JPH0146113B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0146113B2 JPH0146113B2 JP55121093A JP12109380A JPH0146113B2 JP H0146113 B2 JPH0146113 B2 JP H0146113B2 JP 55121093 A JP55121093 A JP 55121093A JP 12109380 A JP12109380 A JP 12109380A JP H0146113 B2 JPH0146113 B2 JP H0146113B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- enzyme
- sample
- reagent
- rate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、複数の酵素活性値分析方法に係り、
特に血清等多数の物質の混在するような試料中の
酵素成分を効率よく、迅速に定量するに好適な分
析方法に関する。
特に血清等多数の物質の混在するような試料中の
酵素成分を効率よく、迅速に定量するに好適な分
析方法に関する。
病院等における臨床化学検査は、近年ますます
機械化、自動化の方向にあり、特に血清酵素の分
析においては、発色後の１点を計測する比色法か
ら、レート法すなわち反応速度を計測する方法に
発展してきている。レート分析法は血清酵素の分
析法として最も秀れた方法ではあるが、反応速度
を計測する関係上、所定時間幅における変化量を
求めねばならず、１点計測に比して測定のための
時間を要する。又従来のレート分析では１つの反
応容器に所定量試料を分注し、１回又は２回試薬
を分注して酵素反応を開始させ、反応の速度を計
測することにより、試料中に含有する１種類の酵
素成分を定量していた。
機械化、自動化の方向にあり、特に血清酵素の分
析においては、発色後の１点を計測する比色法か
ら、レート法すなわち反応速度を計測する方法に
発展してきている。レート分析法は血清酵素の分
析法として最も秀れた方法ではあるが、反応速度
を計測する関係上、所定時間幅における変化量を
求めねばならず、１点計測に比して測定のための
時間を要する。又従来のレート分析では１つの反
応容器に所定量試料を分注し、１回又は２回試薬
を分注して酵素反応を開始させ、反応の速度を計
測することにより、試料中に含有する１種類の酵
素成分を定量していた。
一方、１人の患者の血清を１個の容器に入れ、
分析装置にセツトすれば数種類の成分が同時に、
しかもある成分は比色法で別の成分はレート法で
と任意に選択して分析できる多項目同時分析の自
動装置の出現が臨床検査の分野で求められてい
る。その様な背景から比色分析法とレート分析法
を効率よく組合わせる技術が必要となつてくる。
両分析法の計測上の大きな相違点について述べる
と、比色分析法は、血清と試薬を混合して生ずる
化学反応が終了した後その発色度を計測する方法
であり、血清と試薬の混合後、発色させるための
時間、すなわち反応時間が分析項目により差があ
り、15分程度必要である。しかし反応液の計測時
間そのものは１秒以下でよい。一方レート分析法
は、反応時間は通常２〜３分と短くともよいが、
計測時間は長く、通常数十秒は必要である。この
ような従来のレート分析法は、１つの反応容器に
採取した試料につき被検酵素を１項目だけ定量す
るにすぎなかつた。
分析装置にセツトすれば数種類の成分が同時に、
しかもある成分は比色法で別の成分はレート法で
と任意に選択して分析できる多項目同時分析の自
動装置の出現が臨床検査の分野で求められてい
る。その様な背景から比色分析法とレート分析法
を効率よく組合わせる技術が必要となつてくる。
両分析法の計測上の大きな相違点について述べる
と、比色分析法は、血清と試薬を混合して生ずる
化学反応が終了した後その発色度を計測する方法
であり、血清と試薬の混合後、発色させるための
時間、すなわち反応時間が分析項目により差があ
り、15分程度必要である。しかし反応液の計測時
間そのものは１秒以下でよい。一方レート分析法
は、反応時間は通常２〜３分と短くともよいが、
計測時間は長く、通常数十秒は必要である。この
ような従来のレート分析法は、１つの反応容器に
採取した試料につき被検酵素を１項目だけ定量す
るにすぎなかつた。
本発明の目的は、１つの反応容器に採取した試
料について複数の被検酵素を効率的に定量分析し
得る複数の酵素活性値分析方法を提供することに
ある。
