PL99020B1 - Sposob wytwarzania nowych enzymatycznych substratow chromogenicznych oraz ich soli do oznaczania proteaz seryny a zwlaszcza czynnika xa - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych enzymatycznych substratów chromoge¬ nicznych do oznaczania proteaz seryny a zwlasz¬ cza czynnika Xa.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku nowe substraty lub ich sole sa typu amidowego, o wy¬ sokiej wrazliwosci na czynnik Xa i okreslone sa nastepujacym wzorem ogólnym Ri—Ax—A2—Gly— Arg—NH—R2, w którym Rx oznacza atom wodo¬ ru, grupe alkanoilowa o 1—12 atomach wegla, gru¬ pe cykloheksylokarbonyIowa, benzoilowa, benzoilo- wa podstawiona na przyklad jednym lub dwoma atomami chlorowca, grupami metylowymi, amino¬ wymi lub fenylowymi, benzenosulfonylowa i 4-to- luenosulfonylowa, R2 oznacza grupe nitrofenylowa, naftylowa, nitronaftylowa, metoksynaftylowa, chi- nolilowa i nitrochinolilowa, At oznacza wiazanie pojedyncze lub oznacza aminokwas taki jak Gly.Ala, Val, Leu, Ileu, Pro, Met, Phe i Tyr, A2 moze oznaczac aminokwas taki jak Glu, Gin, Asp i Asn.Te nowe substraty sa szczególnie przydatne do diagnostycznego oznaczania czynnika Xa (E.C.3.4. 21.6), sledzenie reakcji powodujacych powstawa¬ nie Xa, zahamowanie tego procesu, lub jego zuzy¬ cie, albo nawet do oznaczania tych czynników, któ¬ re maja wplyw lub biora udzial w tych reakcjach.Czynnik X jest podstawowa substancja w serii reakcji prowadzacych do koagulacji krwi. Akty¬ wacja czynnika X daje poprzez powstawanie en¬ zymu protealitycznego, czynnik Xa, który jest bez- 2 posrednio odpowiedzialny za przeksztalcenie pro- trombiny w trombine. Posiadanie prostej metody oznaczania czynnika Xa byloby bardzo cenne przy stawianiu diagnozy.Stosowane dotychczas odczynniki do oznaczania czynnika Xa skladaly sie zazwyczaj z substratów estrowych o bardzo niespecyficznym charakterze.Jednym z nich jest na przyklad benzosan p-nitro- fenylo-p'guanidyny (p-NPGB), który jest dobrym substratem tak dla trombiny, jak i dla trypsyny i plasminy. Jego praktyczny zakres zastosowania dla czynnika Xa ogranicza sie do oczyszczania pre¬ paratów enzymowych. Wyniki otrzymane przy u- zyciu krwi nie nadaja sie do praktycznego wyko¬ rzystania z powodu obecnosci innych esteraz ak¬ tywnych wobec p-NPGB (R.L. Smith, J. Biol. Chem. 248, 2418 (1972).W szwedzkim zgloszeniu patentowym nr 5757/72 opisano bardzo dobre chromogeniczne substraty a- midowe dla enzymów podobnych do trombiny. Je¬ den z nich o wzorze benzoilo-Phe-Val-Arg-p-ni- troanilid (S-2160) pracuje bardzo dobrze dla trom¬ biny, natomiast stosowany z czynnikiem Xa, ulega tylko nieznacznemu rozszczepieniu. Jezeli substrat ma byc stosowany do oznaczania Xa w diagnostycz¬ nej analizie krwi, to jego wrazliwosc na trombine powinna byc znikoma.Dlatego byloby pozadanym dysponowanie sub- straktem bardziej wlasciwym dla czynnika Xa, a wiec mniej podatnym na rozszczepianie przez trom- 99 0203 99 020 4 bine. Substrat powinien mierzyc biologiczna fun¬ kcje enzymu rozszczepiajacego wiazania amidowe.Co wiecej, byloby pozadane by substrat mógl byc szybko rozszczepiany na produkty latwe do zmie¬ rzenia, takie jak zwiazki chromoforowe, które moz¬ na latwo okreslic spektrofotometrycznie.Nowe substrakty mozna wytwarzac dwiema pod¬ stawowymi róznymi metodami.Pierwsza metoda polega na sprzeganiu chromo- forowej grupy R2 z arginina i nastepnie stopniowo