JPH0367224B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は細胞、細胞内の高分子等の生体粒子又
は有機高分子等の微小粒子を識別（区分又は選
別）する方法および該方法を実施する装置に関す
る。更に詳しくは連続的に流動している懸濁液中
の微小粒子にレーザー光等の強光線のパルス光を
照射してその粒子から螢光や燐光等を発光せし
め、流れる微小粒子からの発光を分光器で波長帯
に分光した後の光をシンクロスキヤン方式のスト
リークカメラで検出した結果での発光スペクトル
の時間的変化の特性に基づいて微小粒子流内の微
小粒子を識別する方法およびその装置に関する。

従来技術 細胞学の分野においては、細胞の自動分析およ
び分別の要求が増大しつつある。現在、細胞標本
のスクリーニング、例えばガン細胞又は悪性細胞
の発見は主として２種またはそれ以上の方法によ
つてなされている。先ず最初に細胞サンプルは視
覚的にスクリーニングされて、異常細胞を含有し
ていると思われる細胞サンプルが捜し出される。

これらの細胞サンプルは保管され細胞検査技師
又は病理学者等の専門家によつてその細胞が真に
ガン細胞であるか否かの判断を下す。このような
方法は現在のところ適切に行なわれてはいるが、
多くの欠点を有している。すなわち手間がかか
り、非常な熟練を要するために高価なものとなり
更に異常性の判断の基準は大部分主観的なもので
あるため定量的でない。又、時間と費用のため
に、この方法を莫大な数のサンプルに対して適用
することは困難である。

流動システム分析法は、生体微小粒子の分析の
場合、フローサイトメトリ（Flow Cytometry）
と称されるが、この流動システム分析法と称され
る方法は、以上の欠点を幾分でも克服することの
できる可能性をもつている方法である。フローサ
イトメトリーは、細胞懸濁液から光学的、電気的
信号を検出し、細胞の性質、構造を解明する方法
である。これに基づくフローサイトメーター
（Flow Cytometer）は、小さな検出容量内を高
速で流れる細胞懸濁液に光を照射し、細胞からの
光学信号や電気信号を検出し解析する装置であ
る。これによれば多数の細胞を短時間に観察して
正常細胞と異常細胞を識別することができ、従つ
て自動的な細胞のスクリーニングを迅速に行なう
ことができる可能性がある。

照射光としては連続のレーザ光が通常用いら
れ、細胞を観察するために使用されるパラメータ
ーは、例えば細胞の大きさのみのように単一のも
のでは不十分であることが知られており、今日で
はこの外、細胞の光吸収・螢光・光散乱あるいは
それらの組合せがパラメーターとして用いられる
ようになつてきている。ここに、パラメーターが
例えば細胞の大きさであるというのは、正常細胞
と異常細胞とで細胞の大きさが異なる場合に、細
胞の大きさを観察して、正常のものと異常のもの
とを識別することをいう。細胞の大きさの比較だ
けでは正常のものと異常のものとが識別できない
ような種類の細胞の場合には、他の識別できるよ
うなパラメーターが使用されるわけである。しか
して、多くのパラメーターを使用することによつ
てスクリーニングの精度が上ることとなる。

更に、細胞からの光学信号、電気信号を検出、
区分するにとどまらず、信号解析により細胞のグ
ループ分け、例えば正常細胞のグループと異常細
胞のグループへのグループ分け、のできるように
振り分ける機能をもつ装置もセルソーター（Cell
Sortor）と呼ばれ実用化されている。

以上のフローサイトメトリーおよびセルソータ
ーについては、例えば電子技術総合研究所彙報第
44巻第３号（1980年）に野口によつて報告され、
セルソーターについては特公昭46−27118号、特
公昭56−13266号公報にも記載されている。

フローサイトメーターを用いる流動システム分
析法は、顕微鏡下又は試料セルにおける細胞分析
とは異なり細胞を流しながら、特定の性質をもつ
細胞を、短時間に、大量に識別でき、従つて統計
的処理を可能にした点ですぐれている。しかし、
まだ細胞の形態に関する情報、分子生物学的情報
又は分子化学的情報等の細胞の異常に直接結びつ
きうる高価値の情報によつて識別するようなパラ
メーターはなかつた。このような高価値の情報
は、細胞の異常の原因に直接係るものであるた
め、パラメーターの増加に基づきスクリーニング
の精度向上による臨床的有用性が増すだけでな
く、基礎医学への有用性が生れることとなる。

本発明者は、流動システム分析法本来の優れた
機能に前記高価値の情報によつて微小粒子を識別
できるような新たなパラメーターを付加すること
について探究を行つた。

他方、レーザの技術分野において、今日短パル
ス列可同調レーザの技術が確立しつつある。近年
色素溶液をレーザの媒質とする色素レーザ等の出
現によつて、紫外から赤外におよぶ広い範囲にわ
たり任意の波長に同調可能なレーザ光が得られる
ようになり、更にこの可同調レーザによつて非常
に短かい時間軸のパルス光が得られるようになつ
た。

