JPS63251082A - Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS63251082A JPS63251082A JP8747487A JP8747487A JPS63251082A JP S63251082 A JPS63251082 A JP S63251082A JP 8747487 A JP8747487 A JP 8747487A JP 8747487 A JP8747487 A JP 8747487A JP S63251082 A JPS63251082 A JP S63251082A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ＮＡＤＨオキシダーゼ詳しくはＨ２Ｏ２発生
性ＮＡＤＨオキシダーゼの新規な製造法に関する。
性ＮＡＤＨオキシダーゼの新規な製造法に関する。
ＮＡＤＨオキシダーセ゛としては、これまでにＨ２Ｏ２
発生性のものとＨ２０発生件のものとか知られている。
発生性のものとＨ２０発生件のものとか知られている。
前者の酵素即ちＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーセは
、下記式の反応を触媒する酵素であって、ＮＡＤＨから
定量的にＨ２Ｏ。
、下記式の反応を触媒する酵素であって、ＮＡＤＨから
定量的にＨ２Ｏ。
を生成する。
ＮＡＤＨ＋Ｈ” ＋０２→ＮＡＤ＋十Ｈ２Ｏ２従−）で
、Ｈ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキンダーゼは、Ｈ２Ｏ２の
定量法と組合せてＮＡＤＨが関与する各種脱水素酵素活
性及びＮＡＤを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の
測定に利用できる有用な酵素である。
、Ｈ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキンダーゼは、Ｈ２Ｏ２の
定量法と組合せてＮＡＤＨが関与する各種脱水素酵素活
性及びＮＡＤを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の
測定に利用できる有用な酵素である。
従来、Ｈ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼについては
、バチルス・メガテリウム（Ｂａｅｉ ｌ ｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ ）から得られることが報告されてい
る〔ジャーナル オブ バイオケミストり一（Ｊ、Ｂｉ
ｏｅｈｅｍ、）、 ９８． １４３３〜１４４０（１
９８５））。しかしながら、バチルス・メガチリウムに
よる該酵素の生成量は、極めて微量であり（後記比較例
参照）、従って該酵素の入手は難しく酵素分析等への実
用が困難な状態であった。
、バチルス・メガテリウム（Ｂａｅｉ ｌ ｌｕｓｍｅ
ｇａｔｅｒｉｕｍ ）から得られることが報告されてい
る〔ジャーナル オブ バイオケミストり一（Ｊ、Ｂｉ
ｏｅｈｅｍ、）、 ９８． １４３３〜１４４０（１
９８５））。しかしながら、バチルス・メガチリウムに
よる該酵素の生成量は、極めて微量であり（後記比較例
参照）、従って該酵素の入手は難しく酵素分析等への実
用が困難な状態であった。
そのため、該酵素の安価で安定な供給が要望されている
。
。
問題点を解決するための手段
本発明者は、上記要望に応えるべく、Ｈ２Ｏ２発生性Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼを容易に且つ大口に製造できる方法
について鋭意研究した。その結果、バチルス属の特定の
種が著量の該酵素を産生ずることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
ＡＤＨオキシダーゼを容易に且つ大口に製造できる方法
について鋭意研究した。その結果、バチルス属の特定の
種が著量の該酵素を産生ずることを見い出し、本発明を
完成するに至った。
即ち本発明は、バチルス・リケニホルミス、バチルス・
ズブティリス、バチルス・プミルス、バチルス・アノイ
リノリティカス、バチルス・スフエリカス、バチルス・
アミロリクエファシェンス、バチルス番セレウス又はバ
チルス・テユーリンギエンシスを培地に培養し、培養物
からＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼを採取するこ
とを特徴とするＨ２Ｏ２発生性Ｎ’ＡＤＨオキシダーゼ
の製造法に係る。
ズブティリス、バチルス・プミルス、バチルス・アノイ
リノリティカス、バチルス・スフエリカス、バチルス・
アミロリクエファシェンス、バチルス番セレウス又はバ