料について複数の被検酵素を効率的に定量分析し
得る複数の酵素活性値分析方法を提供することに
ある。
本発明では、反応容器列を第１および第２の試
薬添加位置を通るように移送すること、この反応
容器列中の特定の反応容器内で第１の基質を含む
第１試薬と試料とを混合して上記試料中の第１の
被検査酵素が関与した第１の酵素反応を行わせる
こと、その第１の酵素反応が進行している反応液
を複数回測光して上記第１の被検酵素の活性値を
定量すること、上記第１の酵素反応が生じた反応
液を含む反応容器に第２の基質を含む第２試薬を
添加して上記と同じ試料中における第２の被検酵
素が関与した第２の酵素反応を行わせること、お
よびその第２の酵素反応が進行している反応液を
複数回測光して上記第２の被検酵素の活性値を定
量すること、を特徴とする。
薬添加位置を通るように移送すること、この反応
容器列中の特定の反応容器内で第１の基質を含む
第１試薬と試料とを混合して上記試料中の第１の
被検査酵素が関与した第１の酵素反応を行わせる
こと、その第１の酵素反応が進行している反応液
を複数回測光して上記第１の被検酵素の活性値を
定量すること、上記第１の酵素反応が生じた反応
液を含む反応容器に第２の基質を含む第２試薬を
添加して上記と同じ試料中における第２の被検酵
素が関与した第２の酵素反応を行わせること、お
よびその第２の酵素反応が進行している反応液を
複数回測光して上記第２の被検酵素の活性値を定
量すること、を特徴とする。
第１の酵素反応の反応液を測定する波長と、第
２の酵素反応の反応液を測定する波長は、異なる
場合もあるし、同じ場合もある。例えば、被検酵
素が乳酸脱水素酵素（LDH）とロイシンアミノ
ペプチターゼ（LAP）の２項目である場合には、
測定波長が異なり、被検酵素がグルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）とグルタ
ミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）
の２項目である場合には、測定波長が同じであ
る。
２の酵素反応の反応液を測定する波長は、異なる
場合もあるし、同じ場合もある。例えば、被検酵
素が乳酸脱水素酵素（LDH）とロイシンアミノ
ペプチターゼ（LAP）の２項目である場合には、
測定波長が異なり、被検酵素がグルタミン酸オキ
ザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）とグルタ
ミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）
の２項目である場合には、測定波長が同じであ
る。
本発明の望ましい実施例では、比色法とレート
法併用の多項目同時分析を効率よく行う手段とし
て、反応ラインは同心円上に多数の反応容器を配
置したターンテーブル形の反応デイスクとし、デ
イスク上に検体分注位置、２箇所の試薬分注位置
及び反応容器中の反応液の吸光度を直接計測でき
る様な位置に１個の光度計を設置し、前記反応デ
イスク回転の制御を１サイクルごとに停止と回転
の２相で行う。１サイクルの回転角は360度プラ
ス１ピツチとして、検体と第１の試薬の添加混合
後、第１の反応をサイクルごと例えば１サイクル
を9.5秒停止、20.5秒回転時間の計30秒とすると、
30秒ごとに反応液の吸光度が計測でき、検体中に
含有していた１つの物質に関係する反応の速度が
求められ、それにより当該物質が定量できる。そ
の後第２の試薬を前記容器に添加して、同一検体
中に含有していた第２の物質に、関係する反応を
生じさせ、その後複数のサイクルの吸光度を計測
し、第２の物質を定量する。
法併用の多項目同時分析を効率よく行う手段とし
て、反応ラインは同心円上に多数の反応容器を配
置したターンテーブル形の反応デイスクとし、デ
イスク上に検体分注位置、２箇所の試薬分注位置
及び反応容器中の反応液の吸光度を直接計測でき
る様な位置に１個の光度計を設置し、前記反応デ
イスク回転の制御を１サイクルごとに停止と回転
の２相で行う。１サイクルの回転角は360度プラ
ス１ピツチとして、検体と第１の試薬の添加混合
後、第１の反応をサイクルごと例えば１サイクル
を9.5秒停止、20.5秒回転時間の計30秒とすると、
30秒ごとに反応液の吸光度が計測でき、検体中に
含有していた１つの物質に関係する反応の速度が
求められ、それにより当該物質が定量できる。そ
の後第２の試薬を前記容器に添加して、同一検体
中に含有していた第２の物質に、関係する反応を
生じさせ、その後複数のサイクルの吸光度を計測
