JPH02276574A - ワサビ培養細胞によるペルオキシダーゼ製造法及び培養物からのペルオキシダーゼ精製法 - Google Patents
ワサビ培養細胞によるペルオキシダーゼ製造法及び培養物からのペルオキシダーゼ精製法Info
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- JPH02276574A JPH02276574A JP1096773A JP9677389A JPH02276574A JP H02276574 A JPH02276574 A JP H02276574A JP 1096773 A JP1096773 A JP 1096773A JP 9677389 A JP9677389 A JP 9677389A JP H02276574 A JPH02276574 A JP H02276574A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は，植物組織培養法によってワサビア属植物の組
織片は、又は細胞からペルオキシダーゼを製造する方法
、及び培養物からのペルオキシダーゼの精製法に関する
。
織片は、又は細胞からペルオキシダーゼを製造する方法
、及び培養物からのペルオキシダーゼの精製法に関する
。
（従来の技術）
ペルオキシダーゼは，分析用，臨床検査用、免疫化学用
、組織化学用、細胞化学用等に広く用いられており、更
に食品分野においても有用な酵素であり、近年その需要
は益々高まってきている。
、組織化学用、細胞化学用等に広く用いられており、更
に食品分野においても有用な酵素であり、近年その需要
は益々高まってきている。
ペルオキシダーゼは、広く植物界に存在しているが，含
量の点から，従来ワサビダイコン（Ａｒｍｏｒａｃｉａ
ｒｕｓｔｉｃａｎａ Ｌ．）が主として工業的生産に
用いられている。このワサビダイコンからの通常栽培法
によるペルオキシダーゼ製造法においては，品種、栽培
条件等の様々な要因によるベルオキシダーゼ含量やアイ
ソザイム組成比の著しい変動のため、安定した品質のペ
ルオキシダーゼ標品を得ることが極めて困難である。更
に栽培適地の制限と収穫期に依存する生産の限定といっ
た不都合がある。
量の点から，従来ワサビダイコン（Ａｒｍｏｒａｃｉａ
ｒｕｓｔｉｃａｎａ Ｌ．）が主として工業的生産に
用いられている。このワサビダイコンからの通常栽培法
によるペルオキシダーゼ製造法においては，品種、栽培
条件等の様々な要因によるベルオキシダーゼ含量やアイ
ソザイム組成比の著しい変動のため、安定した品質のペ
ルオキシダーゼ標品を得ることが極めて困難である。更
に栽培適地の制限と収穫期に依存する生産の限定といっ
た不都合がある。
このような不都合を解決するために、例えば特開昭５９
−２８４７３号で、植物組織培養法を用いてワサビダイ
コン屈（Ａｒｍｏｒａｃｉａ）植物の組織片、又は細胞
の培養物からペルオキシダーゼを製造する方法が提唱さ
れている。当該方法により。
−２８４７３号で、植物組織培養法を用いてワサビダイ
コン屈（Ａｒｍｏｒａｃｉａ）植物の組織片、又は細胞
の培養物からペルオキシダーゼを製造する方法が提唱さ
れている。当該方法により。
母植物根部と比べて１．５〜７倍高いペルオキシダーゼ
含量（湿重量当り）を持つ培養物（カルス及び培地成分
の混合物）を得ており、植物組織培養法の有用性が示さ
れている。
含量（湿重量当り）を持つ培養物（カルス及び培地成分
の混合物）を得ており、植物組織培養法の有用性が示さ
れている。
（発明が解決しようとする課題）
しかしながら上記方法では、より高いペルオキシダーゼ
含量を有する優良カルス株の選抜に幾世代もの継代培養
を必要とし、しかも株１つ１つについて増殖速度とペル
オキシダーゼ含量を測定しながら選抜を行なうため、多
大の労力と時間を要するという欠点がある。更にペルオ
キシダーゼ含量の高いカルスは、母植物で最も高いペル
オキシダーゼを有する根部組織から得られており、カル
スにおけるペルオキシダーゼ産生能は、母組織自体のペ
ルオキシダーゼ産生能に強く依存すると考えられ、より
ペルオキシダーゼ含量の低い他の組織部位からの高ペル
オキシダーゼ産生能の誘導には至っていない。
含量を有する優良カルス株の選抜に幾世代もの継代培養
