JPH0143559B2 - - Google Patents
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- JPH0143559B2 JPH0143559B2 JP56153472A JP15347281A JPH0143559B2 JP H0143559 B2 JPH0143559 B2 JP H0143559B2 JP 56153472 A JP56153472 A JP 56153472A JP 15347281 A JP15347281 A JP 15347281A JP H0143559 B2 JPH0143559 B2 JP H0143559B2
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- Japan
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- arg
- pro
- cha
- thrombin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/974—Thrombin
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、トロンビン及びトロンビン様酵素に
対する新規発色性且つ蛍光性基質に関する。本発
明の基質は従来報告されている基質に比して、き
わめて選択性よく、トロンビンの定量を行う事が
出来、トロンビンが形成、阻害又は消費される反
応の研究、又はそれ等に関与する因子の測定、例
えばプロトロンビン、抗トロンビン、及びヘパ
リンの測定に特に適している。 凝固・線溶反応に於ける合成基質の導入は、
1954年S.Sherry等〔J.B.C.、208 95〜105
（1954）〕の合成したTAMe（Tos−Age−OMe）
等のアルギニンエステルが、基質としてトロンビ
ンのエステラーゼ活性の測定に使用されたのに始
まるが、エステル氷解活性が凝固活性と一致せ
ず、基質の特異性や感度が低い等の問題があつ
た。しかし、最近のペプチド化学の進歩からフイ
ブリノゲンのトロンビンによる解裂部のアミノ酸
構造に類似したペプチド基質Bz−Phe−Val−
Arg−PNA（Ｓ−2160）がBlo¨mback〔Thromb.
Research１ 267〜278（1972）〕らにより合成さ
れ、酵素反応を受けて遊離したパラニトロアニリ
ン（PNA）の黄色の発色による酵素化学的分光
分析の容易な事、試薬調整の容易さなどからしだ
いに、研究検査に用いられるに至つた。更にトロ
ンビン用として引継ぎTos−Gly−Pro−Arg−
PNA（商品名CHR−TH Pentapharm社）〔特開
昭52−3494〕、或はＨ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−
PNA（Ｓ−2238、Kabi社）〔特開昭52−24590〕
が開発され、続いて、同様に遊離すると蛍光を発
するアミノメチルクマリン（AMS）を結合させ
た蛍光性ペプチド基質も岩永等（1977）〔J.
Biochem.、82、1495〜1498（1977）〕により開発
されている。 一方、酵素測定用合成基質は、酵素に対する高
感度、及び特異性、水又は生物学的試験液に対す
る良好な溶解性及び、分解物の易検出性の４点を
満足する事が重要である。 このうちでも測定しようとする酵素に対する高
い特異性は、特に重要である。 一般に血漿中のプロトロンビン或は、アンチト
ロンビン等を、発色性基質を利用して測定しよ
うとする場合、血漿中に存在すると予測されるト
ロンビン以外の凝固・線溶関連酵素である、プラ
スミン、FXa、ウロキナーゼ等と交差反応を起
すと、正確な測定が期しがたい。 又、例えばプロトロンビン（Ｆ−）を測定す
る場合、通常最も適した方法として、トロンビン
をフオスホリピド、Ca、及びフアクターＶ、
の存在下、FXa或はトロンボプラスチンにより、
トロンビンに変換し、トロンビン用基質に作用さ
せて、その活性を測定するが、この場合、反応系
に存在しているFXaと基質が反応しない事が必
要である。 従来開発されて来た最良のトロンビン用基質と
しては、上記のCHR−TH及びＳ−2238があげ
られるが、基質特異性の点に於いて必ずしも満足
出来るものではない。 即ち、例えばCHR−THは、凝固・線溶系関
連酵素のうちトロンビン以外にプラスミン、
Factor Xa、ウロキナーゼ（UK）等と可成り反
応するし、又比較的選択性の良好と言われている
Ｓ−2238に於いても、プラスミン或いはUKとか
なり反応する事が解つている。 更に、上記の両基質の如く、生成するｐ−ニト
ロアニリンの黄色を比色する方法は、血漿成分の
影響を免かれる事は出来ない。 本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な
トロンビン用基質の開発研究を行つた結果、上記
の欠点を著しく改良し前述の４条件を満足させ
る、すぐれた性質を有する基質を見出した。 即ち、従来開発されている、基質に用いられて
いる発色基ｐ−ニトロアニリド（略号pNA）の
代りに、３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリ
ド（略号CHA）を用いる事により、目的とする、
トロンビン以外の酵素、例えば、プラスミン、
FXa等の酵素に対する反応性を抑制し、従来基
質と比して、著しく、選択性の改良されたトロン
ビン用基質の開発に成功した。 本発明による新規な発色性且つ蛍光性基質は、
次の一般式 〔式中Ｒは、
対する新規発色性且つ蛍光性基質に関する。本発
明の基質は従来報告されている基質に比して、き
わめて選択性よく、トロンビンの定量を行う事が
出来、トロンビンが形成、阻害又は消費される反
応の研究、又はそれ等に関与する因子の測定、例
えばプロトロンビン、抗トロンビン、及びヘパ
リンの測定に特に適している。 凝固・線溶反応に於ける合成基質の導入は、
1954年S.Sherry等〔J.B.C.、208 95〜105
（1954）〕の合成したTAMe（Tos−Age−OMe）
等のアルギニンエステルが、基質としてトロンビ
ンのエステラーゼ活性の測定に使用されたのに始
まるが、エステル氷解活性が凝固活性と一致せ
ず、基質の特異性や感度が低い等の問題があつ
た。しかし、最近のペプチド化学の進歩からフイ
ブリノゲンのトロンビンによる解裂部のアミノ酸
構造に類似したペプチド基質Bz−Phe−Val−
Arg−PNA（Ｓ−2160）がBlo¨mback〔Thromb.