し、第２の物質を定量する。
以下本発明の実施例を詳細に説明する。
実施例 １
第１図は本発明の一実施例の装置の概略構成を
示す平面図である。反応デイスク１は、その円周
上に複数個（例えば40個）の測定セルを兼ねた反
応容器２を有し、回転軸３を中心に自由に回転で
きる。試料テーブル４は、その円周上に複数個の
試料容器５を有し、回転軸６を中心に自由に回転
できる。試料の移送はピペツタ７およびサンプリ
ングプローブ８によつて行われ、試薬の分注は分
注器９および１０によつて行われる。
示す平面図である。反応デイスク１は、その円周
上に複数個（例えば40個）の測定セルを兼ねた反
応容器２を有し、回転軸３を中心に自由に回転で
きる。試料テーブル４は、その円周上に複数個の
試料容器５を有し、回転軸６を中心に自由に回転
できる。試料の移送はピペツタ７およびサンプリ
ングプローブ８によつて行われ、試薬の分注は分
注器９および１０によつて行われる。
ここで多項目同時分析を行う場合、図示されて
いない試薬分注器が必要な試薬の数だけ設置され
る。分光器１１は複数検知器を有する多波長同時
測光形であり、光源ランプ１２と相対し、反応デ
イスク１が回転状態にある時に反応容器２の列が
光源ランプ１２からの光束１３を通過する様に構
成してある。光束１３は反応デイスク１が停止状
態にあるときに吐出位置２５から時計方向に数え
て、例えば31番目の反応容器２の中心を透過する
様に配置されている。光束１３の位置と吐出位置
２５の間には排液管２６および洗浄液吐出管２７
が配置され、それぞれ、排液装置２８および洗浄
装置２９に接続されている。
いない試薬分注器が必要な試薬の数だけ設置され
る。分光器１１は複数検知器を有する多波長同時
測光形であり、光源ランプ１２と相対し、反応デ
イスク１が回転状態にある時に反応容器２の列が
光源ランプ１２からの光束１３を通過する様に構
成してある。光束１３は反応デイスク１が停止状
態にあるときに吐出位置２５から時計方向に数え
て、例えば31番目の反応容器２の中心を透過する
様に配置されている。光束１３の位置と吐出位置
２５の間には排液管２６および洗浄液吐出管２７
が配置され、それぞれ、排液装置２８および洗浄
装置２９に接続されている。
第２図は第１図の実施例の電気系統を示すブロ
ツク線図である。電気系全体の構成はマルチプレ
クサ１４、対数変換増幅器１５、Ａ／Ｄ変換器１
６、中央処理装置１７、読出専用記憶装置１８、
読出書込記憶装置１９、プリンタ２０、操作パネ
ル２１、機構部駆動回路２２から成り立ち、バス
ライン２３で接続されている。
ツク線図である。電気系全体の構成はマルチプレ
クサ１４、対数変換増幅器１５、Ａ／Ｄ変換器１
６、中央処理装置１７、読出専用記憶装置１８、
読出書込記憶装置１９、プリンタ２０、操作パネ
ル２１、機構部駆動回路２２から成り立ち、バス
ライン２３で接続されている。
以下、図に従つて第１図の実施例の動作原理を
説明する。被測定試料、例えば血清を収容した試
料容器５がサンプリング位置３０に供給されると
ピペツタ７のプローブ８の先端が上記試料容器５
内に浸漬され、血清の一定量を吸入し、プローブ
８内に保持する。その後、プローブ８は反応デイ
スク１の吐出位置２５まで移動し、吐出位置２５
に移送されている反応容器２内にプローブ８で保
持していた血清を吐出する。上記サンプリング動
作が終ると反応デイスク１は時計方向に間欠的な
回転移動を開始し、反応デイスク１上に反応容器
２の全数より１つ多い数の反応容器２、例えば41
個の反応容器２が吐出位置２５を通過するに必要
な角度だけ、即ち369度だけ回転して停止する。
説明する。被測定試料、例えば血清を収容した試
料容器５がサンプリング位置３０に供給されると
ピペツタ７のプローブ８の先端が上記試料容器５
内に浸漬され、血清の一定量を吸入し、プローブ
８内に保持する。その後、プローブ８は反応デイ
スク１の吐出位置２５まで移動し、吐出位置２５
に移送されている反応容器２内にプローブ８で保
持していた血清を吐出する。上記サンプリング動
作が終ると反応デイスク１は時計方向に間欠的な
回転移動を開始し、反応デイスク１上に反応容器
２の全数より１つ多い数の反応容器２、例えば41
個の反応容器２が吐出位置２５を通過するに必要
な角度だけ、即ち369度だけ回転して停止する。
上記反応デイスク１の回転によつて上記サンプ
リング動作でサンプリングされた試料の入つた反
応容器２は吐出位置２５より反応容器１ピツチ分
即ち角度９度だけ時計方向に進んだ位置に来て停
止していることになる。上記反応デイスク１の回
