JPH0147150B2 - - Google Patents
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- JPH0147150B2 JPH0147150B2 JP57011303A JP1130382A JPH0147150B2 JP H0147150 B2 JPH0147150 B2 JP H0147150B2 JP 57011303 A JP57011303 A JP 57011303A JP 1130382 A JP1130382 A JP 1130382A JP H0147150 B2 JPH0147150 B2 JP H0147150B2
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- JP
- Japan
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- cholesterol oxidase
- cholesterol
- enzyme
- medium
- hydrogen peroxide
- Prior art date
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、コレステロールオキシダーゼ
（Cholesterol oxidase）の製造法に関する。 従来、コレステロールオキシダーゼ生産菌とし
ては種々知られている。 本発明者らは、静岡県田方郡大仁町の苺畑の土
壤から採取したセルロモナス（Cellulomonas）
属に属する細菌Ｂ−0814が、その培養物中に、少
なくともコレステロールに基質特異性を有し、か
つ１モルのコレステロールに対して１モルの酸素
を消費し、１モルのコレステノンおよび１モルの
過酸化水素を生成する反応を触媒する作用を有す
るコレステロールオキシダーゼを生産する新規な
コレステロールオキシダーゼ生産菌を見い出し
た。 まず上記の細菌Ｂ−0814の肉眼的および顕微鏡
的観察に基く各種培地上における培養の特徴は、
次の記載する通りである。 (A) 肉眼的観察 (1) 肉汁寒天平板培地（30℃、40時間）円形で平
らまたは丘状の集落を形成し、周囲はなめら
か、湿潤半透明で、灰白色〜淡黄色を呈する。 可溶性色素は産生しない。 (2) 肉汁寒天斜面培地（30℃、40時間） 生育はやや弱く、線状に生育し、湿潤半透明
で、灰白色〜淡黄色を呈する。 可溶性色素は産生しない。 (3) 肉汁液体培地（30℃、40時間） 生育は弱いが一様に混濁する。沈澱を生ず
る。 (B) 顕微鏡的観察 普通寒天培地にて30℃、18時間培養した後その
形態的特徴を観察した。 (1) 細胞の形・大きさ 単独、二連、たまに短連鎖する。端の丸くまつ
すぐな桿状で、大きさは0.4×0.8〜1.5μである。 (2) 多形性の有無 なし。 (3) 運動性および鞭毛 陰性。 (4) 芽胞（形、位置、大きさ、菌体のふくらみ） なし。 (C) 生理的性質 硝酸塩還元 ＋ 脱窒反応 − MRテスト ＋ VPテスト − インドールの産生 − 硫化水素の産生（SIM培地） − ゼラチンの加水分解 ＋ デンプンの加水分解 ＋ クエン酸の利用 （シモンズ培地） − （クリステンゼン培地） − 硝酸塩の利用 ＋ アンモニウム塩の利用 ＋ 可溶性色素の生成 − オキシダーゼ − カラターゼ ＋ ウレアーゼ（SSR培地） − 生育の範囲 生育PH 5.5〜 8.0 生育温度 10 〜35 ℃ 酸素に対する態度 通性嫌気性 OFテスト（Hugh Leifson培地） Ｆ エスクリンの分解 ＋ セルロースの分解 ＋ カゼインの分解 ＋ グラム染色 陽性または不定 抗酸性染色 陰性 酸・ガスの産生（Hugh−Leifson Base
Difco） 酸 ガス アドニトール ＋ − Ｌ（＋）アラビノース ＋ − セロビオース ＋ − ヅルシトール − − メソ−エリストール − − Ｄ（−）フラクトース ＋ − Ｄ（＋）ガラクトース ＋ − Ｄ（＋）グルコース ＋ − グリセリン − − イノシトール − − イヌリン − − ラクトース ＋ − マルトース ＋ − Ｄ−マンニトール − − Ｄ−マンノース − − ラフイノース ＋ − Ｌ（＋）ラムノース ＋ − サリシン ＋ − Ｌ−ソルボース − − ソルビトール − − スターチ ＋ − サツカロース ＋ − トレハロース ＋ − Ｄ−キシロース ＋ − 上記の菌学的性質より、本菌Ｂ−0814はグラム
陽性または不定の桿菌でセルロースを分解する特
徴を有するもので、バージース・マニユアル・オ
ブ・デタミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey，ｓ Manual of Determinative
Bacteriologe）第８版（1974）によれば本菌株は
セルロモナス（Cellulomonas）属に属するもの
と認められた。さらに本菌株の諸性状を、バージ
ース・マニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バ
クテリオロジー第７版、第８版に対比したが、本
菌株と性状がよく一致する菌種の記載はなく、よ
つて本菌株をセルロモナス・エス・ピー・Ｂ−
0814（Cellulomonas sp.B−0814）と同定命名し
た。さらに本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に「微工研菌寄第6316号（FERM−ＰNo.