Research１ 267〜278（1972）〕らにより合成さ
れ、酵素反応を受けて遊離したパラニトロアニリ
ン（PNA）の黄色の発色による酵素化学的分光
分析の容易な事、試薬調整の容易さなどからしだ
いに、研究検査に用いられるに至つた。更にトロ
ンビン用として引継ぎTos−Gly−Pro−Arg−
PNA（商品名CHR−TH Pentapharm社）〔特開
昭52−3494〕、或はＨ−Ｄ−Phe−Pip−Arg−
PNA（Ｓ−2238、Kabi社）〔特開昭52−24590〕
が開発され、続いて、同様に遊離すると蛍光を発
するアミノメチルクマリン（AMS）を結合させ
た蛍光性ペプチド基質も岩永等（1977）〔J.
Biochem.、82、1495〜1498（1977）〕により開発
されている。 一方、酵素測定用合成基質は、酵素に対する高
感度、及び特異性、水又は生物学的試験液に対す
る良好な溶解性及び、分解物の易検出性の４点を
満足する事が重要である。 このうちでも測定しようとする酵素に対する高
い特異性は、特に重要である。 一般に血漿中のプロトロンビン或は、アンチト
ロンビン等を、発色性基質を利用して測定しよ
うとする場合、血漿中に存在すると予測されるト
ロンビン以外の凝固・線溶関連酵素である、プラ
スミン、FXa、ウロキナーゼ等と交差反応を起
すと、正確な測定が期しがたい。 又、例えばプロトロンビン（Ｆ−）を測定す
る場合、通常最も適した方法として、トロンビン
をフオスホリピド、Ca、及びフアクターＶ、
の存在下、FXa或はトロンボプラスチンにより、
トロンビンに変換し、トロンビン用基質に作用さ
せて、その活性を測定するが、この場合、反応系
に存在しているFXaと基質が反応しない事が必
要である。 従来開発されて来た最良のトロンビン用基質と
しては、上記のCHR−TH及びＳ−2238があげ
られるが、基質特異性の点に於いて必ずしも満足
出来るものではない。 即ち、例えばCHR−THは、凝固・線溶系関
連酵素のうちトロンビン以外にプラスミン、
Factor Xa、ウロキナーゼ（UK）等と可成り反
応するし、又比較的選択性の良好と言われている
Ｓ−2238に於いても、プラスミン或いはUKとか
なり反応する事が解つている。 更に、上記の両基質の如く、生成するｐ−ニト
ロアニリンの黄色を比色する方法は、血漿成分の
影響を免かれる事は出来ない。 本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な
トロンビン用基質の開発研究を行つた結果、上記
の欠点を著しく改良し前述の４条件を満足させ
る、すぐれた性質を有する基質を見出した。 即ち、従来開発されている、基質に用いられて
いる発色基ｐ−ニトロアニリド（略号pNA）の
代りに、３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリ
ド（略号CHA）を用いる事により、目的とする、
トロンビン以外の酵素、例えば、プラスミン、
FXa等の酵素に対する反応性を抑制し、従来基
質と比して、著しく、選択性の改良されたトロン
ビン用基質の開発に成功した。 本発明による新規な発色性且つ蛍光性基質は、
次の一般式 〔式中Ｒは、
【式】（ｎ＝０また
は１）、
【式】（R1＝Ｈまたは
【式】）、
【式】（R2＝ＨまたはCH3
基）、あるいは−（CH2）o−NH R3（ｎ＝３または
４、
４、
【式】または
【式】基）を表す。〕で表わされ、特
に発色基として、３−カルボキシ−４−ヒドロキ
シ−アニリドを用いる事を特徴とする。本基質は
発色基にヒドロキシル基、カルボキシル基と言う
きわめて親水性の基を持つために卓越した水に対
する溶解特性を持つている。代表的な用途として
は本発明の〔〕基質を、トロンビン測定用基質
として用い生成する３−カルボキシ−４−ヒドロ
キシ−アニリンを酸化縮合して、着色化合物に導
き比色定量するか、又は励起328nｍ、蛍光540n
ｍにて蛍光分析法により定量する事によりトロン
ビンの活性を特異的に測定する場合である。 本基質の特徴は、前述した如くそのトロンビン
に対する優れた基質特異性にある。例えば新規基
質Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHAをＳ−2238、
CHR−TH及び参考の為に合成した上記新規基
質と同じアミノ酸配列でPNAを発色基としたＨ
−Ｄ−Phe−Pro−Arg−PNAと各凝固、線溶に
関与する酵素である、トロンビン（TH）、プラ
スミン（PL）、カリクレイン（KL）、フアクター
Xa（FXa）、ウロキナーゼ（UK）等に於ける相
対反応性をＨ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−PNAを
100として示すと表１の如くなり、プラスミン．
FXa.UK等に対する反応性がCHA系の新規基質
の場合には、著しく低く、例えばプラスミンは１
％FXa9％、UK2％しか反応せず又、CHR−TH
及びＳ−2238のプラスミン各225％、64％
FXa1165％、42％、UK300％、74％と比較して
著しく選択性が改良されている事が解る。 これ等の事は本発明化合物がトロンビン用基質
としてきわめて優れている事を示している。
シ−アニリドを用いる事を特徴とする。本基質は
発色基にヒドロキシル基、カルボキシル基と言う
きわめて親水性の基を持つために卓越した水に対
する溶解特性を持つている。代表的な用途として
は本発明の〔〕基質を、トロンビン測定用基質
として用い生成する３−カルボキシ−４−ヒドロ
キシ−アニリンを酸化縮合して、着色化合物に導
き比色定量するか、又は励起328nｍ、蛍光540n
ｍにて蛍光分析法により定量する事によりトロン
ビンの活性を特異的に測定する場合である。 本基質の特徴は、前述した如くそのトロンビン
に対する優れた基質特異性にある。例えば新規基
質Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHAをＳ−2238、
CHR−TH及び参考の為に合成した上記新規基
質と同じアミノ酸配列でPNAを発色基としたＨ
−Ｄ−Phe−Pro−Arg−PNAと各凝固、線溶に
関与する酵素である、トロンビン（TH）、プラ
スミン（PL）、カリクレイン（KL）、フアクター
Xa（FXa）、ウロキナーゼ（UK）等に於ける相
対反応性をＨ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−PNAを
100として示すと表１の如くなり、プラスミン．
FXa.UK等に対する反応性がCHA系の新規基質
