JPH0146117B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な酵素、Ｌ−フエニルアラニン
オキシダーゼを用いてＬ−フエニルアラニンを定
量する方法に関する。 Ｌ−フエニルアラニンは必須アミノ酸の１つ
で、食品、アミノ酸輸液などの医薬品等に用いら
れ、またフエニルケトン症などのＬ−フエニルア
ラニン代謝異常の診断においても、Ｌ−フエニル
アラニンの定量は重要な意味を有する。しかし、
Ｌ−フエニルアラニンを酵素を用いて簡便かつ高
感度に定量する方法は知られていない。 従来、Ｌ−フエニルアラニンに作用するオキシ
ダーゼとしてはＬ−アミノ酸オキシダーゼ及びＬ
−フエニルアラニン水酸化酵素が知られている。 Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、例えばＬ−フエ
ニルアラニンに対しては次式 で表わされる作用を有しており、種々の微生物、
蛇毒、ラツト腎臓などにその存在が報告されてい
る〔ジヤーナル・オブ・バクテリオロジイ（J.
Bacteriol.）Vol.121、No.２、P.656（1975）、ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）Vol.235、P.2013（1960）〕。しか
しＬ−フエニルアラニンに基質特異性の高いＬ−
アミノ酸オキシダーゼは知られておらず、Ｌ−フ
エニルアラニンの定量には利用できなかつた。 また、Ｌ−フエニルアラニン水酸化酵素は次式 に示す作用を有しており、ネズミ肝臓、微生物等
にその存在が報告されている〔ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、Vol.226、
P.551（1957）〕が、該酵素はＬ−フエニルアラニ
ンに対する基質特異性は高いものの補酵素（テト
ラヒドロビオプテリン）を介して他の反応と共役
し複雑な反応系を必要とする。 そこで本発明者らは、かかる現況に鑑みＬ−フ
エニルアラニンに特異的に作用する酵素について
鋭意研究を重ねた結果、シユードモナス
（Pseudomonas）属に属する細菌がＬ−フエニル
アラニンに対し極めて高い特異性を有し、かつ従
来にない高Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼ活
性をもつ酵素を生産することを見い出し、該酵素
をＬ−フエニルアラニンの定量に応用すべく研究
を重ねた結果、該酵素を酸素の存在下、試料中の
Ｌ−フエニルアラニンに作用させて、酸化的に脱
炭酸する反応と酸化的に脱アミノする反応にとも
ない消費される酸素量又は生成する過酸化水素、
炭酸ガス、アンモニア、フエニルアセトアミド若
しくはフエニルピルビン酸を定量することによ
り、簡便かつ高感度にＬ−フエニルアラニンを特
異的に定量できることを知見し、本発明を完成す
るに至つた。 以下、本発明を詳細に説明する。 先ず本発明に用いられる新規なＬ−フエニルア
ラニンオキシダーゼの理化学的性質を以下に記載
する。 作用及び基質特異性 酸素の存在下でＬ−フエニルアラニンを酸化的
に脱炭酸し、フエニルアセトアミド、炭酸ガスと
水を生成する反応式〔〕 で表わされる反応並びに酸素の存在下でＬ−フエ
ニルアラニンを酸化的に脱アミノしてフエニルピ
ルビン酸、アンモニアと過酸化水素を生成する反
応式〔〕 で表わされる反応を触媒する作用を有する。そし
てＬ−フエニルアラニンに極めて高い基質特異性
を示し、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−スレオニンには作用しない。 至適PH及び安定PH 緩衝液として酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液を用いて新規なＬ−フエニルアラニンオ
キシダーゼのＬ−フエニルアラニンに対する酵素
活性（酸素消費量）を測定した結果、第１図に示
す如く至適PHは５〜10と広い範囲にわたり、また
第２図に示す如く安定PHの範囲は6.5〜10である。 力価の測定 方法−１ 酸素消費法 密閉型反応容器に1Mリン酸カリウム緩衝液
（PH6.8）0.27ml、酵素液0.1mlを入れ総量を水で
2.6mlとする。酸素電極（ベツクマン社製）を挿
入し、反応容器内を撹拌しつつ37℃恒温とする。