rozbudowywaniu zadanej struktury peptydowej sposobem stopniowego sprzegania z pozostalymi a- minokwasami. Grupa chromoforowa jest tu uzyta jako grupa blokujaca koncowy wegiel grupy kar¬ boksylowej pierwszego aminokwasu.Druga metoda polega na stopniowym rozbudo¬ wywaniu zadanej struktury z wyzej wymienionych aminokwasów, po czym usuwa sie grupy blokujace i sprzega chromoforowa grupe R2 z rozbudowanym peptydem.W stopniowanych syntezach rozbudowanych pep- tydów wedlug tych dwóch metod, mozliwe jest oczyszczenie w sposób wystarczajacy na drodze filtracji zelownej, produktu kazdego nastepnego sprzezenia z nowym aminokwasem.Metody sprzegania stosowane w tych stopniowa¬ nych syntezach pochodnych peptydowych sa dobrze znane i powszechnie stosowane w chemii peptydów.Jako grupy blokujace aminy znane sa dobrze i powszechnie stosowane w chemii peptydów takie grupy blokujace jak Cbo (girupa karbobenzoksy- lowa), MeOCbo (p-metoksykarbobenzoksylowa), No2Cbo (p-nitrokarbobenzoksylowa), MCbo (p-me- toksyfenyloazo-karbobenzoksylowa), BOC trzeciorze¬ dowa butoksykarbonylowa), TFA (trójfluoroacety- lowa) lub grupa formylowa.Grupa a-karboksylowa moze byc uaktywniona przez przeprowadzenie jej na drodze konwersji w rózne aktywne pochodne, dobrze znane i czesto stosowane w chemii peptydów, które mozna albo wydzielic albo wytwarzac „in situ", jak na przy¬ klad ester p-nitrofenylowy, ester trójchlorofeny- lowy, ester pieciochlorofenylowy, ester imidowy kwasu N-hydroksybursztynowego, azydek kwaso- * wy, bezwodnik kwasowy, który moze byc syme¬ tryczny albo niesymetryczny. Grupa ta moze byc takze uaktywniona przez karbodwuimidy takie jak: N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimidy. Koncowy we¬ giel grupy karboksylowej w pochodnej amino-pep- tydowej lub pochodnej aminokwasu zabezpiecza sie albo przez estryfikacje przeprowadzajac na przy¬ klad w ester metylowy, etylowy lub izopropylowy lub przeksztalcajac na drodze konwersji w chro¬ moforowa pochodna aniliny, która w ten sposób dziala podczas rozbudowywania lancucha peptydo- wego jako grupa blokujaca. Wolne grupy funkcyj¬ ne nie biorace udzialu w reakcji, moga byc pod¬ czas syntezy peptydów lub pochodnych peptydo¬ wych chronione w sposób nastepujacy: W celu zablokowania pozostalej grupy arginylo- Y-guanidowej mozna uzyc takich grup blokujacych amine jak na przyklad powszechnie stosowana w chemii peptydów protonizacja, grupa N02, lub Tos- p-tpluenosulfonylowa. Do zabezpieczania grupy kar¬ boksylowej w kwasie glutaminowym lub kwasie asparaginowym mozna stosowac grupy blokujace, stosowane powszechnie w chemii peptydów, jak grupy benzylowe, i trzeciorzedowe butylowe.Wynalazek zostanie przedstawiony szczególowiej w nastepujacych przykladach, ilustrujacych spo¬ sób wytwarzania róznych substratów wedlug wy¬ nalazku na drodze stopniowanych syntez.W analizach eluatów i produktów, metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej, zastosowano jako medium absorbcyjne plytki szklane z silika-zelem F254 (Merck).Zestaw stosowanych rozpuszczalników przedsta¬ wiono w ponizszej tabeli: Okreslenie A: C: D: Pi: Rozpuszczalniki n-butanol:kwas octowy:woda n-propanol:octan etylu:woda n-heptan-butanol:kwas octowy chloroform :metanol Stosunek objeto¬ sciowy /3 : i : 1/ /7 : i : 2/ /3 : 2 :1/ /9 : 1/ v Po przeprowadzeniu chromatograficznej analizy cienkowarstwowej, przebadano najpierw plytki w