6316）」として寄託した。 本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、セルロモナス属に属するコレステロールオキ
シダーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物から
コレステロールオキシダーゼを採取することを特
徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法で
ある。 本発明における使用菌としては、上記のセルロ
モナス・エス・ピー・Ｂ−0814はその一例であつ
て、この菌だけでなくセルロモナス属に属する菌
でコレステロールオキシダーゼ生産菌を生産する
菌は、すべて本発明において使用することができ
る。 本発明を実施するに当つては、セルロモナス属
に属するコレステロールオキシダーゼ生産菌を酵
素を生産する通常の方法で培養する。培養の形態
は液体培養でも固体培養でもよく、工業的にはコ
レステロールオキシダーゼ生産菌の細胞をその生
産用培地に接種し、深部通気撹拌培養を行なうの
が有利である。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられているものが広く使用され得る。炭素源と
しては同化可能な炭素化合物であればよく、例え
ばブドウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖、スターチ、
デキストリン、糖密、廃糖密、グリセリンなどが
挙られる。窒素源としては利用可能な窒素化合物
であればよく、例えばコーン・スチープ・リカ
ー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。その他、リン酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、
鉄、マンガン、ハロゲンなどの塩類が必要に応じ
て使用される。さらに培地に、コレステロールオ
キシダーゼの産生を誘導せしめるために、コレス
テロールを誘導物質として培地中に0.1〜1.5％程
度添加せしめることが好ましい。 培養温度は、菌が発育し、コレステロールオキ
シダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
好ましくは25〜30℃、特に26℃程度が好ましい。
培養時間は、条件によつて多少異なるが、通常12
〜50時間程度行なえばよく、さらに200〜400rpm
の条件にて撹拌しつつ通気せしめればよく、コレ
ステロールオキシダーゼが最高力価に達する時期
をみはからつて適当な時期に培養を終了すればよ
い。 このようにして得られたコレステロールオキシ
ダーゼ生産菌の培養物において、コレステロール
オキシダーゼは主にその菌体内に含有される。 本酵素を採取するに当つて例示すれば、まず得
られた培養物を過または遠心分離などの手段に
よりその菌体を採取し、次いでこの菌体を超音波
処理、フレンチプレス処理やガラスビーズ処理な
どの機械的破壊手段やリゾチームなどの酵素的破
壊手段によつて破壊し、また必要に応じてトリト
ンＸ−100（TritonX−100：商品名）、アデカトー
ルSO−120（商品名）などの界面活性剤を添加し
てもよい。次いでこのようにして得られたコレス
テロールオキシダーゼ含有液は、濃縮するか、ま
たは濃縮することなく、可溶性塩類、例えば硫安
なを用いて塩析せしめるか、親水性有機溶媒、例
えばメタノール、エタノール、アセトン、イソプ
ロパノールなどを用いて本酵素を沈澱せしめれば
よい。さらにこの沈澱物は、水または緩衝液に溶
解後、必要に応じて半透膜にて透析せしめ、さら
にDEAE−セフアデツクス、DEAE−セフアロー
スやDEAE−セルロースなどやカルボキシメチル
−セルロース、カルボキシメチル−セフアロー
ス、カルボキシメチル−セフアデツクスなどのイ
オン交換樹脂を用いるクロマトグラフイーやセフ
アデツクスG200、セフアロースCL−6B、セフア
クリルＳ−200などの分子篩剤などのゲル過剤
を用いるクロマトグラフイーにて精製せしめ、そ
の後凍結乾燥などの処理により、精製されたコレ
ステロールオキシダーゼを得る。 次に本発明のコレステロールオキシダーゼの活
性測定法および性質について述べる。 活性測定法 0.2M リン酸緩衝液（PH8.0） 0.25ml 0.3％ ４−アミノアンチピリン 0.1ml 0.2％ フエノール 0.1ml １％ トリトンＸ−100 0.3ml （50U／ml）ペルオキシダーゼ 0.1ml 1mM コレステロール 0.1ml 蒸留水 0.05ml 計 1.0ml 上記の各組成を有する反応液1.0mlを37℃に予
備加温し、次いでこれに酵素液20μを加えて37
℃で正確に10分間反応せしめる。反応後、エタノ