このような短パルス光を得る方法としてモード
同期法がある。モード同期を達成させるには種々
の方法があるが最も広く容易に用いられている方
法は、シンクロナスモード同期法である。この方
法では色素レーザを励起する励起光源として例え
ばモード同期アルゴンイオンレーザの短パルス光
を用い、そのパルス列の周期に対応して色素レー
ザの共振器長を設定することによつて色素レーザ
の利得を周期的に変調して超短パルス列光を発生
させる方法である。

このモード同期法を用いることによりパルス幅
τが数ナノ秒（10^-9秒）から数ピコ秒（10^-12秒）
のオーダーの高出力、単色性、指向性の可同調短
パルス列レーザ光を得ることができる。その周期
はキヤビテイダンプ法によつて数ミリ秒乃至数ナ
ノ秒の範囲で可変にできる。

これらのレーザ光はレーザ共振器内に用いられ
ている光学素子がブリユースター角で設定されて
いるためにおよび励起レーザ光が直線偏光である
ために出力も直線偏向であるのが一般的である。

このような高速で変化する光を物質に照射して
物質を発光させる場合、その発光の時間変化も相
当に高速であるから、その発光の時間変化の観測
側も高度の時間精度をもたなければならない。

その変化時間領域がサブナノ秒より長い場合に
は、被測定光の時間変化をフオトダイオードや光
電子増倍管等の光電検出器で受けて電気的な信号
に変換して、その電気パルス信号を必要に応じ信
号処理、例えばオツシロスコープに入力してブラ
ウン管上に描かせる方法がある。

しかしピコ秒又はサブピコ秒の超高速時間領域
のパルス光の測定では、これらの光電検出器では
その応答速度または感度の点で問題となるので流
しどりカメラ（ストリークカメラ）が用いられ
る。なかでも微弱で繰返しかつ超高速の発光の時
間変化を測定するにはシンクロナススキヤンスト
リークカメラ法が適当である。ストリークカメラ
は、被測定光の受光面からの光電子を加速、偏向
することにより、時間変化が電子の結像螢光面上
の空間位置の変化となるようにした装置である。

前述の短パルス列レーザー励起による過渡的な
発光強度の時間変化の測定がヘモグロビンの錯体
等の光化学反応物質でなされ、更に生体高分子へ
の適用が提案され、その局所構造の解析に有用で
あることが期待されているが、まだその有用性を
チエツクするための試料セル中の基礎研究にとど
まつている。

本発明者は、流動システム分析にこれを組込
み、いわゆるオンラインで生体粒子又は有機高分
子粒子等の微小粒子の分子レベルの局所構造にま
でたちかえつてその違いによつて微小粒子の識別
すなわち、微小粒子の区分の検出を行うかまたは
その区分に応じて微小粒子の選別を行う可能性に
ついて探究を行つた。

発明の目的 本発明の目的は、照射用強光線として強パルス
光を用い、パルス光の照射による特定波長毎の発
光強度の時間変化又は発光スペクトルの時間変化
を測定するという構想にもとづき、流れる微小粒
子からの発光を分光器で波長帯に分光した後の光
のシンクロスキヤン方式のストリークカメラで検
出した結果での発光スペクトルの時間的変化の特
性に基づき、微小粒子流内の微小粒子の識別を迅
速かつ高精度に行うことにある。

発明の構成 本発明においては、微小粒子を識別、選別する
方法であつて、該方法が、 微小粒子の懸濁液から実質的に該微小粒子を１
個づつ間隔を持たせて含む粒子流を生成させる過
程、 該生成された粒子流に、光源から光パルスの数
の制御用のキヤビテイーダンパーを通して、強度
の大なる光パルスを照射する過程、 該光パルスを照射された粒子からの発光を、分
光器で波長帯に分光し、分光後の光強度をシンク
ロスキヤン方式のストリークカメラで検出する過
程、および、 該検出過程後に選別された該微小粒子を含む液
滴を帯電し、高い電場中で該液滴を偏向させる過
程を具備し、 流れる該粒子からの発光を、分光器で波長帯に
分光し、分光した後の光をシンクロスキヤン方式
のストリークカメラで検出し、該検出結果での発
光スペクトルの時間的変化の特性に基づいて、該
粒子流内の微小粒子を識別、選別することを特徴
とする微小粒子を識別する方法、が提供される。

また本発明においては、微小粒子を識別、選別
する方法であつて、該装置が、 微小粒子の懸濁液から実質的に該微小粒子を１
個づつ間隔を持たせて含む粒子流を生成させる手
段、 該生成された粒子流に、光源から光パルスの数
の制御用のキヤビテイーダンパーを通して、強度
の大なる光パルスを照射する手段、 該光パルスを照射された粒子からの発光を、分
光器で波長帯に分光し、分光後の光強度をシンク
ロスキヤン方式のストリークカメラで検出する手
段、 該検出後に選別された該微小粒子を含む液滴を
帯電し、高い電場中で該液滴を偏向させる手段を
具備し、 流れる該粒子からの発光を、分光器で波長帯に
分光し、分光した後の光をシンクロスキヤン方式
のストリークカメラで検出し、該検出結果での発
光スペクトルの時間的変化の特性に基づいて、該
粒子流内の微小粒子を識別、選別することを特徴
とする微小粒子を識別する装置、が提供される。