swietle UV (254 mm) i nastepnie zastosowano me¬ tode bardziej postepowa, z reakcja chloro(toluidy- nowa) Ref. G. Pataki: Dunnschichtchromatografie in der Aminosaure-und Peptidchemie, Walter de Gruyter u. Co, Berlin, 1966, s. 125).Stosowane ponizej skróty maja nastepujace zna¬ czenie: Aminokwasy: Skróty dotycza reszt aminokwasów.Wolny aminokwas lub peptyd pokazuje oczywiscie H— w grupie aminowej i —OH— w grupie karbo- 40 ksylowej. Grupa aminowa jest wskazana po lewej stronie, grupa karboksylowa — po prawej. O ile nie stwierdzono inaczej, wszystkie stosowane ami¬ nokwasy maja konfiguracje —L.Ala = alanina 45 Arg = arginina Asn = asparagina Asp = kwas asparaginowy Gin = glutamina Glu = kwas glutaminowy 50 Gly = glicyna Dalsze skróty: Ac = grupa acetylowa Ac20 = bezwodnik octowy AcOH = kwas octowy 55 BOC = trzeciorzedowy-butoksykarbomyl Bz = grupa benzoilowa Bzl = grupa benzylowa Bz20 = bezwodnik kwasu benzoesowego Cbo = grupa karbobenzoksylowa DCCI = dwucykloheksylokarbodwuimid DMF = dwumetyloformamid Ileu = izoleucyna Leu = leucyna Met = metionina 65 Phe = fenyloalanina 205 99 020 6 Pro = Tyr = Val = Et3N == MCbo = MeOH = OtBU = OEt = OMe = OpNP = OisoPr = pNA = prolina tyrozyna walina trójetyloamina grupa p-metoksyfenyloazokorbobenzo krylowa metanol grupa trzeciorzedowa-butoksylowa grupa etoksylowa grupa metoksylowa grupa p-nitrófenoksylowa =grupa,izo-propoksyIowa p-nitroanilid TFA = grupa trójfluoroacetyIowa Tos = grupa p-toluenosulfonyIowa Wskazniki temperatur w przykladach podano w °C, o ile nie okreslono inaczej.Przyklad I. HC1. Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA Przyklad la. Cbo-Gly-Arg-(N02)-pNA (ciezar molowy 530,4) 5,0 g (10,6 mola) CbO-Arg(N02)-pNA rozpuszcza sie w 21 ml AcOH (kwasu octowego) i 22 ml 4n HBr w AcOH w warunkach pozbawio¬ nych wilgoci. Roztwór miesza sie przez godzine w temperaturze pokojowej, a nastepnie wlewa sie go powoli do 200 ml szybko mieszanego eteru. Roz¬ twór eterowy dekantuje sie i otrzymana ziarnista pozostalosc ponownie traktuje dwa razy 100 ml eteru. Po wysuszeniu pod próznia znad P205 i gra¬ nulek KOH w temperaturze 30°C otrzymuje sie bromowodorowa sól pochodnej aminokwasu z pra¬ wie ilosciowa wydajnoscia (4,95 g).Produkt jest jednorodny, zgodnie z TLC w A, Tak otrzymany produkt rozpuszcza sie w 50 ml destylowanego DMF (dwumetyloformamidu). Roz¬ twór oziebia sie do —10°C i dodaje ET.N (troj- etyloaminy) az do zneutralizowania (2,1 ml). Wy¬ tracony osad Et3N. HBr odsacza sie i przesacz ozie¬ bia do —10°C. Dodaje sie 3,9 g (11,8 mmola) Cbo— Gly—OpNP i powoli roztwór moze osiagnac tem¬ perature pokojowa. Po trzech godzinach roztwór schladza sie ponownie doj—10°G i buforuje za po- ; moca 0,54 g (5,3 mmola) trój etyloaminy (ET3N).Po 2—3 godzinach powtarza sie proces buforowania jeszcze raz. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na noc i potem odparowuje pod próznia w tempe¬ raturze 40°C. Pozostaly ciezki olej miesza sie bar¬ dzo dokladnie z 100 ml wody destylowanej. Wode sie plekantuje vi proces mycia powtarza sie nastep¬ nie dwukrotnie. Pozostaly olej rozpuszcza sie w cieplym metanolu (MeOH) i otrzymuje podczas chlodzenia osad produktu w postaci krystalicznej.Wydajnosc: 4,2 g (75°/o) produktu la Cbo—Gly— —Arg—(NO2)—p—NA. Jednorodny zgodnie z TLC w Pt (Rf = 0,16) [a] d5—36° (c 0,50, MeOH—meta¬ nol).Przyklad Ib. III-rzed.Boc—Glu—)y—OBzl(Gly —Arg(N02)—p—NA) (ciezar molowy 715,8) 2,65 g (5,0 mmola) produktu la poddaje sie dekarbobenzo- ksylacji i sprzega z 2,50 g (5,5 mmola) III-rzed.