チルス・テユーリンギエンシスを培地に培養し、培養物
からＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼを採取するこ
とを特徴とするＨ２Ｏ２発生性Ｎ’ＡＤＨオキシダーゼ
の製造法に係る。
本発明においては、Ｈ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダー
ゼの生産菌として、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス
・ズブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
） 、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍ
ｉｌｕｓ）、バチルス・アノイリノリティカス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチ
ルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒ
ｉｃｕｓ） 、バチルス舎アミロリクエファシェンス（
Ｂａｃｉ ］ ｌ ｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ ） 、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ）及びバチルス・テユーリンギエンシス
（Ｂａｃｆｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の
何れかの種に属する菌株を用いることが必要である。
ゼの生産菌として、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス
・ズブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
） 、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍ
ｉｌｕｓ）、バチルス・アノイリノリティカス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｎｅｕｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バチ
ルス・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｐｈａｅｒ
ｉｃｕｓ） 、バチルス舎アミロリクエファシェンス（
Ｂａｃｉ ］ ｌ ｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ ） 、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ）及びバチルス・テユーリンギエンシス
（Ｂａｃｆｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の
何れかの種に属する菌株を用いることが必要である。
例えば好ましい菌株としては、バチルス・リケニホルミ
スＩＡＭ１１０５４、バチルス◆ズブティリスＩＦＯ３
００７、バチルスφプミルスＩＦ０１２０８６、バチル
ス・アノイリノリティカスＡＨＵ１３５４、バチルス・
スフエリカスＩＦ０３３４１、バチルス・アミロリクエ
ファシェンスＩＦＯ１４１４１、バチルス・セレウスＩ
Ｆ０３１３２及びバチルス・テユーリンギエンシスＩ
Ｆ０３９５１を挙げることができる。これらの菌株は、
何れも公的保存機関の保存菌であり、分譲を受けること
により容易に入手可能である。保存機関は、ＩＡＭは東
京大学応用微生物研究所、ＩＦＯは財団法人発酵研究所
、ＡＨＵは北海道大学農学部である。また、これらの菌
株の各種の変異株も好適に使用できるのは、勿論である
。
スＩＡＭ１１０５４、バチルス◆ズブティリスＩＦＯ３
００７、バチルスφプミルスＩＦ０１２０８６、バチル
ス・アノイリノリティカスＡＨＵ１３５４、バチルス・
スフエリカスＩＦ０３３４１、バチルス・アミロリクエ
ファシェンスＩＦＯ１４１４１、バチルス・セレウスＩ
Ｆ０３１３２及びバチルス・テユーリンギエンシスＩ
Ｆ０３９５１を挙げることができる。これらの菌株は、
何れも公的保存機関の保存菌であり、分譲を受けること
により容易に入手可能である。保存機関は、ＩＡＭは東
京大学応用微生物研究所、ＩＦＯは財団法人発酵研究所
、ＡＨＵは北海道大学農学部である。また、これらの菌
株の各種の変異株も好適に使用できるのは、勿論である
。
これらの菌株の培養法としては、従来のバチルス属菌株
の培養と同様に行なえば良く、適当な炭素源、窒素源、
無機物、及び必要に応じてその他の栄養物を含む栄養培
地に培養する。炭素源としては、資化可能な炭素源であ