転中に反応デイスク１上の全ての反応容器２は光
束１３を通過する。従つて、それぞれの反応容器
２が光束１３を通過するときには分光器１１によ
り光吸収測定がなされ、分光器１１の出力はマル
チプレクサ１４により現在必要な測定波長の信号
が選択され、Ａ／Ｄ変換器１６により中央処理装
置１７に取り込まれて読出書込記憶装置１９に記
憶される。
リング動作でサンプリングされた試料の入つた反
応容器２は吐出位置２５より反応容器１ピツチ分
即ち角度９度だけ時計方向に進んだ位置に来て停
止していることになる。上記反応デイスク１の回
転中に反応デイスク１上の全ての反応容器２は光
束１３を通過する。従つて、それぞれの反応容器
２が光束１３を通過するときには分光器１１によ
り光吸収測定がなされ、分光器１１の出力はマル
チプレクサ１４により現在必要な測定波長の信号
が選択され、Ａ／Ｄ変換器１６により中央処理装
置１７に取り込まれて読出書込記憶装置１９に記
憶される。
上記の反応デイスク１の回転および停止してい
る間の時間を例えば30秒とすると、30秒を１サイ
クルとして上記動作を繰返す。上記サイクルが進
むにつれてサンプリングされた特定の被測定試料
は、反応デイスク１が停止している状態での位置
が反応容器１ピツチ分ずつ時計方向に進んで行
く。分注器９と分注器１０の配管は例えば反応デ
イスク１の停止状態において、それぞれ吐出位置
２５より数えて時計方向に１番目と16番目の反応
容器２の上に設置されており、特定の被測定試料
について見ると吐出位置１に添加された第１試薬
により第１グループの反応が開始され、それより
15サイクル目に分注器１０により第２の試薬が添
加され第２の反応が開始される。
る間の時間を例えば30秒とすると、30秒を１サイ
クルとして上記動作を繰返す。上記サイクルが進
むにつれてサンプリングされた特定の被測定試料
は、反応デイスク１が停止している状態での位置
が反応容器１ピツチ分ずつ時計方向に進んで行
く。分注器９と分注器１０の配管は例えば反応デ
イスク１の停止状態において、それぞれ吐出位置
２５より数えて時計方向に１番目と16番目の反応
容器２の上に設置されており、特定の被測定試料
について見ると吐出位置１に添加された第１試薬
により第１グループの反応が開始され、それより
15サイクル目に分注器１０により第２の試薬が添
加され第２の反応が開始される。
さらにサイクルが進み、反応デイスク１が停止
している状態における反応容器２の位置が光束１
３を越えて光束１３と吐出位置２５の間にある反
応容器２内の試料は測定終了の試料であり、排液
管２６を通して排液装置２８により吸引排液され
る。また洗浄液吐出管２７を通じて洗浄装置２９
より洗浄液（通常は蒸留水）が吐出される。次の
反応デイスク１の停止時にこの反応容器２の洗浄
液は上記と同様にして最後の排液が行われ、さら
にサイクルが進んで吐出位置２５より再度反応容
器２として使用される。
している状態における反応容器２の位置が光束１
３を越えて光束１３と吐出位置２５の間にある反
応容器２内の試料は測定終了の試料であり、排液
管２６を通して排液装置２８により吸引排液され
る。また洗浄液吐出管２７を通じて洗浄装置２９
より洗浄液（通常は蒸留水）が吐出される。次の
反応デイスク１の停止時にこの反応容器２の洗浄
液は上記と同様にして最後の排液が行われ、さら
にサイクルが進んで吐出位置２５より再度反応容
器２として使用される。
以上の動作は読出専用記憶装置１８内のプログ
ラムに従つて中央処理装置１７により機構部駆動
回路２２を通じて各機構部が制御される。操作パ
ネル２１は測定条件の入力、測定開始、および測
定停止等の操作に使用される。以上の動作で１サ
イクルにおける反応デイスク１の停止時間を9.5
秒、回転時間を20.5秒とすると、特定試料に着目
した場合、その試料の反応過程は29.5秒毎に31回
測定され、合計15分15秒間の測定データが読出書
込記憶装置１９に記憶されている。中央処理装置
１７は読出専用記憶装置１８のプログラムに従つ
て作動し、読出書込記憶装置１９内の31個の測定
データから予定のプログラムに従つて必要なデー
タを抽出し、濃度演算等の処理後プリンタ２０に
出力される。
ラムに従つて中央処理装置１７により機構部駆動
回路２２を通じて各機構部が制御される。操作パ
ネル２１は測定条件の入力、測定開始、および測
定停止等の操作に使用される。以上の動作で１サ
イクルにおける反応デイスク１の停止時間を9.5
秒、回転時間を20.5秒とすると、特定試料に着目
した場合、その試料の反応過程は29.5秒毎に31回