の場合には、著しく低く、例えばプラスミンは１
％FXa9％、UK2％しか反応せず又、CHR−TH
及びＳ−2238のプラスミン各225％、64％
FXa1165％、42％、UK300％、74％と比較して
著しく選択性が改良されている事が解る。 これ等の事は本発明化合物がトロンビン用基質
としてきわめて優れている事を示している。
【表】
本発明の化合物の用途は既に述べた通りトロン
ビン活性測定用の基質であるが、その場合当該基
質をPH8.0〜8.7間の緩衝液中でトロンビンに作用
させ生成する、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ
アニリンを適当なカプラーと酸化縮合させて着色
物質に導きこれを比色定量することによるが、又
励起328nｍ蛍光540nｍにて蛍光分析法により定
量することによりトロンビン活性を測定する。 カプラーとしては酸性側での発色の場合は、ア
ニリン系化合物例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニリ
ン、又アルカリ性側では、フエノール、ナフトー
ル系化合物例えば、２，５−キシレノール、２，
６−キシレノール、２，３−キシレノール、チモ
ール、Ｏ−クレゾール、Ｏ−エチルフエノール等
が用いられる。 又、酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、過
硫酸塩等種々のものが用いられるが、メタ過ヨウ
素酸が好適である。 ３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンと上
記カプラーとの酸化縮合により生成する色素はカ
プラーにより極大吸収波長が560〜770nｍに巾広
く分布するが、呈色の温度による変動は極めて少
く安定で、トロンビン活性測定に適している。更
に発色感度を比べてみても、ｐ−ニトロアニリン
の場合一般測定使用波長405nｍにてε＝10600で
あるのに対し、Ｏ−エチルフエノールと３−カル
ボキシ−４−ヒドロキシアニリンによる発色に於
ては、λ＝645nｍで29000又、２，６−キシレノ
ールの場合はλ＝615nｍで21600で極めて吸光度
が大きく、この点に於いても測定上極めて有利で
ある。 本発明の基質は、親水性の官能基を有するので
水に対する溶解性は非常に良好であり、界面活性
剤、有機溶媒等の溶解補助剤を特に必要としない
ため、試薬調整あるいは測定操作において非常に
管理し易く、且つ反応に必要十分な基質濃度を使
用出来ると言う長所を有している。 又、本発明の特徴の一つとして、生体試料中の
夾雑物による測定上の影響をほとんど受けないこ
とがあるが、これは、ｐ−ニトロアニリド系化合
物に於ては、560nｍ以下の波長で測定するのに
対し、本発明では560nｍ以上の波長で測定する
為、試料中の夾雑物の影響を受けず、又過剰の酸
化剤により、試料中の還元性物質（尿酸、アスコ
ルビン酸）も分解されるので、基質本来の高特異
性と併せて、正確な測定結果が得られる。 以上の通り本発明の化合物は、トロンビン活性
用物質として従来のものに比べて、非常に優れて
いることが明らかである。 〔〕で表わされる本発明の化合物は、ペプチ
ド化学においてよく知られる方法により合成され
る。 α−アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ
又は、ｔ−ブチルオキシカルボニル又はそれに関
連する基、例えばｐ−メトキシ−ｐ−ニトロ、又
は、ｐ−メトキシフエニルアゾールカルボベンゾ
キシ等を用いるのが有利である。 アルギニル基のδ−グアニジル基の保護には、
プロトン化、カルボベンゾキシ基（δ，δ−di保
護）を用いるのが有利である。２個のアミノ酸カ
ツプリング又はジペプチドとアミノ酸のカツプリ
ングは、α−カルボキシル基の活性化により行わ
れる。例えば、活性化された形がＮ−ヒドロキシ
サクシニツクイミド、ｐ−ニトロフエノール、ト
リクロロフエノール、４，６−ジメチルピリミジ
ル−２−チオ等である事が出来る。前述のエステ
ル誘導体への活性化はカルボジイミド、例えば、
Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）の存在下で行うのが有利である。 基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合
させ、遂次的にカツプリングしていく方法による
ことが出来るが、或いはＮ−末端ジペプチドフラ
グメント自体を合成し、それに次いで、発色基を
有するアルギニル基に結合する事も可能である。 本発明を以下実施例により詳細に説明するが本
発明は、これら実施例に限定されるものではな
い。 略号 Arg＝アルギニン DMF＝ジメチルホルムア
ミド Leu＝ロイシン MeOH＝メタノール Lys＝リジン THF＝テトラハイドロフラン Phe＝フエニルアラニン NEM＝Ｎ−エチル
モルホリン Pro＝プロリン ESA＝エタンスルホン酸 Thr＝スレオニン TEA＝トリエチルアミン Tyr＝チロシン TFA＝トリフルオロ酢酸 Val＝バリン DCC＝ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル −CHA＝３
−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド BoC＝ｔ−ブチルオキシカルボニル −SDP
＝４，６−ジメチルピリミジン−２−チオ Ｚ（OMe）＝ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル Bzl＝ベンジル Tos＝ｐ−トリルスルホニル TLC＝薄層クロ
マトグラフイー AcOH＝酢酸 GPC＝ゲル過クロマトグラ
フイー AcOEt＝酢酸エチル （注；アミノ酸は、特
にことわらなければＬ−型を示す。） Bz＝ベンゾイル 薄層クロマトグラフイー TLC分析はシリカゲルF254（メルク社製）プ
レートを使用、展開溶媒は、 Rf1；CHCl3：MeoH：AcOH：H2O ＝80：20：2.5：５ Rf2；ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：１ Rf3；ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２ Rf4；ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：５ ゲル過には、Pharmacia Fine Chemicals