ればよく、例えばグルコース、サッカロース、マンニト
ール等を挙げることができる。窒素源としては、利用可
能な窒素源であればよ（、例えば硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合
物、及びペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加
水分解物、コーン・ステイープ・リカー等の有機窒素源
を挙げることができる。更に、必要に応じて、他のリン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛等の金属の各種塩類、ビタミン等を加えるこ
とができる。
の培養と同様に行なえば良く、適当な炭素源、窒素源、
無機物、及び必要に応じてその他の栄養物を含む栄養培
地に培養する。炭素源としては、資化可能な炭素源であ
ればよく、例えばグルコース、サッカロース、マンニト
ール等を挙げることができる。窒素源としては、利用可
能な窒素源であればよ（、例えば硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合
物、及びペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加
水分解物、コーン・ステイープ・リカー等の有機窒素源
を挙げることができる。更に、必要に応じて、他のリン
酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛等の金属の各種塩類、ビタミン等を加えるこ
とができる。
培養は、固体培養、液体培養の何れでも良いが、通常液
体培養によるのが便利である。
体培養によるのが便利である。
培養温度は、バチルス属菌株の成育に適当な温度であれ
ば良く、通常２５〜４０℃程度である。
ば良く、通常２５〜４０℃程度である。
培養時間は、特に限定されるものではなく、目的のＨ２
Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼが最高収量に達する適
当な時期に培養を終了すれば良く、通常は５〜４０時間
程度である。
Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼが最高収量に達する適
当な時期に培養を終了すれば良く、通常は５〜４０時間
程度である。
培養物からＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼを採取
するには、本酵素が主に菌体内に存在することから、ま
ず得られた培ｊ＄物から濾過、遠心分離等の手段により
菌体を分離し、次いでこの菌体を適当な菌体破砕手段、
例えば超音波処理、各種機械的方法等により破砕し、可
溶化して水溶液として分離、採取する。
するには、本酵素が主に菌体内に存在することから、ま
ず得られた培ｊ＄物から濾過、遠心分離等の手段により
菌体を分離し、次いでこの菌体を適当な菌体破砕手段、
例えば超音波処理、各種機械的方法等により破砕し、可
溶化して水溶液として分離、採取する。
この様にして得られた目的オキシダーゼをａむ粗酵素液
からの精製は、通常の酵素の精製に用いらイする方法を
適宜組合せることにより行なわれる。
からの精製は、通常の酵素の精製に用いらイする方法を
適宜組合せることにより行なわれる。
例えば、塩析、有機溶媒沈澱、透析、イオン交換クロマ
トグラフィー・法、ゲル濾過法、アフイニテ・イクロマ
トグラフイー法等の方法を組合せて使用できる。
トグラフィー・法、ゲル濾過法、アフイニテ・イクロマ
トグラフイー法等の方法を組合せて使用できる。
より具体的な例を挙げれば、例えば、菌体を破砕後、遠
心分離し、粗酵素液と１７て上清を得る。
心分離し、粗酵素液と１７て上清を得る。
その粗酵素液を硫安塩析してＮ Ａ Ｄ Ｈオキシダー
ゼ活性画分を得る。透析或いはゲル濾過により沈澱物中
に含まれる硫安を除去後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−
６Ｂイオン交換体（ファルマシア社製）に吸着、溶出さ
せる。活性画分を濃縮後ウルトロゲルＡＣＡ３４ （Ｌ
ＫＢ社製）のゲル濾過を行ない、活性画分を更に５′〜
ＡＭＰ−セファロース（ファルマシア社製）のアフイニ
テイクロマトグラフイーを行なうことにより単離、精製
をすることができる。
ゼ活性画分を得る。透析或いはゲル濾過により沈澱物中
に含まれる硫安を除去後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−
６Ｂイオン交換体（ファルマシア社製）に吸着、溶出さ
せる。活性画分を濃縮後ウルトロゲルＡＣＡ３４ （Ｌ
ＫＢ社製）のゲル濾過を行ない、活性画分を更に５′〜
ＡＭＰ−セファロース（ファルマシア社製）のアフイニ
テイクロマトグラフイーを行なうことにより単離、精製
