JPH0145018B2

JPH0145018B2 -

Info

Publication number: JPH0145018B2
Application number: JP58048674A
Authority: JP
Inventors: Mikio Yamashita; Takuzo Sato; Yoshio Noguchi; Yoshinobu Uchibori; Akio Shinohara; Hiroshi Soga; Sadayuki Myazaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Showa Denko KK
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Resonac Holdings Corp
Priority date: 1983-03-25
Filing date: 1983-03-25
Publication date: 1989-10-02
Also published as: JPS59174742A; US4778593A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は細胞、細胞内の高分子等の生体粒子又
は有機高分子等の微小粒子を識別（区分又は選
別）する方法および該方法を実施する装置に関す
る。更に詳しくは連続的に流動している懸濁液中
の微小粒子にレーザー光等の強光線のパルス光を
照射して螢光や燐光等の励起パルス光を発光せし
め、その強度の時間変化を迅速かつ自動的に測
定、分析して微小粒子の区分を検出し、微小粒子
を、更にその区分に応じて物理的に選別する方法
およびその装置に関する。

従来技術細胞学の分野においては、細胞の自動分析およ
び分別の要求が増大しつつある。現在、細胞材料
のスクリーニング、例えばガン細胞又は悪性細胞
の発見は主として２種またはそれ以上の方法によ
つてなされている。先ず最初に細胞サンプルは視
覚的にスクリーニングされて、異常細胞を含有し
ていると思われる細胞サンプルが捜し出される。

これらのサンプルは保管され細胞学技術者又は
病理学者等の専門家によつてその細胞が真にガン
細胞であるか否かの判断を下す。このような方法
は現在のところ適切に行なわれてはいるが、多く
の欠点を有している。すなわち手間がかかり、非
常な熟練を要するために高価なものとなり更に異
常性の判断の基準は大部分主観的なものであるた
め定量的でない。又、時間と費用のために、この
方法を莫大な数のサンプルに対して適用すること
は困難である。

流動システム分析法は、生体微小粒子の分析の
場合、フローサイトメトリ（Flow Cytometry）
と称されるが、この流動システム分析法と称され
る方法は、以上の欠点を幾分でも克服することの
できる可能性をもつている方法である。フローサ
イトメトリーは、細胞懸濁液から光学的、電気的
信号を検出し、細胞の性質、構造を解明する方法
である。これに基づくフローサイトメーター
（Flow Cytometer）は、小さな検出容量内を高
速で流れる細胞懸濁液に光を照射し、細胞からの
光学信号や電気信号を検出し解析する装置であ
る。これによれば多数の細胞を短時間に観察して
正常細胞と異常細胞を識別することができ、従つ
て自動的な細胞のスクリーニングを迅速に行なう
ことができる可能性がある。

照射光としては連続のレーザ光が用いられ、細
胞を観察するために使用されるパラメーターは、
例えば細胞の大きさのみのように単一のものでは
不十分であることが知られており、今日ではこの
外、細胞の光吸収・螢光・光散乱あるいはそれら
の組合せがパラメーターとして用いられるように
なつてきている。ここに、パラメーターが例えば
細胞の大きさであるというのは、正常細胞と異常
細胞とで細胞の大きさが異なる場合に、細胞の大
きさを観察して、正常のものと異常のものとを識
別することをいう。細胞の大きさの比較だけでは
正常のものと異常のものとが識別できないような
種類の細胞の場合には、他の識別できるようなパ
ラメーターが使用されるわけである。しかして、
多くのパラメーターを使用することによつてスク
リーニングの精度が上ることとなる。

更に、細胞からの光学信号、電気信号を検出、
区分するにとどまらず、信号解析により細胞のグ
ループ分け、例えば正常細胞のグループと異常細
胞のグループへのグループの分け、のできるよう
に振り分ける機能をもつ装置もセルソーター
（Cell Sortor）と呼ばれ実用化されている。

以上のフローサイトメトリーおよびセルソータ
ーについては、例えば電子技術総合研究所彙報第
44巻第３号（1980年）に野口によつて報告され、
セルソーターについては特公昭46−27118号、特
公昭56−13266号公報（特開昭48−74292号公報）
にも記載されている。

フローサイトメーターを用いる流動システム分
析法は、顕微鏡下又は試料セルにおける細胞分析
とは異なり細胞を流しながら、特定の性質をもつ
細胞を、短時間に、大量に識別でき、従つて統計
的処理が可能にした点ですぐれている。しかし、
また細胞の形態に関する情報、分子生物学的情報
又は分子化学的情報等の細胞の異常に直接結びつ
きうる高価値の情報によつて識別するようなパラ
メーターはなかつた。このような高価値の情報
は、細胞の異常の原因に直接係るものであるた
め、パラメーターの増加に基づくスクリーニング
の精度向上による臨床的有用性が増すだけでな
く、基礎医学への有用性が生れることとなる。