ール2.0mlを加えて反応を停止せしめ、次いでそ
の呈色を波長490nmにて吸光度測定する。酵素活
性は、１分間に1μmoleの過酸化水素を生ずる活
性を１単位（1unit，1U）とする。また力価の算
出は、次式に従う。 酵素活性（Ｕ／ml）＝△A490×1.0／1
8×１／２×0.02×１／10×稀釈倍率 （ただし、△A490は、波長490nmにおける吸光
値を示す） 作用 コレステロール１モルに対して、１モルの酸素
を消費して、１モルのコレステノンおよび過酸化
水素を生成する反応を触媒する作用を有する。 基質特異性 前記の活性測定法において、コレステロールの
代りに、下記の種々の基質を用いて、その活性を
測定した。その結果、第１表に示す通りであつ
た。
（Cholesterol oxidase）の製造法に関する。 従来、コレステロールオキシダーゼ生産菌とし
ては種々知られている。 本発明者らは、静岡県田方郡大仁町の苺畑の土
壤から採取したセルロモナス（Cellulomonas）
属に属する細菌Ｂ−0814が、その培養物中に、少
なくともコレステロールに基質特異性を有し、か
つ１モルのコレステロールに対して１モルの酸素
を消費し、１モルのコレステノンおよび１モルの
過酸化水素を生成する反応を触媒する作用を有す
るコレステロールオキシダーゼを生産する新規な
コレステロールオキシダーゼ生産菌を見い出し
た。 まず上記の細菌Ｂ−0814の肉眼的および顕微鏡
的観察に基く各種培地上における培養の特徴は、
次の記載する通りである。 (A) 肉眼的観察 (1) 肉汁寒天平板培地（30℃、40時間）円形で平
らまたは丘状の集落を形成し、周囲はなめら
か、湿潤半透明で、灰白色〜淡黄色を呈する。 可溶性色素は産生しない。 (2) 肉汁寒天斜面培地（30℃、40時間） 生育はやや弱く、線状に生育し、湿潤半透明
で、灰白色〜淡黄色を呈する。 可溶性色素は産生しない。 (3) 肉汁液体培地（30℃、40時間） 生育は弱いが一様に混濁する。沈澱を生ず
る。 (B) 顕微鏡的観察 普通寒天培地にて30℃、18時間培養した後その
形態的特徴を観察した。 (1) 細胞の形・大きさ 単独、二連、たまに短連鎖する。端の丸くまつ
すぐな桿状で、大きさは0.4×0.8〜1.5μである。 (2) 多形性の有無 なし。 (3) 運動性および鞭毛 陰性。 (4) 芽胞（形、位置、大きさ、菌体のふくらみ） なし。 (C) 生理的性質 硝酸塩還元 ＋ 脱窒反応 − MRテスト ＋ VPテスト − インドールの産生 − 硫化水素の産生（SIM培地） − ゼラチンの加水分解 ＋ デンプンの加水分解 ＋ クエン酸の利用 （シモンズ培地） − （クリステンゼン培地） − 硝酸塩の利用 ＋ アンモニウム塩の利用 ＋ 可溶性色素の生成 − オキシダーゼ − カラターゼ ＋ ウレアーゼ（SSR培地） − 生育の範囲 生育PH 5.5〜 8.0 生育温度 10 〜35 ℃ 酸素に対する態度 通性嫌気性 OFテスト（Hugh Leifson培地） Ｆ エスクリンの分解 ＋ セルロースの分解 ＋ カゼインの分解 ＋ グラム染色 陽性または不定 抗酸性染色 陰性 酸・ガスの産生（Hugh−Leifson Base
Difco） 酸 ガス アドニトール ＋ − Ｌ（＋）アラビノース ＋ − セロビオース ＋ − ヅルシトール − − メソ−エリストール − − Ｄ（−）フラクトース ＋ − Ｄ（＋）ガラクトース ＋ − Ｄ（＋）グルコース ＋ − グリセリン − − イノシトール − − イヌリン − − ラクトース ＋ − マルトース ＋ − Ｄ−マンニトール − − Ｄ−マンノース − − ラフイノース ＋ − Ｌ（＋）ラムノース ＋ − サリシン ＋ − Ｌ−ソルボース − − ソルビトール − − スターチ ＋ − サツカロース ＋ − トレハロース ＋ − Ｄ−キシロース ＋ − 上記の菌学的性質より、本菌Ｂ−0814はグラム
陽性または不定の桿菌でセルロースを分解する特
徴を有するもので、バージース・マニユアル・オ
ブ・デタミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey，ｓ Manual of Determinative
Bacteriologe）第８版（1974）によれば本菌株は
セルロモナス（Cellulomonas）属に属するもの
と認められた。さらに本菌株の諸性状を、バージ
ース・マニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バ
クテリオロジー第７版、第８版に対比したが、本
菌株と性状がよく一致する菌種の記載はなく、よ
つて本菌株をセルロモナス・エス・ピー・Ｂ−
0814（Cellulomonas sp.B−0814）と同定命名し
た。さらに本菌株は工業技術院微生物工業技術研
究所に「微工研菌寄第6316号（FERM−ＰNo.