をすることができる。
本発明の製造法により得られたＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨ
オキシダーゼの酵素化学的及び理化学的性質を、以下に
示す。
オキシダーゼの酵素化学的及び理化学的性質を、以下に
示す。
（１）作用＝１モルのＮＡＤＨを１モルの０２で酸化し
て１モルのＮＡＤ＋と１モルのＨ２０□を生成する。
て１モルのＮＡＤ＋と１モルのＨ２０□を生成する。
（２）補酵素： ＦＡＤを補酵素とし、酵素蛋白中に含
むが、反応液中にＦＡＤを別途添加することにより数十
倍に活性は−に昇する。
むが、反応液中にＦＡＤを別途添加することにより数十
倍に活性は−に昇する。
（３）基質特異性： ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの何れに
も作用するが、下記第１８表に示す様に、反応液中にＦ
ＡＤを添加することによってＮＡＤＨに対する活性は約
３５倍に上昇するのに比しＮ Ａ Ｄ Ｐ Ｈに対する
活性は約５倍の−」二昇に過ぎず、ＦＡＤ存在下での反
応ではＮＡＤＰＨに比べＮＡＤＨに対して約７倍の活性
を示す。
も作用するが、下記第１８表に示す様に、反応液中にＦ
ＡＤを添加することによってＮＡＤＨに対する活性は約
３５倍に上昇するのに比しＮ Ａ Ｄ Ｐ Ｈに対する
活性は約５倍の−」二昇に過ぎず、ＦＡＤ存在下での反
応ではＮＡＤＰＨに比べＮＡＤＨに対して約７倍の活性
を示す。
第 １ 表
（４）Ｋｍ値二ＮＡＤＩｌ：に対するＫｍ値は約３．２
Ｘ１０’Ｍであり、ＦＡＤに対するＫ ｍ値は約６．７
Ｘ１０−６Ｍである。
Ｘ１０’Ｍであり、ＦＡＤに対するＫ ｍ値は約６．７
Ｘ１０−６Ｍである。
（５）分子量＝ 「セファデックスＧ−１５０Ｊ（ファ
ルマシア社製）を用いるゲル濾過法で約１１６０００で
あり、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で約
５６０００である。従って、分子量約５６０００のサブ
ユニットよりなる２聞体である。
ルマシア社製）を用いるゲル濾過法で約１１６０００で
あり、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で約
５６０００である。従って、分子量約５６０００のサブ
ユニットよりなる２聞体である。
（６）至適ｐＨ：第１図の曲線で表わされる如く、約ｐ
Ｈ６，５〜８．０に高い活性を有している。
Ｈ６，５〜８．０に高い活性を有している。
（７）至適温度：第２図の曲線で表わされる如く、ｐＨ
７，０で約４５℃付近にある。
７，０で約４５℃付近にある。
（８）ｐＨ安定性：３０°Ｃで２４時間、それぞれのｐ
Ｈで放置したときのｐＨ安定性を第３図に示す。第３図
から明らかなようにｐＨ７，０〜・９、０の間で安定で
ある。
Ｈで放置したときのｐＨ安定性を第３図に示す。第３図
から明らかなようにｐＨ７，０〜・９、０の間で安定で
ある。
（９）熱安定性：ｐＨ７，２でそれぞれの温度で】０分
間処理したときの熱安定性を第４図に示す。第４図から
明らかなように３０°Ｃまで安定である。また、牛血清
アルブミン０．１％存在下では４０℃まで安定である。
間処理したときの熱安定性を第４図に示す。第４図から
明らかなように３０°Ｃまで安定である。また、牛血清
アルブミン０．１％存在下では４０℃まで安定である。
（１０）阻害剤：Ａｇ”、Ｈｇ”、Ｃｕ４＋などの重金
属イオンで阻害される。ＫＣＮ及びＰＣＭＢ（ｐ−クロ
ロマーキュリ−ヘンシェード）テ部分的に阻害される。
属イオンで阻害される。ＫＣＮ及びＰＣＭＢ（ｐ−クロ
ロマーキュリ−ヘンシェード）テ部分的に阻害される。
本発明により得られるＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダ
ーゼの」二記諸性質を、前記ジャーナルオブ バイオケ
ミストリー、９８．１４３３〜１４４０ （１９８５）
に記載の同様のＮＡＤＨオキシダーゼの諸性質と比較す
ると、（１）作用、（２）補酵素及び（３）基質特異性
の点で殆んど変るところがなく、又（４）Ｋｍ値及び（
５）分子量の点でも近似している。
ーゼの」二記諸性質を、前記ジャーナルオブ バイオケ
ミストリー、９８．１４３３〜１４４０ （１９８５）
に記載の同様のＮＡＤＨオキシダーゼの諸性質と比較す
ると、（１）作用、（２）補酵素及び（３）基質特異性
の点で殆んど変るところがなく、又（４）Ｋｍ値及び（
５）分子量の点でも近似している。
酵素活性測定方法：
本発明における酵素活性は、下記条件下１分間にＮＡＤ
Ｈの１μｍｏ ｌ ｅを酸化するに要する酵素量を１単
位とし、ＮＡＤＨの３４０ｎｍでの吸光度の減少を測定
することにより定量する。
Ｈの１μｍｏ ｌ ｅを酸化するに要する酵素量を１単
位とし、ＮＡＤＨの３４０ｎｍでの吸光度の減少を測定