本発明による方法および装置は下記の事実にそ
の基礎をおくものである。

まず、微小粒子内に発光成分を有する粒子、例
えば発光する生体構成物質などの粒子そのもの又
は染色用色素を結合した微小粒子は、その微小粒
子に含まれる分子の吸収帯に同調した強い光即ち
パルス光を受けて励起され、螢光や燐光等の光を
発し、失活する。

このパルス光励起により分子から発した特定波
長の光は、その分子又は分子同志の相互作用に固
有な強度の時間変化をみせる。また、特定波長を
逐次に連続的に選べば発光のスペクトルの時間変
化が各分子などに個有であり、従つてそれを包含
する微小粒子に固有である。

ここに各粒子に固有とは、例えば大部分の正常
な細胞のグループと、ガン細胞又は悪性細胞等の
異常な細胞のグループにそれぞれに固有であるこ
とを云い、従つて細胞に固有な特定波長の発光強
度の時間変化あるいは発光スペクトルの時間変化
を検知することができれば、正常な細胞と異常な
それとを区分することが可能である。

微小粒子に含まれる分子の吸収帯には、大略、
分子骨格、例えばDNA塩素の分子骨格、が光吸
収する吸収帯と、色素、例えばアクリジン染料等
の色素が光吸収する吸収帯があり、そのどちらの
吸収帯に同調するパルス光を照射するかによつて
得られる情報が異なつてくる。

第１図は、光照射に対する発光および失活につ
いての説明図であり、縦軸にエネルギレベル（E.
L.）をとる。実線矢印はレーザー光吸収、励起
（EX）を、屈曲状矢印は螢光（FL）を、破線矢
印はエネルギトランスフアー（TR）をそれぞれ
あらわす。(a)は分子骨格の吸収帯に同調するパル
ス光を照射した場合であつて、分子骨格自身と色
素からの両方から異種の光が発せられる。(b)は分
子骨格に対して、２つの色素が結合され、エネル
ギーのドナーとなる色素の吸収帯に同調するパル
ス光を照射した場合であつて、ドナー色素とアク
セプター色素とからなる異種の光が発せられる。
(c)は２つの色素（例えばドナー色素とアクセプタ
ー色素）が結合された分子骨格の吸収帯に同調す
るパルス光を照射した場合であつて、分子骨格自
身と、２つの色素から異種の光が発せられる。

以上の発光は、パルス光であるが、これらを微
小粒子の識別のパラメーターとするためには、こ
れら発光を分光して、粒子を特徴づける特定波長
について、発光の立上り時間、減衰時間あるいは
発光スペクトルの時間変化を測定することとな
る。

更に照射するパルス光が直線偏向である場合に
は、光の電気ベクトルの方向に遷移モーメントを
もつた分子が選択的に励起される。この分子は熱
運動によつて回転し、励起直後の異方性を失い、
等方的になつていく。この配向緩和の様子は、励
起分子からの螢光等の発光の特定波長毎の偏光の
時間変化あるいは特定波長を逐次に連続的に選ん
だときの偏光のスペクトルの時間変化を観測する
こととなり、これらの時間変化（以下配向緩和時
間という）は各分子に個有であり、分子の大き
さ、それを取り囲む溶媒や他分子との相互作用の
程度により異なり、配向緩和時間を測定すること
ができれば粒子の識別が可能となる。この場合の
１例を掲げると、細胞膜は異方性に敏感であるた
め、細胞膜に関する細胞の識別にこのパラメータ
ーは有効である。

なお励起パルス光の偏光角に対し、並行方向
（0゜）と直角方向（90゜）に生ずるそれぞれの発光
強度をＩ（０）、Ｉ（90）とする各波長毎の発光偏
光度Ｐは Ｐ＝Ｉ（０）−Ｉ（90）／Ｉ（０）＋Ｉ（90）、 異方性ＡはＡ＝Ｉ（０）−Ｉ（90）／Ｉ（０）＋2I（
90） で定義される。これらの時間変化を粒子区分のパ
ラメーターとすることができる。

実施例 本発明の方法および装置を、正常細胞と異常細
胞を識別（区分又は選別）することを一態様とし
て、以下に更に詳しく説明する。

第２図は、本発明の一実施例としての微小粒子
の識別（区分又は選別）を行う装置の全体的な構
成を示す図である。第３図および第４図は第２図
装置における流動チヤンバーの構造の例を示す図
である。

細胞サンプルは必要ならばまず適切な螢光色素
により染色される。適切な色素とは、細胞と結合
してパルス光の吸収帯をもつような、そして好ま
しくは異常細胞の異常部位に選択的に結合するよ
うなものである。例えばフオイルゲン染料やアク
リジン染料などが用いられる。またモノクローナ
ル抗体と称し、特定細胞の特定部位にしかつかな
い抗体を細胞につけ、その抗体に色素を吸着させ
るようなことも選択的な結合に有用である。