あらかじめ37℃に保温した27mML−フエニルア
ラニンを0.1ml添加、反応を開始し、経時的に酸
素の消費量をオキシゲンアナライザー（ベツクマ
ン社製）にて測定する。酵素活性は１分間に1μ
モルの酸素を消費する活性を１単位とする。 方法−２ 過酸化水素法 1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.8）0.3ml、
10mML−フエニルアラニン0.3ml、４−アミノア
ンチピリン（0.005％）、フエノールあるいはＮ，
Ｎ−ジメチルアニリン（0.02％）、パーオキシダ
ーゼ（４単位）及び酵素液を添加し、総量を３ml
とし、37℃、10分間反応させた後、生成する色素
の可視部吸収（550nm）を測定し、標準曲線（検
量線）より過酸化水素の生成量を算出する。 方法−３フエニルアセトアミド、フエニルピル
ビン酸の定量 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.8）0.8mlに
10mMのＬ−フエニルアラニン0.1mlを加えた後
酵素液0.1mlを加え、37℃で10分間反応させた。
この反応液を適量とりあらかじめ調整した高速液
体クロマトグラフイー（カラム：LS410、カラム
サイズ４mmID×250mmＬ、Mobile phase：メタ
ノール：0.1Mリン酸カリウム緩衝液＝10：90、
温度60℃、デテクター：UV220nm）にて分離後
各ピーク高を標準品のピーク高から換算し、フエ
ニルアセトアミド量、フエニルピルビン酸を定量
した。 作用適温の範囲 高速液体クロマトグラフイによりフエニルアセ
トアミド及びフエニルピルビン酸の生成量を測定
したところ第３図に示す如く20〜60℃であつた。 PH、温度などによる失活条件 第４図に示すように65℃、10分間の熱処理では
安定であり、PH４〜９で４℃、１夜放置後酵素活
性（酸素消費法）を測定するとPH6.5〜９で安定
である。PH４以下で失活する 阻害、活性化及び安定化 各重金属イオン（1.8mM）又は阻害剤
（1mM）を加え酵素活性（酸素消費法）を測定し
たところ第１表に示すごとくバリウムイオン、カ
ドミウムイオン、銅イオンにより強く阻害され
た。 なお第１表中の相対活性は、金属イオン又は阻
害剤無添加時の活性に対する添加時の活性比で示
したものである。

【表】 分子量 本酵素の分子量は高速液体クロマトグラフイー
（G3000sw×１、東洋曹達工業株式会社）による
ゲル過法により測定した結果、約67000であり、
セフアデツクスＧ−200によるゲル濾過法では
140000である。 これらの結果から本酵素は同一分子量の同じサ
ブユニツト２ケから構成されていると考えられ
る。 均一性 ポアサイズ7.5％のアクリルアミドゲル（PH
9.4）を用いて常法によりアクリルアミドデイス
ク電気泳動を行つた結果、第５図に示す通り単一
のバンドが認められた。 等電点 デイスクゲル焦点電気泳動法により測定した結
果、4.83である。 アミノ酸分析値 アスパラギン酸55、スレオニン28、セリン34、
グルタミン酸41、グリシン49、アラニン72、1/2
−シスチン３〜４、バリン47、メチオニン６、イ
ソロイシン24、ロイシン50、チロシン30、フエニ
ルアラニン21、リジン17、ヒスチジン13、アルギ
ニン30、プロリン34、トリプトフアン14. 本発明方法により新規なＬ−フエニルアラニン
オキシダーゼを用いて、例えば0.1Mリン酸カリ
ウム緩衝液（PH6.8）、反応温度37℃、10分の反応
条件下でＬ−フエニルアラニンに作用させた場合
には、Ｌ−フエニルアラニン１モルにつき、１モ
ルの酸素を要求し、反応式〔〕に従つて0.85モ
ルのフエニルアセトアミド、0.85モルの炭酸ガス
及び反応式〔〕に従つて0.15モルのフエニルピ
ルビン酸、0.15モルのアンモニア、0.15モルの過
酸化水素を生成する。 しかしＬ−フエニルアラニン以外の基質につい
ては酸素の存在下、酸下的脱炭酸反応と酸化的脱
アミノ反応との割合はそれぞれ異なり、全反応に
対する酸化的脱アミノ反応の割合は第２表、Ａ欄
に示す如くである。 前記条件で本発明酵素の基質特異性を、Ｌ−フ
エニルアラニンに対する各基質の相対活性（％）
でみると第２表の如くであつて、従来のＬ−アミ
ノ酸オキシダーゼとは全く異つた基質特異性を有
し、かつ極めて高いＬ−フエニルアラニンオキシ