本発明者は、流動システム分析法本来の優れた
機能に前記高価値の情報によつて微小粒子を識別
できるような新たなパラメーターを付加すること
について探究を行つた。

他方、レーザの技術分野において、今日短パル
ス列可同調レーザの技術が確立しつつある。近年
色素溶液をレーザの媒質とする色素レーザ等の出
現によつて、紫外から赤外におよぶ広い範囲にわ
たり任意の波長に同調可能なレーザ光が得られる
ようになり、更にこの可同調レーザによつて非常
に短かい時間軸のパルス光が得られるようになつ
た。

このような短パルス光を得る方法としてモード
同期法がある。モード同期を達成させるには種々
の方法があるが最も広く容易に用いられている方
法は、シンクロナスモード同期法である。この方
法では色素レーザを励起する励起光源として例え
ばモード同期アルゴンイオンレーザの短パルス光
を用い、そのパルス列の周期に対応して色素レー
ザの共振器長を設定することによつて色素レーザ
の利得を周期的に変調して超短パルス列光を発生
させる方法である。

このモード同期法を用いることによりパルス幅
τが数ナノ秒（10^-9秒）から数ピコ秒（10^-12秒）
のオーダーの高出力、単色性、指向性の可同調短
パルス列レーザ光を得ることができる。その周期
はキヤビテイダンプ法によつて数ミリ秒乃至数ナ
ノ秒の範囲で可変にできる。

これらのレーザ光はレーザ共振器内に用いられ
ている光学素子がブリユースター角で設定されて
いるためにおよび励起レーザ光が直線偏光である
ために出力も直線偏光であるのが一般的である。

このような高速で変化する光を物質に照射して
物質を発光させる場合、その発光の時間変化も相
当に高速であるから、その発光の時記変化の観測
側も高度の時間精度をもたなければならない。

その変化時間領域がサブナノ秒より長い場合に
は、被測定光の時間変化をフオトダイオードや光
電子増倍管等の光電検出器で受けて電気的な信号
に変換して、その電気パルス信号を必要に応じ信
号処理、例えばオツシロスコープに入力してブラ
ウン管上に描かせる方法又はフオトンカウンテイ
ング法のような処理等を行うことができる。

しかしピコ秒又はサブピコ秒の超高速時間領域
のパルス光の測定では、これらの光電検出器では
その応答速度または感度の点で問題となるので流
しどりカメラ（ストリークカメラ）が用いられ
る。なかでも微弱で繰返しかつ超高速の発光の時
間変化を測定するにはシンクロスキヤンストリー
クカメラ法が適当である。ストリークカメラは、
被測定法の受光面からの光電子を加速、偏向する
ことにより、時間変化が電子の結像螢光面上の空
間位置の変化となるようにした装置である。

前述の短パルス列レーザー励起による過渡的な
発光強度の時間変化の測定がヘモグロビンの錯体
等の光化学反応物質でなされ、更に生体高分子へ
の適用が提案され、その局所構造の解析に有用で
あることが期待されているが、まだその有用性を
チエツクするための試料セル中の基礎研究にとど
まつている。

本発明者は、流動システム分析にこれを組込
み、いわゆるオンラインで生体粒子又は有機高分
子粒子等の微小粒子の分子レベルの局所構造にま
でたちかえつてその違いによつて微小粒子の識別
すなわち、微小粒子の区分の検出を行うかまたは
その区分に応じて微小粒子の選別を行う可能性に
ついて探究を行つた。

発明の目的本発明の目的は、照射用強光線として強パルス
光を用い、かつシンクロスキヤン形のストリーク
カメラを用い、発光強度の時間的変化を測定する
という構想にもとづき、微小粒子の発光による識
別を高価値の識別情報により、大量のサンプルに
つき迅速に高精度に行うことのできる方法および
装置を実現することにある。

発明の構成本発明においては、微小粒子を区分、選別する方法であつて、該方
法が、微小粒子の懸濁液から実質的に該微小粒子を１
個ずつ間隔をもたせて含む粒子流を生成させる過
程、該生成された粒子流に、光源から光パルスの数
の制御用のキヤビテイダンパーを通して指向され
る強度の大なる光パルスを照射する過程、該照射された粒子からの発光の強度をシンクロ
スキヤンのストリークカメラにより検出する過
程、該照射された粒子の発光の強度により該粒子流
内の微小粒子を識別する過程、および、該微小粒子の照射された粒子流を一連の液滴に
変化させる過程、を具備し、該識別が、該照射された微小粒子からの発光の
強度のシンクロスキヤンのストリークカメラによ
る検出結果を用いて、発光の立上り時間、発光さ
れた光の減衰時間、および配向緩和時間の少なく
とも１つによりあらわされる該発光の強度の経時
変化の特性にもとづいて行われるようになつてい
る、ことを特徴とする微小粒子を区分、選別する方
法、が提供される。