社（スエーデン）のヒドロキシプロピル化交叉
結合デキストランゲル（Sephadex Ｌ−Ｈ−20
（商品名）を使用した。 実施例 １ Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHA（NT−Ｃ）の
合成 Ｚ（OMe）−Arg（Z2）−CHA 60.6gr（0.1mole）のＺ（OMe）−Arg（Z2）−
OHと15.4gr（0.1mole）のHSDP
ビン活性測定用の基質であるが、その場合当該基
質をPH8.0〜8.7間の緩衝液中でトロンビンに作用
させ生成する、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ
アニリンを適当なカプラーと酸化縮合させて着色
物質に導きこれを比色定量することによるが、又
励起328nｍ蛍光540nｍにて蛍光分析法により定
量することによりトロンビン活性を測定する。 カプラーとしては酸性側での発色の場合は、ア
ニリン系化合物例えばＮ，Ｎ−ジエチルアニリ
ン、又アルカリ性側では、フエノール、ナフトー
ル系化合物例えば、２，５−キシレノール、２，
６−キシレノール、２，３−キシレノール、チモ
ール、Ｏ−クレゾール、Ｏ−エチルフエノール等
が用いられる。 又、酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、過
硫酸塩等種々のものが用いられるが、メタ過ヨウ
素酸が好適である。 ３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンと上
記カプラーとの酸化縮合により生成する色素はカ
プラーにより極大吸収波長が560〜770nｍに巾広
く分布するが、呈色の温度による変動は極めて少
く安定で、トロンビン活性測定に適している。更
に発色感度を比べてみても、ｐ−ニトロアニリン
の場合一般測定使用波長405nｍにてε＝10600で
あるのに対し、Ｏ−エチルフエノールと３−カル
ボキシ−４−ヒドロキシアニリンによる発色に於
ては、λ＝645nｍで29000又、２，６−キシレノ
ールの場合はλ＝615nｍで21600で極めて吸光度
が大きく、この点に於いても測定上極めて有利で
ある。 本発明の基質は、親水性の官能基を有するので
水に対する溶解性は非常に良好であり、界面活性
剤、有機溶媒等の溶解補助剤を特に必要としない
ため、試薬調整あるいは測定操作において非常に
管理し易く、且つ反応に必要十分な基質濃度を使
用出来ると言う長所を有している。 又、本発明の特徴の一つとして、生体試料中の
夾雑物による測定上の影響をほとんど受けないこ
とがあるが、これは、ｐ−ニトロアニリド系化合
物に於ては、560nｍ以下の波長で測定するのに
対し、本発明では560nｍ以上の波長で測定する
為、試料中の夾雑物の影響を受けず、又過剰の酸
化剤により、試料中の還元性物質（尿酸、アスコ
ルビン酸）も分解されるので、基質本来の高特異
性と併せて、正確な測定結果が得られる。 以上の通り本発明の化合物は、トロンビン活性
用物質として従来のものに比べて、非常に優れて
いることが明らかである。 〔〕で表わされる本発明の化合物は、ペプチ
ド化学においてよく知られる方法により合成され
る。 α−アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ
又は、ｔ−ブチルオキシカルボニル又はそれに関
連する基、例えばｐ−メトキシ−ｐ−ニトロ、又
は、ｐ−メトキシフエニルアゾールカルボベンゾ
キシ等を用いるのが有利である。 アルギニル基のδ−グアニジル基の保護には、
プロトン化、カルボベンゾキシ基（δ，δ−di保
護）を用いるのが有利である。２個のアミノ酸カ
ツプリング又はジペプチドとアミノ酸のカツプリ
ングは、α−カルボキシル基の活性化により行わ
れる。例えば、活性化された形がＮ−ヒドロキシ
サクシニツクイミド、ｐ−ニトロフエノール、ト
リクロロフエノール、４，６−ジメチルピリミジ
ル−２−チオ等である事が出来る。前述のエステ
ル誘導体への活性化はカルボジイミド、例えば、
Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）の存在下で行うのが有利である。 基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合
させ、遂次的にカツプリングしていく方法による
ことが出来るが、或いはＮ−末端ジペプチドフラ
グメント自体を合成し、それに次いで、発色基を
有するアルギニル基に結合する事も可能である。 本発明を以下実施例により詳細に説明するが本
発明は、これら実施例に限定されるものではな
い。 略号 Arg＝アルギニン DMF＝ジメチルホルムア
ミド Leu＝ロイシン MeOH＝メタノール Lys＝リジン THF＝テトラハイドロフラン Phe＝フエニルアラニン NEM＝Ｎ−エチル
モルホリン Pro＝プロリン ESA＝エタンスルホン酸 Thr＝スレオニン TEA＝トリエチルアミン Tyr＝チロシン TFA＝トリフルオロ酢酸 Val＝バリン DCC＝ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル −CHA＝３
−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド BoC＝ｔ−ブチルオキシカルボニル −SDP
＝４，６−ジメチルピリミジン−２−チオ Ｚ（OMe）＝ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル Bzl＝ベンジル Tos＝ｐ−トリルスルホニル TLC＝薄層クロ
マトグラフイー AcOH＝酢酸 GPC＝ゲル過クロマトグラ
フイー AcOEt＝酢酸エチル （注；アミノ酸は、特
にことわらなければＬ−型を示す。） Bz＝ベンゾイル 薄層クロマトグラフイー TLC分析はシリカゲルF254（メルク社製）プ
レートを使用、展開溶媒は、 Rf1；CHCl3：MeoH：AcOH：H2O ＝80：20：2.5：５ Rf2；ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：１ Rf3；ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２ Rf4；ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：５ ゲル過には、Pharmacia Fine Chemicals
