JPH0143558B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペプチド又はペプチド誘導体の新規
な合成法に関するものである。

近年、ペプチドに種々の生理活性が存在するこ
とが相ついで知られ、治療、診断などの医薬品と
しての重要性並びに呈味物質としての重要性がま
すます増大しつつある。それに伴いペプチド合成
法の開発も活発である。現在までに知られている
ペプチド合成法の主なものとしては、例えばフア
ルマシア、レビユー、３号、27−47頁（1980年）
にまとめられているように、化学合成法と酵素法
の二つに大別することができる。その化学合成法
としては、アジド法、混合酸無水物法、活性エス
テル法、カルボジイミド法でアミノ酸を逐次的に
縮合する方法とフラグメントで縮合させる方法な
どが代表的なものであるが、これらどの化学合成
法においても、ラセミ化及び副反応が起きやすく
反応時間が長く、末端アミノ基を保護基にて反応
前にあらかじめ保護しておく必要があるなど種々
の問題がある。フラグメント縮合法の場合、特に
ラセミ化が起りやすいという重大な欠点を有する
ものである。

一方、ラセミ化の生起を極力避ける方法として
プロテアーゼを用いる酵素法が提案されているが
この方法においてもやはり、反応時間が長く、末
端アミノ基を保護基にて保護しておく必要がある
など操作の煩雑さを改良するには至らなかつた。
さらに、このプロテアーゼを用いる酵素法では、
用いる酵素が本来ペプチド分割活性を有している
ため、生じたペプチドが合成と併行して分解さ
れ、しばしば目的のペプチドが得られないという
重大な欠点を示すものであつた。特に、オリゴペ
プチドの合成に適用した場合には、一部のアミノ
酸が欠落した目的外のペプチドが得られる重大な
欠点が指摘されている（ジヤータル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー誌、256巻、1301頁
（1981年）。また、酵素法によるペプチド合成法と
しては、プロテアーゼ法の他に、特定なアミノ酸
配列を有する単一ペプチドの合成のみを司る特殊
な酵素を用いる方法が知られている。この種の酵
素としては、例えばグルタミン酸／システイン／
グリシンの配列であるトリペプチドを合成するグ
ルタチオン合成酵素（特開昭54−122793号公報。）
やデカペプチドであるグラミシジンＳを合成する
グラミシジンＳ合成酵素（現代化学1974年12月号
12頁）などが報告されている。しかし、これらの
酵素は特殊な酵素であつて、この酵素によつて合
成しうるペプチドは、限定された一種のみのペプ
チドであり、目的とする任意なペプチドを合成す
ることができない。このため、この方法は一般的
なペプチド合成法とはなり得ないのが現状であ
る。

本発明者らは、ペプチドの有用性に鑑み、上記
のような欠点、特にラセミ化、副反応の生起、反
応の煩雑さ等の原因となり、同時に経済性を損う
保護基の必要性を解決し、汎用性のある新規なペ
プチド合成法を提供することを目的として鋭意研
究を重ねた結果、アミノ酸を核酸の一種である
tRNAに結合させる作用を有する酵素で、従来全
くペプチド結合を形成する作用が知られていなか
つたアミノアシル−tRNAシンテターゼに驚くべ
きことに、ペプチド合成能があることを見い出
し、この酵素を縮合剤として用いると、前記の目
的がすべて達成されることを見い出し、先に特許
出願した（特願昭57−10336号）。しかし、この方
法は縮合剤として用いるアミノアシル−tRNAシ
ンテターゼを高純度に精製しており、このため、
操作が煩雑で所望のアミノアシル−tRNAシンテ
ターゼを得るに長時間を要し、アミノアシル−
tRNAシンテターゼ活性が精製中に度々失われる
例があり、このため、酵素の収率の低下をきたし
易い傾向があつた。これを改良するため、アミノ
アシル−tRNAシンテターゼを、例えば微生物な
ど自然界に広く求めたとしても、取得したアミノ
アシル−tRNAシンテターゼの収率が低い傾向に
あり、上記の点を改善することはできなかつた。
さらに操作の煩雑性を改良すべく、例えば、微生
物細胞などをホモジナイザーやダイノミル等で破
砕したままの粗抽出液を用いることを検討してみ
たが、この方法では、ペプチド合成時に混在する
他の酵素などの影響のためか、度々副反応が認め
られて目的ペプチドの収率を低下せしめる傾向に
あり、かつ反応後の目的物の単離精製が十分では
なかつた。

