JPH0467954B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、NAD合成酵素の製造法に関する。 〔従来の技術〕 従来、NAD合成酵素（NAD⁺synthetase）は、
ラツト肝臓〔J.Biol.Chem.，233，493〜500
（1958）〕、ブタ肝蔵〔J.Biol.Chem.，236，525〜
530（1961）〕酵母〔J.Biol.Chem.，247，4794〜
4802（1972）〕、E.Coli〔J.Biol.Chem.，236，1494
〜1497（1961）〕、J.Biol.Chem.，242，385〜392
（1967）に夫々その存在が知られている。そして、
酵素分類上、 Mg⁺⁺ ATP＋デアミド−NAD＋NH₃AMP＋ppi＋
NAD の反応を触媒するNAD合成酵素（E.C.6.3.1.5）
と Mg⁺⁺ ATP＋デアミド−NAD＋Gln＋H₂OAPM＋
ppi＋NAD＋Ｌ−グルタミン酸 の反応を触媒するNAD合成酵素（E.C.6.8.5.1）
に分類されているが、いずれもNH₃またはGlnの
アミドを利用でき、両者の相違はアザセリンで阻
害されるか否かによつて区別されている。 本酵素の活性測定法は、反応により生じた還元
型NADをアルコールデヒドロゲナーゼ（E.
C.1.1.1）で還元し、生じたNADHを340nmにお
ける吸光度測定する方法または生じたNADを蛍
光法で測定する方法が報告されている。しかし、
この活性測定法に基いてATP、デアミドーNAD
またはNH₃またはGlnの定量を試みようとして
も、その感度が低く、従来由来の酵素では測定用
試薬としては著しく困難であつた。 本発明者らは、前記のNAD合成酵素の反応に
より生じたNADを補酵素とする酸化還元反応系
と還元型NADを補酵素とする酸化還元反応系と
の組み合わせによる補酵素サイクリング反応によ
り増幅反応させ、消費または生成される成分を定
量することにより着目した。 本発明のNAD合成酵素において、バチルス・
リケニホルミスＢ−0844の産生する酵素は、本発
明者らが新たに見出したものであり、従来公知の
NAD合成酵素より安定であり、診断用酵素とし
て有用であり、本発明は、バチルス属に属する
NAD合成酵素生産菌を培地に培養し、その培養
物からNAD合成酵素を採取することを特徴とす
るNAD合成酵素の製造法である。 まず、本バチルス・リケニホルミスＢ−0844菌
株は、静岡田方郡修善寺町大野の堆肥より分離さ
れた菌株であつて、その菌学的性質は次の通りで
ある。 ａ 形態的特徴 普通寒天斜面培地を用いて、30℃で18〜24時
間培養して顕微鏡観察を行つた。 (1) 形および配列； 端は丸く、まつすぐ又はやや曲がつた桿菌
で単独又は二連たまに短連鎖する。 (2)大きさ； 0.6〜0.8×1.5〜3.0μm (3)運動性； 周毛で運動する (4) 芽胞； 中央又は端に近いところに形成する。大き
さは0.8×1.5μm細胞は膨張する時もある。 ｂ 各培地における生育状態（50℃） (1) 普通寒天平板培地 灰白色で円形周縁は波状で平らな集落を形
成する。表面にしわを生ずる時がある。可溶
性色は産生しない。 (2) 普通寒天斜面培地 疣状（Echnulate）で良好に生育する。灰
白色を呈する。可溶性色素は産生しない。 (3) ブイヨン培地 一様に混濁良好に生育する。後に菌膜を形
成し柔毛状沈澱を生ずる。 (4) BCPミルク １〜２週間後凝固し一部ペプトン化する。 ｃ 生理的性質（＋；陽性、−；陰性） グラム染色 ＋ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ ウレアーゼ産生（SSR培地） − 〃 （Chris，培地） − ゲラチン加水分解 ＋ デンプン加水分解 ＋ カゼイン加水分解 −（３日目） エスクリン加水分解 ＋ セルロース加水分解 − インドール産生 − 硫化水素産生 ＋ アセトイン産生 ＋ MRテスト ＋（弱） 硝酸塩の還元 ＋ 脱窒反応 − クエン酸塩の利用 ＋ 7.0％NaCl添加培地での生育 ＋ 50℃での生育 ＋ 20℃での生育 ＋ 糖より酸の産生＊（ガス非産生） アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース ＋ セロビオース ＋ ヅルシトール − meso−エリスリトール − フラクトース ＋ フコース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン − ラクトース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフイノース ＋ Ｌ（＋）ラムノース ＋ サリシン ＋ Ｌソルボース − ソルビトール ＋ デンプン ＋ サツカロース ＋ トレハロース ＋ キシロース ＋ OFテスト（Hukerの方法）NT （変化なし） OFテスト（変法）※ Ｆ （醗酵） ※基礎培地 （NH₄）₂HPO₄ 1.0ｇ KCl 0.2ｇ MgSO₄7H₂O 0.2ｇ Yeast ex 1.0ｇ Agar 3.0ｇ BTB 0.02ｇ Distilled water 1000ml PH7.0 利用性テスト（炭素源として） Ｄアラニン − Ｌアラニン ＋ フラクトース − プロパノール − エタノール − エチルアミン − ラクテイト ＋ αアミノブチレイト − グルコース ＋ イノシトール − シユークロース ＋ セロビオース − Ｌ（＋）アラビノース − マンノース ＋ マルトース ＋ ラムノース − トレハロース ＋ アセテイト − プロピオネイト ＋ DNAのシトシン グアニン含量（％）45.6％
（Tm変法） 上記の菌学的性質から、本Ｂ−0844菌株は50℃
で生育でき、端の丸いまつすぐまたはやや曲がつ
た桿菌で、グラム陽性、芽胞を形成し、糖を醗酵
的に分解する細菌であるとの特徴を有する。この
ような諸性状を有する本菌の分類学上の位置を
Bergey′s Manual ８版、1974、医学細菌同定の
手引き２版、1974おびAgriculture Handbook，
427，The genus Bacillusを参照して検討する
と、本菌は芽胞を形成し、好気条件で生育できる
ことからバチルス属に属するものと判定される。
そこで、50℃で生育できる菌種として、(イ)バチル
ス・コアギユランス、(ロ)バチルス・リケニホルミ
ス、(ハ)バチルス・ズブチリス、(ニ)バチルス・ブレ
ビスおよび(ホ)バチルス・ステアーサーモフイラス
が挙げられる。これらの性状を比較対比すると次
の通りである〔＋；陽性、−陰性、ｄ；菌株によ
つて反応が異なる〕

【表】 以上の比較対比から、本菌株はバチルス・リケ
ニホルミスとよく一致しており、その他の諸性状
について比較検討した結果でもバチルス・リケニ
ホルミスとよく一致した。よつて本−0844菌株を
バチルス・リケニホルミス（Bacilllus
lichniformis）Ｂ−0844と同定命名した。なお、
本菌株は工業技術院微生物工業技術院研究所に
「微工研菌寄第6809号（FERM BP−601」とし
て寄託されている。 本発明においては、バチルス属に属するNAD
合成酵素生産菌としては、上記のバチルス・リケ
ニホルミスＢ−0844はその一例であつて、この菌
株に限らず、バチルス属に属し、NAD合成酵素
を生産する菌はすべて本発明において使用でき
る。 本発明は、先ずバチルス属に属するNAD生産
菌を酵素する生産する通常の方法で培養される。
培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、
工業的に深部通気撹拌培養を行うのが望ましい。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。炭素源としては
同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブド
ウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖、スターチ、デキス
トリン、糖蜜、廃糖蜜、グリセリンなどが挙げら
れる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物で
あればよく、例えばコーン、スチーブ、リカー、
大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、カゼイン加水分解物などが使
用される。その他リン酸塩、マグネシウム、カル
シウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マン
ガン、ハロゲンなどの塩類が必要に応じて使用さ
れる。 培養温度は、NAD合成酵素生産菌が発育し、
本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、26
〜50℃が好ましい。培養時間は培養条件によつて
異なるが通常15〜40時間程度行ばよい。本酵素が
最高力価に達する時期を見計らつて適当な時期に
培養を終了すればよい、通気撹拌する場合には、
200〜400r.p.mの条件で充分である。 このようにして得られたNAD合成酵素生産菌
の培養物からNAD合成酵素を採取するのである
が、本酵素は主にその菌体内に含有されるので、
得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段
により集菌し、この菌体を超音波処理、フレンチ