社（スエーデン）のヒドロキシプロピル化交叉
結合デキストランゲル（Sephadex Ｌ−Ｈ−20
（商品名）を使用した。 実施例 １ Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHA（NT−Ｃ）の
合成 Ｚ（OMe）−Arg（Z2）−CHA 60.6gr（0.1mole）のＺ（OMe）−Arg（Z2）−
OHと15.4gr（0.1mole）のHSDP
【式】をTHF500mlに溶解し、
これに０〜５℃にてDCC20.6gr（0.1mole）
THF250ml溶液を滴下反応する。18時間室温に
て反応後（20〜25℃）、析出したジシクロヘキ
シル尿素（DCHU）を別、THFを減圧留去
し、合成されたオイル状粗製活性エステル
PMZ−Arg（Z2）−SDP54gr（74％）を得る。こ
れをそのまま次の反応に使用する。 上記にて合成した活性エステルPMZ−Arg
（Z2）−SDP54gr（0.4mole）をTHF150mlに溶解
し、これを５−アミノサルチル酸11.4gr
（0.74mole）とTEA20.8ml（0.148mole）を
DMF80mlに溶解した液に０〜５℃にて滴下反
応を行い、更に室温にて18時間反応後、溶媒を
留去し、残分をAcOEt800mlに溶解、５％冷
HCl aq400mlにて２回洗浄、析出した結晶を
取乾燥するとＺ（OMe）−Arg（Z2）−
CHA36.8gr（67.6％）を得る。 Rf1＝0.52m.p.182〜185℃ 〔α〕D＋11.0（Cl.DMF） BOC−Pro−Arg（Z2）−CHA Ｚ（OMe）−Arg（Z2）−CHA37.1gr
（0.05mole）にアニソール15mlとTFA250mlを
加え、室温にて２時間反応を行う。反応終了後
TFAを減圧留去し、次いで乾燥エーテルにて
処理すると結晶化する。26.3gr（76％）の
TFA・Ｈ−Arg（Z2）−CHAを得る。 〔α〕D＋22.4（Cl.DMF） 17.5gr（0.0255mole）のTFA・Ｈ−Arg（Z2）
−CHAを0.75N NEM／DMF102mlに溶解し、
０〜５℃にてBOC−Pro−SDP8.6gr
（0.0255mole）のDMF15ml溶液を滴下反応す
る。18時間室温にて反応液（20〜25℃）、DMF
を減圧留去し、残分をAcOEt750mlに溶解、冷
５％HCl250mlにて４回、Sat NaCl aq250mlに
て２回洗浄する。MgSO4上で乾燥後溶媒を減
圧留去するとフオーム状の粗製BOC−Pro−
Arg（Z2）−CHAが得られ、これをIPA／IPEよ
り再結晶して7.4gr（37.3％）のを得る。 Rf1＝0.53m.p.110〜135℃ 〔α〕D−18.0（Cl.DMF） Ｚ−Ｄ−Phe−Pro−Arg（Z2）−CHA 12.7gr（0.016mole）のBOC−Pro−Arg（Z2）
−CHAを2N−HCl／AcOH41mlにて２時間室
温処理し、BOC基を脱離し、反応液をエーテ
ル中に再沈する。析出物を取、乾燥すると
HCl・Ｈ−Pro−Arg（Z2）−CHA12.4gr（98.4
％）を得る。 Rf1＝0.60m.p.184〜187℃ 〔α〕D−25.8（Cl.MeOH） HCl・Ｈ−Pro−Arg（Z2）−CHA7.43gr（10.5
ｍmole）とTEA4.5ml（3.15ｍmole）を
DMF66mlに溶解し、これに−５〜０℃に冷却
下、Ｚ−Ｄ−Phe−SDP4.5gr（10.5ｍmole）を
33mlDMFに溶解した液を滴下反応を行う。２
時間後室温にもどし、次いで常温にて15時間反
応後、DMFを留去、残つた油状分をMeOH60
mlに溶解し、３％クエン酸水溶液3000mlに再沈
し、析出した結晶を取・乾燥すると、結晶
7.8grを得る。これを、セフアデツクスLH−
20、展開溶媒MeOHにてゲル過し、結晶
3.8grを得る。 Rf1＝0.55m.p.224〜228℃ 〔α〕D−40.2（Cl.MeOH） 元素分析 C51H53N7O12・1.5H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 62.46 5.70 10.17 計算値 62.31 5.74 9.97 2HCl・Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHA Ｚ−Ｄ−Phe−Pro−Arg（Z2）−CHA2.9gr
（3.03ｍmole）をMeOH130mlに溶解し、
AcOH5〜６滴を加えパラジウム黒1grを触媒と
して、接触還元を行う。反応終了後、MeOH
を濃縮、残分を2N−HCl／AcOH5mlに溶解
し、エーテル200ml中に加え、再沈させ、析出
した結晶を取、KOH上乾燥を行うと2HCl・
Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHA1.30gr（68％）
を得る。 mp.213℃（分解）〔α〕D−109.2（C0.5MeOH） 元素分析 C27H35N7O6・AcOH・3/2H2O・
2HCl Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 48.61 6.04 14.05 計算値 48.81 6.21 13.78 実施例 ２ 2HCl・Ｈ−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−Arg−
CHA（TN−Ｅ） BOC−Pro−Arg−CHA
C23H34O7N6506.563 6.4gr（8.3ｍmole）の
BOC−Pro−Arg（Z2）−CHAをMeOH120mlに
溶解して、パラジウム黒の存在下、６時間水素
還元をする。反応後触媒を別してMeOHを
減圧留去し、エーテルにて結晶化させ、取、
乾燥するとBOC−Pro−Arg−CHA3.6gr（85.7
％）を得る。 Rf2＝0.48mp.199〜203℃ 〔α〕D−76.0（Cl.MeOH） 2HCl・Ｈ−Pro−Arg−CHA C18H26O5N6・
2HCl479.367 3.0gr（5.9ｍmole）のBOC−Pro−Arg−
CHA29.5ml（59ｍmole）の2N−HCl／AcOH
にて２時間室温処理して、エーテル中に落す。 析出物を取・乾燥すると2HCl・Ｈ−Pro
−Arg−CHA2.8gr（100％）を得る。 Rf40.11mp.〜203℃（分解） 〔α〕D−42.4（Cl、MeOH） BOC−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−Arg−CHA C34H46N7O9696.788 0.959gr（2.0ｍmole）の2HCl・Ｈ−Pro−