を必要とし、しかも株１つ１つについて増殖速度とペル
オキシダーゼ含量を測定しながら選抜を行なうため、多
大の労力と時間を要するという欠点がある。更にペルオ
キシダーゼ含量の高いカルスは、母植物で最も高いペル
オキシダーゼを有する根部組織から得られており、カル
スにおけるペルオキシダーゼ産生能は、母組織自体のペ
ルオキシダーゼ産生能に強く依存すると考えられ、より
ペルオキシダーゼ含量の低い他の組織部位からの高ペル
オキシダーゼ産生能の誘導には至っていない。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、上記従来技術の不都合な点を克服するた
めに、ワサビア属植物を材料にして１本来ワサビダイコ
ンＦＡ（Ａｒ厘ｏｒａｃｉａ）植物より著しくペルオキ
シダーゼ含量が低い（１０％未満）にもかかわらず、極
めて高いペルオキシダーゼ産生能を有する細胞株を幾世
代にも及ぶ継代を必要とすることなく短期間で分離し得
る方法を見い出した。しかもこの方法によれば、高ペル
オキシダーゼ産生能を有する細胞株を、母植物の組織部
位のペルオキシダーゼ産生能に左右されることなく誘導
し得ることを見い出した。
めに、ワサビア属植物を材料にして１本来ワサビダイコ
ンＦＡ（Ａｒ厘ｏｒａｃｉａ）植物より著しくペルオキ
シダーゼ含量が低い（１０％未満）にもかかわらず、極
めて高いペルオキシダーゼ産生能を有する細胞株を幾世
代にも及ぶ継代を必要とすることなく短期間で分離し得
る方法を見い出した。しかもこの方法によれば、高ペル
オキシダーゼ産生能を有する細胞株を、母植物の組織部
位のペルオキシダーゼ産生能に左右されることなく誘導
し得ることを見い出した。
本発明で用いるワサビア属植物は、ワサビ（Ｗａｓａｂ
ｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）及びユリワサビ（Ｗａｓａｂ
ｉａｔｅｎｕｉｓ）であり、その組織片、又は細胞は、
培養時に分裂増殖し得る母植物の任意の部位より得られ
るが、一般にワサビア属植物から増殖率が高く、且つ容
易に小さな細胞塊に分離するカルスを組織片から誘導す
ることが困難であることと、高ペルオキシダーゼ産生能
を有する細胞株の選択促進という点を考慮すれば、プロ
トプラストから再生された細胞株を用いるのが望ましい
、特に葉を材料として得たプロトプラストは、容易に分
裂し、細胞塊を形成するのみならず、材料としても豊富
に得られるので好ましいが１本発明の効果がこのことで
左右されることはない。
ｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）及びユリワサビ（Ｗａｓａｂ
ｉａｔｅｎｕｉｓ）であり、その組織片、又は細胞は、
培養時に分裂増殖し得る母植物の任意の部位より得られ
るが、一般にワサビア属植物から増殖率が高く、且つ容
易に小さな細胞塊に分離するカルスを組織片から誘導す
ることが困難であることと、高ペルオキシダーゼ産生能
を有する細胞株の選択促進という点を考慮すれば、プロ
トプラストから再生された細胞株を用いるのが望ましい
、特に葉を材料として得たプロトプラストは、容易に分
裂し、細胞塊を形成するのみならず、材料としても豊富
に得られるので好ましいが１本発明の効果がこのことで
左右されることはない。
本発明で用いる栄養培地としては、植物組織培養法で一
般に使用されている既知の培地で良く、必要に応じて添
加されるオーキシン、サイトカイニンなどのホルモン類
も既知のもので何ら差し支えない、又、栄養培地に添加
する炭素源も、最も一般的に用いられているショ糖で何
ら差し支えない、即ち本発明の効果は、培地の特性に特
に依存する性質のものではないことに留意すべきである
。
般に使用されている既知の培地で良く、必要に応じて添
加されるオーキシン、サイトカイニンなどのホルモン類
も既知のもので何ら差し支えない、又、栄養培地に添加
する炭素源も、最も一般的に用いられているショ糖で何
ら差し支えない、即ち本発明の効果は、培地の特性に特
に依存する性質のものではないことに留意すべきである
。
本発明において特に必須の操作ではないが、ペルオキシ
ダーゼの大量生産を目的とした大ＩＭ養を行なう前に、
予め簡便な方法で高ペルオキシダーゼ産生細胞株を選抜