ダーゼ活性を示すことから該酵素は公知の何れの
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとも異つており、新規
な酵素と認められる。

【表】

【表】 次に新規なＬ−フエニルアラニンオキシダーゼ
を製造するための具体的手段について以下に述べ
る。 先ず製造原料としては、如何なる起源のもので
もよいが、例えば微生物起源、殊にシユードモナ
ス（Pseudomonas）属に属し、新規なＬ−フエ
ニルアラニンオキシダーゼを生成する能力を有す
る菌株を用いるのが本酵素を製造する上で特に有
利である。 そしてシユードモナス属に属する菌株の具体例
としては、シユードモナスsp.P−501が挙げられ、
又この菌の変種若しくは変異株も用いることがで
きる。 上記したシユードモナスsp.P−501は、本発明
者が土壌中より新たに分離した菌株で、その菌学
的性質は以下に示す通りである。 なお菌学的性質は概ねマニユアル・オブ・マイ
クロバイオロジカル・メソツヅ（マグロー・ヒ
ル・ブツク・カンパニー社出版、1959年）記載の
方法に準拠した。 (a) 形態 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地で30℃、16時間培
養） 細胞の形および大きさ：0.5〜1.0×1.5〜
3.0ミクロンの桿菌 細胞の多形性：認められない。 運動性：極毛を有し、運動性有り。 胞子の有無：形成せず。 グラム染色性：陰性。 抗酸性：陰性。 (b) 各培地における生育状態 肉汁寒天板培養 30℃、24時間で黄緑色のコロニー、表面や
や粗面で鈍い光沢を有し、不透明である。黄
緑色の拡散性色素を有する。 肉汁寒天斜面培養 生育は良好でコロニーの色は黄緑色。 肉汁液体培養 均一によく生育し、濁度有り。 肉汁ゼラチン穿刺培養 30℃、４日間でやや生育し、液化する。 リトマスミルク：わずかにアルカリ。 (c) 生理的性質 硝酸塩の還元 ：陽性。 脱窒反応 ：陰性。 MRテスト ：陰性。 VPテスト ：陰性。 インドールの生成：陰性。 硫化水素の生成 ：陰性。 デンプンの加水分解：陰性 クエン酸の利用 ：クリステンセンの培地
利用。 無機窒素源の利用：陽性。 色素の生成：黄緑色の水溶性色素を生成す
る。 ウレアーゼ ：陰性。 オキシダーゼ ：陽性。 カタラーゼ ：陽性。 生育の範囲：至適PH５〜８、至適温度25〜
30℃。 酸素に対する態度：好気性。 Ｏ−Ｆテスト ：酸化性。 糖類から酸およびガスの生成

【表】

【表】 (d) 諸性質 DL−アルギニンを唯一の炭素源として生
育することができる。 上述の新規なＬ−フエニルアラニンオキシダー
ゼ生産能を有する本菌の分類学的諸性質を「バー
ジエイス・マニユアル・オブ・デタミネイテイ
ブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）の分類
と対比すると、本菌株はグラム染色が陰性、好気
性の無胞子桿菌で鞭毛を有し、運動性があり、か
つカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陽性等により、
シユードモナス属に属し、シユードモナス・マー
ジナタ、シユードモナス・セパシアに近縁な株と
目されるが、その分離源及びメサコン膜、Ｄ−酒
石酸、ラムノース、トリプタミンなどの炭素源が
利用できない等の生理的性質において相違点があ
る。 以上の理由により、本菌をシユードモナスsp.P
−501と命名した。 なお、シユードモナスsp.P−501は工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第5887号とし
て寄託されている。 次に上記の新規なＬ−フエニルアラニンオキシ
ダーゼを生産する能力を有する菌を用いるＬ−フ
エニルアラニンオキシダーゼの製造について述べ
る。 本発明において上記の新規なＬ−フエニルアラ
ニンオキシダーゼを生産する能力を有する菌を培
養するのに用いられる培地としては、シユードモ
ナス属に属する微生物の培養に用いられる培地が
挙げられる。培地の窒素源としては利用可能な窒
素化合物又はこれを含有するものであればよく、
例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、大豆、
アミノ酸、硫安、硝酸カリウム、尿素等の１種以