Arg−CHAを0.75N−NEM／DMF8mlに溶解
して、０〜５℃にて0.863gr（2.0ｍmole）の
BOC−Ｄ−Thr（OBzl）−SOPを加えて、18時
間室温にて反応後、反応液を冷10％クエン酸／
Sat NaCl aq＝１／１溶液2000mlに落す。析
出物を取・乾燥するとBOC−Ｄ−Thr
（OBzl）−Pro−Arg−CHA1.07gr（72.7％）を
得る。 Rf2＝0.61mp.180〜195℃ 2HCl・Ｈ−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−Arg−
CHA C29H41N7O7Cl2670.599 0.9gr（1.2ｍmole）のBOC−Ｄ−Thr（OBzl）
−Pro−Arg−CHAを10ml（20ｍmole）の2N
HCl／AcOHにて２時間室温処理して、反応液
をエーテル中に落す。析出物を取・乾燥して
粗製の2HCl・Ｈ−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−
Arg−CHAが得られ、これをセフアデツクス
LH−20（４×112cm）カラムで展開溶媒MeOH
にてゲル過を行い、0.32gr（40.2％）を得る。 Rf2＝0.33mp.183〜190℃ 実施例 ３ 2HBr・Ｈ−Ｄ−Lys（BZ）−Pro−Arg−CHA
（NT−Ｈ）の合成 Ｚ−Ｄ−Lys（BZ）−Pro−Arg−CHA・HCl C39H48N8O9・HCl809.328 0.959gr（2.0ｍmole）の2HCl・Ｈ・Pro−
Arg−CHAを0.75M・NEM／DMF8mlに溶解
して、０〜５℃にて0.9630gr（2.0ｍmole）のＺ
−Ｄ−Lys（BZ）−OSuを加え、18時間室温にて
反応後、反応液を冷10％クエン酸／Sat・NaCl
aq−１／１溶液2000mlに、再沈殿させる。析
出物を濾取し、乾燥してＺ−Ｄ−Lys（BZ）−
Pro−Arg−CHA1.13gr（70.0％）を得る。 Rf2＝0.59m.p.149〜152℃ 2HBr.H−Ｄ−Lys（BZ）−Pro−Arg−CHA C31H42N8O7・2HBr688.318 1.0gr（1.2ｍmole）のＺ−Ｄ−Lys（BZ）−
Pro−Arg−CHA・HClを10mlの25％HBr／
AcOHにて１時間室温で処理し、次いで反応液
をエーテル中に再沈殿させる。析出物を濾取
し、乾燥して粗製の2HBr・Ｈ−Ｄ−Lys（BZ）
−Pro−Arg−CHAを得、これをセフアデツク
スLH−20（４×112cm）カラムで展開溶媒
MeOHにてゲル濾過を行い、生成物0.44gr
（53.4％）を得る。 Rf2＝0.32m.p.182〜188℃ 実施例 ４ 2MSA・Ｈ−Ｄ−Orn（Tos）−Pro−Arg−
CHA（NT−Ｉ）の合成（Orn＝オルニチン） Ｚ−Ｄ−Orn（Tos）−Pro−Arg（Z2）−CHA C54H60N8O14S1 1077.19 1.415gr（2.0ｍmol）のHCl・Ｈ−Pro−Arg
（Z2）−CHAを0.75N−NEM／DMF8mlに溶解
し、1.085gr（2.0ｍmol）のＺ−Ｄ−Orn−
SDMPyを０〜５℃で加え、次いで18時間室温で
反応させた後に、AcOEt200mlにて希釈し、次い
で５％冷水性HCl00mlにて２回、次いで飽和
NaCl水溶液100mlにて２回洗浄する。MgSO4上
で乾燥後に溶媒を減圧留去すると、Ｚ−Ｄ−Orn
（Tos）−Pro−Arg（Z2）−CHA1.38gr（64.2％）が
得られる。 Rf1＝0.53；m.p.＝95〜105℃。 2MSA・Ｈ−Ｄ−Orn（Tos）−Pro−Arg−
CHA（NT−Ｉ） C32H50N8O14S3866.993 1.185gr（1.1ｍmol）のＺ−Ｄ−Orn（Tos）−
Pro−Arg（Z2）−CHAをメタンスルホン酸7.1ml
およびアニソール0.6mlで１時間室温で処理し、
反応液を次いでエーテル中に落す。析出物を濾取
し、乾燥させ、粗製の2MSA・Ｈ−Ｄ−Orn
（Tos）−Pro−Arg−CHAを得る。この生成物を
セフアデツクスLH−20カラム（４×112cm）で
展開溶媒としてメタノールを用いてゲル濾過し、
標記化合物0.432gr（45.3％）を得る。 Rf3＝0.30；m.p.＝176〜179℃。 実施例 ５ 同様な方法にて、下記基質の合成を行つた。
THF250ml溶液を滴下反応する。18時間室温に
て反応後（20〜25℃）、析出したジシクロヘキ
シル尿素（DCHU）を別、THFを減圧留去
し、合成されたオイル状粗製活性エステル
PMZ−Arg（Z2）−SDP54gr（74％）を得る。こ
れをそのまま次の反応に使用する。 上記にて合成した活性エステルPMZ−Arg
（Z2）−SDP54gr（0.4mole）をTHF150mlに溶解
し、これを５−アミノサルチル酸11.4gr
（0.74mole）とTEA20.8ml（0.148mole）を
DMF80mlに溶解した液に０〜５℃にて滴下反
応を行い、更に室温にて18時間反応後、溶媒を
留去し、残分をAcOEt800mlに溶解、５％冷
HCl aq400mlにて２回洗浄、析出した結晶を
取乾燥するとＺ（OMe）−Arg（Z2）−
CHA36.8gr（67.6％）を得る。 Rf1＝0.52m.p.182〜185℃ 〔α〕D＋11.0（Cl.DMF） BOC−Pro−Arg（Z2）−CHA Ｚ（OMe）−Arg（Z2）−CHA37.1gr
（0.05mole）にアニソール15mlとTFA250mlを
加え、室温にて２時間反応を行う。反応終了後
TFAを減圧留去し、次いで乾燥エーテルにて
処理すると結晶化する。26.3gr（76％）の
TFA・Ｈ−Arg（Z2）−CHAを得る。 〔α〕D＋22.4（Cl.DMF） 17.5gr（0.0255mole）のTFA・Ｈ−Arg（Z2）
−CHAを0.75N NEM／DMF102mlに溶解し、
０〜５℃にてBOC−Pro−SDP8.6gr
（0.0255mole）のDMF15ml溶液を滴下反応す
る。18時間室温にて反応液（20〜25℃）、DMF
を減圧留去し、残分をAcOEt750mlに溶解、冷
５％HCl250mlにて４回、Sat NaCl aq250mlに
て２回洗浄する。MgSO4上で乾燥後溶媒を減
圧留去するとフオーム状の粗製BOC−Pro−
Arg（Z2）−CHAが得られ、これをIPA／IPEよ