また本発明においては、微小粒子を区分、選別
する装置であつて、該装置が、流動チヤンバー、微小粒子の懸濁液を該流動チヤンバーに送り込
み、実質的に該微小粒子を１個ずつ間隔をもたせ
て含む粒子流を生成させ、そして該生成された粒
子流を一連の液滴に変化させる手段、強度の大なる光パルスを発生させる手段、該生成された粒子流を該強度の大なる光パルス
で照射する手段であつて、該粒子流に照射される
光パルスの数を制御するため該光パルスの経路内
に配置されたキヤビテイダンパーを含有するも
の、該照射された微小粒子からの発光を検出するシ
ンクロスキヤンのストリークカメラ、および、該発光検出用のシンクロスキヤンのストリーク
カメラによる検出にもとづき、発光の立上り時
間、発光された光の減衰時間、および配向緩和時
間の少なくとも１つによりあらわされる該発光の
強度の経時変化の特性を演算する手段、を具備す
ることを特徴とする微小粒子を区分、選別する装
置、が提供される。

本発明による方法においては、前記の従来の流
動システム分析の技術、可同調短パルス光の技術
および高速光現象の測定技術を新たな高速実時間
データ処理技術によつて結合し、微小粒子の識別
すなわち、微小粒子の区分の検出又はその区分に
応じての粒子の選別を行う。

本発明による方法においては、微小粒子そのも
の又は、色素を結合した微小粒子の懸濁液を細流
とし、その後更に細流をノズルから噴出させて噴
出流としてから液滴となし、その細流又は噴出流
に微小粒子の吸収帯に同調した強いパルス光を照
射し、それによつて発生する螢光等の光を受光し
て、予め選択された種類の発光の強度の時間変化
又はその組合せを高速下に検出し、かつ予め設定
された強度の時間変化に関する区分の値と比較
し、該区分の値との隔りの程度の区分に応じたパ
ルス波形に関する情報の電気信号を発生させ、一
方噴出流の液滴となる瞬間に荷電電極によつて帯
電され、次いで偏向板を通過して試料受器に採取
され、このとき、前記電気信号は、パルス光の照
射を受けた粒子が通過するときに荷電電極又は偏
向電場に送られ、前記区分に応じて帯電又は偏向
されて選別される。

本発明による方法においては、従来の流動シス
テム分析法および装置に比較して、照射光とし
て、強パルス光を用い、該パルス光の照射による
予め選択された種類の発光強度の時間変化又はそ
の組合せを測定することにより、微小粒子を識別
する。

本発明による方法および装置は下記の事実にそ
の基礎をおくものである。

まず、微小粒子内に発光成分を有する粒子、例
えば発光する生体構成物質などの粒子、そのもの
又は染色用色素を結合した微小粒子は、その微小
粒子に含まれる分子の吸収帯に同調した時間変化
する強い光即ちパルス光を受けて励起され、螢光
や燐光等の光を発し、失活する。

このパルス光励起により分子から発した光は、
その分子に固有な時間変化をみせる。即ち、受光
後発光がピークに達するまでの時間（立上り時
間）とピークに達した後の減衰して消光するまで
の時間（減衰時間）が各分子に固有であり、従つ
てそれを包含する微小粒子に固有である。

ここに各粒子に固有とは、例えば大部分の正常
な細胞のグループと、ガン細胞又は悪性細胞等の
異常な細胞のグループにそれぞれに固有であるこ
とを云い、従つて細胞に固有な時間変化を検知す
ることができれば、正常な細胞と異常なそれとを
区分することが可能である。

微小粒子に含まれる分子の吸収帯には、大略、
分子骨格、例えばDNA塩素の分子骨格、が光吸
収する吸収帯と、色素、例えばアクリジン染料等
の色素が光吸収する吸収帯があり、そのどちらの
吸収帯に同調するパルス光を照射するかによつて
得られる情報が異なつてくる。

第１図Ａ，Ｂは、光招射に対する。発光および
失活の状況を説明する図であり、縦軸にエネルギ
レベルをとる。実線矢印はレーザー光吸収、励起
（EX）を、屈曲状矢印は螢光（FL）を、破線矢
印はエネルギートランスフアー（TR）をそれぞ
れあらわす。

Ａは色素の吸収帯に同調するパルス光を照射し
た場合であり、色素の発光の減衰時間が、区分の
パラメーターとなり、Ｂは分子骨格の吸収帯に同
調するパルス光を照射した場合であり、分子骨格
自身からの発光の減衰時間と、色素からの発光の
立上り時間がパラメーターとなる。

発光の減衰時間が区分のパラメーターになりう
るのは励起された色素自身の失活過程が分子自身
の分子内又は色素へのエネルギー移動による失活
過程が分子内の相互作用の違いにより異なるから
であり、発光の立上り時間がパラメーターとなり
うるのは、分子骨格と色素との結合状態、例えば
結合距離がものにより異なり、従つて受光した分
子骨格から発光する色素へのエネルギー移動が異
なつてくるからである。

前者の場合、例えば、細胞のDNA塩基間にア
クリジンオレンジ等の螢光色素を挿入すると、一
般にがん細胞等の異常細胞は螢光色素の取り込み
が正常細胞に比べて多く、これにアルゴンイオン
レーザのパルス光を照射すると、螢光の減衰時間
が大きくなることが認められる。