6316）」として寄託した。 本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、セルロモナス属に属するコレステロールオキ
シダーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物から
コレステロールオキシダーゼを採取することを特
徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法で
ある。 本発明における使用菌としては、上記のセルロ
モナス・エス・ピー・Ｂ−0814はその一例であつ
て、この菌だけでなくセルロモナス属に属する菌
でコレステロールオキシダーゼ生産菌を生産する
菌は、すべて本発明において使用することができ
る。 本発明を実施するに当つては、セルロモナス属
に属するコレステロールオキシダーゼ生産菌を酵
素を生産する通常の方法で培養する。培養の形態
は液体培養でも固体培養でもよく、工業的にはコ
レステロールオキシダーゼ生産菌の細胞をその生
産用培地に接種し、深部通気撹拌培養を行なうの
が有利である。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられているものが広く使用され得る。炭素源と
しては同化可能な炭素化合物であればよく、例え
ばブドウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖、スターチ、
デキストリン、糖密、廃糖密、グリセリンなどが
挙られる。窒素源としては利用可能な窒素化合物
であればよく、例えばコーン・スチープ・リカ
ー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。その他、リン酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、
鉄、マンガン、ハロゲンなどの塩類が必要に応じ
て使用される。さらに培地に、コレステロールオ
キシダーゼの産生を誘導せしめるために、コレス
テロールを誘導物質として培地中に0.1〜1.5％程
度添加せしめることが好ましい。 培養温度は、菌が発育し、コレステロールオキ
シダーゼを生産する範囲内で適宜変更し得るが、
好ましくは25〜30℃、特に26℃程度が好ましい。
培養時間は、条件によつて多少異なるが、通常12
〜50時間程度行なえばよく、さらに200〜400rpm
の条件にて撹拌しつつ通気せしめればよく、コレ
ステロールオキシダーゼが最高力価に達する時期
をみはからつて適当な時期に培養を終了すればよ
い。 このようにして得られたコレステロールオキシ
ダーゼ生産菌の培養物において、コレステロール
オキシダーゼは主にその菌体内に含有される。 本酵素を採取するに当つて例示すれば、まず得
られた培養物を過または遠心分離などの手段に
よりその菌体を採取し、次いでこの菌体を超音波
処理、フレンチプレス処理やガラスビーズ処理な
どの機械的破壊手段やリゾチームなどの酵素的破
壊手段によつて破壊し、また必要に応じてトリト
ンＸ−100（TritonX−100：商品名）、アデカトー
ルSO−120（商品名）などの界面活性剤を添加し
てもよい。次いでこのようにして得られたコレス
テロールオキシダーゼ含有液は、濃縮するか、ま
たは濃縮することなく、可溶性塩類、例えば硫安
なを用いて塩析せしめるか、親水性有機溶媒、例
えばメタノール、エタノール、アセトン、イソプ
ロパノールなどを用いて本酵素を沈澱せしめれば
よい。さらにこの沈澱物は、水または緩衝液に溶
解後、必要に応じて半透膜にて透析せしめ、さら
にDEAE−セフアデツクス、DEAE−セフアロー
スやDEAE−セルロースなどやカルボキシメチル
−セルロース、カルボキシメチル−セフアロー
ス、カルボキシメチル−セフアデツクスなどのイ
オン交換樹脂を用いるクロマトグラフイーやセフ
アデツクスG200、セフアロースCL−6B、セフア
クリルＳ−200などの分子篩剤などのゲル過剤
を用いるクロマトグラフイーにて精製せしめ、そ
の後凍結乾燥などの処理により、精製されたコレ
ステロールオキシダーゼを得る。 次に本発明のコレステロールオキシダーゼの活
性測定法および性質について述べる。 活性測定法 0.2M リン酸緩衝液（PH8.0） 0.25ml 0.3％ ４−アミノアンチピリン 0.1ml 0.2％ フエノール 0.1ml １％ トリトンＸ−100 0.3ml （50U／ml）ペルオキシダーゼ 0.1ml 1mM コレステロール 0.1ml 蒸留水 0.05ml 計 1.0ml 上記の各組成を有する反応液1.0mlを37℃に予
備加温し、次いでこれに酵素液20μを加えて37
℃で正確に10分間反応せしめる。反応後、エタノ