することにより定量する。
試薬： （Ａ）０．２５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
７，０ （Ｂ）２ｍＭ ＮＡＤＨ水溶液 （Ｃ）１ｍＭ ＦＡＤ水溶液 （Ｄ）ＩＭ ＮａＮ３水溶液 （Ｅ）酵素液：ＮａＮ３の濃度が０．１Ｍになるように
Ｉ Ｍ Ｎ ａ Ｎ ３水溶液（Ｄ）を予め１７１０
量添加する。
７，０ （Ｂ）２ｍＭ ＮＡＤＨ水溶液 （Ｃ）１ｍＭ ＦＡＤ水溶液 （Ｄ）ＩＭ ＮａＮ３水溶液 （Ｅ）酵素液：ＮａＮ３の濃度が０．１Ｍになるように
Ｉ Ｍ Ｎ ａ Ｎ ３水溶液（Ｄ）を予め１７１０
量添加する。
ｄｕｊ定手順：光路長１０ｍｍのキュベツトに上記リン
酸カリウム緩衝液（Ａ） ０． ６ｍｌ、基質溶液（Ｂ
）０．３ｍｌ、補酵素溶液（Ｃ） ０． １０１１、Ｉ
Ｍ ＮａＮ３水溶液（Ｄ） ０． ３ｍｌ、及び蒸留
水１．６ｍｌを入れて混和し、３０°Ｃ下１０分間予備
加温後酵素液（Ｅ）０．１ｍｌを加えて直ちに混和し、
反応を開始する。３０°Ｃ下基質ＮＡＤＨの３４０ｎｍ
での吸光度の減少 （ΔＡ３４ｏ）の初速度を測定し、下記式に従って酸化
されたＮＡＤＨ量を算出する。酵素濃度は反応開始後３
０秒〜９０秒間の１分間のΔＡ３４ｏが０．０３５〜０
．０５０程度の変化量になるように調節して測定する。
酸カリウム緩衝液（Ａ） ０． ６ｍｌ、基質溶液（Ｂ
）０．３ｍｌ、補酵素溶液（Ｃ） ０． １０１１、Ｉ
Ｍ ＮａＮ３水溶液（Ｄ） ０． ３ｍｌ、及び蒸留
水１．６ｍｌを入れて混和し、３０°Ｃ下１０分間予備
加温後酵素液（Ｅ）０．１ｍｌを加えて直ちに混和し、
反応を開始する。３０°Ｃ下基質ＮＡＤＨの３４０ｎｍ
での吸光度の減少 （ΔＡ３４ｏ）の初速度を測定し、下記式に従って酸化
されたＮＡＤＨ量を算出する。酵素濃度は反応開始後３
０秒〜９０秒間の１分間のΔＡ３４ｏが０．０３５〜０
．０５０程度の変化量になるように調節して測定する。
６．２２
Ｈ２Ｏ２の測定方法：
上記酵素活性測定条件下ＮＡＤＨを完全に酸化するに充
分な量の酵素を加えて反応を行なわせ、３４０ｎｍの吸
光度の減少が０になった時点でその反応終了液中の生成
Ｈ２Ｏ２量を反応終了液の一定回についてＨ２Ｏ２の定
量法である酸化発色法（４−アミノアンチピリン−Ｎ、
Ｎ’ −ジメチルアニリン−ペルオキシダーゼ系）で測
定する。
分な量の酵素を加えて反応を行なわせ、３４０ｎｍの吸
光度の減少が０になった時点でその反応終了液中の生成
Ｈ２Ｏ２量を反応終了液の一定回についてＨ２Ｏ２の定
量法である酸化発色法（４−アミノアンチピリン−Ｎ、
Ｎ’ −ジメチルアニリン−ペルオキシダーゼ系）で測
定する。
試薬： （Ａ）０．２５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
７，０ （Ｂ）０．３％４−アミノアンチピリン水溶液 （Ｃ）０．２％Ｎ、Ｎ’ −ジメチルアニリン−０，
０ＩＮ ＨＣＩ溶液 （Ｄ）ペルオキシダーゼ溶液：５０ｕ／鵬の３０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７，２ 測定手順：試験管に上記リン酸カリウム緩衝液（Ａ）
０． ２ｍｌ、４−アミノアンチピリン水溶液（Ｂ）
Ｏ，１ｍｌ、Ｎ、Ｎ’ −ジメチルアニリン溶液（Ｃ）
０． ２ｒｒｖＱ及びＨ２Ｏ２定量用試料溶液０．
８ｍＧを加えて混和し、これにペルオキシダーゼ溶液（
Ｄ） ０． １ａｕＱを添加、混和して室温下１０分間
放置後、蒸留水１．６鵬を加え、終液ｆｆ１３． ０Ｉ
ＴＩＱとして５６５ｎｍにおける吸光度を測定する。Ｈ
２Ｏ２含有量は、予め上記測定法により既知量のＨ２Ｏ
２について作製した検母線から測定吸光度に相当するＨ
２Ｏ２量を読み取り求める。
７，０ （Ｂ）０．３％４−アミノアンチピリン水溶液 （Ｃ）０．２％Ｎ、Ｎ’ −ジメチルアニリン−０，
０ＩＮ ＨＣＩ溶液 （Ｄ）ペルオキシダーゼ溶液：５０ｕ／鵬の３０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７，２ 測定手順：試験管に上記リン酸カリウム緩衝液（Ａ）
０． ２ｍｌ、４−アミノアンチピリン水溶液（Ｂ）
Ｏ，１ｍｌ、Ｎ、Ｎ’ −ジメチルアニリン溶液（Ｃ）
０． ２ｒｒｖＱ及びＨ２Ｏ２定量用試料溶液０．
８ｍＧを加えて混和し、これにペルオキシダーゼ溶液（
Ｄ） ０． １ａｕＱを添加、混和して室温下１０分間
放置後、蒸留水１．６鵬を加え、終液ｆｆ１３． ０Ｉ
ＴＩＱとして５６５ｎｍにおける吸光度を測定する。Ｈ
２Ｏ２含有量は、予め上記測定法により既知量のＨ２Ｏ
２について作製した検母線から測定吸光度に相当するＨ
２Ｏ２量を読み取り求める。
発明の効果
本発明によれば、特にバチルス属の特定の種を用いるこ
とにより、Ｈ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼを容易