測定され、合計15分15秒間の測定データが読出書
込記憶装置１９に記憶されている。中央処理装置
１７は読出専用記憶装置１８のプログラムに従つ
て作動し、読出書込記憶装置１９内の31個の測定
データから予定のプログラムに従つて必要なデー
タを抽出し、濃度演算等の処理後プリンタ２０に
出力される。
ここで本発明の具体化例である乳酸脱水素酵素
（LDH）とロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）
の２成分分析法を上述した装置に適用した場合に
ついて述べる。この場合の好適な試薬組成の１例
として、次の組成の溶液が使用できる。
（LDH）とロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）
の２成分分析法を上述した装置に適用した場合に
ついて述べる。この場合の好適な試薬組成の１例
として、次の組成の溶液が使用できる。
第１試薬
ピルビン酸 0.6ｍ mole／
リン酸塩緩衝剤（PH7.5） 50ｍ mole／
NADH 0.18ｍ mole／
第２試薬
Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド
3.2ｍ mole／ リン酸塩緩衝剤（PH7.5） 400ｍ mole／ 装置の測定条件は次のようである。
3.2ｍ mole／ リン酸塩緩衝剤（PH7.5） 400ｍ mole／ 装置の測定条件は次のようである。
検体量 20μ
第１試薬量 500μ
第２試薬量 250μ
反応温度 25℃
測定波長１ 340nm／376nm
測定波長２ 405nm／505nm
上記の第１試薬、第２試薬を分注器９，１０に
それぞれセツトし、検体を試料テーブル４にセツ
トし、分析スタートの命令を操作パネルより与え
ると、装置は上述した動作原理によつて作動す
る。今反応容器２内の反応を追跡すると、検体と
第一試薬が混合された時点から次の(1)式の反応が
進行する。検体中の第１の被検酵素であるLDH
は、第１の基質であるピルビン酸に作用し、補酵
素のNADHをLDHの含有量に応じてNADに変
える。
それぞれセツトし、検体を試料テーブル４にセツ
トし、分析スタートの命令を操作パネルより与え
ると、装置は上述した動作原理によつて作動す
る。今反応容器２内の反応を追跡すると、検体と
第一試薬が混合された時点から次の(1)式の反応が
進行する。検体中の第１の被検酵素であるLDH
は、第１の基質であるピルビン酸に作用し、補酵
素のNADHをLDHの含有量に応じてNADに変
える。
ビルピン酸＋NADHLDH
――→
乳酸＋NAD …(1)
つづいて7.5分後に第２試薬を添加すると、上
記の(1)式と平行して次の(2)式の反応が開始する。
(1)式の反応が進んでいる反応液内において、検体
中の第２の被検酵素であるLAPは、第２の基質
であるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドに作用
し、ｐ−ニトロアニリンを生成する。
記の(1)式と平行して次の(2)式の反応が開始する。
(1)式の反応が進んでいる反応液内において、検体
中の第２の被検酵素であるLAPは、第２の基質
であるＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドに作用
し、ｐ−ニトロアニリンを生成する。
Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド＋H2O
LAP
――→
Ｌ−ロイシン＋ｐ−ニトロアニリン
…(2) ここで(1)式の反応速度はNADHを340nm／
376nmの２波長測光の吸光度を追跡すれば計測す
ることができ、この速度はLDHの活性量に比例
するものである。又(2)式の反応の速度はｐ−ニト
ロアニリンの生成速度を405nm／505nmの２波長
測光の吸光度を追跡して測定でき、この方法で求
めた反応速度はLAPの活性量に比例するもので
ある。
…(2) ここで(1)式の反応速度はNADHを340nm／
376nmの２波長測光の吸光度を追跡すれば計測す
ることができ、この速度はLDHの活性量に比例
するものである。又(2)式の反応の速度はｐ−ニト
ロアニリンの生成速度を405nm／505nmの２波長
測光の吸光度を追跡して測定でき、この方法で求
めた反応速度はLAPの活性量に比例するもので
ある。
第３図に示す様に、この２つの組合せの場合に
は第２試薬の添加時点Ｂで測定波長を、第１試薬