ール2.0mlを加えて反応を停止せしめ、次いでそ
の呈色を波長490nmにて吸光度測定する。酵素活
性は、１分間に1μmoleの過酸化水素を生ずる活
性を１単位（1unit，1U）とする。また力価の算
出は、次式に従う。 酵素活性（Ｕ／ml）＝△A490×1.0／1
8×１／２×0.02×１／10×稀釈倍率 （ただし、△A490は、波長490nmにおける吸光
値を示す） 作用 コレステロール１モルに対して、１モルの酸素
を消費して、１モルのコレステノンおよび過酸化
水素を生成する反応を触媒する作用を有する。 基質特異性 前記の活性測定法において、コレステロールの
代りに、下記の種々の基質を用いて、その活性を
測定した。その結果、第１表に示す通りであつ
た。
【表】
至適PH
前記の活性測定法における緩衝液において、PH
４〜5.5の酢酸緩衝液（●−●）、PH5.5〜8.5のリ
ン酸緩衝液（Γ−Γ）、PH8.5〜10のホウ酸緩衝液
（△−△）を用いて、その酵素活性を測定した。
その結果、第１図に示す通りで、本酵素はPH７付
近に至適PHを有すると認められる。 PH安定性 コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、各
種の緩衝液（PH４〜5.5の酢酸緩衝液・PH5.5〜8.5
のリン酸緩衝液、PH8.5〜10ホウ酸緩衝液）で37
℃、60分間加熱処理した後、その残存活性を前記
活性測定法に基いて測定した。その結果、第２図
に示す通りで、本酵素はPH６〜７の範囲で安定と
認められた。 熱安定性 コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、
50mMリン酸緩衝液（PH7.0）で10分間、10〜70
℃にて加熱処理した後、その残存活性を前記活性
測定法に基いて測定した。その結果、第３図を示
す通りで、本酵素は50℃まで安定と認められた。 等電点 PH4.8付近（キヤリア・アンフオライトる用い
た電気泳動法により測定した。） 分子量 約58000（セフアデツクスＧ−150） 約58000（SDSポリアクリルアミド電気泳動） Km値 約２×10-5M（コレステロール） 以上の本酵素の性質により、本酵素をコレステ
ロールオキシダーゼと認めたものである。 さらにこのコレステロールオキシダーゼは、コ
レステロールを遊離する試料やコレステロールを
含有する試料の定量に使用される。例えばコレス
テロール含有試料に、このコレステロールオキシ
ダーゼを作用せしめることにより、このコレステ
ロールオキシダーゼの酵素作用に基いて消費され
る酵素、または生成される過酸化水素またはコレ
ステノンを定量することにより、コレステロール
の定量をなし得るものである。また酸素や過酸化
水素定量に当つては、酸素電極、過酸化水素電極
などの目的とする成分に感応する電極による電気
的手段によつて行なつてもよく、また酵素を公知
の種々の手段によつて固定化酵素となして、電気
的手段に用いられる電極面に固着せしめた酵素電
極となして行なつてもよい。さらに過酸化水素を
測定するに当つては、好ましくは過酸化水素の存
在下で色調変化を受ける１種もしくは２種以上の
呈色剤によるシステムにて比色測定する。測定す
る方法としては、例えば生成する過酸化水素と反
応して安定した赤色を形成する４価のチタン化合
物とキシレノールオレンジによつて、生成した過
酸化水素の量をその呈色の強さによつて測定する
か、フエノール、４−アミノアンチピリンおよび
ペルオキシダーゼとの反応によつて、その色調の
変化を測定する方法などが挙られる。またこの４
−アミノアンチピリンの代りに４−アミノフエナ
ゾーンを用いてもよい。さらにジエチル−ｍ−ト
ルイジン、４−アミノアンチピリン、ペルオキシ
ダーゼを含有する試薬を用いて、生成した過酸化
水素の量をその呈色の強さによつて測定してもよ
い。その他、2.6−ジクロルフエノールインドフ
エノールとペルオキシダーゼとの組合せによる過
酸化水素の定量測定、グアヤク脂とペルオキシダ
ーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、ホモ
バニリン酸とペルオキシダーゼの組合せによる過
酸化水素の定量測定などのペルオキシダーゼを用
いる定量法が簡便かつ正確なために好ましい。さ
らにこの過酸化水素の定量用試薬を、フイルムや
紙などの担体面に塗布せしめた簡便な積層一体
型となしてもよい。 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれらによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例 １ コレステロール1.0％、肉エキス0.5％、
