JPH0143760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）
から抽出される新規な免疫刺激性糖たん白質、そ
の取得方法、その薬剤としての応用及びそれを含
む組成物に関する。 いくつかのフランス国特許が肺炎桿菌から抽出
された糖たん白質を既に記載している。例えば、
フランス国特許第2043475号、同2088112号及び同
2171907号がある。 本発明は、これらよりも正確に規定された糖た
ん白質に関し、したがつて本発明の目的は、30％
〜45％のたん白質、30％〜40％の中性オース、４
％以下のグルクロン酸、２％〜５％のオサミンを
含有し、そして約350000ダルトンの分子量を有す
ることを特徴とする、肺炎桿菌から抽出された新
規な水溶性の免疫刺激性糖たん白質に関する。 ここで、中性オースとは、特に、グルコース、
マンノース又はガラクトースのような中性ヘキソ
ースを意味する。 本発明の糖たん白質の分子量は、超遠心分離に
よつて評価した。 本発明に従う糖たん白質は、肺炎桿菌の各種の
菌株から抽出することができる。特に、パスツー
ル研究所にNo.52145として寄託された菌株から得
られるものがあげられる。 これらの糖たん白質の構造を各種の化学的技
術、特にカルボジイミドによるウロン酸残基の還
元、過メチル化、ウロン酸分解、過よう素酸酸化
又は酸化クロムによる酸化によつて研究してそれ
らの組成及び構造が決定された。 本発明に従う糖たん白質は、多糖類部分がグラ
フト化しているたん白質鎖から形成されている。 本発明に従う好ましい糖たん白質は、たん白質
部分が約30％の酸性アミノ酸からなるものであ
る。酸性アミノ酸とは、アスパラギン酸又はグル
タミン酸のようなアミノ酸を意味する。 また、本発明に従う好ましい糖たん白質は、多
糖類部分が４個のガラクトース分子につきほぼ１
個のグルコース分子を含有するものである。 これらの中でも、特に、多糖類部分が次式の構
造 〔− ³ガラクトース¹−）_n ³ガラクトース¹ − ⁴グルコース¹−〕_o （ここで、ｍは３、４又は５に等しい整数であ
る）の多糖類単位の繰返しより本質上なるものが
あげられる。この構造においてｍは５に等しいと
きはｎは94に等しいか又はこれと少し異なること
を決定することができた。 また、本発明の主題は、上述のような新規な水
溶性糖たん白質の取得方法にあり、この方法は、
肺炎桿菌の培養物の溶解質の抽出物を透析過
（diafiltration）することによつて得られた糖た
ん白質の溶液を第四アンモニウムで処理し、得ら
れた沈殿を除去することにより上澄液を分離し、
糖たん白質の塩水溶液に相当するこの上澄液を低
分子量のアルカノールで冷間処理し、そのように
して得られた新たな沈殿を水に再び溶解し、透析
し、凍結乾燥し、再び溶液となし、ゲルで過
し、次いで第一溶出画分を集め、濃縮し、所望な
らば乾固させることを特徴とする。 本法の開始時には各種の糖たん白質溶液を用い
ることができる。これらの溶液は、多孔質膜であ
つて、所定の分子量（該膜の定数である）と同等
又はそれ以上の分子量の分子を保持できる校正さ
れた多孔質膜上での肺炎桿菌の培養物の溶解質の
透析過によつて得られる。 用いられる膜は、例えば、商品名「AMICON
XM50」、「PM30」及び「UM2」として市販され
ているものであるが、保持閾値が100000ダルトン
であるような膜、例えばアミコン社より名称
「XM100」又は「HIP100」として市販されてい
るものを用いるのが好ましい。特に好ましい膜
は、分子量が300000ダルトン以上である分子を保
持せしめるものである。これらは、アミコン社及
びロミコン社より名称「XM300」として入手で
きる膜より構成される。 透析過は、膜を所望の保持閾値の関数として
選択することによつて前述のように分子量が所定
の分子量よりも大きい溶液状分子を選別するのを
可能にさせる。また、その他の手段、例えば、重
合した親水性ゲルでのクロマトグラフイーによつ
て得られるような同じ特性のその他の溶液を用い
ることも完全に可能であることは当業者に自明で
ある。 この選別操作の先だつて、溶解質から脂質や核
酸を有効に除去することができる。 本発明に従う方法を実施するのに特に好ましい
条件下では、糖たん白質の出発原料溶液は、フラ
ンス国特許第2043475号の第二追加特許証第
2171907号に記載された方法によつて得られる。