後者の場合、分子骨格を含む微小粒子におい
て、その分子骨格自身に立体構造等の差があつ
て、例えば同種の細胞のうち異常細胞が正常細胞
よりも色素と弱い結合しか持ちえない場合には、
細胞自身が吸収する波長のパルス光を照射したと
き、異常細胞と正常細胞とでは、立上り時間に差
があるはずである。

更に照射するパルス光が直線偏光である場合に
は、光の電気ベクトルの方向に遷移モーメントを
もつた分子が選択的に励起される。この分子は熱
運動によつて回転し、励起直後の異方性を失い、
等方的になつていく。この配向緩和の様子は励起
分子からの螢光等の偏光の時間変化を観測するこ
とによつて知ることができる。

この配向緩和に要する時間（配向緩和時間）も
各分子に固有であり、分子の大きさ、それを取り
囲む溶媒や他分子との相互作用の程度により異な
り、螢光等のパルスの配向緩和を測定することが
できれば粒子の区分が可能となる。この場合に
は、分子骨格又は色素のいずれに同調するパルス
光を照射しても、配向緩和時間が粒子区分のパラ
メーターとなりうる。例えば細胞膜は異方性に敏
感であるため、細胞膜に関する細胞の区分にこの
パラメーターは有効である。

なお励起パルス光の偏光角に対し、並行方向
（0゜）と直角方向（90゜）に生ずるそれぞれの発光
強度を（０）、Ｉ（90）とすると、発光偏光度Ｐ
はＰ＝Ｉ（０）−Ｉ（90）／Ｉ（０）＋Ｉ（90）、異方
性ＡはＡ＝Ｉ（０）−Ｉ（90）／Ｉ（０）＋2I（90）で定義される
。これらの時間変化を粒子区分のパラメーターとすることができ
る。

実施例本発明の方法および装置を、正常細胞と異常細
胞を識別（区分又は選別）することを一態様とし
て、以下に更に詳しく説明する。

第２図は、本発明の実施例としての微小粒子の
識別（区分又は選別）を行う装置の全体的な構成
を示す図である。第３図および第４図は第２図装
置における流動チヤンバーの構造の例を示す図で
ある。

細胞サンプルは必要ならばまず適切な螢光色素
により染色される。適切な色素とは、細胞と結合
してパルス光の吸収帯をもつような、そして好し
くは異常細胞の異常部位に選択的に結合するよう
なものである。例えばフオイルゲン染料やアクリ
ジン染料などが用いられる。またモノクローナル
抗体と称し、特定細胞の特定部位にしかつかない
抗体を細胞につけ、その抗体に色素を吸着させる
ようなことも選択的な結合に有用である。

そして細胞サンプル又は適切な螢光色素により
染色された細胞サンプルは生理食塩水の如き液に
懸濁させ水性懸濁液とし、過して大きなくずや
かたまりを除去して試料容器２に入れられる。試
料容器から懸濁液は、加圧されて、管５を通じて
流動チヤンバー６に送られる。加圧の手段の一例
は第２図の管３２に示されるような空気等の気体
による加圧である。又他の例は脈動のない又は脈
動の消去されたポンプ加圧である。流動チヤンバ
ー６に送られた懸濁液は、そのチヤンバー内で細
流となる。細流は、流動チヤンバー内で、細流中
の細胞が装置の中心軸にくるようにするため、又
細胞の区分又は選択が可能な間隔をとるために包
囲鞘としての役割をするシース液６３、例えば生
理食塩水に同心円的に包囲されて流動チヤンバー
６の出口ノズル６２から噴出流として噴出され
る。

シース液は、容器１から加圧され管４を通つて
流動チヤンバー内の出口ノズルを同軸的に包囲す
るシース管に送られる。シース液と懸濁液との圧
力調整は、細胞が実質的に１個ずつ出口ノズルを
通過できるようになされる。

流動チヤンバーの型式には、第３図の細流の段
階でパルス光の照射を受けるように光源の投射口
と観測口を有し、出口ノズルを有する液中測定型
のものがある。また第４図のように流動チヤンバ
ーは噴出流を調製するものであつて、出口ノズル
を出たあとの噴出流がパルス光の照射を受けるよ
うな空中測定型のものがある。本発明では、この
いずれの型でも適用できる。そしていずれにして
も液滴となり落下する。

流動チヤンバーの上部には流れ出てくる液体噴
出流を規則的に振動させることによつて均一な液
滴を生ぜしめるために機械的に接続された振動手
段６１、例えば圧電型結晶が設けられる。全ての
液滴に細胞を含むとは限らず、又ある液滴には複
数個の細胞を含むこともあるが、統計的には大部
分の細胞は、一つの液滴に一個に単離されること
が理想であるが、現実には、数個の液滴に細胞が
１個という風に若干希釈される。

これらの調節は細胞懸濁液とシース液の加圧の
程度と、圧電型結晶に印加される周波数と電圧、
通常では周波数40〜50kHz、電圧15Vを制御する
ことによつてなされる。