上の有機若しくは無機の窒素源が用いられる。炭
素源としては例えばグルコース、ガラクトース、
キシロース等の炭水化物、レブリン酸等の有機酸
が挙げられる。無機塩類としてはリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第１鉄、塩化ナトリウム等が適宜用いられ、必要
により菌の生育あるいは酵素生産に必要な各種の
有機物、無機物、ビタミンなどを添加したものが
培地として好適に用いられる。 菌の培養は固体培養で行つてもよいが通常液体
培養法を採用するのが好ましく、振盪培養、撹拌
培養、通気培養等により好気的に菌の培養を行
う。工業的には液体培地を用い、通気撹拌深部培
養するのが好ましい。 培養温度は10〜40℃、好ましくは25〜35℃付近
である。培養時のPHは５〜８が好ましい。培養時
間は培養形態によつても異なるが、14〜72時間で
ある。 かくして得られた培養物からの該酵素の抽出、
精製には、一般の酵素の抽出、精製法を用いるこ
とができる。 例えば適当な方法により培養物から菌体を分離
したのち、その菌体を摩毛剤の存在下ですりつぶ
す方法、リゾチーム等の加水分解酵素を用いる方
法、超音波エネルギーを適用する方法、浸透圧シ
ヨツクを適用する方法等の公知の方法により破壊
するか、又はトリトンＸ−100のような界面活性
剤、トルエン等の存在下で振盪もしくは放置し、
又は自己消化等により本酵素を菌体外に排出させ
た後、該溶液を過法、遠心分離方法などの適当
な操作により処理し、固形物を除去して菌体抽出
液を得るか、又は水、緩衝液若しくは適当な溶剤
で抽出し、これをそのまま粗酵素液として得る。
また通常の酵素回収法、即ち該抽出液に必要によ
り凍結乾燥法、硫安等による塩析法、アルコール
類、アセトン類を用いる有機溶媒沈殿法などを適
宜選択して実施することにより粗酵素粉末を得る
こともできる。 上記粗酵素液若しくは粗酵素粉末よりさらに精
製酵素標品を得るには、例えばセフアデツクス若
しくはバイオゲル等を用いるゲル過法、イオン
交換体を用いる吸着溶出法、ハイドロキシアパタ
イトを用いる吸着溶出法、蕉糖密度勾配遠心法等
の沈降法、フエニルセフアロース4Bを用いるア
フイニテイクロマト法、分子ふるい膜若しくは中
空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、組み合
わせて実施することにより、本発明方法で使用で
きる精製された酵素標品を得ることができる。 また培養時間を長くして自己消化を行わせた場
合の培養液についても同様に処理することによ
り本酵素を得ることができる。 本発明方法において、新規なＬ−フエニルアラ
ニンオキシダーゼの調製形態及び精製度合は、Ｌ
−フエニルアラニンの該酵素による分解反応によ
る酸素吸収又は生成物質の検出の種類に応じて適
宜選択される。すなわちＬ−フエニルアラニンの
分解反応及び／又は生成物質の検出系に対して妨
害的に作用する物質を有意に含まない限り、Ｌ−
フエニルアラニンオキシダーゼの酵素剤中に夾雑
物質が存在しても使用できる。 また、定量方法によつては、可溶性酵素あるい
は適宜担体に吸着若しくは不溶化したものとして
調製される。 Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼの酵素反応
条件は、前記のシユードモナス属に属する菌株の
生産酵素の場合、PH4.5〜11の範囲で定量可能で
あり、好ましくはPH６〜10の範囲である。反応時
間は通常10〜20分程度で、温度条件は70℃以下、
好ましくは、30〜65℃である。 また、酵素反応の至適PHを維持する目的で、酵
素反応媒質として各種の緩衝液を使用することが
好ましい。緩衝液としては、前記PH範囲を維持で
き、かつ酵素反応を阻害しないものであればよ
く、例えば通常リン酸緩衝液、トリスー塩酸緩衝
液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が使用できる。 新規なＬ−フエニルアラニンオキシダーゼの使
用量は、酵素反応に充分な量であればよく、通常
0.1〜0.5単位程度である。 本発明方法によるＬ−フエニルアラニンの定量
は、本酵素反応にともなう酸素の消費量又は反応
生成物質である過酸化水素、炭酸ガス、アンモニ
ア、フエニルアセトアミド若しくはフエニルピル