そこで、本発明者らは上記の点を改良するため
にさらに鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに
粗抽出液をリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で
処理して得たアミノアシル−tRNAシンテターゼ
を含む粗酵素液を用いると、上記の点をすべて解
決し、ペプチド又はペプチド誘導体を高収量で合
成できることを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はアミノ酸からペプチド又は
ペプチド誘導体を合成するに際し、生物細胞を破
砕して得た粗抽出液をリン酸基を有する陽イオン
交換樹脂で処理してアミノアシル−tRNAシンテ
ターゼを含む粗酵素液を反応系に加えて合成する
ことを特徴とするペプチド又はペプチド誘導体の
合成法である。

本発明に使用されるアミノアシル−tRNAシン
テターゼは、酵素分類6.1.1に属し、次式 アミノ酸＋ATP＋tRNA→アミノアシル−tRNA＋AMP＋
ピロリン酸 の反応を触媒する酵素であり、例えば、ウサギ、
ウマ、ウシ、ラツト、ニワトリ、ヘビなどの動物
組織より得られるもの、イネ、イモ、トマトなど
の植物組織より得られるもの、カビ、酵母、キノ
コ、細菌、放線菌などの微生物及び藻類より得ら
れるものなどがあげられる。なかでも、酵素の取
得が容易であるから、微生物より得られるものが
好ましく、さらに酵素の安定性からバチルス・ス
テアロサーモフイルス、サーマス・サーモフイル
ス、サーマス・フラバス、クロストリジウム・サ
ーモアセチカム、サーマス・マグアテイカスなど
の好熱性細菌より得られるアミノアシル−tRNA
シンテターゼが最適である。

これら各種のアミノアシル−tRNAシンテター
ゼは、種々のα−アミノ酸に特異性のあるものが
用いられ、例えばチロシンに特異性のあるものと
しては、チロシル−tRNAシンテターゼが、また
ロイシンに特異性のあるものとしては、ロイシル
−tRNAシンテターゼが、さらにバリンに特異性
のあるものとしては、バリル−tRNAシンテター
ゼ、その他イソロイシル−tRNAシンテターゼ、
フエニルアラニル−tRNAシンテターゼ、アラニ
ン−tRNAシンテターゼ、グルタミル−tRNAシ
ンテターゼ、アスパラギニル−tRNAシンテター
ゼ、メチオニル−tRNAシンテターゼ、ヒスチジ
ル−tRNAシンテターゼ、リジル−tRNAシンテ
ターゼ、トレオニル−tRNAシンテターゼ、セリ
ル−tRNAシンテターゼ、などが具体例としてあ
げられる。

本発明においては、これらのアミノアシル−
tRNAシンテターゼを含む粗酵素液を得るには、
例えば、上記組織又は細胞をホモジナイザーやダ
イノミル等で破砕した後、得られた粗抽出液をリ
ン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理すること
が必要である。

このリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理
するには、例えば、PH３ないしPH12、好ましくは
PH６ないしPH９、最適にはPH７ないしPH８で、濃
度が１ｍＭないし1M、好ましくは20ｍＭないし
100ｍＭの緩衝液で平衡化したリン酸基を有する
陽イオン交換樹脂に、上記粗抽出液を加える（バ
ツチ法）か、上記樹脂をカラムにつめ、そのカラ
ムに粗抽出液を通液（カラム法）して行なえばよ
い。その時の処理温度としては、アミノアシル−
tRNAシンテターゼの活性を維持する温度で行え
ばよいが、一般には、０℃から70℃が好ましく、
特に０℃から30℃が最適である。また、その時に
用いる緩衝液としては、アミノアシル−tRNAシ
ンテターゼが溶解し、所望のPHが得られるもので
あればいかなるものでもよい。そのようなものと
して、例えば、トリス塩酸緩衝液、ヘペス緩衝
液、トリエタノールアミン緩衝液、イミダゾール
緩衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。さらに
酵素の失活を防ぐことを主目的として、処理用緩
衝液にメルカプトエタノール、ジチオスレイトー
ルなどのスルフヒドリル化剤フエニルメチルスル
ホニルフルオリドなどのタンパク質分解酵素阻害
剤、エチレンジアミン四酢酸ナトリウムなどのキ
レート剤を添加してもよい。前記バツチ法で処理
するには、例えば、粗抽出液を上記緩衝液で平衡
化したリン酸基を有する陽イオン交換樹脂に加
え、５分以上、好ましくは30分以上撹拌し、さら
にしばらく放置した後、同じ緩衝液で溶出せしめ
るか、PHの異なる上記緩衝液、濃度変化を持たせ
た、あるいは塩を含む緩衝液で吸着した酵素を溶
出せしめることにより、アミノアシル−tRNAシ
ンテターゼを含む粗酵素液を得ることができる。
また、カラム法で処理するには、例えば、カラム
内で所望の酵素の吸着・脱着操作を行えばよく、
原理的にはバツチ法と同じである。処理する時間
としては、できるだけ迅速であることが好まし
く、カラム内の線速度が１cm・h^-1以上で行うの
がよい。さらに分離能を考慮してカラム内の線速
度としては、最大60cm・h^-1であることがより好
ましい。さらにバツチ法及びカラム法で溶出に使
用する塩としては、本質的に完全に解離するもの
であればどのようなものでも使用できるが、特に
イオン交換基の対イオンとなる塩、あるいは用い
た緩衝液のそれと同じである塩が好ましい。

このように処理して得たアミノアシル−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液を、そのまま用いて
もよいし、これをさらに凍結乾燥して得た固形状
のものも用いられる。

このように処理して得たアミノアシル−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液は、さらにDEAE樹
脂処理を施してペプチド合成に使用してもよい。

本発明に用いられるリン酸基を有する陽イオン
交換樹脂としては、交換基がリン酸基であるもの
であれば、いかなる基材でもよい。なかでも、セ
ルロースを基材としたリン酸セルロース樹脂（例
えば、ワツトマン社製、バイオ・ラツド社製ある
いはセルバ社製）を用いると、所望のアミノアシ
ル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液が迅速か
つ高収率で得られ、その粗酵素液を用いると高収
量でペプチド又はペプチド誘導体を合成すること
ができて好ましい。

次に、リン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処
理して得たアミノアシル−tRNAシンテターゼを
含む粗酵素液を用いたペプチド又はペプチド誘導
体の合成方法を具体的に説明する。