K2HPO0.1％、KCl 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05
％含有培地100mlを500ml容三角フラスコにとり、
120℃20分間滅菌後セルロモナス・エス・ピー・
Ｂ−0814菌体を白金耳で接種約26℃で24時間振盪
培養を行なつた。 次いで、この培養物200ml（２本分）を同一組
成の培地20を含む30容ジヤーフアーメンター
に植菌し、26℃で、撹拌速度200rpm、通気量20
／minで培養を行ない、24時間後反応を停止
し、菌体を5000rpm、15分で集菌した。集菌した
ものは、0.1％リゾチーム、5mM・EDTA含有
20mM・リン酸緩衝液（PH7.5）、5.0に分散さ
せ、37℃で３時間菌体を溶解させ酵素を可溶化し
た。 可溶化後、不溶物を5000rpmで15分間遠心して
除去し、得られた上清4.8（3.3／ml、16000
ｕ）について硫安分画を行ない、0.54〜0.7飽和
画分を集めた。この沈澱画分を20mM・リン酸緩
衝液（PH7.5）800mlに溶解後透析チユーブに入
れ、流水に対して透析した。その後不溶物を
12000rpm、10分間遠心分離して、上清760mlを得
た。（17，26u／ml、13120u）。 さらに得られた上清液を、20mM・リン酸緩衝
液（PH7.5）で緩衝化したDEAE−Sepharose CL
−6B（５×70cm）にチヤージし、KCl濃度０〜
0.5Mの濃度勾配で溶出を行ない、KCl濃度0.28〜
0.32Mで溶出された画分を集めた（37.72u／ml、
12070u）。この画分を10mM・リン酸緩衝液（PH
7.0）10に対して透析し、同じ緩衝液で緩衝化
したDEAE−Sepharose CL−6B（５×30cm）カ
ラムにチヤージしKCl濃度0.1〜0.5Mの濃度勾配
で容出し、0.29〜0.31M・KClで溶出された画分
を集めた（76.32u／ml、10380）。この画分を即
外ロ過膜（アミコン社製）で濃縮し、セフアデツ
クスＧ−100カラム（５×70cm）にチヤージし、
20mMリン酸緩衝液（PH7.5）で溶出を行ない活
性画分を集め、凍結乾燥した（276mg，8096.4u、
収率50.6％、本標品の比活性は31.6u／mg蛋白質
で電気泳動的に単一バンドであつた。 実施例 ２ コレステロールオキシダーゼの至適量。 50mM リン酸緩衝液（PH7.5） 0.03％ ４−アミノアンチピリン 0.02％ フエノール リパーゼ（クロモバクテリウム属に属する生産
菌由来） 200u／ml ペルオキシダーゼ 2u／ml コレステロールオキシダーゼ（２種）* ０〜1.67u／ml （*コレステロールオキシダーゼは本発明のも
のとストレプトマイセス属由来のものとの２種を
比較した。） 上記の組成液３mlを小試験管にとり37℃に予備
加温後、人血清20μを添加後正確に５分間37℃
で反応し、直ちに500nmで比色定量を行なつた。
その結果、第４図に示す通りで、図中Γ−Γは本
発明のコレステロールオキシダーゼの場合を示
し、●−●はストレプトマイセス属由来のコレス
テロールオキシダーゼの場合を示すもので、スト
レプトマイセス属の由来のコレステロールオキシ
ダーゼが１テスト当り約５必要なのに対し、本
発明のコレステロールオキシダーゼは0.5／テ
スト有れば十分で非常に反応の速いことが確認さ
れた。
４〜5.5の酢酸緩衝液（●−●）、PH5.5〜8.5のリ
ン酸緩衝液（Γ−Γ）、PH8.5〜10のホウ酸緩衝液
（△−△）を用いて、その酵素活性を測定した。
その結果、第１図に示す通りで、本酵素はPH７付
近に至適PHを有すると認められる。 PH安定性 コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、各
種の緩衝液（PH４〜5.5の酢酸緩衝液・PH5.5〜8.5
のリン酸緩衝液、PH8.5〜10ホウ酸緩衝液）で37
℃、60分間加熱処理した後、その残存活性を前記
活性測定法に基いて測定した。その結果、第２図
に示す通りで、本酵素はPH６〜７の範囲で安定と
認められた。 熱安定性 コレステロールオキシダーゼ含有酵素液を、
50mMリン酸緩衝液（PH7.0）で10分間、10〜70
℃にて加熱処理した後、その残存活性を前記活性
測定法に基いて測定した。その結果、第３図を示
す通りで、本酵素は50℃まで安定と認められた。 等電点 PH4.8付近（キヤリア・アンフオライトる用い
た電気泳動法により測定した。） 分子量 約58000（セフアデツクスＧ−150） 約58000（SDSポリアクリルアミド電気泳動） Km値 約２×10-5M（コレステロール） 以上の本酵素の性質により、本酵素をコレステ