前述のように細流又は噴出流となつた細胞流
は、パルス光の照射を受ける。光源は、例えば、
モード同期によりパルス光となる機構を備えたア
ルゴン・イオンレーザ１０と波長変換およびパル
ス幅の極小化を行なう色素レーザ１１およびパル
ス数のコントロールを行なうキヤビテイダンパー
１２により構成される。

光源としてはいずれもパルス光を使用するが、
使用する光ビームとしては、アルゴンイオンレー
ザの発振波長、主として488nｍまたは514.5nｍが
強くその他紫外領域の波長、および、色素レーザ
より出てくる波長、例えば色素としてローダミン
6Gを用いた場合は600nｍ前後の波長、の両者を
使用する。これら両者の波長を用いると、ダブル
ビームの光源となり、細胞への最適励起波長の選
択が容易となる。

このパルス光のレーザビーム、例えばパルス幅
として50psec〜50nsecのレーザビームを、Ｓ／Ｎ
比を向上させるために、そのウエストポイントが
細胞流の部分にくるように集光して、細胞流にほ
ぼ直角に照射する。

照射光の細胞流をつきぬけた側に、照射光源に
向けたフオトダイオード１６２は、細胞が検出範
囲に入つた事を検知し、例えばストリークカメラ
２０のシヤツターを開閉するための信号を取り出
すために使用される。吸収光は通常パルス動作を
しているが、細胞がパルス光に入つてくると吸収
が起り信号に変化が起きるのでこれをシヤツター
開信号とする。

細胞がパルス光を横切らないときには、螢光は
発せられないのでストリークカメラ２０からはベ
ースノイズ以外の信号は出力されないが、このベ
ースノイズを消去するためにフオトダイオード１
６２の出力信号をストリークカメラ２０に入力し
て、細胞がパルス光をさえぎらないときには、、
ストリークカメラ２０の加速電圧を０とし、チヤ
ンネルプレートの操作電圧を０とするようなシヤ
ツター同期信号を発せしめる。シヤツターを開い
て加速電圧およびチヤンネルプレートが動作開始
した後シヤツターを閉じる信号は、例えばパルス
が100個通過してのち、又は、1μs経過後に発せら
れる。

パルス光と細胞流が交わる点に細胞が流れてく
ると、そこで細胞内の生体高分子又はそれに結合
した色素が励起され、パルス状の螢光が発せられ
る。この螢光の列は、細胞流とパルス光の照射方
向の双方にほぼ直交する方向にて、できるだけ広
角で集光レンズ１５３で集め、ストリークカメラ
２０および／または光電子増倍管やフオトダイオ
ード１６３，１６４に送られ、必要ならば、これ
らの検出手段の前には偏光板１７１〜１７４が置
かれる。

但し、第１図装置における流動チヤンバーが第
３図、第４図に例示したものでなく、細胞流が入
射光軸に平行して流れるタイプのもの、又は斜め
に入射されるタイプのものの場合には、螢光の検
知は、前記細胞流とパルス光の照射方向の双方に
直交する必要はなく入射光の影響を受けないよう
に螢光が検知されればよい。

光電子増倍管やフオトダイオードは、応答時定
数が遅いため、その時定数より短いパルス光は、
検知できない。逆にストリークカメラの時定数は
長くできない場合が多い。従つて、検知手段とし
て両者を選択使用すればよいこととなる。なお例
えば入射パルス光のパルス幅が0.02nsecでくり返
し間隔が250nsecとすると、細胞のパルス光を通
過する間に受けるパルスの数は、細胞流速による
が100〜1000個となる。

ストリークカメラ２０の動作が第５図を参照し
つつ説明される。発光パルスはまず光電面２０１
に入射して、その刻々の光の強さ（）に応じ、
光電子を放出する。その刻々の光電子は、加速電
極２０２で初速度を揃えて加速されてチヤンネル
プレート２０４に向う一方、電子ビームの進行方
向に垂直な、偏向電極２０３による偏向電場で上
下方向に偏向される。

この偏向電極２０３には、シンクロスキヤン方
式を用いて、ほぼ発光パルスに同期する高速掃引
電圧が印加されており、従つて遅れて発生する光
電子は例えばチヤンネルプレートの下方に入射す
ることとなり、その後電子増倍されて螢光面に射
突し、再び光に変換される。結局この螢光面に
は、時間を縦軸とし、螢光パルスの強度が輝度
（Ｌ）として表わされた像が与えられる。この光
像は、光電子ビームが螢光パルス毎に発生し、高
速掃引されるけれども、螢光面の残像効果のため
に、パルスの累積されたもの、すなわち、細胞毎
の像である。

この光像は、出力リレーレンズ、オプテイカル
フアイバー等２１を通して撮像管又はダイオード
アレイ等の受光素子２２に結像する。この結果、
受光素子を掃引してから得られる電気信号は、励
起発光パルスの強度の時間変化を示すものとな
る。