本発明によれば、アミノ酸とアミノ酸から誘導
されるアミノ酸誘導体とをアミノアシル−tRNA
シンテターゼを含む粗酵素液の存在下で反応させ
ることによつてペプチド又はペプチド誘導体を合
成することができる。さらに本発明によれば、あ
らかじめアミノ酸とアミノアシル−tRNAシンテ
ターゼを含む粗酵素液とを混合させて混合物を
得、次いで得られた混合物とアミノ酸誘導体とを
反応させることによつてペプチド又はペプチド誘
導体を合成することができる。このアミノアシル
−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液とあらかじ
め混合させるのに好ましく用いられるアミノ酸と
しては、例えばチロシン、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、フエニルアラニン、メチオニン、
リジン、セリン、バリンなどのα−アミノ酸があ
げられ、Ｌ体、Ｄ体のいずれでもよい。また、上
記反応に好ましく用いられるアミノ酸誘導体とし
ては、例えば、グリシン、アラニン、ロイシン、
イソロイシン、フエニルアラニン、グルタミン
酸、グルタミン、ノルロイシン、システイン、チ
ロシン、アルギニン、バリン、リジン、ヒスチジ
ン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニ
ン、トリプトフアン、トレオニンなどのα−アミ
ノ酸、β−アラニン、β−アミノイソ酪酸などの
β−アミノ酸、クレアチンなどの含窒素γ−アミ
ノ酸、ピペリジン酸などのγ−アミノ酸、ε−ア
ミノカプロン酸などのε−アミノ酸などの各種ア
ミノ酸のエステル、チオエステル、アミド、ヒド
ロキサミドなどがあげられるが、アミノ基が遊離
の形であるアミノ酸誘導体であれば、上記例示化
合物に限定されるものではない。そのエステルと
しては、例えばメチル、エチル、プロピル、シク
ロヘキシル、フエニル、ベンジルなどの単純な炭
化水素系のエステルから、tRNAの3′−OHで上
記アミノ酸がエステル化したものまで、種々のエ
ステルを用いることができる。また、アミドとし
ては、遊離のアミドの他、例えば異種あるいは同
種のアミノ酸がアミド結合したオリゴペプチドや
ポリペプチドを用いることもできる。このオリゴ
ペプチドやポリペプチドがさらにエステル、チオ
エステル、ヒドロキサミド、エーテル化したもの
を用いることも可能である。また、上記アミノ酸
誘導体は水溶液の状態で用いるか、あるいは固体
のまま用いてもよい。

次に混合物を得るには、例えばPH５ないしPH11
好ましくはPH６ないしPH10、最適にはPH７ないし
PH10の緩衝液中、アデノシン三リン酸又はデオキ
シアデノシン三リン酸存在下に、アミノ酸とアミ
ノアシルtRNAシンテターゼを含む粗酵素液と混
合することによつて行えばよい。そのときの混合
の温度としては、酵素活性を維持する観点から一
般に０℃から70℃が好ましく、最適には０℃から
30℃で行われる。また、そのときに用いられる緩
衝液としては、アミノ酸、アデノシン三リン酸、
デオキシアデノシン三リン酸及びアミノアシル−
tRNAシンテターゼを含む粗酵素液が溶解し所望
のPHが得られるものであれば、いかなるものを使
用してもよい。例えば、トリス塩酸緩衝液、ヘペ
ス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、マレー
ト緩衝液、リン酸緩衝液などがあげられる。さら
に反応を円滑に進行させ、酵素の失活を防ぐこと
を主目的として、反応系にマグネシウム、マンガ
ンなどの二価カチオン、メルカプトエタノール、
ジチオスレイトールなどのスルフヒドリル化剤、
ピロフオスフアターゼを単独又は混合して添加し
てもよい。各添加剤の好適な濃度としては、二価
カチオン0.01ｍＭ〜500ｍＭ、スルフヒドリル化
剤0.001ｍＭ〜100ｍＭ、ピロホスフアターゼ
0.001ユニツト／ml〜100ユニツト／mlであり、最
適な濃度としては、それぞれ、二価カチオン0.1
ｍＭ〜10ｍＭ、スルフヒドリル化剤0.01ｍＭ〜１
ｍＭ、ピロホスフアターゼ１ユニツト／ml〜10ユ
ニツト／mlである。また、アミノ酸、アミノアシ
ル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液及びアデ
ノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸
の使用量は特に制限されないが、実用的な収量を
得るためには、アミノ酸１重量部に対し、アミノ
アシル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液10³
〜10⁶重量部（アミノアシル−tRNAシンテター
ゼの濃度としては、10μM以上のものが好まし
い。）の範囲アミノ酸とアデノシン三リン酸又は
デオキシアデノシン三リン酸とのモル比を１：10
〜１：100の範囲内で行うのが好ましい。前記の
条件で反応を実施すると、反応は円滑に進行し、
数秒から30分以内に完結する。