そして細胞サンプル又は適切な螢光色素により
染色された細胞サンプルは生理食塩水の如き液に
懸濁させ水性懸濁液とし、過して大きなくずや
かたまりを除去して試料容器２に入れられる。試
料容器から懸濁液は、加圧されて、管５を通じて
流動チヤンバー６に送られる。加圧の手段の一例
は第２図の管３２に示されるような空気等の気体
による加圧である。又他の例は脈動のない又は脈
動の消去されたポンプ加圧である。流動チヤンバ
ー６に送られた懸濁液は、そのチヤンバー内で細
流となる。細流は、流動チヤンバー内で、細流中
の細胞が装置の中心軸にくるようにするため、又
細胞の区分又は選別が可能ら間隔をとるために包
囲鞘としての役割をするシース液６３、例えば生
理食塩水に同心円的に包囲されて流動チヤンバー
６の出口ノズル６２から注入される。

シース液は、容器１から加圧され管４を通つて
流動チヤンバー内の出口ノズルを同軸的に包囲す
るシース管に送られる。シース液と懸濁液との圧
力調整は、細胞が実質的に１個ずつ出口ノズルを
通過できるようになされる。

流動チヤンバーの型式には、第３図の細流の段
階でパルス光の照射を受けるように光源の投射口
と観測口を有し、出口ノズルを有する液中測定型
のものがある。また第４図のように流動チヤンバ
ーは噴出流を形成するものであつて、流動チヤン
バーから噴出された噴出流がパルス光の照射を受
けるような空中測定型のものがある。本発明で
は、このいずれの型でも適用できる。そしていず
れにしても液滴となり落下する。

流動チヤンバーの上部には流れ出てくる液体噴
出流を規則的に振動させることによつて均一な液
滴を生ぜしめるために機械的に接続された振動手
段６１、例えば圧電型結晶が設けられる。全ての
液滴に細胞を含むとは限らず、又ある液滴には複
数個の細胞を含むこともあるが、統計的には大部
分の細胞は、１つの液滴に１個に単離されること
が理想的であるが、現実には、数個の液滴に細胞
が１個という風に若干希釈される。

これらの調節は細胞懸濁液とシース液の加圧の
程度と、圧電型結晶に印加される周波数と電圧、
通常では周波数40〜50kHz、電圧15Vを制御する
ことによつてなされる。

前述のように細流又は噴出流となつた細胞流
は、パルス光の照射を受ける。光源は、例えば、
モード同期によりパルス光となる機構を備えたア
ルゴン・イオンレーザ１０と波長可変およびパル
ス幅の極小化を行なう色素レーザ１１およびパル
ス列周期のコントロールを行なうキヤビテイーダ
ンパー１２により構成される。

光源としてはいずれもパルス光を使用するが、
使用する光ビームとしては、アルゴンイオンレー
ザの発振波長、主として488nmまたは514.5nmが
強くその他紫外領域の波長、および、色素レーザ
より出てくる波長、例えば色素としてローダミン
6Gを用いた場合は600nm前後の波長、の両者を
使用する。これら両者の波長を用いると、ダブル
ビームの光源となり、細胞への最適励起波長の選
択が容易となる。

このパルス光のレーザビーム、例えばパルス幅
として10psec〜10nsecのレーザビームを、Ｓ／Ｎ
比を向上させるために、そのウエストポイントが
細胞流の部分にくるように集光して、細胞流にほ
ぼ直角に照射する。

照射光の細胞流をつきぬけた側に、照射光源に
向けたフオトダイオード１６２は、細胞が検出範
囲に入つた事を検知し、例えばストリークカメラ
２０のシヤツターを開閉するための信号を取り出
すために使用される。フオトダイオード１６２へ
の入射光は通常パルス動作をしているが、細胞が
パルス光に入つてくると吸収が起り信号に変化が
起きるのでこれをシヤツター開信号とする。

細胞がパルス光で横切らないときには、螢光は
発せられないのでストリークカメラ２０からはベ
ースノイズ以外の信号は出力されないが、このベ
ースノイズを消去するためにフオトダイオード１
６２の出力信号をストリークカメラ２０に入力し
て、細胞がパルス光をさえぎらないときには、ス
トリークカメラ２０の加速電圧を０とし、チヤン
ネルプレートの操作電圧を０とするようなシヤツ
ター同期信号を発せしめる。シヤツターを開いて
加速電圧およびチヤンネルプレートが動作開始し
た後シヤツターを閉じる信号は、例えばパルスが
100個通過してのち、又は、1μs経過後に発せられ
る。

パルス光と細胞流が交わる点に細胞が流れてく
ると、そこで細胞内の生体高分子又はそれに結合
した色素が励起され、パルス状の螢光が発せられ
る。この螢光の列は、細胞流とパルス光の照射方
向の双方にほぼ直交する方向にて、できるだけ広
角で集光レンズ１５３で集め、分光器１９又は特
定波長のバンドパスフイルター１７３，１７４等
の分光手段を介してストリークカメラ２０およ
び／または光電子増倍管やフオトダイオード１６
３，１６４に送られ、必要ならば、これらの検知
手段の前には偏光板（図示せず）が置かれる。