り再結晶して7.4gr（37.3％）のを得る。 Rf1＝0.53m.p.110〜135℃ 〔α〕D−18.0（Cl.DMF） Ｚ−Ｄ−Phe−Pro−Arg（Z2）−CHA 12.7gr（0.016mole）のBOC−Pro−Arg（Z2）
−CHAを2N−HCl／AcOH41mlにて２時間室
温処理し、BOC基を脱離し、反応液をエーテ
ル中に再沈する。析出物を取、乾燥すると
HCl・Ｈ−Pro−Arg（Z2）−CHA12.4gr（98.4
％）を得る。 Rf1＝0.60m.p.184〜187℃ 〔α〕D−25.8（Cl.MeOH） HCl・Ｈ−Pro−Arg（Z2）−CHA7.43gr（10.5
ｍmole）とTEA4.5ml（3.15ｍmole）を
DMF66mlに溶解し、これに−５〜０℃に冷却
下、Ｚ−Ｄ−Phe−SDP4.5gr（10.5ｍmole）を
33mlDMFに溶解した液を滴下反応を行う。２
時間後室温にもどし、次いで常温にて15時間反
応後、DMFを留去、残つた油状分をMeOH60
mlに溶解し、３％クエン酸水溶液3000mlに再沈
し、析出した結晶を取・乾燥すると、結晶
7.8grを得る。これを、セフアデツクスLH−
20、展開溶媒MeOHにてゲル過し、結晶
3.8grを得る。 Rf1＝0.55m.p.224〜228℃ 〔α〕D−40.2（Cl.MeOH） 元素分析 C51H53N7O12・1.5H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 62.46 5.70 10.17 計算値 62.31 5.74 9.97 2HCl・Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHA Ｚ−Ｄ−Phe−Pro−Arg（Z2）−CHA2.9gr
（3.03ｍmole）をMeOH130mlに溶解し、
AcOH5〜６滴を加えパラジウム黒1grを触媒と
して、接触還元を行う。反応終了後、MeOH
を濃縮、残分を2N−HCl／AcOH5mlに溶解
し、エーテル200ml中に加え、再沈させ、析出
した結晶を取、KOH上乾燥を行うと2HCl・
Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−CHA1.30gr（68％）
を得る。 mp.213℃（分解）〔α〕D−109.2（C0.5MeOH） 元素分析 C27H35N7O6・AcOH・3/2H2O・
2HCl Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 48.61 6.04 14.05 計算値 48.81 6.21 13.78 実施例 ２ 2HCl・Ｈ−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−Arg−
CHA（TN−Ｅ） BOC−Pro−Arg−CHA
C23H34O7N6506.563 6.4gr（8.3ｍmole）の
BOC−Pro−Arg（Z2）−CHAをMeOH120mlに
溶解して、パラジウム黒の存在下、６時間水素
還元をする。反応後触媒を別してMeOHを
減圧留去し、エーテルにて結晶化させ、取、
乾燥するとBOC−Pro−Arg−CHA3.6gr（85.7
％）を得る。 Rf2＝0.48mp.199〜203℃ 〔α〕D−76.0（Cl.MeOH） 2HCl・Ｈ−Pro−Arg−CHA C18H26O5N6・
2HCl479.367 3.0gr（5.9ｍmole）のBOC−Pro−Arg−
CHA29.5ml（59ｍmole）の2N−HCl／AcOH
にて２時間室温処理して、エーテル中に落す。 析出物を取・乾燥すると2HCl・Ｈ−Pro
−Arg−CHA2.8gr（100％）を得る。 Rf40.11mp.〜203℃（分解） 〔α〕D−42.4（Cl、MeOH） BOC−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−Arg−CHA C34H46N7O9696.788 0.959gr（2.0ｍmole）の2HCl・Ｈ−Pro−
Arg−CHAを0.75N−NEM／DMF8mlに溶解
して、０〜５℃にて0.863gr（2.0ｍmole）の
BOC−Ｄ−Thr（OBzl）−SOPを加えて、18時
間室温にて反応後、反応液を冷10％クエン酸／
Sat NaCl aq＝１／１溶液2000mlに落す。析
出物を取・乾燥するとBOC−Ｄ−Thr
（OBzl）−Pro−Arg−CHA1.07gr（72.7％）を
得る。 Rf2＝0.61mp.180〜195℃ 2HCl・Ｈ−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−Arg−
CHA C29H41N7O7Cl2670.599 0.9gr（1.2ｍmole）のBOC−Ｄ−Thr（OBzl）
−Pro−Arg−CHAを10ml（20ｍmole）の2N
HCl／AcOHにて２時間室温処理して、反応液
をエーテル中に落す。析出物を取・乾燥して
粗製の2HCl・Ｈ−Ｄ−Thr（OBzl）−Pro−
Arg−CHAが得られ、これをセフアデツクス
LH−20（４×112cm）カラムで展開溶媒MeOH
にてゲル過を行い、0.32gr（40.2％）を得る。 Rf2＝0.33mp.183〜190℃ 実施例 ３ 2HBr・Ｈ−Ｄ−Lys（BZ）−Pro−Arg−CHA
（NT−Ｈ）の合成 Ｚ−Ｄ−Lys（BZ）−Pro−Arg−CHA・HCl C39H48N8O9・HCl809.328 0.959gr（2.0ｍmole）の2HCl・Ｈ・Pro−
Arg−CHAを0.75M・NEM／DMF8mlに溶解
して、０〜５℃にて0.9630gr（2.0ｍmole）のＺ
−Ｄ−Lys（BZ）−OSuを加え、18時間室温にて
反応後、反応液を冷10％クエン酸／Sat・NaCl
aq−１／１溶液2000mlに、再沈殿させる。析
出物を濾取し、乾燥してＺ−Ｄ−Lys（BZ）−
Pro−Arg−CHA1.13gr（70.0％）を得る。 Rf2＝0.59m.p.149〜152℃ 2HBr.H−Ｄ−Lys（BZ）−Pro−Arg−CHA C31H42N8O7・2HBr688.318 1.0gr（1.2ｍmole）のＺ−Ｄ−Lys（BZ）−
Pro−Arg−CHA・HClを10mlの25％HBr／
AcOHにて１時間室温で処理し、次いで反応液
をエーテル中に再沈殿させる。析出物を濾取
し、乾燥して粗製の2HBr・Ｈ−Ｄ−Lys（BZ）
−Pro−Arg−CHAを得、これをセフアデツク
スLH−20（４×112cm）カラムで展開溶媒
MeOHにてゲル濾過を行い、生成物0.44gr