次いで、上記のようにして得られた混合物とア
ミノ酸誘導体とを混合して反応させることにより
目的のペプチド又はペプチド誘導体を得ることが
できる。（この段階を以後ペプチド化と称する。）
このときに用いる反応混合物は、そのままペプチ
ド化反応に用いることもできるが、Ｇ−25（フア
ルマシア社製）Ｇ−75（フアルマシア社製）など
のゲルクロマトグラフイーを行うことによつて、
反応後に混在するアデノシン三リン酸、アデノシ
ン一リン酸あるいはピロリン酸等を除去して用い
ることもできる。また、ペプチド化反応の温度と
しては、０℃から70℃が好ましく、酵素の失活防
止と適正な反応速度を得るという観点から、10℃
から50℃、特に20℃から40℃で行うことが好まし
い。PHとしては、既出の各種緩衝液等を用いて、
５ないし11好ましくは６ないし10、最適には７な
いし９で行えばよい。

反応混合物とアミノ酸誘導体との混合比として
例えば、容量で１：0.1〜１：100の範囲で行えば
よい。また、この時用いるアミノ酸誘導体の濃度
としては10ｍＭから10Mの範囲であるが、これを
さらに低くして用いることもできる。

上記条件でペプチド化は、数秒から数日で完結
し、目的のペプチド又はペプチド誘導体を得るこ
とができる。

本発明によつて得られるペプチド誘導体は、例
えば血圧降下作用等のあるブラジキニンや内・外
分泌抑制作用等のあるソマトスタチンなどの各種
ホルモン及び抗生物質ペプチド、呈味ペプチドの
ような他の生物学的活性物質として有用である。

本発明によれば、上記有用ペプチド又はペプチ
ド誘導体を保護基を用いることなく、安価に製造
することができ、さらにより高収量で製造できる
ため、工業的に極めて有用である。

以下本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１、比較例１ バチルス・ステアロサーモフイルス菌体６Kg
を、２倍量の100ｍＭトリス・塩酸緩衝液（PH
7.5）に懸濁し、ダイノミルを用いて細胞を破砕
後、遠心分離により不溶物を除去し、チロシンに
特異的なチロシン−tRNAシンテターゼを含む粗
抽出液を得た。あらかじめ５ｍＭメルカプトエタ
ノール２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム
及び0.1ｍＭホスホフエニルスルホニルフルオリ
ドを含む50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化
したリン酸セルロース（ワツトマン社製）を充填
したカラムに、上記の粗抽出液をとおし、塩化カ
リウムを上記緩衝液に加えた溶液で、線速度60
cm・h^-1で溶出せしめると、チロシル−tRNAシ
ンテターゼが溶出した。この区分を集め、濃縮、
脱塩を行つた結果、80％以上の高い収率でチロシ
ンに特異的なチロシル−tRNAシンテターゼを含
む粗酵素液を得た。上記操作をすべて４℃で行つ
た。

このようにリン酸基を有する陽イオン交換樹脂
で処理して得たチロシル−tRNAシンテターゼを
含む粗酵素液６ｇ（純度８％）、塩化マグネシウ
ム0.4ｇ、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩0.1
ｇ、Ｌ−チロシン１mgピロホスフアターゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）200ユニツト及びジ
チオスレイトール0.01mgを200mlの20ｍＭヘペス
緩衝液PH8.0に溶解し、４℃で15分間混合させて
混合物を得た。得られた混合物にＬ−フエニルア
ラニンメチルエステル４ｇを加え、反応系をPH
8.0に維持した状態でよく混合し、反応温度を30
℃に保つて１日放置して反応させた。

次いで得られた反応液にアセトン200mlを加え
沈殿を濾別後、上清をエバポレーターにて約20ml
に濃縮し、ボンダパツクC₁₈カラム（ウオーター
ズ社製）に供し、アセトニトリル／50ｍＭリン酸
カリ水溶液、85／15、PH７を展開溶媒として用い
て分離し、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステルを0.4mg得た。