による反応測定用の340nm／376nmから、
405nm／505nmに切換えると、(1)式の反応成分に
は当該波長に吸収のある成分がないので、(2)式の
反応のみが計測できる。第３図において、Ａは第
１試薬添加時点である。Ａ点とＢ点の間では
LDH反応が行われ、Ｂ点以降ではLAP反応が行
われる。
は第２試薬の添加時点Ｂで測定波長を、第１試薬
による反応測定用の340nm／376nmから、
405nm／505nmに切換えると、(1)式の反応成分に
は当該波長に吸収のある成分がないので、(2)式の
反応のみが計測できる。第３図において、Ａは第
１試薬添加時点である。Ａ点とＢ点の間では
LDH反応が行われ、Ｂ点以降ではLAP反応が行
われる。
実施例 ２
次にグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナ
ーゼ（GOT）とグルタミン酸ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（GPT）の２成分同時分析の例に
ついて、本発明の具体例を説明する。この場合の
好適な試薬組成の１例として、次の組成の溶液が
使用できる。
ーゼ（GOT）とグルタミン酸ピルビン酸トラン
スアミナーゼ（GPT）の２成分同時分析の例に
ついて、本発明の具体例を説明する。この場合の
好適な試薬組成の１例として、次の組成の溶液が
使用できる。
第１試薬は次の組成である。
α−ケトグルータール酸 18ｍ mole／
Ｌ−アスパラギン酸 200ｍ mole／
NADH 0.18ｍ mole／
MDH 0.6u／ml
LDH 1.2u／ml
リン酸塩緩衝剤（PH7.4） 80ｍ mole／
第２試薬は次の組成である。
Ｌ−アラニン 6.4ｍ mole／
リン酸塩緩衝剤（PH7.4） 80ｍ mole／
装置の測定条件は次のようである。
検体量 20μ
第１試薬量 350μ
第２試薬量 50μ
反応温度 25℃
測定波長 340nm／376nm
実施例１に記載の装置に適用すると、第１試薬
添加後、(3)、(4)式の反応が進行する。
添加後、(3)、(4)式の反応が進行する。
Ｌ−アスパラギン酸＋α−ケトグルタール酸
GOD
――→
グルタミン酸＋オキザロ酢酸 …(3)
オキザロ酢酸＋NADH
MDH
――→
リンゴ酸＋NAD …(4)
つづいて第２試薬を添加すると(3)、(4)式の反応
と並行して(5)式と(1)′式の反応が進行する。
と並行して(5)式と(1)′式の反応が進行する。
Ｌ−アラニン＋α−ケトグルタール酸GPT
――→
グルタミン酸＋ピルビン酸 …(5)
ピルビン酸＋NADHLDH
――→
乳酸＋NAD …(1)′
(3)式において、第１の基質であるＬ−アスパラ
ギン酸はα−ケトグルタール酸の共存下で検体中
の第１の被検酵素であるGOTの作用によつてオ
キザロ酢酸を生成し、この生成されたオキザロ酢
酸が(4)式の反応に関与する。すなわち、この例で
は、第１の被検酵素が関与した第１の酵素反応は
(3)式と(4)式を含む反応である。また、(5)式におい
て第２の基質であるＬ−アラニンはα−ケトグル
タール酸の共存下で検体中の第２の被検酵素であ
るGPTの作用によつてピルビン酸を生成し、こ
の生成されたピルビン酸が(1)′式の反応に関与す
る。すなわち、第２の被検酵素が関与した第２の
酵素反応は、(5)式と(1)′式を含む反応である。な
お、(1)′式のLDHは第１試薬に含有されているも
のである。
ギン酸はα−ケトグルタール酸の共存下で検体中
の第１の被検酵素であるGOTの作用によつてオ
キザロ酢酸を生成し、この生成されたオキザロ酢
酸が(4)式の反応に関与する。すなわち、この例で
は、第１の被検酵素が関与した第１の酵素反応は
(3)式と(4)式を含む反応である。また、(5)式におい
て第２の基質であるＬ−アラニンはα−ケトグル
タール酸の共存下で検体中の第２の被検酵素であ
るGPTの作用によつてピルビン酸を生成し、こ
の生成されたピルビン酸が(1)′式の反応に関与す
る。すなわち、第２の被検酵素が関与した第２の
酵素反応は、(5)式と(1)′式を含む反応である。な
お、(1)′式のLDHは第１試薬に含有されているも
のである。
(3)式の反応速度は検体中のGOT濃度に比例し、
(3)式に共役させた(4)式のNADHの減少速度にも
比例し、NADHの減少速度は340nm／376nmで
の吸光度で計測できる。また、(5)式の反応速度は
検体中のGPT濃度に比例し、(1)′式のNADHの
減少速度にも比例するので、340nm／376nmでの
吸光度で計測できる。すなわち第４図に示すよう