ビン酸の生成量を検出、測定することにより達成
でき、検出のための具体的な方法は特に限定され
ない。 以下に酸素の消費量又は反応生成物質の検出、
測定方法についてその代表的な方法を例示する。 酸素消費量の測定は、常法に従つて行うことが
でき、例えばワールブルグの検圧法、酸素電極法
が用いられる。酸素電極法の応用として酸素電極
の先端部にＬ−フエニルアラニンオキシダーゼを
密着させた酵素電極による方法もある。酵素電極
を用いる場合は、Ｌ−フエニルアラニン含有試料
液中に電極を入れて酸素の消費速度を測定するこ
とによりＬ−フエニルアラニン濃度を求めること
ができる。酸素電極の先端部にＬ−フエニルアラ
ニンオキシダーゼを密着させる方法には、可溶性
酵素を半透膜などにより封入する方法、適当な担
体に化学的若しくは物理的に酵素を固定化したも
のを封入する方法などがある。担体への酵素の固
定化例としては、アクリルアミルゲルに包括させ
る方法、有機高分子粉末に固定化する方法など、
種々の酵素の固定化方法が応用されうる。 過酸化水素の測定としては、過酸化水素電極を
用いる方法や過酸化水素と反応してその色調に変
化を生ずる１種若しくは２種以上の呈色剤からな
る系によつて比色測定する方法が挙げられる。ま
たこの呈色剤としては、例えば生成する過酸化水
素と反応して安定した赤色を形成する４価のチタ
ン化合物とキシレノールオレンジによる反応、あ
るいはフエノールあるいはＮ，Ｎ−ジメチルアニ
リン、４−アミノアンチピリン及びパーオキシダ
ーゼによる反応を利用する方法などが挙げられ
る。呈色剤は必要に応じて、酵素とともに調整し
てもよく、次いでその結果において呈色せしめた
色調を適当な波長にて測定してその検量線より過
酸化水素を定量すればよい。 アンモニアの測定は、アンモニウムイオン電極
を用いる方法やインドフエノール法による比色
法、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ反応とカツプ
リングさせてβ−NADHの減少を340nmの吸収
で定量する方法がある。 二酸化炭素の測定はワールブルグ検圧計を用い
ることにより容易に測定できるが本酵素反応の場
合酸素の吸収も同時に起こるので補正しなければ
ならない。また ¹⁴Cで標識した基質を用いて酵素
反応で放出された二酸化炭素の放射能を測定する
方法も用いることができる。また二酸化炭素電極
を利用することもできる。 フエニルアセトアミド若しくはフエニルピルビ
ン酸を定量する方法としては高速液体クロマトグ
ラフイーにより分離後紫外部吸収で検出、定量す
る方法又はフエニルピルビン酸については一般の
ケト酸を定量する方法等いずれでもよく、例えば
２，４−ジニトロフエニルヒドラジンを用いて生
成するヒドラゾンを定量する方法が利用できる。 以上の様に新規なＬ−フエニルアラニンオキシ
ダーゼを使用してＬ−フエニルアラニンを定量す
る方法は、酵素反応による酸素消費量又は生成す
る過酸化水素、炭酸ガス、アンモニア、フエニル
アセトアミド若しくはフエニルピルビン酸を測定
することによつて、例えば血清中のＬ−フエニル
アラニンの定量測定、Ｌ−フエニルアラニンを用
いた医薬品中のＬ−フエニルアラニンの定量測
定、Ｌ−フエニルアラニン発酵におけるＬ−フエ
ニルアラニンの定量測定、Ｌ−フエニルアラニン
を基質とする酵素などの酵素活性などの種々の分
析に使用され有用なものである。 以下、本発明方法の実施の一例を示して具体的
に説明する。しかしながらこれらは単なる例示で
あつて、本発明方法を何ら限定するものではな
い。 なお、各実施例で使用した新規なＬ−フエニル
アラニンオキシダーゼは後述する参考例の方法に
準じていずれもシユードモナスsp.P−501（微工研
菌寄第5887号）から調製したものである。 実施例 １ 密閉型反応容器に1Mリン酸カリウム緩衝液
（PH6.8）0.27ml、新規Ｌ−フエニルアラニンオキ
シダーゼ液（５単位／ml）0.1mlを入水総量を2.6
mlとする。酸素電極（ベツクマン社製）を挿入
し、反応容器内を撹拌しつつ37℃恒温とする。次
にあらかじめ37℃に保温した標準Ｌ−フエニルア
ラニン溶液（０〜5μモル／ml）又は各試料溶液
0.1mlを添加、反応を開始し、酸素消費量が一定
になるまで反応を行い（10分以内）、酸素の消費
量をオキシゲンアナライザー（ベツクマン社製）
にて測定した。検量線を作成し、試料中のＬ−フ