前記発光パルスに同期する偏向電極２０３の高
速掃引電圧は、同期源としては、照射パルス光の
一部をフオトダイオード１６１を受けた後の出力
として用い掃引同期回路によつて得られる。

第１図Ｂのようなパターンの発光の場合のよう
に分子骨格例えばDNAの分子骨格からの発光と、
色素からの発光の区別がつかないと解析の意義が
なくなる場合には、解析に必要なそれぞれの発光
波長に対応するバンドパスフイルターをストリー
クカメラ入射前に設ければよい。

配向緩和時間は次のようにしてストリークカメ
ラによつて検知される。即ち、発光パルスを0゜お
よび90゜の２つの偏光板１７１，１７２を通る光
路に分け、それぞれを各々のストリークカメラで
検知する方法や、偏光板を通した偏光角0゜および
90゜の２つの偏向螢光パルスをそれぞれ１台のス
トリークカメラの左半分および右半分に別けて入
光し、チヤンネルプレートの後の螢光面の左右に
別けてそれぞれ光像を描かせ、別々にそれぞれの
光像の電気信号を得る方法である。

前記したように、励起パルス光がレーザパルス
である場合にはパルス光も直線偏光であることが
一般的であるが、この場合、発光パルスについて
偏光の効果を除いて、発光の減衰時間を測定する
には、偏光角がマジツクアングルと呼ばれる
54.7゜に設定された偏光板を通して観測すればよ
い。

光電子増倍管やフオトダイオード１６３，１６
４を発光パルスの検知手段に使用する場合は、１
つの細胞について数多く発せられる螢光パルスの
１つを検知して、直接に、発光の立上り時間、減
衰時間や、配向緩和時間を検知することができ
る。高感度を得るために数個のパルスの平均値を
とつてもよい。

ストリークカメラ又は、光電子増倍管やフオト
ダイオードからの電気信号は、後記される時定数
計時回路によつて発光の立上り時間、減衰時間又
は配向緩和時間が演算される。

第１図装置における信号処理部７の構成が第６
図に示される。

時定数計時回路７００ａ，７００ｂの演算出力
である発光の立上り時間、減衰時間、配向緩和時
間はデータマルチプレクサ７１及びソーテイング
マルチプレクサ７２に送られる。

データマルチプレクサは、中央処理ユニツト
（CPU）７４の指令に基づき、各センサーの信号
を順次切換えてメモリ７３に書き込む。メモリ７
３に書き込まれた信号は、微小粒子の区分の表示
として、CPU７４の指令によりCRT等のデイス
プレイ８１上に測定値あるいはグラフ等のデータ
として表示し、また、印字装置にそれらのデータ
を印字し、ハードコピーを作成する。

一方、ソーテイングマルチプレクサ７２は、選
別（ソーテイング）すべき要素、例えば立上り時
間、減衰時間、配向緩和時間等の要素が設定され
ると、CPU７４からの指令により一つ又は複数
の要素の信号が選択され、一つ又は複数の上限あ
るいは下限比較器７５，７６に送られる。ここで
あらかじめ設定された値と測定値が比較され、所
定の範囲（例えば上限以下でかつ下限以上）にあ
るときは、荷電パルス発生回路８２は一定の遅延
時間、例えば500〜1000μs程度をもたせて偏向信
号を出力する。

このようにして１個の細胞の螢光の立上り時
間、減衰時間又は配向緩和時間が正常な細胞のも
つこれらの基準値（前記設定値）と比較され、そ
の基準値との隔りに応じて識別され偏向信号が、
細胞のソーテイングのために出力されることとな
る。

細胞流が液滴を形成する所に、細胞流をはさん
で荷電電極２３が設けられており、荷電電極に
は、前記偏向信号を受けて、パルス幅50〜200μs、
電圧±50〜300Vのパルスが荷電パルス発生回路
から印加されている。そして液滴が形成される瞬
間に液滴はその荷電パルスに応じて荷電される。
この荷電パルスは、前記のように細胞がパルス光
の照射を受けて、螢光等を検知され、比較演算さ
れたのち遅延されているので、その細胞が丁度荷
電電極を通過するときには、比較演算の結果とし
ての荷電を受けるようにされている。

次いで液滴は、液滴流をはさむ形で２〜５cmの
間隔で対向しておかれている２枚の偏向板２４の
間を通過する。偏向板には±1500〜2000Vの電圧
が加えられており、荷電された液滴は、静電気力
により偏向され偏向板の４〜５cm下方の細胞受器
２５に集められる。荷電されていない液滴はその
まま偏向されずに落下する。

なお偏向信号を荷電パルス発生回路に入力する
代りに、荷電電極では一定の荷電状態として、偏
向板の電場を駆動する回路に入力して、偏向電場
の強さを偏向信号に応じて変化させるようにして
もよい。

第１図装置における粒子流、照射するパルス
光、発生する発光パルス、ストリークカメラのシ
ヤツター用ゲート、ストリークカメラの掃引電
圧、液滴にかける荷電電場、相互間の時間的関係
が第７図の波形図を参照しつつ説明される。