に且つ大量に製造することができ、該酵素の安価で安定
な供給が実現される。
とにより、Ｈ２Ｏ２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼを容易
に且つ大量に製造することができ、該酵素の安価で安定
な供給が実現される。
実施例
以下に本発明によるＮＡＤＨオキシダーゼの製造法を実
施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限
定されるものではない。
施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限
定されるものではない。
実施例１〜９及び比較例
培地組成 グルコース１．０％、ペプトン１．０％、酵
母エキス０．２％、クエン酸ナトリウム０，１％、（Ｎ
Ｈａ ）２ ＳＯａ ０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，６
％、Ｋ２ＨＰＯ４１０，４％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ
２００，０２％、ｐＨ７，２ ト記培地５ＴｌＩＱ及び５０能をそれぞれ試験管及び３
００（財）容フラスコに分注して綿栓１７．１２０’Ｃ
１１５分間オートクレーブ滅菌し７た。先ず５ｍｌの試
験管培地に各種菌株を斜面培地から］白菌耳接種し、３
０’Ｃ１約２０時間振盪培養して種培養物を調製した。
母エキス０．２％、クエン酸ナトリウム０，１％、（Ｎ
Ｈａ ）２ ＳＯａ ０．２％、ＫＨ２ＰＯ４０，６
％、Ｋ２ＨＰＯ４１０，４％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ
２００，０２％、ｐＨ７，２ ト記培地５ＴｌＩＱ及び５０能をそれぞれ試験管及び３
００（財）容フラスコに分注して綿栓１７．１２０’Ｃ
１１５分間オートクレーブ滅菌し７た。先ず５ｍｌの試
験管培地に各種菌株を斜面培地から］白菌耳接種し、３
０’Ｃ１約２０時間振盪培養して種培養物を調製した。
次にこの各種菌株の種培養物０．５鵬を５０ｍ！Ｑ容の
フラスコ培地に植菌して３０℃、約２０時間振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、生菌体を
約１０％濃度（重量／容はパーセント）に３０ｍ〜１リ
ン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，２に＋３濁し７て水冷下で
超音波処理（２０ＫＣ１５分）した。この超音波処理７
１ｋを遠心分離し、上清を粗酵素液として活性を測定し
た。
フラスコ培地に植菌して３０℃、約２０時間振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離により菌体を集め、生菌体を
約１０％濃度（重量／容はパーセント）に３０ｍ〜１リ
ン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，２に＋３濁し７て水冷下で
超音波処理（２０ＫＣ１５分）した。この超音波処理７
１ｋを遠心分離し、上清を粗酵素液として活性を測定し
た。
また、比較例として、バチルス・メガテリウムＡＨＵ１
２４０を用い、同様に培養、酵素の精製、測定をしまた
。
２４０を用い、同様に培養、酵素の精製、測定をしまた
。
測定結果は第２表に示した。
第２表において、ＮＡＤＨオキシダーゼ活性は、粗酵素
液の酵素活性を元の培養液の１ｍＱ当りに換算したもの
である。Ｈ２０□発生率とは、ＮＡＤＨかＮＡＤＨオキ
シダーゼによって反応式に従い酸化された時発生する理
論値に対する反応液中でのＨ２０□の実測値の比率を表
わしたものである。
液の酵素活性を元の培養液の１ｍＱ当りに換算したもの
である。Ｈ２０□発生率とは、ＮＡＤＨかＮＡＤＨオキ
シダーゼによって反応式に従い酸化された時発生する理
論値に対する反応液中でのＨ２０□の実測値の比率を表
わしたものである。
実施例１０
実施例１と同様に調製した培地３０Ｑを含む５０Ｑ容ジ
ャーファーメンタ−を１−２０°Ｃで２０分間蒸気滅菌
１７た。予め実施例１−と同（工に（７て培養したバチ
ルス・リケニフオルミスＩＡＭＩＩＯ５４の種培養物３
００ｍ１を植菌し、３０°ＣＣ１３００ｒｐ、通気量３
０＆／ｍｉｎで６ｈｒ培養した。得られた培養液のＮＡ
ＤＨオキシダ−セ活性は０．４３ｕ／ｍＱであった。’
？３ ｉｉ液３（ｌを遠心分離し、菌体を集め３０ｍ〜
Ｉリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，２３，２Ｑに懸濁し、
菌体破砕機ダイノミルＫＤＬ （ライｌルー・工・ハッ
コーフエン社製）により破砕した。
ャーファーメンタ−を１−２０°Ｃで２０分間蒸気滅菌
１７た。予め実施例１−と同（工に（７て培養したバチ