に、第１試薬添加後の15サイクル、7.5分間の15
個の吸光度データから、１分間あたりの吸光度の
変化量x1を求めると、GOTの活性量Y1は Y1＝x1×V1×1000／ε×ｄ×ｖ …(6) として求められる。ここで V1：全反応液量（Ｖ＝370μ） ε：分子吸光係数（ε＝4.20） ｄ：光路長 （ｄ＝１cm） ｖ：検体量 （ｖ＝20μ） (6)式のY1は Y1＝x1×370×1000／4.20×１×20＝x1×4405…(7) として求められる。次に第２試薬添加後の15個の
吸光度データから求めた１分間あたりの吸光度の
変化量x2はGOTとGPTの加算した量（Y2）に比
例する。すなわち Y2＝x2×V2×1000／ε×ｄ×ｖ …(8) となり、V2＝420μであるので、 Y2＝x2×420×1000／4.20×１×20＝x2×5000…(9) したがつて、GPTの活性量Y3は Y3＝Y2−Y1 として求められる。第４図において、Ａは第１試
薬添加時点、Ｂは第２試薬添加時点を示す。
(3)式に共役させた(4)式のNADHの減少速度にも
比例し、NADHの減少速度は340nm／376nmで
の吸光度で計測できる。また、(5)式の反応速度は
検体中のGPT濃度に比例し、(1)′式のNADHの
減少速度にも比例するので、340nm／376nmでの
吸光度で計測できる。すなわち第４図に示すよう
に、第１試薬添加後の15サイクル、7.5分間の15
個の吸光度データから、１分間あたりの吸光度の
変化量x1を求めると、GOTの活性量Y1は Y1＝x1×V1×1000／ε×ｄ×ｖ …(6) として求められる。ここで V1：全反応液量（Ｖ＝370μ） ε：分子吸光係数（ε＝4.20） ｄ：光路長 （ｄ＝１cm） ｖ：検体量 （ｖ＝20μ） (6)式のY1は Y1＝x1×370×1000／4.20×１×20＝x1×4405…(7) として求められる。次に第２試薬添加後の15個の
吸光度データから求めた１分間あたりの吸光度の
変化量x2はGOTとGPTの加算した量（Y2）に比
例する。すなわち Y2＝x2×V2×1000／ε×ｄ×ｖ …(8) となり、V2＝420μであるので、 Y2＝x2×420×1000／4.20×１×20＝x2×5000…(9) したがつて、GPTの活性量Y3は Y3＝Y2−Y1 として求められる。第４図において、Ａは第１試
薬添加時点、Ｂは第２試薬添加時点を示す。
上述したような実施例によれば検体の無駄がな
く、処理分析数が多く、しかも操作が簡単にて成
分が１度に分析でき、効率の良い多項目同時分析
システムとして適用できる。
く、処理分析数が多く、しかも操作が簡単にて成
分が１度に分析でき、効率の良い多項目同時分析
システムとして適用できる。
以上説明した通り本発明によれば、１回の検体
サンプリングによる１個の反応容器内で、複数の
反応を時間差をつけて段階的に生ぜしめ、そのつ
ど反応液の変化速度を計測することにしたので、
分析項目数と同数の反応容器が必要であつた従来
の方法に比べて反応容器の数を減少でき、かつ１
つの反応容器に対応して複数の被検酵素を測定で
きるにもかかわらずその反応容器への試料サンプ
リングは１回で済むので、貴重な試料の消耗量を
少なくできる。
サンプリングによる１個の反応容器内で、複数の
反応を時間差をつけて段階的に生ぜしめ、そのつ
ど反応液の変化速度を計測することにしたので、
分析項目数と同数の反応容器が必要であつた従来
の方法に比べて反応容器の数を減少でき、かつ１
つの反応容器に対応して複数の被検酵素を測定で
きるにもかかわらずその反応容器への試料サンプ
リングは１回で済むので、貴重な試料の消耗量を
少なくできる。
第１図は本発明を適用した自動分析装置の概略
構成の説明図、第２図は第１図の自動分析装置に
おける電気系統を示すブロツク線図、第３図は
LDHとLAPの同時分析の反応過程を示す線図、
第４図はGOTとGPTの同時分析の反応過程を示
す線図である。 １…反応デイスク、２…反応容器、５…試料容
器、７…ピペツタ、９，１０…試薬分注器、１１
…分光器。
構成の説明図、第２図は第１図の自動分析装置に
おける電気系統を示すブロツク線図、第３図は
LDHとLAPの同時分析の反応過程を示す線図、
第４図はGOTとGPTの同時分析の反応過程を示
す線図である。 １…反応デイスク、２…反応容器、５…試料容
器、７…ピペツタ、９，１０…試薬分注器、１１
…分光器。
Claims (1)
- １ 試料と酵素反応用基質を混合し、基質の減少
速度又は生成物の増加速度を測定することにより