ロールオキシダーゼと認めたものである。 さらにこのコレステロールオキシダーゼは、コ
レステロールを遊離する試料やコレステロールを
含有する試料の定量に使用される。例えばコレス
テロール含有試料に、このコレステロールオキシ
ダーゼを作用せしめることにより、このコレステ
ロールオキシダーゼの酵素作用に基いて消費され
る酵素、または生成される過酸化水素またはコレ
ステノンを定量することにより、コレステロール
の定量をなし得るものである。また酸素や過酸化
水素定量に当つては、酸素電極、過酸化水素電極
などの目的とする成分に感応する電極による電気
的手段によつて行なつてもよく、また酵素を公知
の種々の手段によつて固定化酵素となして、電気
的手段に用いられる電極面に固着せしめた酵素電
極となして行なつてもよい。さらに過酸化水素を
測定するに当つては、好ましくは過酸化水素の存
在下で色調変化を受ける１種もしくは２種以上の
呈色剤によるシステムにて比色測定する。測定す
る方法としては、例えば生成する過酸化水素と反
応して安定した赤色を形成する４価のチタン化合
物とキシレノールオレンジによつて、生成した過
酸化水素の量をその呈色の強さによつて測定する
か、フエノール、４−アミノアンチピリンおよび
ペルオキシダーゼとの反応によつて、その色調の
変化を測定する方法などが挙られる。またこの４
−アミノアンチピリンの代りに４−アミノフエナ
ゾーンを用いてもよい。さらにジエチル−ｍ−ト
ルイジン、４−アミノアンチピリン、ペルオキシ
ダーゼを含有する試薬を用いて、生成した過酸化
水素の量をその呈色の強さによつて測定してもよ
い。その他、2.6−ジクロルフエノールインドフ
エノールとペルオキシダーゼとの組合せによる過
酸化水素の定量測定、グアヤク脂とペルオキシダ
ーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、ホモ
バニリン酸とペルオキシダーゼの組合せによる過
酸化水素の定量測定などのペルオキシダーゼを用
いる定量法が簡便かつ正確なために好ましい。さ
らにこの過酸化水素の定量用試薬を、フイルムや
紙などの担体面に塗布せしめた簡便な積層一体
型となしてもよい。 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べる
が、本発明はこれらによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例 １ コレステロール1.0％、肉エキス0.5％、
K2HPO0.1％、KCl 0.05％、MgSO4・7H2O 0.05
％含有培地100mlを500ml容三角フラスコにとり、
120℃20分間滅菌後セルロモナス・エス・ピー・
Ｂ−0814菌体を白金耳で接種約26℃で24時間振盪
培養を行なつた。 次いで、この培養物200ml（２本分）を同一組
成の培地20を含む30容ジヤーフアーメンター
に植菌し、26℃で、撹拌速度200rpm、通気量20
／minで培養を行ない、24時間後反応を停止
し、菌体を5000rpm、15分で集菌した。集菌した
ものは、0.1％リゾチーム、5mM・EDTA含有
20mM・リン酸緩衝液（PH7.5）、5.0に分散さ
せ、37℃で３時間菌体を溶解させ酵素を可溶化し
た。 可溶化後、不溶物を5000rpmで15分間遠心して
除去し、得られた上清4.8（3.3／ml、16000
ｕ）について硫安分画を行ない、0.54〜0.7飽和
画分を集めた。この沈澱画分を20mM・リン酸緩
衝液（PH7.5）800mlに溶解後透析チユーブに入
れ、流水に対して透析した。その後不溶物を
12000rpm、10分間遠心分離して、上清760mlを得
た。（17，26u／ml、13120u）。 さらに得られた上清液を、20mM・リン酸緩衝
液（PH7.5）で緩衝化したDEAE−Sepharose CL
−6B（５×70cm）にチヤージし、KCl濃度０〜
0.5Mの濃度勾配で溶出を行ない、KCl濃度0.28〜
0.32Mで溶出された画分を集めた（37.72u／ml、
12070u）。この画分を10mM・リン酸緩衝液（PH
7.0）10に対して透析し、同じ緩衝液で緩衝化
したDEAE−Sepharose CL−6B（５×30cm）カ
ラムにチヤージしKCl濃度0.1〜0.5Mの濃度勾配
で容出し、0.29〜0.31M・KClで溶出された画分
を集めた（76.32u／ml、10380）。この画分を即
外ロ過膜（アミコン社製）で濃縮し、セフアデツ
クスＧ−100カラム（５×70cm）にチヤージし、
20mMリン酸緩衝液（PH7.5）で溶出を行ない活
性画分を集め、凍結乾燥した（276mg，8096.4u、
収率50.6％、本標品の比活性は31.6u／mg蛋白質