ルス・リケニフオルミスＩＡＭＩＩＯ５４の種培養物３
００ｍ１を植菌し、３０°ＣＣ１３００ｒｐ、通気量３
０＆／ｍｉｎで６ｈｒ培養した。得られた培養液のＮＡ
ＤＨオキシダ−セ活性は０．４３ｕ／ｍＱであった。’
？３ ｉｉ液３（ｌを遠心分離し、菌体を集め３０ｍ〜
Ｉリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，２３，２Ｑに懸濁し、
菌体破砕機ダイノミルＫＤＬ （ライｌルー・工・ハッ
コーフエン社製）により破砕した。
菌体破砕液を連続遠心分離（１２００Ｏｒｐｍ）し、上
清３２００ＩＴＩＩ２を得た。上滑に硫安を添加、硫安
塩析し、硫安３５％で溶解し、硫安６０％で沈澱する両
分を集め、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解、同緩
衝液に透析し、同緩衝液に平衡化したＤＥＡＥセファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム１゛２に吸着させ、０．２Ｍ
ＮａＣＱにて溶出した。
清３２００ＩＴＩＩ２を得た。上滑に硫安を添加、硫安
塩析し、硫安３５％で溶解し、硫安６０％で沈澱する両
分を集め、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解、同緩
衝液に透析し、同緩衝液に平衡化したＤＥＡＥセファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム１゛２に吸着させ、０．２Ｍ
ＮａＣＱにて溶出した。
溶出液の活性画分を硫安塩析し、硫安７０％飽和で沈澱
する両分を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝１（ｋｐＨ７
，２に溶解し、同緩衝液に平衡化したウルトロゲルＡＣ
Ａ３４にてゲル濾過を行なった。
する両分を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝１（ｋｐＨ７
，２に溶解し、同緩衝液に平衡化したウルトロゲルＡＣ
Ａ３４にてゲル濾過を行なった。
活性溶出画分を限外濾過により濃縮し、３０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液ｐＨ７，２に透析し、同緩衝液に平衡化
した５’ −ＡＭＰ−セファロース４Ｂカラムに吸着さ
せ、非吸着画分を洗浄溶出後、０．５Ｍ ＮａＣＱを
含む同緩衝液で活性画分を溶出し、更にこの活性画分を
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＩ（’７． ２に平
衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）
にてゲル濾過を行ないその活性溶出画分を限外濾過によ
り濃縮してＮＡＤＨオキシダーゼを単離、精製した。水
精製ＮＡＤＨオキシダーゼは５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動分析的に単一のバンドを示し、比活性５６．
４．ｕ／ｍｇ−蛋白であり、比活性は１３７倍に上昇し
た、活性の回収率は４４％であった。この酵素の諸性質
は、前記の通りである。
カリウム緩衝液ｐＨ７，２に透析し、同緩衝液に平衡化
した５’ −ＡＭＰ−セファロース４Ｂカラムに吸着さ
せ、非吸着画分を洗浄溶出後、０．５Ｍ ＮａＣＱを
含む同緩衝液で活性画分を溶出し、更にこの活性画分を
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＩ（’７． ２に平
衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）
にてゲル濾過を行ないその活性溶出画分を限外濾過によ
り濃縮してＮＡＤＨオキシダーゼを単離、精製した。水
精製ＮＡＤＨオキシダーゼは５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動分析的に単一のバンドを示し、比活性５６．
４．ｕ／ｍｇ−蛋白であり、比活性は１３７倍に上昇し
た、活性の回収率は４４％であった。この酵素の諸性質
は、前記の通りである。
第１図は、本発明により得られるＨ２Ｏ２発生性ＮＡＤ
Ｈオキシダーゼの至適ｐＨを示すグラフである。第２図
は、当該オキシダーゼの至適温度を示すグラフである。 第３図は、当該オキシダーゼのｐＨ安定性を示すグラフ
である。第４図は、当該オキシダーゼの熱安定性を示す
グラフである。 （以 上） 第１図 ｐＨ 第２図 温度（°Ｃ） 第３図 第４図
Ｈオキシダーゼの至適ｐＨを示すグラフである。第２図
は、当該オキシダーゼの至適温度を示すグラフである。 第３図は、当該オキシダーゼのｐＨ安定性を示すグラフ
である。第４図は、当該オキシダーゼの熱安定性を示す