試料中の酵素の活性値を定量する分析方法におい
て、反応容器列を第１および第２の試料添加位置
を通るように移送すること、上記反応容器列中の
特定の反応容器内で、第１の被検酵素によつて変
化され得る第１の基質を含む第１試薬と試料とを
混合して上記試料中の上記第１の被検酵素が関与
した第１の酵素反応を行わせること、上記第１試
薬は上記第１の試薬添加位置にて上記反応容器へ
添加されること、上記第１の酵素反応が進行して
いる反応液を複数回測光して上記第１の被検酵素
の活性値を定量すること、上記第１の酵素反応が
生じた反応液を含む上記反応容器に、第２の被検
酵素によつて変化され得る第２の基質を含む第２
試薬を添加し上記試料中の上記第２の被検酵素が
関与した第２の酵素反応を行わせること、上記第
２試薬は上記第２の試薬添加位置にて上記反応容
器へ添加されること、および上記第２の酵素反応
が進行している反応液を複数回測光して上記第２
の被検酵素の活性値を定量すること、を特徴とす
る複数の酵素活性値分析方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12109380A JPS5747491A (en) | 1980-09-03 | 1980-09-03 | Method of determining activities of a plurality of enzymes and the system therefor |
| DE8181302354T DE3175289D1 (en) | 1980-05-30 | 1981-05-28 | Method for operating an apparatus for analysing samples optically |
| EP81302354A EP0041366B1 (en) | 1980-05-30 | 1981-05-28 | Method for operating an apparatus for analysing samples optically |
| US06/574,586 US4668617A (en) | 1980-05-30 | 1984-01-27 | Apparatus and method for optically analyzing a plurality of analysis items in a sample in a container |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12109380A JPS5747491A (en) | 1980-09-03 | 1980-09-03 | Method of determining activities of a plurality of enzymes and the system therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5747491A JPS5747491A (en) | 1982-03-18 |
| JPH0146113B2 true JPH0146113B2 (ja) | 1989-10-05 |
Family
ID=14802696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12109380A Granted JPS5747491A (en) | 1980-05-30 | 1980-09-03 | Method of determining activities of a plurality of enzymes and the system therefor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5747491A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5327494A (en) * | 1976-08-27 | 1978-03-14 | Hitachi Ltd | Enzyme analysis and apparatus therefor |
-
1980
- 1980-09-03 JP JP12109380A patent/JPS5747491A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5747491A (en) | 1982-03-18 |
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