で電気泳動的に単一バンドであつた。 実施例 ２ コレステロールオキシダーゼの至適量。 50mM リン酸緩衝液（PH7.5） 0.03％ ４−アミノアンチピリン 0.02％ フエノール リパーゼ（クロモバクテリウム属に属する生産
菌由来） 200u／ml ペルオキシダーゼ 2u／ml コレステロールオキシダーゼ（２種）* ０〜1.67u／ml （*コレステロールオキシダーゼは本発明のも
のとストレプトマイセス属由来のものとの２種を
比較した。） 上記の組成液３mlを小試験管にとり37℃に予備
加温後、人血清20μを添加後正確に５分間37℃
で反応し、直ちに500nmで比色定量を行なつた。
その結果、第４図に示す通りで、図中Γ−Γは本
発明のコレステロールオキシダーゼの場合を示
し、●−●はストレプトマイセス属由来のコレス
テロールオキシダーゼの場合を示すもので、スト
レプトマイセス属の由来のコレステロールオキシ
ダーゼが１テスト当り約５必要なのに対し、本
発明のコレステロールオキシダーゼは0.5／テ
スト有れば十分で非常に反応の速いことが確認さ
れた。
第１図は、本発明のコレステロールオキシダー
ゼ至適PH曲線、第２図はPH安定性曲線、第３図は
熱安定性曲線を示し、第４図はコレステロールオ
キシダーゼの至適量を示す曲線である。
ゼ至適PH曲線、第２図はPH安定性曲線、第３図は
熱安定性曲線を示し、第４図はコレステロールオ
キシダーゼの至適量を示す曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ セルロモナス属に属するコレステロールオキ
シダーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物から
コレステロールオキシダーゼを採取することを特
徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法。 ２ セルロモナス属に属するコレステロールオキ
シダーゼ生産菌が、セルロモナス・エス・ピー・
Ｂ−0814菌である特許請求の範囲第１項記載のコ
レステロールオキシダーゼ生産菌の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57011303A JPS58129973A (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57011303A JPS58129973A (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58129973A JPS58129973A (ja) | 1983-08-03 |
| JPH0147150B2 true JPH0147150B2 (ja) | 1989-10-12 |
Family
ID=11774226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57011303A Granted JPS58129973A (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | コレステロ−ルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58129973A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6131097A (ja) * | 1984-07-23 | 1986-02-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な高感度酵素的測定法 |
| JP2786679B2 (ja) * | 1989-07-24 | 1998-08-13 | 旭化成工業株式会社 | 新規なω位カルボキシアルコール酸化酵素 |
| US5206148A (en) * | 1989-07-24 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for assaying aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or ω-carboxylic acid derivatives thereof |
-
1982
- 1982-01-26 JP JP57011303A patent/JPS58129973A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58129973A (ja) | 1983-08-03 |
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