この追加特許証では糖たん白質の分子量はゲル排
除技術によつて算定された。 糖たん白質の出発原料溶液を処理するのに用い
られる第四アンモニウムは、例えば塩化ピリジル
セチルアンモニウムであつてよいが、臭化トリメ
チルセチルアンモニウム即ちセタブロン
（Cetavlon）が特に好ましい。 第四アンモニウムで処理した後に得られる沈殿
は、標準的な方法、例えばデカンテーシヨン又は
過により上澄液から分離することができるが、
遠心分離により分離するのが好ましい。 得られた溶液は、次いで、約＋４℃において、
メタノール、エタノール、ｎ‐プロパノール又は
イソプロパノールのような低分子量のアルカノー
ルによつて冷間処理される。エタノールが優先的
に用いられる。最も有効な結果は、＋４℃の温度
で一夜の間に塩水溶液１容につき６容のエタノー
ルを用いることによつて得られる。 次いで沈殿は水に再び溶解され、透析されて精
製される。透析は、膜、例えばコロジオン又はセ
ルロース膜で閉じられた標準型のセルによつて行
なわれる。特に、膜が再生セルロースであり、約
24Åに等しい平均細孔直径を有し、そして分子量
が12000〜14000ダルトン以上の物質を保持するよ
うなセルが考慮される。これらの透析セルの中で
も、特に「VISKING」管をあげることができ
る。 この透析は、微量のアルカノールのような低分
子量の残留不純物を糖たん白質溶液から除去させ
るものである。 濃縮乾固は、標準的な技術、例えば噴霧化又は
凍結乾燥によつて行なうことができる。 凍結乾燥は、標準的な方法で、例えばユジフロ
イド社より販売されているSMU又はSMRGモデ
ルのような中規模の凍結‐昇華器で、又は大規模
の凍結乾燥器、例えばユジフロイド社より市販さ
れている冷凍器CAL及び昇華器SMIRSよりなる
装置で行なわれる。また、さらに小型の実験室用
モデルも、そしてセレーユ社のようなその他の会
社より販売されている装置も使用することができ
る。 凍結乾燥工程は随意であるが、それでも好まし
い。 ゲルでの過は、凍結乾燥物を水に溶解した後
に直接に、或いは糖たん白質の水溶液を用いて実
施することができる。しかしながら、過すべき
溶液に緩衝剤を加え、そしてその緩衝剤と共に溶
出させることが好ましい。緩衝剤は、過すべき
糖たん白質溶液がその緩衝剤中で0.1Mの濃度で
あるように炭酸アンモニウムから有利に構成され
る。 用いるゲルは、例えば、「Sephadex」の商品名
で市販されているものであつてよい。また、商品
名「Sephacryl S300」又は「Ultragel ACA34」
として入手できるもの（特に後者）を用いること
が好ましい。 過は、標準的な方法により、特に、波長
238nmでのUV分光法により制御することができ
る。 好ましい操作条件下では、上述の方法は、用い
る第四アンモニウムが臭化セチルトリメチルアン
モニウムであること、上澄液が遠心分離によつて
分離されること、低分子量のアルカノールがエタ
ノールであること、用いるゲルがUltragel
ACA34であること、溶出した画分が凍結乾燥に
より乾固されることにより特徴づけられる。 本発明の主題は、また、本発明の方法により得
られる糖たん白質にある。 本発明の主題をなす糖たん白質は、非常に有用
な薬理学的性質を持つている。それらは著しい免
疫刺激（immuno‐stimulating）性と非常に良
好な耐性（tolerance）を付与されている。 これらの性質は、実験の部でさらに例示する。 これらの性質は、本発明の糖たん白質を薬剤と
して使用するのを正当化させるものである。しか
して、本発明の主題は、上記のような糖たん白質
の薬剤としての使用にある。 本発明の薬剤の中でも、本発明の方法により得
られるような糖たん白質よりなることを特徴とす
るものが特にあげられる。 本発明の薬剤は、人や動物における細菌又はウ
イルスに原因のある感染性疾病の治療又は予防
に、寄生疾病や毒性感染症の治療に並びに臨床後
や外科手術後の感染症の治療に使用される。 有効薬量は、用いる生成物、治療患者及び疾病
によつて変るが、例えば人の場合に、経口投与で
１日当り１mg〜15mg、直腸経路で１日当り１mg〜
15mg、非経口投与で１日当り0.25mg〜５mgであろ
う。 最後に、本発明の主題は、本発明の糖たん白質
を活性成分として含有する製薬組成物にある。 薬剤としての本発明の糖たん白質は、消化器経
路で、非経口的に又は経口的に投与することがで
