JPH0145358B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はトランスグルタミナーゼを用いて補酵
素ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド
（NADと略す）をタンパク質物質に結合させて固
定化したNADを製造する方法に関する。 NADは、酸化還元反応に関係する酵素系にお
いて補酵素として働き、極めて不安定な化合物で
使用時、保存時に変化しやすく、また高価なもの
である。従つて、使用したNADを反応系から分
離、回収し再利用する工夫が必要である。 そこで、本発明者らは、NADを固定化するこ
とを検討した結果、トランスグルタミナーゼを使
用すると首尾よく目的を達成することを見出し
た。本発明は、この知見に基づき完成されたもの
で、固定化された補酵素NADの製法にかかり、
トランスグルタミナーゼを作用させてタンパク質
又はタンパク質分解物にNAD、すなわちニコチ
ンアミド−アデニン−ジヌクレオチド類を結合す
ることを特徴とするものである。 一般に補酵素NAD類を化学的に固定化する方
法は知られているが、NAD類をトランスグルタ
ミナーゼで酵素的に固定化することは、これまで
報告されていない。 本発明によれば、補酵素NADの酵素的固定化
により、NADの回収、再使用が容易になり、ま
た、不安定なNADを安定化した形で得ることが
できる。本発明で得られた固定化NADは、医薬
品などの有用物質を生産する酵素反応や有害物質
を分解、除去する酵素反応において、繰返し使用
することができるから、工業上極めて有利であ
る。 本発明ではNAD又は（及び）NAD誘導体が用
いられ、NADの誘導体としては、例えばアミノ
ヘキシルNAD誘導体すなわち８−（６−アミノヘ
キシル）−NADやN⁶−〔（６−アミノヘキシル）
カルバモイルメチル〕−NAD等がある。 本発明で使用されるタンパク質又はタンパク質
分解物はNADを固定化する性能、すなわちグル
タミン残基を有するものならば制限はない。タン
パク質として例えば、カゼイン、大豆タンパク質
など全ての動植物タンパク質、菌体タンパク質が
挙げられる。タンパク質分解物としては上記の全
てのタンパク質の分解物を例示することができ
る。またグルタミン残基を含むアミノ酸の合成ポ
リマーも使用しうる。 トランスグルタミナーゼは、カルシウム依存性
のアシル転移反応を触媒する酵素であり、タンパ
ク質又はタンパク質分解物中のグルタミン残基
（アシル供与体）と種々の化合物中のアミノ基
（アシル供与体）と種々の化合物中のアミノ基
（アシル受容体）との間にアミド結合を形成させ
る能力をもつ。トランスグルタミナーゼはコネラ
ンらの方法〔Connellan et al J.Biol.Chem.246、
1093（1971）〕に従つてモルモツトの肝臓から取得
され、他に牛などの血液からも得られる。 本発明の方法ではタンパク質等とNAD類とを
混合したものにトランスグルタミナーゼを作用さ
せて酵素反応を起させタンパク質等とNAD類を
結合させる。一般に、タンパク質１〜５部を水
1000部に混合した液にNAD誘導体0.1〜１部、塩
化カルシウム0.6部、トランスグルタミナーゼ0.1
〜0.2部を添加する。反応はPH６〜8.5、好ましく
は7.5で、温度20〜40℃、好ましくは37℃前後で
行う。反応時間は１〜10時間である。反応時間経
過後、エチレンジアミン四酢酸12部を加え反応を
停止させる。反応終了後、反応液を通常の方法例
えば透析処理して目的物を取得する。 還元剤、例えばシステイン、グルタチオン、メ
ルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどは
トランスグルタミナーゼを活性化し、また安定化
する。従つて反応液に還元剤を添加するのが望ま
しいが、必ずしも必須ではない。 好ましい実施態様の１例は下記のとおりであ
る。 トリス緩衝液（PH7.5） 100ｍＭ 塩化カルシウム ５ｍＭ NAD １ｍＭ カゼイン １〜３mg／ml トランスグルタミナーゼ 183μｇ／ml PH：7.5、反応温度37℃ 次に、タンパク質としてカゼインを例にとつ
て、カゼイン中の種々のタンパク画分とNADと
の結合量を検討した結果を述べる。この結合量は
馬肝のアルコール脱水素酵素の補酵素活性により
測定され、測定結果はアセチル化αS1カゼイン画
分の場合が最も効率よくNADと結合することを
示している。

【表】 本発明で得られた固定化NADを例えば医薬品
等製造の酸化反応に使用すると、NADは還元型
NAD（NADH）に変るが、ここに生じたNADH
−タンパク質固定化結合体は、塩化カルシウム等
による塩析又は酸沈殿によつて反応液から容易に
分離、回収することが可能なので、NADを有効
に再使用することができる。この際の回収率はほ
ぼ100％である。また、固定化NADは遊離のもの
に比し保存安定性に優れている。 次に、本発明を実施例によつて説明する。 実施例 〔トランスグルタミナーゼの製法〕 モルモツト肝臓の抽出液を出発原料として
DEAE−セルロースによるクロマトグラフイー、
プロタミン硫酸分画、アガロースによるゲルクロ
マトグラフイーを行い、トランスグルタミナーゼ
を精製した。２Kgの肝臓より200mgの精製酵素を
得た。 〔固定化NADの製法〕 塩化カルシウム0.6ｇを溶解したトリス塩酸緩
衝液（PH7.5）１中に、カゼインを３ｇおよび
アミノヘキシルNAD誘導体0.8ｇを添加、溶解し
て反応液とした。 これにトランスグルタミナーゼを200mg加え、
37℃で８時間反応させた。 反応は0.4MのEDTA（PH8.0）270mlを加えて停
止させた。 反応液を70ｍＭ KClを含む10ｍＭイミダゾー
ル緩衝液（PH6.0）に透析して、遊離のNAD誘導
体を除き、NAD誘導体・カゼイン複合体2.8ｇを
得た。 使用例 Ｄ−フラクトースの前駆体Ｄ−マニトールを原
料としてマニトールデヒドロゲナーゼと、実施例
１で得たNAD誘導体・カゼイン複合体を共用し
て酸化反応させ、Ｄ−フラクトースを得た。 反応終了後、反応液に塩化カルシウムを最終濃
度が40〜60ｍＡになるようにカゼイン複合体を沈
殿させて、分離、回収した。 この回収したNADH誘導体・カゼイン複合体
はアルコールデヒドロゲナーゼと共用して例えば
アルデヒド類からアルコール類を得ることができ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ トランスグルタミナーゼを作用させてタンパ
   ク質又はタンパク質分解物に補酵素ニコチンアミ
   ド−アデニン−ジヌクレオチド類を結合すること
   を特徴とする固定化補酵素の製法。