その元素分析（C₁₉H₂₂N₂O₄＝342.39）は、 計算値（％） Ｃ＝66.65 Ｈ＝6.48 Ｎ＝8.18 測定値（％） Ｃ＝66.71 Ｈ＝6.37 Ｎ＝8.23 であつた。

次に比較のため、バチルス・ステアロサーモフ
イルス６Kgから、上記と同様の方法で粗抽出液を
得、続いて陰イオン交換樹脂のDEAE−セルロー
スカラムクロマトグラフイー、ヒドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフイー、DEAE−セフア
デツクスカラムクロマトグラフイー、硫酸アンモ
ニウムによる分別沈殿法、ヒドロキシアパタイト
グラフイー、DEAE−セフアデツクスカラムクロ
マトグラフイー及びセフアデツクスＧ−150カラ
ムクロマトグラフイー法で単一に精製したチロシ
ル−tRNAシンテターゼを用い、上記と同様にし
てＬ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニンメチルエ
ステルを0.1mg得た。

実施例２、比較例２ バチルス・ステアロサーモフイルス菌体55Kgを
用い、実施例１と同様にして得た粗抽出液を、あ
らかじめ５ｍＭメルカプトエタノール、２ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム及び0.1ｍＭホ
スホフエニルスルホニルフルオリドを含む20ｍＭ
リン酸緩衝液（PH7.5）で平衡化したリン酸セレ
ツクス（バイオ−ラツド社製）に加え、30分撹拌
し、数分放置後、上清を除去し、塩化ナトリウム
を上記緩衝液に加えた溶液で溶出させると、チロ
シル−tRNAシンテターゼが溶出した。上記操作
をすべて30℃下で行つた。

このリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理
して得たチロシル−tRNAシンテターゼを含む粗
酵素液45ｇ（純度11％）、塩化マグネシウム150
mg、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩300mg、
Ｌ−チロシン９mg、ピロホスフアターゼ（ベーリ
ンガーマンハイム社製）200ユニツト及びジチオ
スレイトール0.01mgを200mlの25ｍＭリン酸緩衝
液PH8.5に溶解し、４℃で20分間反応させたのち、
反応混合物をＧ−75（フアルマシア社製）カラム
に供し、ヘペス緩衝液にて溶出し、ボイド容の画
分300mlを集め反応混合物を単離した。単離した
混合物にＤ−バリンメチルエステル1.0ｇを加え、
反応系をPH8.5に維持した状態でよく混合し、反
応温度を20℃に保つて30分間反応させた。

次いで得られた反応液をアセトン１を加え、
沈殿を濾別後、上清をエバポレーターにて約30ml
に濃縮し、ボンダパツクC₁₈カラムに供し、実施
例１と同様に分離して、Ｌ−チロシル−Ｄ−バリ
ンメチルエステル14.6mgを得た。

その元素分析（C₁₅H₂₂N₂O₄＝294.36）は 計算値（％） Ｃ＝61.21 Ｈ＝7.53 Ｎ＝9.52 測定値（％） Ｃ＝61.41 Ｈ＝7.50 Ｎ＝9.39 であつた。

次に比較のため、上記と同じ菌体量を用い、比
較例１と同様にして得たチロシル−tRNAシンテ
ターゼで反応を行つてＬ−チロシル−Ｄ−バリン
メチルエステルを3.6mg得た。

実施例３、比較例３ パン酵母から実施例１と同様の操作で得た粗抽
出液を、あらかじめ、10ｍＭメルカプトエタノー
ル、20ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム及
び0.1ｍＭホスホフエニルスルホニルフルオリド
を含む50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し
たリン酸セルロース（セルバ社製）を充填したカ
ラムに通し、塩化カリウムを上記緩衝液に加えた
溶液で、線速度10cm・h^-1で溶出せしめると、メ
チオニル−tRNAシンテターゼを含む粗酵素液が
溶出し、これを凍結乾燥して粉末状の粗酵素標品
を得た。

このリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理
して得たメチオニル−tRNAシンテターゼを含む
粗酵素標品２ｇ（純度10％）、塩化マグネシウム
20mg、アデノシン三リン酸二ナトリウム塩40mg、
Ｄ−メチオニン１mg、ピロホスフアターゼ（ベー
リンガー・マンハイム社製）10ユニツト及びメル
カプトエタノール20μを30mlの50ｍM2，５−
ジメチルイミダゾール緩衝液PH9.0に加えて反応
系をPH9.0に維持した状態で実施例２と同様に反
応させた後、実施例２と同様に反応混合物を単離
し、これにＬ−ロイシンエチルエステル１ｇを固
体のまま加えて20℃で５時間反応させた。得られ
た反応物にアセトン20mlを加え生じた沈殿を濾別
し、エバポレーターにて約10mlに濃縮後、実施例
１と同様に分離し、Ｄ−メチオニル−Ｌ−ロイシ
ンエチルエステルを1.8mg得た。

その元素分析（C₁₃H₂₆N₂O₃S₁＝290.43）は、 計算値（％） Ｃ＝53.77 Ｈ＝9.02 Ｎ＝9.64 測定値（％） Ｃ＝53.80 Ｈ＝8.90 Ｎ＝9.75 であつた。

次に比較のため、上記で得た粗抽出液をリン酸
基を有する陽イオン交換樹脂で処理することなく
そのまま用い、上記と同様の方法で反応を行つて
Ｄ−メチオニル−Ｌ−ロイシンエチルエステルを
0.2mg得た。

実施例３に比べると粗抽出液中に存在する他の
酵素などの影響による副反応のためか、収率は低
下する傾向にあつた。

実施例４、比較例４ ウサギの肝臓からホモジナイザーを使つて、実
施例１と同様の操作でセリル−tRNAシンテター
ゼを含む粗抽出液を得た。あらかじめ、１ｍＭジ
チオスレイトール、２ｍＭエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム及び0.1ｍＭホスホフエニルスルホ
ニルフルオリドを含む25ｍＭイミダゾール緩衝液
（PH7.5）で平衡化したリン酸セルロース（ワツト
マン社製）に上記粗抽出液を加え、１時間撹拌
し、静置後、上清を除去した。これを塩化カリウ
ムを上記緩衝液に加えた溶液で溶出せしめると、
セリル−tRNAシンテターゼが溶出した。

こうして得たセリル−tRNAシンテターゼを含
む粗酵素液３ｇ（純度10％）、塩化マグネシウム
50mg、デオキシアデノシン三リン酸二ナトリウム
塩50mg、Ｌ−セリン１mg、ピロホスフアターゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）200ユニツト及び
ジチオスレイトール0.01mgを用いて、実施例３と
同様に反応させ、Ｇ−25（フアルマシア社製）カ
ラムを用いて反応混合物を得た。次いで、これに
β−アラニルアミド４ｇを加え、反応系をPH9.0
に維持した状態で混合し、50℃で10分間反応させ
た。得られた反応液をボンダパツクC₁₈カラムに
より実施例１と同様に分離し、Ｌ−セリル−β−
アラニルアミド1.3mgを得た。

その元素分析（C₆H₁₃N₃O₃＝175.19）は、 計算値（％） Ｃ＝41.14 Ｈ＝7.48 Ｎ＝23.99 測定値（％） Ｃ＝41.10 Ｈ＝7.43 Ｎ＝24.05 であつた。

次に比較のため、上記で得た粗抽出液をリン酸
基を有する陽イオン交換樹脂で処理することなく
そのまま用いて、上記と同様の方法で反応を行つ
てＬ−セリル−β−アラニルアミド0.2mgを得た。

実施例４に比べると、収率は低下する傾向にあ
つた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アミノ酸からペプチド又はペプチド誘導体を
   合成するに際し、生物細胞を破砕して得た粗抽出
   液をリン酸基を有する陽イオン交換樹脂で処理し
   てアミノアシル−tRNAシンテターゼを含む粗酵
   素液を得、得られた粗酵素液を反応系に加えて合
   成することを特徴とするペプチド又はペプチド誘
   導体の合成法。