビダイコン属に属する
植物体から分離した組織片または細胞を栄養培地
で培養し、得られる培養地よりペルオキシダーゼ
を採取することを特徴とするペルオキシダーゼの
製造法である。

本発明において用いられるワサビダイコン属植
物としては、Armoracia lapathifolia、
Armoracia rusticanaなどがあげられる。また本
発明において用いられるワサビダイコン属に属す
る植物体から分離される組織片または細胞として
は植物体の根部、葉柄部、葉部、種子等培養条件
下で細胞分裂して増殖し得る組織片または細胞な
らばどの部位でも良いが、一般的には根部が好ん
で用いられる。また植物体から直接個々の細胞を
単離して培養に導くことは困難であることから、
組織片を用いるのが便利である。

本発明において用いられる栄養培地としては既
知の無機合成培地に炭素源、オーキシン類、サイ
トカイニン類を加えたものを基本とし、これにビ
タミン類、アミノ酸類、有機物などを加えたもの
であれば支障なく使用することができる。

上記無機合成培地としては、ホワイト培地、リ
ンスマイヤー―スクーグ培地、ムラシゲースクー
グ培地などが好んで用いられるが、これら培地組
成を改良したものも使用することができる。

本発明において使用されるオーキシン類は総て
既知のものであり、例えば３―インドール酢酸、
１―ナフタレン酢酸、ｐ―クロロフエノキシ酢
酸、２，４―ジクロロフエノキシ酢酸などを挙げ
ることができる。

また、オーキシン類を用いる場合には、非常に
希釈した濃度、たとえば１×10^-4〜１×10^-8モー
ル、好ましくは１×10^-6〜１×10^-7モルの濃度が
適当である。

本発明において使用されるサイトカイニン類と
してはキネチン、ゼアチン、６―ベンジルアミノ
プリンなどがあるが、これらは総て既知の物質で
ある。また、これらの物質は０〜１×10^-5モル、
好ましくは０〜１×10^-6モルの濃度で使用され
る。

本発明において使用される炭素源としてはアル
コール類、有機酸類が使用可能であるが、細胞の
増殖性を考えるとシヨ糖、ブドウ糖、バクガ糖な
どが好ましい。使用濃度としては１〜10％ｗ／
ｖ、好ましくは２〜４％ｗ／ｖである。

培地のPH値は一般には中性附近、即ち5.4〜7.3
が適当であり、培養温度は20〜30℃、特に23〜28
℃が好ましい。

培養日数については実質的に必要とされる培養
物が得られるまで培養は続けられるが、通常は10
日〜３週間程度である。

尚、本発明で述べる組織片または細胞は前記培
養条件下に培養すると、特に組織片は増殖細胞の
集塊（以後カルスと呼ぶ）となり、元の組織片の
様子とは全く異なつてくるが本発明の培養物とは
このようにして得られたカルスを固型培地上また
は液体振温培地中で継代培養して得られるカルス
の集合と培地成分の混合物を示すものである。

上記の如き条件下に培養することにより、培養
物中の湿物当りのペルオキシダーゼ含量は、例え
ばワサビダイコン根部組織の湿物当りのペルオキ
シダーゼ含量に比し、1.5〜７倍高いものを得る
ことができる。

培養物からのペルオキシダーゼの採取法として
は、天然物からペルオキシダーゼを採取するに通
常用いられる手段が適宜利用される。即ちカルス
からペルオキシダーゼを採取する場合には培養物
を別し、得られたカルスに適量の水を加え、ホ
モジナイズした後、布を用いて過する。得ら
れた液を硫安塩析することにより粗ペルオキシ
ダーゼ標品を得る。又培養物を別して得られた
培地からペルオキシダーゼを採取する場合には直
接得られた培地を硫安塩析することにより粗ペル
オキシダーゼを得ることができる。

次いで、公知のクロマトグラフフイーによる吸
着法と脱着法、或いは分子量の差を利用したゲル
過法などの組合せにより、粗ペルオキシダーゼ
標品を精製することができる。

採取法は上記方法に限定されない。

本発明では天候、地域、収穫、時期等に左右さ
れず、また広い耕地を必要とせず、人為的に管理
された条件下で、常に生産性、品質共に安定した
ペルオキシダーゼの生産が可能となつた。