しておくことにより１本発明の効果は一層高められる０
選抜は１例えば適当な固体培地を含むプレート上に生育
させた細胞コロニーのレプリカを用意した後、元のプレ
ートを直接ペルオキシダーゼの呈色反応液で処理し、よ
り高い呈色反応を示すコロニーに相当するコロニーをレ
プリカプレートから分離することにより行なうことがで
きる。このように分離選抜された細胞株を適切な環境条
件下で静置、又は振盪培養を行なって増殖させ、ペルオ
キシダーゼを産生させる。
ダーゼの大量生産を目的とした大ＩＭ養を行なう前に、
予め簡便な方法で高ペルオキシダーゼ産生細胞株を選抜
しておくことにより１本発明の効果は一層高められる０
選抜は１例えば適当な固体培地を含むプレート上に生育
させた細胞コロニーのレプリカを用意した後、元のプレ
ートを直接ペルオキシダーゼの呈色反応液で処理し、よ
り高い呈色反応を示すコロニーに相当するコロニーをレ
プリカプレートから分離することにより行なうことがで
きる。このように分離選抜された細胞株を適切な環境条
件下で静置、又は振盪培養を行なって増殖させ、ペルオ
キシダーゼを産生させる。
尚、細胞はそのままで、あるいは適当に固定化した状態
でジャーファーメンタ−などの特に大量の増殖に適した
装置を用いて培養することも可能である。
でジャーファーメンタ−などの特に大量の増殖に適した
装置を用いて培養することも可能である。
本発明においてペルオキシダーゼは細胞内に蓄積するの
みならず、・培地中へも放出される。これらのペルオキ
シダーゼは、公知の方法を用いることにより分離精製す
ることが可能であるが、既知のペルオキシダーゼが糖蛋
白質酵素であることを利用してα−Ｄ−マンノピラノー
ス、α−Ｄ −クラコピラノース、及びこれらに立体的
に類似した糖残留基を含む分子と結合する性質を持つコ
ンカナバリンＡと一旦吸着させた後溶出させると、濃縮
度及び精製度を一挙に高めることが出来て便利である０
例えばホモジナイズした細胞の濾液、及び培養後の培地
をそのままコンカナバリンＡ−セファ０−ス力ラムを通
過させて吸着させて後、メチル−α−Ｄ−マンノシドで
溶出させ、硫安塩析を行なえばより少量の容植で純度の
高い粗ペルオキシダーゼ標品を得ることが可能である。
みならず、・培地中へも放出される。これらのペルオキ
シダーゼは、公知の方法を用いることにより分離精製す
ることが可能であるが、既知のペルオキシダーゼが糖蛋
白質酵素であることを利用してα−Ｄ−マンノピラノー
ス、α−Ｄ −クラコピラノース、及びこれらに立体的
に類似した糖残留基を含む分子と結合する性質を持つコ
ンカナバリンＡと一旦吸着させた後溶出させると、濃縮
度及び精製度を一挙に高めることが出来て便利である０
例えばホモジナイズした細胞の濾液、及び培養後の培地
をそのままコンカナバリンＡ−セファ０−ス力ラムを通
過させて吸着させて後、メチル−α−Ｄ−マンノシドで
溶出させ、硫安塩析を行なえばより少量の容植で純度の
高い粗ペルオキシダーゼ標品を得ることが可能である。
ジャーファーメンタ−を用いて細胞増殖を行なう場合に
は、培地を循環させながら、途中にコンカナ八リンＡ−
セファロースのトラップを適当に挿入することにより、
培地中に放出されるペルオキシダーゼを連続的に吸着濃
縮させる事も可能である。
は、培地を循環させながら、途中にコンカナ八リンＡ−
セファロースのトラップを適当に挿入することにより、
培地中に放出されるペルオキシダーゼを連続的に吸着濃
縮させる事も可能である。
（実施例）
次に本発明を実施例により説明する。
笈巌皇−」
約１ｇ（湿風）相当のワサビ（Ｗａｓａｂｉａ ｊａｐ
ｏｎｉ−Ｃａ）の根茎と葉、ワサビ葉肉プロトプラスト
から再生したカルス（組織片、又は細胞の集塊）、及び
ワサビダイコン（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａ
ｎａ）の根に、２０倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を加えて乳鉢で磨砕し、 ２０，０００ｇ、
４℃で１０分間遠心して得た上清液のペルオキシダー
ゼ活性を。
ｏｎｉ−Ｃａ）の根茎と葉、ワサビ葉肉プロトプラスト
から再生したカルス（組織片、又は細胞の集塊）、及び