グラフである。 （以 上） 第１図 ｐＨ 第２図 温度（°Ｃ） 第３図 第４図
Claims (1)
- （１）バチルス・リケニホルミス、バチルス・ズブティ
リス、バチルス・プミルス、バチルス・アノイリノリテ
ィカス、バチルス・スフェリカス、バチルス・アミロリ
クエファシエンス、バチルス・セレウス又はバチルス・
テューリンギエンシスを培地に培養し、培養物からＨ＿
２Ｏ＿２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼを採取することを
特徴とするＨ＿２Ｏ＿２発生性ＮＡＤＨオキシダーゼの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8747487A JPH07108219B2 (ja) | 1987-04-08 | 1987-04-08 | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8747487A JPH07108219B2 (ja) | 1987-04-08 | 1987-04-08 | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63251082A true JPS63251082A (ja) | 1988-10-18 |
| JPH07108219B2 JPH07108219B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=13915916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8747487A Expired - Lifetime JPH07108219B2 (ja) | 1987-04-08 | 1987-04-08 | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07108219B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| JPH03151898A (ja) * | 1989-11-10 | 1991-06-28 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用フローインジェクション測定法 |
| US5336608A (en) * | 1989-02-28 | 1994-08-09 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | Process for producing NADH oxidase |
| JP2008092832A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Keio Gijuku | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ |
-
1987
- 1987-04-08 JP JP8747487A patent/JPH07108219B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5336608A (en) * | 1989-02-28 | 1994-08-09 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | Process for producing NADH oxidase |
| US5416012A (en) * | 1989-02-28 | 1995-05-16 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | Process for producing NADH oxidase |
| JPH0339096A (ja) * | 1989-07-04 | 1991-02-20 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用高速液体クロマトグラフィー |
| JPH03151898A (ja) * | 1989-11-10 | 1991-06-28 | Sekisui Chem Co Ltd | 固定化酵素利用フローインジェクション測定法 |
| JP2008092832A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Keio Gijuku | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07108219B2 (ja) | 1995-11-22 |
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