きる。 対応する製薬組成物は、例えば、固体又は液体
であつてよく、人の医薬に通常用いられる製薬形
態、例えば、無味の又は糖衣圧縮錠剤、ゼリー、
顆粒、溶液、シロツプ、坐薬、注射用調合物（凍
結、乾燥に関係なく）、丸薬、クリーム、軟膏、
ローシヨン、滴下薬、点眼剤、エーロゾルとして
提供できる。これらは通常の方法で製造される。
活性成分は、これらの製薬組成物に通常用いられ
る補助剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクト
ース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、コ
コアバター、水性又は非水性ビヒクル、動物又は
植物起源の脂肪物質、パラフイン誘導体、グリコ
ール、各種の湿潤、分散若しくは乳化剤及び（又
は）保存剤と混合することができる。 ここで、本発明の実施例を示す。 例 １ フランス国特許第2171907号の例１に記載の方
法で得られた20gの生成物を２のイオン交換水
に溶解する。 約1.6の３％セタブロン（Cetavlon）をゆつ
くりと添加し、全体を１時間かきまぜ、次いで
10000rpmで15分間遠心分離する。沈殿を除去し、
分離した上澄液に３の95゜エタノールを15分間
で添加する。１時間かきまぜ、10000rpmで15分
間遠心分離した後、そのようにして得られた上澄
液を除去し、沈殿を１の水に再び溶解し、次い
でVisking管において、＋４℃のイオン交換水に
向けて48時間透析する。この透析の終了後、溶液
を凍結乾燥する。6.2gの糖たん白質を得、その1g
を10mlの0.1M炭酸アンモニウムに溶解する。そ
の溶液を１のUltragel ACA34を入れた2.5cm直
径のカラムに入れ（溶出液：0.1M炭酸アンモニ
ウム）、第一溶出ピーク（280nmのUVで検出）
に相当する画分を集め、凍結乾燥し、0.51gの精
製された所期たん白質を得る。 例 ２ フランス国特許第2171907号の例１に記載の方
法で得た20gの生成物を１のイオン交換水に溶
解する。0.800の３％セタブロンをかきまぜな
がら添加する。１時間かきまぜた後、これを
10000rpmで15分間遠心分離する。沈殿を除去し、
分離した上澄液に1.5の95゜エタノールを添加す
る。１時間かきまぜた後、これを10000rpmで15
分間遠心分離する。上澄液を除去し、沈殿を
0.500の水に溶解し、Visking管において＋４℃
のイオン交換水に向けて48時間透析する。 この透析の終了後に、溶液を凍結乾燥し、6.5g
の所期の糖たん白質を得、これを例１に記載の方
法に従つてUltragel ACA34に通すことによつて
精製し、3.28gの所期の糖たん白質を得る。 例 ３ 下記の処方に相当する圧搾錠剤を調製した。 例１で得た糖たん白質 ……５mg 補助剤 ……１錠100mgとするに要する量 （補助剤の詳細：ラクトース、でん粉、タルク、
ステアリン酸マグネシウム） 例 ４ 下記の処方に相当する軟膏を調製した。 例２で得た糖たん白質 ……200mg 補助剤 ……100gとするに要する量 薬理学的研究 (A) 免疫刺激性及びミトゲン様（mitogenic）活
性 10頭づつのマウスの各群に動物１頭につき
40μgの被検生成物と40μgのウシ血清アルブミ
ンを足底内投与する。10日後に非致死性で且つ
非シヨツク誘発性薬用量の血清アルブミン（動
物１頭当り100μg）を静脈内投与する。対照動
物には、最初の注射時に血清アルブミンのみを
与える。 免疫刺激活性は血清アルブミンに対するアナ
フイラキシー性シヨツクの応答の増加によつて
測定され、またミトゲン様活性は注射個所から
排出させたガングリオンの重量増加により測定
される。 １ 免疫刺激活性 血清アルブミンを静脈注射してから２時間
後に死亡数及びシヨツク状態（鼻のチアノー
ゼを伴なう呼吸困難、後脚の麻痺の進行、痙
れん及び死亡）を示す動物数を数える。

【表】 ２ ミトゲン様活性 血清アルブミンを静脈内注射してから２時
間後に生存体を殺し、注射をした脚から排出
する膝かがみ筋ガングリオンを切除し、秤量
する。ミトゲン様活性は、被検生成物で処理
した動物のガングリオンの平均重量と血清ア
ルブミンのみを与えた対照動物のガングリオ
ンの平均重量の比に相当する指数によつて表
わされる。

【表】 したがつて、例１及び２の生成物は非常に良