- Boc-Glu-(y-OBzl)-OpNP zgodnie z metoda podana w przykladzie la. Surowy produkt oczyszcza sie na drodze chromatografii zelowej w kolumnie zawie¬ rajacej SEPHADEX LH—20 w metanolu.Wydajnosc: 3,25 g (91°/» produktu Ib) Jednorodny zgodnie z TLC w Pt (Rf = 0,22) [a] £ —34° (c 1,0 metanol).Ic: Cbo—ILeu—Glu (y-^OBzl)—Gly—Arg(N02)— —pNA (ciezar molekularny 862,9) 1,08 g (1,5 mmola) produktu Ib rozpuszcza sie w 10 ml TFA. Roztwór miesza sie przez godzine w temperaturze pokojo¬ wej i nastepnie wlewa powoli do 75 ml szybko mieszanego osuszonego eteru. Roztwór eterowy de¬ kantuje sie i otrzymana ziarnista pozostalosc trak- tuje dwukrotnie 50 ml eteru. Po osuszeniu pod próznia znad P205 i granulek KOH w temperatu¬ rze 30°C, wydajnosc trójfluoroacetylowej (TFA)soli pochodnej trójpeptydowej jest prawie ilosciowa (1,08 g). Produkt jest jednorodny zgodnie z TLC !5 w A. Powyzszy produkt rozpuszcza sie w 20 ml DMF-dwumetylcformamidzie. Roztwór oziebia sie do temperatury —10°C i neutralizuje ET3N-trójety- lomaina (0,23 ml). Dodaje sie 0,65 g (1,68 mmola) produktu Cbo-Ileu-OpNP i roztwór powoli osiaga temperature pokojowa. Po okolo trzech godzinach roztwór schladza sie ponownie do —10°C i bufo¬ ruje trójetyloamina (0,12 ml). Po 2—3 godzinach powtarza sie jeszcze raz procedure buforowania i roztwór pozostawia przez noc. Nadmiar Cbo-ILeu- OpNP rozklada sie potem przez dodanie do roztwo¬ ru okolo 100 mg (okolo 1,4 mmola) n-butyloaminy.(Nadmiar aktywnego estru jest niekorzystny, gdyz trudno jest go oddzielic podczas filtracji zelowej).Po okolo 30 minutach roztwór odparowuje sie pod próznia w temperaturze 40°C. Pozostaly olej prze¬ mywa sie trzema porcjami wody destylowanej. Olej rozpuszcza sie w MeOH (metanolu) i oczyszcza za pomoca chromatografii zelowej w kolumnie zawie¬ rajacej SEPHADEX LH—20 w metanolu.Wydajnosc: 1,07 g (83%) produktu Ic, jednorodny zgodnie z TLC w P! (Rf = 0,35). [a] ™ —32° (c. O. 3, MeOH (metanol); DMF (dwu- metyloformamid) (95:5).Id: Bz-Ileu-Glu) y—OBzi)—Gly—Arg(N02)—pNA 40 260 mg (0,30 mmola) produktu Ic dekarbobenzo- ksylowano jak w przykladzie Ia. Produkt wykazuje 2 plamki w TLC w A (Rf = 6,45 i 0,60), a IR — spektroskopia wykazuje, ze produkt jest miesza¬ nina HBr. H—Ileu—Glu) y—OH(—Gly—Arg(N02)— 45 —pNA i HBr. H—Ileu—Glu—)y—OBzl (—Gly—Arg (N02)—pNA).Mieszanine te poddaje sie reakcji z 800 mg (0,35 mmola) bezwodnika kwasu benzoesowego jak w przykladzie la. Surowy benzoilowany produkt 0- 50 czyszcza sie w kolumnie chromatograficznej z SEPHADEX LH—20 w metanolu.Otrzymano dwie frakcje: a—130 mg [a]" —15°C (c 0,5, CH3CN), Rf = 0,20 w Pi i p: 105 mg [a] JJ —11° (c 0,5, CH3CN), Rf = 0,06 wPlt Spektroskopia IR okresla te dwie frakcje jako: Bz—Ileu—Glu) y—OBzl)—Gly—Arg(NOz)—pNA i Bz—Ileu—Glu—Gly—Arg(N02)—pNA. Z obu frakcji, reakcja z HF daje ten sam produkt koncowy Ie.Ie: HCl.Bz-ILeu—Glu—Gly—Arg—pNA (ciezar molowy 734,5). 