但し、第１図装置における流動チヤンバーが第
３図、第４図に例示したものでなく、細胞流が入
射光軸に平行して流れるタイプのもの、又は斜め
に入射されるタイプのものの場合には、螢光の検
知は、前記細胞流とパルス光の照射方向の双方に
直交する必要はなく入射光の影響を受けないよう
に螢光が検知されればよい。

光電子増倍管やフオトダイオードは、応答時定
数が大きいため、その時定数より短いパルス光
は、検知できない。逆にストリークカメラの時定
数は長くできない場合がある。従つて、検知手段
として両者を選択使用すればよいこととなる。な
お例えば入射パルス光のパルス幅が0.1nsecでく
り返し間隔が10nsecとすると、細胞がパルス光を
通過する間に受けるパルスの数は、細胞流速によ
るが100〜1000個となる。

ストリークカメラ２０の動作が第５図を参照し
つつ説明される。第５図には、分光器１９を通つ
た光がストリークカメラ２０で時間・位置変換を
受け、２次元ストリーク像として結像する様子が
示される。発光パルスはまず光電面２０１に入射
して、その刻々の光の強さ（Ｉ）に応じ、光電子
を放出する。入射光の横軸が波長となる。刻々の
光電子は、加速電極２０２で初速度を揃えて加速
されてチヤンネルプレート２０４に向う一方、電
子ビームの進行方向に垂直な、偏向電極２０３に
よる偏向電場で上下方向に偏向される。

この偏向電極２０３には、シンクロスキヤン方
式を用いて、ほぼ発光パルスに同期する高速掃引
電圧が印加されており、従つて遅れて発生する光
電子は例えばチヤンネルプレートの下方に入射す
ることとなり、その後電子増倍されて螢光面に衝
突し、再び光に変換される。結局この螢光面に
は、時間ｔを縦軸とし、波長λを横軸として螢光
パルスの強度が輝度（Ｌ）として表わされた像が
与えられる。分光器１９で光は横方向、すなわち
波長方向に広がり、ストリークカメラ２０でそれ
ぞれの波長帯での光強度の時間的変化が縦方向、
すなわち位置的変化に変換され、光強度の２次元
濃淡像になる。この光像は、光電子ビームが螢光
パルス毎に発生し、高速掃引されるけれども、螢
光面の残像効果のために、パルスの累積されたも
の、すなわち、細胞毎の像である。

この光像は、出力リレーレンズ、オプテイカル
フアイバー等２１を通して撮像管又はダイオード
アレイ等の受光素子２２に結像する。この結果、
受光素子を掃引して得られる電気信号は、励起発
光パルスの強度の時間変化又は発光スペクトルの
時間変化を示すものとなる。

前記発光パルスに同期する偏向電極２０３の高
速掃引電圧は、同期源としては、照射パルス光の
一部をフオトダイオード１６１で受けたときの出
力を用いた掃引同期回路によつて得られる。

配向緩和時間は次のようにしてストリークカメ
ラによつて検知できる。即ち、発光パルスを0゜お
よび90゜の２つの偏光板を通る光路に分け、ある
特定波長のそれぞれを各々のストリークカメラで
検知する方法や、偏光板を通した偏光角0゜および
90゜の２つの偏光螢光パルスをある特定波長のそ
れぞれを１台のストリークカメラの左半分および
右半分に別けて入光し、チヤンネルプレートの後
の螢光面の左右に別けてそれぞれの光像を描か
せ、別々にそれぞれの光像の電気信号を得る方法
である。

前記したように、励起パルス光がレーザパルス
である場合には、パルス光が直線偏光であること
が一般的であるが、この場合、発光パルスについ
て偏光の効果を除いて、発光の減衰時間を測定す
るには、偏光角がマジツクアングルと呼ばれる
54.7゜に設定された偏光板を通して観測すればよ
い。

光電子増倍管やフオトダイオードアレイ１６
３，１６４を発光パルスの検知手段に使用する場
合は、１つの細胞について数多く発せられる螢光
パルスの１つを検知して、直接に、発光の立上り
時間、減衰時間や、配向緩和時間を検知すること
ができる。高感度を得るために数個のパルスの平
均値をとつてもよい。

ストリークカメラ又は、光電子増倍管やフオト
ダイオードからの電気信号は、後記される時定数
計時回路によつて特定波長の発光の立上り時間、
減衰時間、配向緩和時間又は発光スペクトルの時
間変化が演算される。

第２図装置における信号処理部７の構成が第６
図に示される。

時定数計時回路７００ａ，７００ｂの演算出力
である発光の立上り時間、減衰時間、配向緩和時
間はデータマルチプレクサ７１及びソーテイング
マルチプレクサ７２に送られる。