第７図の(1)は微粒子がパルス光を横切るときを
Ｈレベル、そうでないときをＬレベルとして粒子
流の状態を示したものである。第７図の(2)は照射
するパルス光を示し、第７図の(3)は発生する発光
パルスを示している。第７図の(4)および(5)はそれ
ぞれストリークカメラのシヤツター用ゲートと、
ストリークカメラの掃引電圧を示し、第７図の(6)
は荷電電極にかける電圧を２つのレベルで示して
いる。第７図の(2)から(3)の間は、発光の立上り時
間だけ少し遅れ、ピークに達したあと、緩やかに
減衰する。

第７図の(5)の周期は、発光源からストリークカ
メラまで光の到達時間だけの遅れを生じるが、図
では無視した。第７図の(6)は、微小粒子がパルス
光の照射を受けてから、荷電電場に至る時間差だ
け遅れる。光の遅れを問題とする第７図の(2)〜(5)
の遅れに比べれば比較にならない程の遅れとなる
が、便宜上図では若干大きく画くことにとどめ
た。

第６図回路における時定数計時回路の構成が第
８図および第９図に示される。時定数計時回路が
発光パルスの立上り時間、又は減衰時間を演算す
る場合の時定数計時回路７００ａ，７００ｂは第
８図のように構成される。

第８図回路において、発光の立上り時間の測定
は、光像を変換した電気信号（偏光の無い、又は
所定の偏光角例えば54.7゜の電気信号）Ｓ（OPT）
をまず前置増幅し、スムージング等の前処理を行
なつたのち、第１比較器７０３により立上りの基
準レベルを定め、これを信号Ｓ（７０３）とする。
信号Ｓ（７０３）とする立上りの基準レベルは、
しきい値設定器により任意の値に設定Ｓ（７０２）
できるものとする。このしきい値は、発光信号の
無信号時からの変化点、光学系あるいはこの回路
に入る迄の電気系のノイズ等を勘案して決められ
る。

立上り時間の測定上信号がピーク値に到達した
時の信号が必要となるが、これには第２比較器７
０５により作成される信号Ｓ（７０５）を用いる。
即ち発光信号とそのピークホールド回路の信号を
第２比較器で比較し、発光信号の方が小さくなる
ときのピーク点の信号を得る。このＳ（７０３）、
Ｓ（７０５）の２つの信号発生時点の時間差を立
上り時間計時回路にて計測する事により発光の立
上り時間を測定できる。

発光の減衰時間の測定は、まず第２比較器７０
５により前記ピーク点となるべき時間をとられ
る。それには発光信号とピークホールド回路を通
つた信号を比較すれば発光信号の方が小さくなつ
た所で第２比較器７０５の出力が逆転するので、
これを信号Ｓ（７０５）として時間測定回路の時
間計測開始の信号として使用する。

減衰時間とは、通常、信号ピーク値からの値が
１／ｅ（36.8％）になるまでの時間を採用すれば
よいがこの１／ｅ又はその他の値を減衰比設定器
に設定し、これと発光信号を第３比較器７０８に
入れ、大きさの逆転する時出力信号Ｓ（７０８）
が得られる。減衰時間の測定は、この信号Ｓ（７
０５），Ｓ（７０８）を用い、減衰時間測定回路に
より計測される。STTは計時開始を、STPは計
時停止を、それぞれあらわす。

立下り時間計時回路の計時終了信号COMPLに
より、ピークホールド回路および２つの計時回路
をリセツトRSTする。このようにして第８図回
路により立上り時間計時信号Ｓ（７０７）、立下り
時間計時信号Ｓ（７０９）が得られる。

時定数計時回路が配向緩和時間を演算する場合
の時定数計時回路は、第９図のように構成され
る。第９図回路において、光像検出器よりの偏光
角0゜および90゜の電気信号Ｓ（OPT）を前置増幅を
行なつたのち、前記偏光を示す換算値、例えば発
光偏光度を演算させる。その回路よりの出力を前
記減衰時間計時と同様に処理するものである。こ
のようにして第９図回路により配向緩和時間計時
信号Ｓ（７１６）が得られる。

第６図回路における時定数計時回路の各個とし
ては、第８図回路、第９図回路の両者を用いるこ
とができる。また、状況に応じて、第８図回路、
第９図回路の一方のみを用いることができる。ま
た、第８図回路が用いられる場合においては、信
号Ｓ（７０７），信号Ｓ（７０９）の一方を省略す
ることが可能である。

第２図装置においては、微小粒子の区分、選別
のパラメーターは、微小粒子の分子レベルの局所
構造の違いに基づくものである。具体的には、生
体微小粒子について言えば、分子生物学的又は分
子化学的な細胞レベル、染色体レベル更には生体
分子レベルにまでたちかえつたものである。更に
具体的には、まず第１に各構成分子、部位の接近
度、例えば核酸−塩基ペアの距離、染色用色素分
子−分子骨格の距離等であり、第２に核酸、タン
パク質などの粒子の大きさや型であり、第３に分
子の構造に関し、例えば２重らせんのピツチ、分
子の内部振動、ブラウン運転、鎖のベンデイン
グ、分子の局部的な回転運動等の情報である。