ワサビダイコン（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａ
ｎａ）の根に、２０倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）を加えて乳鉢で磨砕し、 ２０，０００ｇ、
４℃で１０分間遠心して得た上清液のペルオキシダー
ゼ活性を。
必要に応じて上清液を１０＋ａＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）で希釈してオルトアミノフェノール法により７１
１１１定した。その結果を第１表に示す。
，０）で希釈してオルトアミノフェノール法により７１
１１１定した。その結果を第１表に示す。
第１表
材 料
ペルオキシダーゼ活性
（Ｕ／ｇ湿重湿
風サビ根茎
ワサビ葉
ワサビカルス
ワサビダイコン根
１２．８
０．８
１８９３．４
２５７．２
ワサビにおいては、明らかに根茎の方が葉よりもペルオ
キシダーゼ含量が高いにもかかわらず、葉肉プロトプラ
ストから再生したカルスにおけるペルオキシダーゼ含量
は根茎の約１５０倍にも達し、しかもワサビダイコン根
の約７倍もあることが判明した。
キシダーゼ含量が高いにもかかわらず、葉肉プロトプラ
ストから再生したカルスにおけるペルオキシダーゼ含量
は根茎の約１５０倍にも達し、しかもワサビダイコン根
の約７倍もあることが判明した。
見立班−」
２０ｇ／ｆＬ（１）ショ糖、０．１ｍｇ／ｕ （７）２
．４−ジクロロフェノキシ酢酸、及び２ｇ／ｌのゲラン
ガムを添加したムラシゲ−スクーグの固体培地で１ケ月
毎の継代維持されたワサビ葉肉プロトプラストから再生
したカルス０．５ｇ （湿風）を、ゲランガムを除く以
外は同様組成の液体培地６０１を含む２００１容三角フ
ラスコ内に懸濁後、２５℃の暗条件下で２週間振盪培養
（１２Ｏｒｐｍ） Ｌ、て、培養期間中における細胞量
、細胞の蛋白質量、細胞のペルオキシダーゼ活性、及び
培地のペルオキシダーゼ活性の変化を測定した。細胞内
ペルオキシダーゼの活性は、乳鉢の代わりにテフロンホ
モジナイザーにより磨砕した以外は、実施例１に準じて
、又、培地中のペルオキシダーゼは遠心後の上清液のペ
ルオキシダーゼ活性を実施例１に準じて測定した。
．４−ジクロロフェノキシ酢酸、及び２ｇ／ｌのゲラン
ガムを添加したムラシゲ−スクーグの固体培地で１ケ月
毎の継代維持されたワサビ葉肉プロトプラストから再生
したカルス０．５ｇ （湿風）を、ゲランガムを除く以
外は同様組成の液体培地６０１を含む２００１容三角フ
ラスコ内に懸濁後、２５℃の暗条件下で２週間振盪培養
（１２Ｏｒｐｍ） Ｌ、て、培養期間中における細胞量
、細胞の蛋白質量、細胞のペルオキシダーゼ活性、及び
培地のペルオキシダーゼ活性の変化を測定した。細胞内
ペルオキシダーゼの活性は、乳鉢の代わりにテフロンホ
モジナイザーにより磨砕した以外は、実施例１に準じて
、又、培地中のペルオキシダーゼは遠心後の上清液のペ
ルオキシダーゼ活性を実施例１に準じて測定した。
その結果を第２表に示す。
第２表
細胞
培
地
０ ０．４８ ４．７
７３１ ４８２ ０．４１３
４．９ ７２０ ８３４ ０
．５１ ４．８ ８８２
８７８ ０．５４ ５．７
１１３５ １２１８ ０．５１３
８．９ １４１９ １７４１０
０．８３ ８．５ １
８２３ ２３０１２ ０．９８
１２．１ ２１５８ ２９５１４
１．９７ ２２．３ ４３７１
４５３ワサビ細胞の増殖に伴って細胞の総ペル
オキシダーゼ活性が増加するのみならず、培地中に放出
される総ペルオキシダーゼ活性も増加し、細胞内に存在
するペルオキシダーゼ活性の約１０％程度のペルオキシ
ダーゼ活性が培地中に存在することが判明した。
７３１ ４８２ ０．４１３
４．９ ７２０ ８３４ ０
．５１ ４．８ ８８２
８７８ ０．５４ ５．７
１１３５ １２１８ ０．５１３
８．９ １４１９ １７４１０
０．８３ ８．５ １
８２３ ２３０１２ ０．９８
１２．１ ２１５８ ２９５１４
１．９７ ２２．３ ４３７１
４５３ワサビ細胞の増殖に伴って細胞の総ペル
オキシダーゼ活性が増加するのみならず、培地中に放出
される総ペルオキシダーゼ活性も増加し、細胞内に存在
するペルオキシダーゼ活性の約１０％程度のペルオキシ