データマルチプレクサは、中央処理ユニツト
（CPU）７４の指令に基づき、各センサーの信号
を順次切換えてメモリ７３に書き込む。メモリ７
３に書き込まれた信号は、微小粒子の識別の表示
として、CPU７４の指令によりCRT等のデイス
プレイ８１上に測定値あるいはグラフ等のデータ
として表示し、また、印字装置にそれらのデータ
を印字し、ハードコピーを作成する。

一方、ソーテイングマルチプレクサ７２は、ソ
ーテイング（分取）すべき要素、例えば波長、立
上り時間、減衰時間、配向緩和時間等の要素が設
定されると、CPU７４からの指令により１つ又
は複数の要素の信号が選択され、１つ又は複数の
上限あるいは下限比較器７５，７６に送られる。
ここであらかじめ設定された値又はスペクトルと
測定値又は測定スペクトルが比較され、所定の範
囲（例えば上限以下でかつ下限以下）にあるとき
は、信号処理部７の動作により荷電パルス発生回
路８２は一定の遅延時間、例えば500〜1000μs程
度をもたせて偏向信号を出力する。

このようにして１個の細胞の特定波長の螢光の
立上り時間、減衰時間、発光スペクトルの時間変
化又は配向緩和時間が正常な細胞のもつこれらの
基準値（前記設定値又は設定スペクトル）と比較
され、その基準値との隔りに応じて識別され偏向
信号が細胞のソーテイング（分取）のために出力
されることとなる。

細胞流が液滴を形成する所に、細胞流をはさん
で荷電電極２３が設けられており、荷電電極に
は、パルス幅50〜200μs、電圧±50〜300Vのパル
スが荷電パルス発生回路から印加されている。そ
して液滴が形成される瞬間に液滴はその荷電パル
スに応じて荷電される。この荷電パルスは、前記
のように細胞がパルス光の照射を受けて、螢光等
を検知され、比較演算されたのち遅延されている
ので、その細胞が丁度荷電電極を通過するときに
は、比較演算の結果としての荷電を受けるように
されている。

次いで液滴は、液滴流をはさむ形で２〜５cmの
間隔で対向しておかれている２枚の偏向板２４の
間を通過する。偏向板には±1500〜2000Vの電圧
が加えられており、荷電された液滴は、静電気力
により偏向され偏向板の４〜５cm下方の細胞受器
２５に集められる。荷電されていない液滴はその
まま偏向されずに落下する。

なお偏向信号を荷電パルス発生回路から出力さ
せる代りに、荷電電極では一定の荷電状態とし
て、偏向板の電場を駆動する回路を用いて偏向電
場の強さを変化させるようにしてもよい。

第１図装置における粒子流、照射するパルス
光、発生する発光パルス、ストリークカメラのシ
ヤツター用ゲート、ストリークカメラの掃引電
圧、液滴にかける荷電電場、相互間の時間的関係
が第７図の波形図を参照しつつ説明される。

第７図の１は微粒子がパルス光を横切るときを
Ｈレベル、そうでないときをＬレベルとして粒子
流の状態を示したものである。第７図の２は照射
するパルス光を示し、第７図の３は発生する発光
パルスを示している。第７図の４および５はそれ
ぞれストリークカメラのシヤツター用ゲートと、
ストリークカメラの掃引電圧を示し、第７図の６
は荷電電極にかける電圧を２つのレベルで示して
いる。第７図の２から３の間は、発光の立上り時
間だけ少し遅れ、ピークに達したあと、緩やかに
減衰する。

第７図の５の周期は、発光源からストリークカ
メラまでの光の到達時間だけの遅れを生じるが、
図では無視した。第７図の６は、微小粒子がパル
ス光の照射を受けてから、荷電電場に至る時間差
だけ遅れる。光の遅れを問題とする第７図の２〜
５の遅れに比べれば比較にならない程の遅れとな
るが、便宜上図では若干大きく画くことにとどめ
た。

第６図回路における時定数計時回路の構成が第
８図および第９図に示される。時定数計時回路が
発光パルスの立上り時間、又は減衰時間を演算す
る場合の時定数計時回路は第８図のように構成さ
れる。

第８図回路において、発光の立上り時間の測定
は、光像を変換した電気信号Ｓ（OPT）をまず前
置増幅し、スムージング等の前処理を行なつたの
ち、第１比較器７０３により立上りの基準レベル
を定め、これを信号Ｓ（703）とする。信号Ｓ
（703）とする立上りの基準レベルは、しきい値設
定器により任意の値に設定Ｓ（702）できるものと
する。このしきい値は、発光信号の無信号時から
の変化点、光学系あるいはこの回路に入る迄の電
気系のノイズ等を勘案して決められる。

立上り時間の測定上信号がピーク値に到達した
時の信号が必要となるが、これには第２比較器７
０５により作成される信号Ｓ（705）を用いる。即
ち発光信号とそのピークホールド回路の信号を第
２比較器で比較し、発光信号の方が小さくなると
きのピーク点の信号を得る。このＳ（703）、Ｓ
（705）の２つの信号発生時点の時間差を立上り時
間計時回路にて計測する事により発光の立上り時
間を測定できる。