以下本発明を実施例により説明する。

実施例１アブラナ科植物のワサビダイコン（別名セイヨ
ウワサビ、horseradish、Armoracia
lapathifolia）の根部を充分水洗し剥皮後、70％
エタノール水溶液で10秒間、0.2％オスバン水溶
液で５分間、0.8％アンチホルミン水溶液で20分
間順次殺菌処理を施した後、滅菌蒸留水を用いて
残存殺菌剤を除去した。次いで無菌条件下で該根
部を約５mm³程度に切断した。この小片を10^-6モ
ルの2.4―ジクロクフエノキシ酢酸、10^-8モルの
キネチン及び10ｇ/の寒天を含むリンスマイヤ
ー―スクーグの培地へ置床し、25℃、暗条件下で
３週間培養し、カルスを誘導した。このようにし
て得られたカルスの部分を切り取つて、上記と同
様組成の新培地で数代以上継代培養を行ない、そ
の増殖速度とペルオキシダーゼ含量の両者を基準
として優良カルスを選抜した。

選抜したカルス中のペルオキシダーゼ活性は、
950μ/ｇ（湿物量）で、母植物の根部のそれ
（130〜180μ/ｇ湿物量）よりも著しく高かつた。

なお、ペルオキシダーゼ活性は下記の方法に従
つて測定した。即ち、150〜200mgのカルスを正確
に秤量し20倍量の水と共に乳ばち内ですりつぶし
た後、5000ｇ４℃で10分間遠心分離し、得られた
上澄液を下記分析方法における酵素溶液とした。
２mlの200ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）、１mlの１
ｍＭオルトアミノフエノール溶液及び１mlの４ｍ
Ｍ過酸化水素溶液からなる反応液を25℃で５分間
加温し、酵素溶液は0.08〜0.2U／mlになるように
10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）で希釈した後、こ
の0.5mlを上記反応液に加え、25℃で３分間反応
せしめた後、これに0.5mlのIN―HCl溶液を加え
て反応を停止した。盲検は上記反応液に酵素溶液
を加えないで３分間反応し、0.5mlのIN―HCl溶
液を加えた後0.5mlの酵素溶液を加えた。

両者とも、分光光度計にて480nmの吸光度を測
定し、下記の計算式に従つて酵素力価を求めた。

Ｕ／ml＝△0D480×5.0（ml）／7.00×3.0×0.5（ml）
×希釈率 △0D480＝0D480−0D480（盲検） 7.00＝モル吸光度係数（cm²／ミリモル） 5.00＝反応液量（ml） 3.0 ＝反応時間（min） 0.5 ＝酵素溶液 U/ｇ＝Ｕ／ml×ｘ（ml）ｙ(ｇ) ｘ＝カルスを懸濁した時液量（ml）ｙ＝カルス重量(ｇ) 実施例２実施例１で得られた2.5ｇ（湿物量）の優良カ
ルスを10^-6モルの2.4―ジクロロフエノキシ酢酸
及び10^-8モルのキネチンを含むリンスマイヤース
クーグの培地75ml（300ml容三角フラスコ）に移
し、25℃暗条件下で10日間振盪培養した。その結
果カルスの湿重量は約20ｇ、培地約55mlが得られ
た。

ここで得られたカルス20ｇに蒸留水100mlを加
えて、ホモジナイザーにより充分粉砕したあと遠
心分離（5000ｇ４℃15分間）により上清を得た。
この上清に0.3と0.65飽和の硫安分画を施し、得
られた沈澱は10mlの10mM酢酸ナトリウム緩衝液
PH4.7に溶解し、セフアデツクスＧ―25により脱
塩した。得られた活性フラクシヨンは、同緩衝液
に緩衝化したSP―セフアデツクスＣ―50に吸着
させた後、緩衝液濃度を10ｍＭから100ｍＭに上
げて溶出した。ここで活性フラクシヨンは４つに
分かれ、それぞれを別々に回収し濃縮した後、セ
フアデツクスＧ―75によりゲル過し、活性フラ
クシヨンを回収濃縮後、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液PH5.5で透析し、凍結乾燥した。

又、培地中のペルオキシダーゼを採取する場合
には、培地に直接0.3と0.65飽和の硫安分画を施
し、以後同様に精製操作を実施した。

以上の結果、カルスからはペルオキシダーゼ活
性が約300U／mgである固型物が20mg、培地から
は約250U／mgである固形物が７mg得られた。

実施例３ワサビダイコンの根部以外に茎部、葉部につい
て実施例１と同じ方法でカルスを誘導し、細胞の
増殖性が高く、かつペルオキシダーゼ含量の高い
カルスを選抜したが、茎部からのカルスのペルオ
キシダーゼ活性は300μ/ｇ（湿物量）葉部からの
カルスで同じく200μ/ｇ（湿物量）と根部より得
られたカルスのそれと比較して低い結果が得られ
た。

Claims

【特許請求の範囲】

１ワサビダイコン属に属する植物から分離した
組織片または細胞を栄養培地に培養し、得られた
培養物からペルオキシダーゼを採取することを特
徴とするペルオキシダーゼの製造法。