ダーゼ活性が培地中に存在することが判明した。
支ムＵ
ワサビ葉肉のプロトプラストから再生したカルスＩｇ（
湯玉）を、２０ｇ１文のショ糖、０．１ｍｇ／文の２．
４−ジクロロフェノキシ酢酸を添加したムラシゲ−スク
ーグの液体培地８０ａ＋ｌを含む３００１容三角フラス
コに懸濁し、１週間振盪培養（１２０ｒｐｍ）後、１１
１！ｌのメツシュを通過した細胞を集め。
湯玉）を、２０ｇ１文のショ糖、０．１ｍｇ／文の２．
４−ジクロロフェノキシ酢酸を添加したムラシゲ−スク
ーグの液体培地８０ａ＋ｌを含む３００１容三角フラス
コに懸濁し、１週間振盪培養（１２０ｒｐｍ）後、１１
１！ｌのメツシュを通過した細胞を集め。
滅菌蒸留水で５回（各３０１）洗浄した。
次いで、３００ＪＬｍ及び１００ ｇｍのメツシュを順
次通過させて細胞を集めたところ、単細胞及び数個の細
胞塊よりなる細胞！！ｊｓＱ液が得られた。
次通過させて細胞を集めたところ、単細胞及び数個の細
胞塊よりなる細胞！！ｊｓＱ液が得られた。
この細胞懸濁液を細胞濃度が５ｍｇ湿重／１になるよう
に調製して、２１を２ｇ／４１のゲランガムを添加した
同様組成のムラシゲ−スクーグ固体培地２０１を含む径
１０ｃｍのプラスチックシャーレ上に出来るだけ細胞が
均一に分布するように蒔き、余分な液体を除いた後、２
５°Ｃの暗所で２ケ月間静置培養した。生じたコロニー
のうち径３■以上のものについて、レプリカプレートに
その半分量を移した後、ｌｓ＋Ｍのオルトアミノフェノ
ールを合むｌＯｄリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０ｍＭ
を静かに加えて１分後に除いた。
に調製して、２１を２ｇ／４１のゲランガムを添加した
同様組成のムラシゲ−スクーグ固体培地２０１を含む径
１０ｃｍのプラスチックシャーレ上に出来るだけ細胞が
均一に分布するように蒔き、余分な液体を除いた後、２
５°Ｃの暗所で２ケ月間静置培養した。生じたコロニー
のうち径３■以上のものについて、レプリカプレートに
その半分量を移した後、ｌｓ＋Ｍのオルトアミノフェノ
ールを合むｌＯｄリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０ｍＭ
を静かに加えて１分後に除いた。
次いで４ｍＭの過酸化水素溶液１０ｍＭを同様に注意深
く加えて、３分間反応させた後、静かに取り除いて蒸留
水で洗浄し、余分な色素を除去した。
く加えて、３分間反応させた後、静かに取り除いて蒸留
水で洗浄し、余分な色素を除去した。
ペルオキシダーゼ活性により各コロニーは淡黄色から濃
褐色までの様々な呈色を示したが、そのうち同程度に黄
色、赤色、褐色を示すコロニーを各５つ任意に選抜し、
対応するコロニーを１ケ月培五したレプリカプレートか
ら取り出してそのペルオキシダーゼ活性を実施例１に準
じて測定した。
褐色までの様々な呈色を示したが、そのうち同程度に黄
色、赤色、褐色を示すコロニーを各５つ任意に選抜し、
対応するコロニーを１ケ月培五したレプリカプレートか
ら取り出してそのペルオキシダーゼ活性を実施例１に準
じて測定した。
但し、細胞の磨砕は、テフロンホモジナイザーを用いて
行なった。その結果を第３表に示す。
行なった。その結果を第３表に示す。
第３表
コロニーの呈色 ペルオキシダーゼ活性（１１／
ｇ湿重） 褐 各細胞コロニーの呈色度合は、明らかにそのペルオキシ
ダーゼ活性を反映しており、コロニーを直接呈色反応さ
せることにより、高ペルオキシダーゼ産生株の選抜が可
能であることが判明した。
ｇ湿重） 褐 各細胞コロニーの呈色度合は、明らかにそのペルオキシ
ダーゼ活性を反映しており、コロニーを直接呈色反応さ
せることにより、高ペルオキシダーゼ産生株の選抜が可
能であることが判明した。
見立１
２０ｇ１文のショ糖、０．１ｔａｇ１文の２．４−ジク
ロロフェノキシ酢酸を添加したムラシゲ−スクーグ液体
培地で２週間振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行なったワサ
ビ葉肉プロトプラストから再生した細胞１ｇ（湯玉）に
対し、２０倍量の１Ｍ塩化ナトリウムを含むｌＯｅＭリ
ンｍ緩衝液（ｐ ＨＧ、Ｑ）、又は１０層Ｍリン酸緩衝
液（ｐ Ｈ８，０）を加えて、テフロンホモジナイザー