発光の減衰時間の測定は、まず第２比較器７０
５により前記ピーク点となるべき時間をとらえ
る。それには発光信号とピークホールド回路を通
つた信号を比較すれば発光信号の方が小さくなつ
た所で第２比較器７０５の出力が逆転するので、
これを信号Ｓ（705）として時間測定回路の時間計
測開始の信号として使用する。

減衰時間とは、通常、信号ピーク値からの値が
１／ｅ（63％）になるまでの時間を採用すればよ
いがこの１／ｅ又はその他の値を減衰比設定器に
設定し、これと発光信号を第３比較器７０８に入
れ、大きさの逆転する時出力信号Ｓ（708）が得ら
れる。減衰時間の測定は、その信号Ｓ（705）、Ｓ
（708）を用い、減衰時間測定回路により計測され
る。STTは計時開始を、STPは計時停止を、そ
れぞれあらわす。

立下り時間計時回路の計時終了信号COMPLに
より、ピークホールド回路および２つの計時回路
をリセツトRSTする。このようにして第８図回
路により立上り時間計時信号Ｓ（707）、立下り時
間計時信号Ｓ（709）が得られる。

以上は特定の一波長に関する時定数計時回路で
あるが、特定波長が複数ある場合には、特定波長
の数に応じてそれぞれの波長について同様の処理
を行なえばよい。また、第８図回路が用いられる
場合においては、信号Ｓ（707）、信号Ｓ（709）の
一方を省略することが可能である。

時定数計時回路が配向緩和時間を演算する場合
の時定数計時回路は、第９図のように構成され
る。第９図回路において、光像検出器よりの偏光
角0゜および90゜の電気信号Ｓ（OPT）を前置増幅を
行なつたのち、前記偏光を示す換算値、例えば発
光偏光度を演算させる。その回路よりの出力を前
記減衰時間計時と同様に処理するものである。こ
のようにして第９図回路により配向緩和時間計時
信号Ｓ（716）が得られる。複数の特定波長につい
ては、その各々に同様の処理を行なえばよい。

粒子からの螢光を分光器で波長帯に分光し、分
光した後の光をシンクロスキヤン方式のストリー
クカメラで検出した、発光スペクトルの時間変化
が第１０図に示される。本発明による装置におい
ては、このようなストリーク像を取扱いの対象と
する。また、スペクトルの時間変化を、時間分解
スペクトルとも言う。

第１０図においては、ｘ軸が時間軸、70ピコ秒
ごとの区切り、ｙ軸が蛍光の波長、ｚ軸が蛍光の
強さを表す。Ａ，B2種類の粒子の時間分解スペ
クトルを、重ねて表示した。実線はＡ粒子の、点
線はＢ粒子の、スペクトルの時間変化を示し、２
つのカーブが重なる部分は、実線で表した。

第１０図においては、Ａ粒子からの蛍光が速く
減衰し、Ｂ粒子からの蛍光が比較的にゆつくり減
衰することが示される。したがつて、最初の曲線
（時間ｔ＝０の蛍光強度のスペクトル；強いパル
スレーザを照射した直後のスペクトル）に注目す
れば、ＡとＢの粒子が識別出来ることが、第１０
図から読み取れる。もし、スペクトル分解しなけ
れば、Ａ，Ｂ粒子の時間ｔ＝０での蛍光強度差は
わずかであるから、ＡとＢの区別がつかない。

第１０図以外でも、スペクトル分解すること
で、流れる粒子からの蛍光の減衰が、赤色シフト
（長波長側の光強度が強くなる）、青色シフト（波
長500nm付近の光強度が強くなる）、変化しない、
等に分かれる場合があり、このことに注目するこ
とで、粒子が識別できる。

第２図装置においては、微小粒子の区分、選別
のパラメーターは、微小粒子の分子レベルの局所
構造の違いに基づくものである。具体的には、生
体微小粒子について言えば、分子生物学的又は分
子化学的な細胞レベル、染色体レベル更には生体
分子レベルにまでたちかえつたものである。更に
具体的には、まず第１に各構成分子、部位の接近
度、例えば核酸−塩基ペアの距離、染色用色素分
子−分子骨格の距離、ドナ色素分子とアクセプタ
色素分子との距離等であり、第２に核酸、タンパ
ク質などの粒子の大きさや型であり、第３に分子
の構造に関し、例えば２重らせんのピツチ、分子
の内部振動、ブラウン運転、鎖のベンデイング、
分子の局部的な回転運動等の情報である。

第４に光化学反応を含む生化学反応の過渡中間
生成物の検出であり、第５に細胞の領域の情報で
あつて、例えば、細胞膜とタンパク質との結合状
態や膜の厚さである。第６に細胞の融合状態、表
面レクチンリセプターの分布、クロメーシヨン接
近などの生体微小粒子のその他の性質に関する情
報である。

これらは、生体微小粒子の異常因子に直接係わ
る高価値の情報である。第２図装置においては、
これらの高価値の情報によつて生体微小粒子を区
分、選別でき、しかもそれを大量のサンプルを短
時間でオンラインで行なうことが可能である。こ
のことは、第２図装置の医学分野における臨床的
有用性と、その基礎医学への有用性を意味し、ま
たその他の微小粒子の区分、選別への有用性をも
意味する。