エニルアラニン含量を求めた。検量線は第６図に
示した。 試料は、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキスか
ら調製した天然培地、及び該天然培地をベースに
Ｌ−フエニルアラニンを第３表に示した如く添加
したものを用いた際のＬ−フエニルアラニンの定
量値を第３表に示した。

【表】 実施例 ２ 1Mリン酸カリウム緩衝液（PH6.8）0.3ml、４
−アミノアンチピリン0.005％、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアニリン0.02％、パーオキシダーゼ５単位、及
び新規Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼ液（５
単位／ml）0.1mlを添加し、総量を2.9mlとする。 標準Ｌ−フエニルアラニン溶液（０〜10μモ
ル／ml）及び各試料溶液0.1mlを添加し、37℃、
10分間反応させた後生成する色素の可視部吸収
（550nm）を測定した。検量線を作成し、試料中
のＬ−フエニルアラニン含量を求めた。検量線を
第７図に示した。 試料は実施例１同様に調製し、その結果を第４
表に示す。

【表】 実施例 ３ 実施例１同様に調整したＬ−フエニルアラニン
含有試料0.2ml、1Mリン酸カリウム緩衝液（PH
6.8）0.1ml、Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼ
0.5単位を蒸留水で１mlとし、37℃、10分間反応
を行つた後、該反応液１mlに1Mリン酸カリウム
緩衝液0.3ml、0.03Mα−ケトグルタル酸（PH7.0）
0.2ml、2.25mMβ−NADH0.2ml、15mMADP0.1
ml、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（10mg／ml）
0.05mlを添加、総量を３mlとし、37℃、20分間反
応後340nmの吸収の減少からアンモニア測定し
た。あらかじめ作成した検量線より試料中、Ｌ−
フエニルアラニンの含量を測定した。検量線を第
８図、定量値を第５表に示した。

【表】 実施例 ４ ワールブルグマノメーター２本を用意し、１つ
には、ワールブルグの容器の主室に1M酢酸緩衝
液（PH5.8）0.1mlと新規なＬ−フエニルアラニン
オキシダーゼ0.5単位を蒸留水で2.5mlとし、側室
に実施例１同様に調整したＬ−フエニルアラニン
含有試料0.5mlを入れる。他方には副室に苛性カ
リウム溶液（10％）0.2mlを入れる以外は上記同
様に準備する。30℃で20分間温度平衡させた後、
側室に入れたＬ−フエニルアラニン含有試料を主
室に移すことにより反応を開始させる。20〜30分
後に両方の検圧計の読みを測定し、ワールブルグ
の直接法による計算で二酸化炭素の発生量を求
め、既知Ｌ−フエニルアラニンの検量線によりＬ
−フエニルアラニンの含量を求めた。検量線を第
９図、定量値を第６表に示した。

【表】 実施例 ５ 実施例１同様に調整したＬ−フエニルアラニン
含有試料0.1ml、1Mリン酸カリウム緩衝液（PH
6.8）0.1ml、新規なＬ−フエニルアラニンオキシ
ダーゼ0.5単位を蒸留水で１mlとし、37℃、10分
間反応を行う。該反応液0.01mlをあらかじめ調整
した高速液体クロマトグラフイー（カラム：
LS410、東洋曹達工業(株)カラムサイズ４mmID×
250mmＬ、Mobile phase：メタノール：リン酸カ
リウム緩衝液＝10：90、温度60℃、レンジ＝
0.04）で分離、UV220mmにて検出し、各ピーク高
を標準品のピーク高から換算し、フエニルアセト
アミド量、フエニルピルビン酸量を定量する。既
知Ｌ−フエニルアラニンより得た検量線よりＬ−
フエニルアラニンの含量を求めた。 フエニルアセトアミドの検量線を第１０図、フ
エニルピルビン酸の検量線を第１１図に、定量値
を第７表に示した。

【表】 実施例１〜５において用いた天然培地中のアミ
ノ酸分析によるＬ−フエニルアラニン含量を測定
した結果、1.1マイクロモル／mlであり、本発明
方法により測定された値は該数値に近似した値を
得た。 参考例 KH₂PO₄0.1％、K₂HPO₄0.1％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、FeSO₄・7H₂O0.001％、酵母エキス