で磨砕した後、濾液を４℃、 ２０，０００ｇで１０分
間遠心分離し、上清画分と沈殿画分に分けて各々のペル
オキシダーゼ活性をオルトアミノフェノール法により、
実施例１に準じて測定した。その結果を第４表に示す。
ロロフェノキシ酢酸を添加したムラシゲ−スクーグ液体
培地で２週間振盪培養（１２０ｒｐｍ）を行なったワサ
ビ葉肉プロトプラストから再生した細胞１ｇ（湯玉）に
対し、２０倍量の１Ｍ塩化ナトリウムを含むｌＯｅＭリ
ンｍ緩衝液（ｐ ＨＧ、Ｑ）、又は１０層Ｍリン酸緩衝
液（ｐ Ｈ８，０）を加えて、テフロンホモジナイザー
で磨砕した後、濾液を４℃、 ２０，０００ｇで１０分
間遠心分離し、上清画分と沈殿画分に分けて各々のペル
オキシダーゼ活性をオルトアミノフェノール法により、
実施例１に準じて測定した。その結果を第４表に示す。
第４表
沈 殿 ８９７３
１８６１１Ｍ塩化ナトリウムを添加した場合には、細胞
内ペルオキシダーゼの約８４％が可溶化するが。
１８６１１Ｍ塩化ナトリウムを添加した場合には、細胞
内ペルオキシダーゼの約８４％が可溶化するが。
無添加の場合には細胞内ペルオキシダーゼの約２０％が
可溶化するのみであり、遠心上清液を用いて細胞の総ペ
ルオキシダーゼ活性を判定するには、１Ｍ塩化ナトリウ
ムの添加が必要であることが判明した。
可溶化するのみであり、遠心上清液を用いて細胞の総ペ
ルオキシダーゼ活性を判定するには、１Ｍ塩化ナトリウ
ムの添加が必要であることが判明した。
笈ム１」
ワサビ葉肉プロトプラストから再生したカルスＩｇ（湯
玉）を、２０ｇ１ｌｆ）シ；ｘ糖と、０．１ｒａｇ／ｌ
の２．トシクロロフェノキシ酢酸を添加したムラシゲ−
スクーグの液体培地８０１を含む３００ｍ１容の三角フ
ラスコに懸濁し、２５℃で暗所に２週間振盪培養（１２
０ｒｐｉ＋）した後、ｌ！！過により培地（約７０ｍ１
）を集めてペルオキシダーゼ活性ヲオルトアミノフェノ
ール法により測定したところ１８．７υ／１であった。
玉）を、２０ｇ１ｌｆ）シ；ｘ糖と、０．１ｒａｇ／ｌ
の２．トシクロロフェノキシ酢酸を添加したムラシゲ−
スクーグの液体培地８０１を含む３００ｍ１容の三角フ
ラスコに懸濁し、２５℃で暗所に２週間振盪培養（１２
０ｒｐｉ＋）した後、ｌ！！過により培地（約７０ｍ１
）を集めてペルオキシダーゼ活性ヲオルトアミノフェノ
ール法により測定したところ１８．７υ／１であった。
この培地を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＨトリ
ス塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）で平衡化したコンカナバ
リンＡ−セファロース（ファルマシア社Ｉ ）のカラム
（ｌ ｃｍＸ ８ ｃｍ）に通した後、同じ緩衝液で十
分にカラムを洗浄した０次いで０．２Ｍメチル−α−Ｄ
−マンノシドと、 ０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含む２
０ｍＨトリス塩酸緩衝液で溶出したところ、ペルオキシ
ダーゼは単一ピークとして溶出され、はぼ１００％の活
性（１２７４Ｕ）が回収された。
ス塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，０）で平衡化したコンカナバ
リンＡ−セファロース（ファルマシア社Ｉ ）のカラム
（ｌ ｃｍＸ ８ ｃｍ）に通した後、同じ緩衝液で十
分にカラムを洗浄した０次いで０．２Ｍメチル−α−Ｄ
−マンノシドと、 ０．５ Ｍ塩化ナトリウムを含む２
０ｍＨトリス塩酸緩衝液で溶出したところ、ペルオキシ
ダーゼは単一ピークとして溶出され、はぼ１００％の活
性（１２７４Ｕ）が回収された。
（発明の効果）
以上詳述したように１本発明の方法によれば、植物組織
培養の技術を導入することにより、母細胞の有するペル
オキシダーゼ産生能より飛躍的に高いペルオキシダーゼ
産生能を有する細胞を誘導することが可能となるのみな
らず、更に高い産生能を有する細胞株を簡便な方法で選
抜してペルオキシダーゼ生産に供することが可能となる
。又、本発明は、産生されるペルオキシダーゼをより効
率的に精製する手段をも与える。従って本発明によれば
、ペルオキシダーゼの生産効率を飛躍的に増大せしめる