本発明の実施にあたつては、前述の実施例のほ
か、種々の変形形態をとることが可能である。ま
た、本発明の方法および装置には、前記特公昭56
−13266号公報に記載されたようなコウルターオ
リフイスを使用する容量検知システムやパルス光
照射による粒子からのパルス状の螢光や散乱光を
連続光としてならしてその強弱を検知し、それら
を粒子の区分、選別のパラメーターとすること、
即ち、従来の流動システム分析の手法を併用する
ことは勿論可能である。

発明の効果 本発明によれば、微小粒子を１個づつ間隔を持
たせて含み生成された粒子流に、光源から光パル
スの数の制御用のキヤビテイーダンパーを通し
て、強度の大なる光パルスが照射され、該照射さ
れた粒子からの発光を、分光器で波長帯に分光し
た後の光強度がシンクロスキヤン方式のストリー
クカメラで検出され、該検出過程後に選別された
該微小粒子を含む液滴が帯電させられ高い電場中
で偏向させられ、流れる微小粒子からの発光を分
光器で波長帯に分光した後の光をシンクロスキヤ
ン方式のストリークカメラで検出した結果での発
光スペクトルの時間的変化の特性に基づき該粒子
流内の微小粒子の識別を迅速かつ高精度に行うこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、光照射に対する粒子の発光および失
活の状況を説明する図、第２図は、本発明の一実
施例としての微小粒子の識別（区分又は選別）を
行う装置の全体的な構成を示す図、第３図および
第４図は流動チヤンバーの構造例を示す図、第５
図はストリークカメラの動作を説明する図、第６
図は第２図装置における信号処理部の構成を示す
図、第７図は、第１図装置における各部の信号の
時間的関係を示す波形図、第８図および第９図
は、第６図回路における時定数計時回路の構成を
示す図、第１０図は粒子からの発光を分光器で波
長帯に分光した後の光をシンクロスキヤン方式の
ストリークカメラで検出した発光スペクトルの時
間的変化を示す特性図である。 １……シース液容器、２……試料容器、４，５
……管、６……流動チヤンバー、７……信号処理
部、１０……アルゴンイオンレーザ、１１……色
素レーザ、１２……キヤビテイーダンパー、１９
……分光器、２０……ストリークカメラ、２３…
…荷電電極、２４……偏向板、２５……細胞受
器、３２……管、６１……振動手段、６２……出
口ノズル、６３……シース液、８１……デイスプ
レイ部、８２……荷電パルス発生部、８３……掃
引同期回路、８４……シヤツター同期回路、１３
１〜１３３……ハーフミラー、１３４，１３６…
…ダイクロイツクミラー、１４１，１４２……全
反射ミラー、１５１〜１５８……レンズ、１６
１，１６２……フオトダイオード、１６３，１６
４……光電子増倍管又はフオトダイオード、１７
３〜１７４……バンドパスフイルタ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微小粒子を識別、選別する方法であつて、該
   方法が、 微小粒子の懸濁液から実質的に該微小粒子を１
   個づつ間隔を持たせて含む粒子流を生成させる過
   程、 該生成された粒子流に、光源から光パルスの数
   の制御用のキヤビテイーダンパーを通して、強度
   の大なる光パルスを照射する過程、 該光パルスを照射された粒子からの発光を、分
   光器で波長帯に分光し、分光後の光強度をシンク
   ロスキヤン方式のストリークカメラで検出する過
   程、および、 該検出過程後に選別された該微小粒子を含む液
   滴を帯電し、高い電場中で該液滴を偏向させる過
   程を具備し、 流れる該粒子からの発光を、分光器で波長帯に
   分光し、分光した後の光をシンクロスキヤン方式
   のストリークカメラで検出し、該検出結果での発
   光スペクトルの時間的変化の特性に基づいて、該
   粒子流内の微小粒子を識別、選別することを特徴
   とする微小粒子を識別する方法。 ２ 微小粒子を識別、選別する装置であつて、該
   装置が、 微小粒子の懸濁液から実質的に該微小粒子を１
   個づつ間隔を持たせて含む粒子流を生成させる手
   段、 該生成された粒子流に、光源から光パルスの数
   の制御用のキヤビテイーダンパーを通して、強度
   の大なる光パルスを照射する手段、 該光パルスを照射された粒子からの発光を、分
   光器で波長帯に分光し、分光後の光強度をシンク
   ロスキヤン方式のストリークカメラで検出する手
   段、 該検出後に選別された該微小粒子を含む液滴を
   帯電し、高い電場中で該液滴を偏向させる手段を
   具備し、 流れる該粒子からの発光を、分光器で波長帯に
   分光し、分光した後の光をシンクロスキヤン方式
   のストリークカメラで検出し、該検出結果での発
   光スペクトルの時間的変化の特性に基づいて、該
   粒子流内の微小粒子を識別、選別することを特徴
   とする微小粒子を識別する装置。