好な免疫刺激活性及びミトゲン様活性を示す。 (B) 非特異的防御の刺激 この刺激は、Halpern氏により発展された技
術に従つてマウスでの炭素「清掃率
（Clearance）」試験により研究した。この方法
は、動物の眼洞にコロイド状炭素の懸濁液を注
射し、血中への炭素の消失移動を光学密度の測
定により時間の関数として評価することからな
る。 生成物は、試験の24時間及び48時間前に動物
に腹腔内投与する。結果は、コロイド状炭素の
注射のみを受け且つ炭素粒子数の100％に相当
する対照例と比較して、炭素粒子の除去率とし
て表わされる。

【表】 これらの結果の検討により、生体の防御に対
してこれら二つの生成物により引起される強い
刺激を観察することができる。 (C) 急性毒性 マウスにおいて腹腔内投与による致死量50
（LD50）をBehrens‐Karber法により決定し
た。 それは、例１及び２の糖たん白質について30
mg／Kgである。 (D) 耐 性 例１及び２の糖たん白質0.2mlを1000γ/Kgの
薬用量でマウスに皮下注射しても局部的又は全
身的不耐性を何ら生じさせない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 30％〜45％のたん白質、30％〜40％の中性オ
   ース、４％以下のグルクロン酸、２％〜５％のオ
   サミンを含有し、そして約350000ダルトンの分子
   量を有することを特徴とする、肺炎桿菌
   （Klebsiella pneumoniae）から抽出された新規
   な水溶性の免疫刺激性糖たん白質。 ２ パスツール研究所にNo.52145として寄託され
   た菌株から抽出されたことを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の糖たん白質。 ３ たん白質部分が約30％の酸性アミノ酸よりな
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１又は２項
   記載の糖たん白質。 ４ 多糖類部分がガラクトース４分子につきほぼ
   １分子のグルコースを含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の新
   規な糖たん白質。 ５ 多糖類部分が次式の構造 〔− ³ガラクトース¹）_n− ³ガラクトース¹ − ⁴グルコース¹−〕_o （ここで、ｍは３、４又は５に等しい整数であ
   る）の多糖類単位の繰返しより本質上なることを
   特徴とする特許請求の範囲第４項記載の新規な糖
   たん白質。 ６ 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）の培養
   物の溶解質の抽出物を透析過することによつて
   得られた糖たん白質の溶液を第四アンモニウムで
   処理し、得られた沈殿を除去することにより、糖
   たん白質の塩水溶液に相当する上澄液を分離し、
   次いでこれを低分子量のアルカノールで冷間処理
   し、そのようにして得られた新たな沈殿を水に再
   び溶解し、透析し、凍結乾燥し、溶液に戻し、ゲ
   ルで過し、次いで第一溶出画分を集め、濃縮
   し、所望ならば乾固させることを特徴とする、30
   ％〜45％のたん白質、30％〜40％の中性オース、
   ４％以下のグルクロン酸、２％〜５％のオサミン
   を含有し、そして約350000ダルトンの分子量を有
   する肺炎桿菌から抽出された水溶性の免疫刺激性
   糖たん白質の製造方法。 ７ 用いる第四アンモニウムが臭化セチルトリメ
   チルアンモニウムであり、上澄液が遠心処理によ
   り分離され、そして低分子量アルカノールがエタ
   ノールであり、用いるゲルがUltragel ACA34で
   あり、溶出画分が凍結乾燥により乾固せしめられ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ８ 30％〜45％のたん白質、30％〜40％の中性オ
   ース、４％以下のグルクロン酸、２％〜５％のオ
   サミンを含有し、そして約350000ダルトンの分子
   量を有する肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）
   から抽出された水溶性の免疫刺激性糖たん白質よ
   りなることを特徴とする免疫刺激剤。