（53.4％）を得る。 Rf2＝0.32m.p.182〜188℃ 実施例 ４ 2MSA・Ｈ−Ｄ−Orn（Tos）−Pro−Arg−
CHA（NT−Ｉ）の合成（Orn＝オルニチン） Ｚ−Ｄ−Orn（Tos）−Pro−Arg（Z2）−CHA C54H60N8O14S1 1077.19 1.415gr（2.0ｍmol）のHCl・Ｈ−Pro−Arg
（Z2）−CHAを0.75N−NEM／DMF8mlに溶解
し、1.085gr（2.0ｍmol）のＺ−Ｄ−Orn−
SDMPyを０〜５℃で加え、次いで18時間室温で
反応させた後に、AcOEt200mlにて希釈し、次い
で５％冷水性HCl00mlにて２回、次いで飽和
NaCl水溶液100mlにて２回洗浄する。MgSO4上
で乾燥後に溶媒を減圧留去すると、Ｚ−Ｄ−Orn
（Tos）−Pro−Arg（Z2）−CHA1.38gr（64.2％）が
得られる。 Rf1＝0.53；m.p.＝95〜105℃。 2MSA・Ｈ−Ｄ−Orn（Tos）−Pro−Arg−
CHA（NT−Ｉ） C32H50N8O14S3866.993 1.185gr（1.1ｍmol）のＺ−Ｄ−Orn（Tos）−
Pro−Arg（Z2）−CHAをメタンスルホン酸7.1ml
およびアニソール0.6mlで１時間室温で処理し、
反応液を次いでエーテル中に落す。析出物を濾取
し、乾燥させ、粗製の2MSA・Ｈ−Ｄ−Orn
（Tos）−Pro−Arg−CHAを得る。この生成物を
セフアデツクスLH−20カラム（４×112cm）で
展開溶媒としてメタノールを用いてゲル濾過し、
標記化合物0.432gr（45.3％）を得る。 Rf3＝0.30；m.p.＝176〜179℃。 実施例 ５ 同様な方法にて、下記基質の合成を行つた。
【表】
実施例 ５
新規に合成した基質の特異性を各種酵素と反応
させる事により試験した。 試験方法； (1) 基質液、濃度；3.5ｍmole／H2O (2) 緩衝液；トリス−塩酸緩衝液50ｍmol／ NaCl150ｍmole／（0.875％） を使用し、反応PHは、酵素により次の通りとし
た。 酵 素 PH（25℃） トロンビン（TH） 8.4 プラスミン（PL） 7.4 カリクレイン（KL） 7.9 Ｆ−Xa（FXa） 8.4 ウロキナーゼ（UK） 8.2 (3) 使用酵素
させる事により試験した。 試験方法； (1) 基質液、濃度；3.5ｍmole／H2O (2) 緩衝液；トリス−塩酸緩衝液50ｍmol／ NaCl150ｍmole／（0.875％） を使用し、反応PHは、酵素により次の通りとし
た。 酵 素 PH（25℃） トロンビン（TH） 8.4 プラスミン（PL） 7.4 カリクレイン（KL） 7.9 Ｆ−Xa（FXa） 8.4 ウロキナーゼ（UK） 8.2 (3) 使用酵素
【表】
(4) 反応停止液（PNA）
10％−酢酸
(5) 発色試液（CHA）
Ｏ−エチルフエノール、7.0ｍmol＋
NaIO41.5ｍmole／0.2N−KOH 測定方法； 緩衝液0.5mlと酸素試薬0.05mlを、シリコン処
理硬質ガラス製試験管又は、プラスチツク製試験
管に採取し、37℃恒温槽中にて５分間予加温す
る。次いで基質液0.1mlを加えて酵素反応を37℃
で10分間実施する。正確に、10分後反応停止液又
は停止発色試液2.5mlを加えて酵素反応を停止し
た後、25℃で10分間放置後405nｍ又は645nｍの
吸光度を測定、 但し
NaIO41.5ｍmole／0.2N−KOH 測定方法； 緩衝液0.5mlと酸素試薬0.05mlを、シリコン処
理硬質ガラス製試験管又は、プラスチツク製試験
管に採取し、37℃恒温槽中にて５分間予加温す
る。次いで基質液0.1mlを加えて酵素反応を37℃
で10分間実施する。正確に、10分後反応停止液又
は停止発色試液2.5mlを加えて酵素反応を停止し
た後、25℃で10分間放置後405nｍ又は645nｍの
吸光度を測定、 但し
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 〔式中Ｒは、【式】((ｎ＝０また は１))、【式】((R1＝Ｈまたは 【式】))、 【式】((R2＝ＨまたはCH3基 ))、あるいは−（CH2）o−NHR3((ｎ＝３または
４、R3＝【式】または 【式】基))を表す〕または、その塩で 表わされる、トロンビンおよびトロンビン様酵素
に対して、発色性且つ蛍光性を有する新規なトロ
ンビン測定用基質。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56153472A JPS5856695A (ja) | 1981-09-28 | 1981-09-28 | 新規なトロンビン測定用基質 |
| US06/406,025 US4450105A (en) | 1981-09-28 | 1982-08-06 | Substrates for measuring thrombin |
| EP82304588A EP0076042B1 (en) | 1981-09-28 | 1982-09-01 | Novel substrates for measuring thrombin |
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| US06/578,805 US4520100A (en) | 1981-09-28 | 1984-02-10 | Method for measuring thrombin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56153472A JPS5856695A (ja) | 1981-09-28 | 1981-09-28 | 新規なトロンビン測定用基質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5856695A JPS5856695A (ja) | 1983-04-04 |
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Family
ID=15563312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56153472A Granted JPS5856695A (ja) | 1981-09-28 | 1981-09-28 | 新規なトロンビン測定用基質 |
Country Status (4)
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