と共に、安定した供給を確保し１価格の低廉化に著しい
貢献をもたらす。
培養の技術を導入することにより、母細胞の有するペル
オキシダーゼ産生能より飛躍的に高いペルオキシダーゼ
産生能を有する細胞を誘導することが可能となるのみな
らず、更に高い産生能を有する細胞株を簡便な方法で選
抜してペルオキシダーゼ生産に供することが可能となる
。又、本発明は、産生されるペルオキシダーゼをより効
率的に精製する手段をも与える。従って本発明によれば
、ペルオキシダーゼの生産効率を飛躍的に増大せしめる
と共に、安定した供給を確保し１価格の低廉化に著しい
貢献をもたらす。
Claims (4)
- （１）ワサビア属植物から分離した組織片、又は細胞片
を人工栄養培地で培養し、ペルオキシダーゼを産生させ
ることを特徴とするワサビ培養細胞によるペルオキシダ
ーゼ製造法。 - （２）前記ワサビア属植物の組織片、又は細胞が、プロ
トプラストから再生した組織片、又は細胞であることを
特徴とする前記請求項（１）記載のワサビ培養細胞によ
るペルオキシダーゼ製造法。 - （３）前記ペルオキシダーゼを、予め選抜した高ペルオ
キシダーゼ細胞株を培養することにより産生させること
を特徴とする前記請求項（１）記載のワサビ培養細胞に
よるペルオキシダーゼ製造法。 - （４）前記ペルオキシダーゼを、コンカナバリンＡで吸
着させた後溶出させることを特徴とする培養物からのペ
ルオキシダーゼ精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1096773A JPH02276574A (ja) | 1989-04-17 | 1989-04-17 | ワサビ培養細胞によるペルオキシダーゼ製造法及び培養物からのペルオキシダーゼ精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1096773A JPH02276574A (ja) | 1989-04-17 | 1989-04-17 | ワサビ培養細胞によるペルオキシダーゼ製造法及び培養物からのペルオキシダーゼ精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02276574A true JPH02276574A (ja) | 1990-11-13 |
Family
ID=14173954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1096773A Pending JPH02276574A (ja) | 1989-04-17 | 1989-04-17 | ワサビ培養細胞によるペルオキシダーゼ製造法及び培養物からのペルオキシダーゼ精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02276574A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5928473A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-02-15 | Toyobo Co Ltd | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPH0352874A (ja) * | 1989-07-14 | 1991-03-07 | Ciba Geigy Ag | 置換ベンゾニトリル |
-
1989
- 1989-04-17 JP JP1096773A patent/JPH02276574A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5928473A (ja) * | 1982-08-09 | 1984-02-15 | Toyobo Co Ltd | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPH0352874A (ja) * | 1989-07-14 | 1991-03-07 | Ciba Geigy Ag | 置換ベンゾニトリル |
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