0.2％、Ｌ−フエニルアラニン１％からなる培地
を50ml宛、各500ml容の振盪フラスコに分注し、
120℃、10分間殺菌後、シユードモナスsp.P−501
（微工研菌寄第5887号）を接種し、30℃、16時間、
振幅５cm、120rpmで振盪培養した。 培養終了後培養液10を過して得られた菌体
を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）2000mlに懸濁し
た後、トリトンＸ−100 0.5％を添加し、溶菌し
た後、遠心分離により固形分を除去し、粗酵素液
を得る。該粗酵素液に硫酸アンモニウムを添加
し、30％飽和〜50％飽和の沈殿区分を採取し、こ
れを0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）50mlに溶解し、
同一緩衝液で１夜透析する。次に上記同一緩衝液
で平衡化したDEAEセルロースカラム（5.2×80
cm）に通し、食塩0.1M含有同緩衝液で不純物を
溶出後、食塩0.2M濃度を含む同緩衝液で溶出し、
活性区分を集め、濃縮後バイオゲルＡ−0.5mカ
ラム（2.5×150cm）によるゲル過を行い活性区
分を集めた。該溶液の硫酸アンモニウム60％飽和
の沈殿区分を集め、これを10％硫酸アンモニウム
を含む0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）10mlに溶解
し、フエニルセフアロースCL−4B（フアーマシ
ア社製、スエーデン国）カラム（2.8×10cm）に
通し、10％硫酸アンモニウムを含む0.01Mリン酸
緩衝液（PH7.0）でカラムを洗滌後、１％硫酸ア
ンモニウム50％エチレングリコールを含む0.01M
リン酸緩衝液にて酵素を溶出し、活性区分を集め
て、再びバイオゲルＡ−0.5mカラム（2.5×150
cm）にてゲル過を行い活性区分を集めて精製酵
素標品2.1mg（収率11.6％、比活性94.2単位／mg蛋
白質）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法に用いられる新規なＬ−フ
エニルアラニンオキシダーゼの至適PHを示す図で
あり、第２図は同じく、４℃、20時間各PHで処理
後の残存活性を示す図である。第３図は高速液体
クロマトグラフイーにより定量した新規なＬ−フ
エニルアラニンオキシダーゼの作用温度を示す図
であり、第４図は同じくPH6.8での熱安定性を示
す図である。第５図は新規なＬ−フエニルアラニ
ンオキシダーゼの電気詠動図を示すものである。
第６図〜第１１図は本発明方法の実施例において
作成した検量線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料中のＬ−フエニルアラニンを酸素の存在
   下、Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼを用いて
   分解し、反応液中の酸素の消費量又は生成する過
   酸化水素、炭酸ガス、アンモニア、フエニルアセ
   トアミド若しくはフエニルピルビン酸を定量する
   ことを特徴とするＬ−フエニルアラニンの定量
   法。 ２ Ｌ−フエニルアラニンオキシダーゼが、以下
   の理化学的性質を有するＬ−フエニルアラニンオ
   キシダーゼである特許請求の範囲第１項記載のＬ
   −フエニルアラニンの定量法。 (a) 作用： 酸素の存在下でＬ−フエニルアラニンを酸化
   的に脱炭酸し、フエニルアセトアミド、炭酸ガ
   スと水を生成する反応式〔〕 で表わされる反応並びに酸素の存在下でＬ−フ
   エニルアラニンを酸化的に脱アミノしてフエニ
   ルピルビン酸、アンモニアと過酸化水素を生成
   する反応式〔〕 で表わされる反応を触媒する作用を有する。 (b) 基質特異性： Ｌ−フエニルアラニンに極めて高い基質特異
   性を示し、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グ
   ルタミン酸、Ｌ−スレオニンには作用しない。 (c) 至適PH及び安定PH範囲： 至適PH：５〜10 安定PH範囲：6.5〜10 (d) 分子量： 高速液体クロマトグラフイーによるゲル濾過
   法により測定した値が約67000である。