100 mg (0,12 mmola) produktu Id frakcji i 0,5 ml anizolu umieszcza sie w naczyniu reakcyjnym aparatu Sakakibara. Nastepnie do tego naczynia 65 przedestylowuje sie. okolo 5 ml osuszonego fluoro-7 99 020 8 wodoru i pozwala przereagowac w ciagu 75 minut mieszajac w temperaturze 0°C. Nastepnie fluoro¬ wodór oddestylowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem i oleista pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml AcOH (33V»-owy wodny roztwór kwasu octowego), potem oczyszcza sie w kolumnie chromatograficz¬ nej zawierajacej SEPnADEX G-15 w 33^/o-owym wodnym roztworze AcOH (kwasu octowego). Na¬ stepnie frakcje eluentu zawierajaca czysta odblo¬ kowana pochodna czteropeptydowa poddaje sie lio¬ filizacji. Otrzymany zwiazek rozpuszcza sie w mie¬ szaninie metanolu i wody destylowanej (95:5) i w postaci chlorku poddaje chromatografii na lekko zasadowym wymieniaczu anionowym QAE—SEP- HADEX A-25, przy czym mieszanina rozpuszczal¬ ników jest taka sama jak w eluencie. Metanol usuwa sie z eluentu w temperaturze 30°C pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i pozostaly wodny roztwór poddaje liofilizacji.Wydajnosc: 75 mg (85%), jednorodny z TLC w A (Ri = 0,48) Md^°° 5, 50°/o-owy AcOH (kwas octowy- wodny roztwór).Analiza aminokwasów: izoleucyna: 0,98, kwas glu¬ taminowy; 0,95, arginina: 0,98, glicyna: 1.00.Przyklad IL 2HC1.H—Ileu—Olu—Oly—Arg— —pNA.Przyklad Ha. 2HC1. fi—Ileu—Glu—Gly—Arg— —p-NA (o ciezarze molowym 666,6) 100 mg (0,116 mmola) produktu Ic poddaje sie reakcji z fluoro¬ wodorem, oczyszcza i poddaje na wymieniacz jono¬ wy jak w przykladzie Ie.Wydajnosc: 66 mg (73%), jednorodny zgodnie z TLC w A (Ri = 0,34). [a]"-35° 5 5(Wb AcOH — kwas octowy w wodzie destylowanej.Analiza aminokwasów: Ileu (izoleucyna): 0,06; Glu (kwas glutaminowy): 0,94; Arg (arginina) 0,06; Gly (glicyna): 1,00.Substraty opisane w powyzszych przykladach zas¬ tosowano do oinaczania czynników w sposób na¬ stepujacy: Zasada oznaczania polega na tym, ze produkt powstaly z enzymatycznej hydrolizy daje zupelnie inne widmo UV niz widmo substratu. W ten sposób substrat z przykladu I, Bz-Ileu-Glu-Gly-Arg-pNA- -HC1 wykazuje maximum absorbcji przy 315 nm przy wspólczynniku moralnej ekstynkcji 12000. Ab¬ sorpcja substratu przy 405 nm jest nieznaczna.P-nitroanilina (pNA), która powstaje z substratu podczas jego enzymatycznej hydrolizy wykazuje maksymalna absorpcje przy 380 nm a wspólczyn¬ nik molarnej ekstynkcji 13Z00, który przy 405 nm spada tylko do 9620. Dlatego mozliwym jest na drodze pomiaru spektrometrycznego przy 405 nm sledzic z latwoscia stopien enzymatycznej hydroli¬ zy, który jest proporcjonalny do ilosci wyprodu¬ kowanej p-nitroaniliny.Obecny nadmiar substratu nie wplywa na pomiar przy tej dlugosci fali. Sytuacja jest prawie iden¬ tyczna dla innych substratów wedlug wynalazku i z tego powodu spektrofotometryczne pomiary byly caly czas przeprowadzane przy 405 nm. Tabela I daje zestawienie porównawcze wzglednego stopnia io (szybkosci) reakcji róznych enzymów typu proteaz seryny (E. C. 3. 4. 21), na poprzednio wymieniony substrat S-2160 i substrat I wedlug wynalazku.Stopnie reakcji okreslono wyzej opisana metoda.Jak wynika z tabeli, czynnik Xa rozszczepia sub- strat I sto razy lepiej niz to ma miejsce z S-2160 i w porównaniu z S-2160 efekt ten wywoluje tylko w nieznacznej mierze trombina. Tak wiec nie ma zadnych watpliwosci, ze substrat I, zgodnie z zesta¬ wieniem, jest najlepszym substratem dla Xa. Co wiecej z tablicy widac, ze substrat 1 moze byc z powodzeniem stosowany równiez jako substrat dla trypsyny. Jednak ten pozytywny efekt dla tryp- syny nie zaklóca oznaczania czynnika Xa, poniewaz trypsyna normalnie nie wystepuje we krwi. PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.