第４に光化学反応を含む生化学反応の過渡中間
生成物の検出であり、第５に細胞の領域の情報で
あつて、例えば、細胞膜とタンパク質との結合状
態や膜の厚さである。第６に細胞の融合状態、表
面レクチオンリセプターの分布、クロメーシヨン
接近などの生体微小粒子のその他の性質に関する
情報である。

これらは、生体微小粒子の異常因子に直接係わ
る高価値の情報である。第２図装置においては、
これらの高価値の情報によつて生体微小粒子を区
分、選別でき、しかもそれを大量のサンプルを短
時間でオンラインで行なうことが可能である。こ
のことは、第２図装置の医学分野における臨床的
有用性と、その基礎医学への有用性を意味し、ま
たその他の微小粒子の区分、選別への有用性をも
意味する。

本発明の実施にあたつては、前述の実施例のほ
か、種々の変形形態をとることが可能である。ま
た、本発明の方法および装置には、前記特公昭56
−13266号公報に記載されたようなコウルターオ
リフイスを使用する容量検知システムやパルス光
照射による粒子からのパルス状の螢光や散乱光を
連続光としてならしてその強弱を検知し、それら
を粒子の区分、選別のパラメーターとすること、
即ち、従来の流動システム分析の手法を併用する
ことは勿論可能である。

発明の効果本発明によれば、照射用強光線として強パルス
が用いられ、シンクロスキヤン形のストリークカ
メラによる検出が行われ、微小粒子の発光による
識別を高価値の識別情報により、大量のサンプル
につき迅速に高精度に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、光照射に対する粒子の発光および失
活の状況を説明する図、第２図は、本発明の一実
施例としての微小粒子の識別（区分又は選別）を
行う装置の全体的な構成を示す図、第３図および
第４図は流動チヤンバーの構造例を示す図、第５
図はストリークカメラの動作を説明する図、第６
図は第１図装置における信号処理部の構成を示す
図、第７図は、第１図装置における各部の信号の
時間的関係を示す波形図、第８図および第９図
は、第６図回路における時定数計時回路の構成を
示す図である。１……シース液容器、２……試料容器、４，５
……管、６……流動チヤンバー、７……信号処理
部、１０……アルゴンイオンレーザ、１１……色
素レーザ、１２……キヤビテイダンパー、１８…
…スリツト、２０……ストリークカメラ、２３…
…荷電電極、２４……偏向板、２５……細胞受
器、３２……管、６１……振動手段、６２……出
口ノズル、６３……シース液、８１……デイスプ
レイ部、８２……荷電パルス発生部、８３……掃
引同期回路、８４……シヤツター同期回路、１３
１〜１３６……ハーフミラー、１４１〜１４３…
…全反射ミラー、１５１〜１５８……レンズ、１
６１〜１６４……フオトダイオード、１７１〜１
７４……偏光板。

Claims

【特許請求の範囲】１微小粒子を区分、選別する方法であつて、該
方法が、微小粒子の懸濁液から実質的に該微小粒子を１
個ずつ間隔をもたせて含む粒子流を生成させる過
程、該生成された粒子流に、光源から光パルスの数
の制御用のキヤビテイダンパーを通して指向され
る強度の大なる光パルスを照射する過程、該照射された粒子からの発光の強度をシンクロ
スキヤン形のストリークカメラにより検出する過
程、該照射された粒子の発光の強度により該粒子流
内の微小粒子を識別する過程、および、該微小粒子の照射された粒子流を一連の液滴に
変化させる過程、を具備し、該識別が、該照射された微小粒子からの発光の
強度のシンクロスキヤン形のストリークカメラに
よる検出結果を用いて、発光の立上り時間、発光
された光の減衰時間、および配向緩和時間、の少
なくとも１つによりあらわされる該発光の強度の
経時変化の特性にもとづいて行われるようになつ
ている、ことを特徴とする微小粒子を区分、選別する方
法。２微小粒子を区分、選別する装置であつて、該
装置が、流動チヤンバー、微小粒子の懸濁液を該流動チヤンバーに送り込
み、実質的に該微小粒子を１個ずつ間隔をもたせ
て含む粒子流を生成させ、そして該生成された粒
子流を一連の液滴に変化させる手段、強度の大なる光パルスを発生させる手段、該生成された粒子流を該強度の大なる光パルス
で照射する手段であつて、該粒子流に照射される
光パルスの数を制御するため該光パルスの経路内
に配置されたキヤビテイダンパーを含有するも
の、該照射された微小粒子からの発光を検出するシ
ンクロスキヤン形のストリークカメラ、および、該発光検出用のシンクロスキヤン形のストリー
クカメラによる検出にもとづき、発光の立上り時
間、発光された光の減衰時間、および配向緩和時
間、の少なくとも１つによりあらわされる該発光
の強度の経時変化の特性を演算する手段、を具備
することを特徴とする微小粒子を区分、選別する装
置。