プレス処理やガラスビーズ処理などの機械的破壊
手段やリゾチームなどの酵素的破壊手段にて破壊
し、また必要に応じてトリトンＸ−100（Triton
Ｘ−100：商品名）アデカトールSO−120（商品
名）などの界面活性剤を添加してもよい。こうし
て得られたNAD合成酵素含有液は、濃縮するか、
または濃縮することなく、可溶性塩類、例えば硫
安などを用いて塩析するか、親水性有機溶媒、例
えばメタノール、エタノール、アセトン、イソプ
ロパノールなどを用いて本酵素を沈澱させればよ
い。この沈澱物は、水または緩衝液に溶解後、必
要に応じて半透膜にて透析し、さらにDEAE−セ
フアデデツクス、DEAE−セフアロースやDEAE
−セルロースなどやカルボキシメチル−セルロー
ス、カルボキシメチル−セフアロース、カルボキ
シメチル−セフアデツクスなどのイオン交換樹脂
を用いるクロマトグラフイーやセフアデツクス
G200、セフアロースCL−6B、セフアクリルＳ−
200などの分子篩剤などのゲル濾過剤を用いるク
ロマトグラフイーにて精製せしめ、その後凍結乾
燥などの処理により生成されたNAD合成酵素を
得ることができる。 次に、本発明で得たNAD合成酵素の性質につ
いて述べる。 (1) 分子量；約62000（セフアデツクスＧ−150ゲ
ル濾過による。 (2) 等電点；PH4.6付近（アンフオライトを用い
た電気泳動法による） (3) 作用； Mg⁺⁺ ATP＋デアミド−NAD＋NH₃→AMP＋ppi＋
NAD (4) 基質特異性； NH₃以外にＬ−Gln、Ｌ−Asnにも作用し
て、次の反応を触媒する。 ATP＋デアミノ−NAD＋Gln（またはＡ Mg⁺⁺ sn）→AMP＋ppi＋NAD＋Glu（またはAsp） (5) 至摘PH 酵素活性測定法の反応液１の緩衝液を酢酸緩
衝液（PH3.8〜6.6）、ジメチルグルタル酸−水
酸化ナトリウム緩衝液（PH5.1〜6.8）およびト
リス塩酸緩衝液（PH6.5〜8.8）に加えて酵素活
性を測定した結果は第１図の通りである。PH
8.0〜8.7付近に至適PHを有する。 (6) PH安定性 本酵素を50mMの酢酸緩衝液（PH3.9〜6.8）、
ジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液
（PH4.1〜7.1）、リン酸緩衝液（PH6.3〜7.9）お
よびトリス塩酸緩衝液（PH6.4〜8.9）に溶解
し、37℃で60分間処理した後、その残存活性を
酵素活性測定法に従つて測定した結果は、第２
図の通りである。PH5.5〜9.0の範囲で安定であ
る。 (7) 熱安定性 50mMトリス塩酸緩衝液（PH6.8）に本酵素
を溶解し、各温度で10分間加熱処理した後、そ
の残存活性を酵素活性測定法に従つて測定した
結果は、第３図の通りである。40℃まで安定で
ある。 (8) 界面活性剤の影響 酵素活性測定法において、反応液に第１表
に記載の界面活性剤を0.1％になるように添加
し、37％に加温後、酵素液5μを添加し、37
℃で10分間反応後、0.8mlの反応液を加え、
37℃で正確に５分間反応させた後、0.1N塩酸
2.0mlを加えてサイクリング反応を停止し、
550nmで比色定量した。その結果は第１表通り
である。非イオン性界面活性剤では影響を受け
なかつたが、カチオンおよびアニオン界面活性
剤により阻害された。

【表】 (9) 金属イオンの影響 酵素活性測定法において反応液（20mM
MgCl₂含有）に最終濃度１mlになるように各種
金属塩を添加した後、酵素活性測定法に従つ
て、そのとき酵素活性を相対活性で示すと第２
表の通りである。

【表】 (10) 酵素活性測定法 活性測定法 反応液 50mM トリス−HCl緩衝液PH8.0 20mM KCl 20mM MgCl₂ 0.05％ 牛血清アルブミン 2mM ATP 0.5mM デアミド−NAD 25mM （NH₄）₂SO₄ 反応液 50mM トリス−HCl緩衝液PH8.0 10U ジアホラーゼ／ml（東洋醸造製、バチル
ス属生産菌由来） ８％ エタノール 10U アルコールデヒドロゲナーゼ／ml（東洋
紡績、イースト菌由来） 0.025％ NTB（ニトロテトラゾリウムブルー） 0.1％ Triton Ｘ−100 10mM EDTA 反応液10.2mlを小試験管にとり、37℃に加温後
酵素液5μを添加し、37℃で正確に10分間反応
を行い、0.8mlの反応液を添加し、反応を停止
するとともにサイクリング反応を開始した。サイ
クリング反応は37℃で正確に５分間行い、
0.1NHCl2.0mlを添加によりサイクリング反応を
停止後550nmにおける吸光度を測定してそのとき
の値より酵素活性を求めた。なお、活性の計算式
は次の式に順じた。 NAD合成酵素活性（mU／ml） ＝Δ550／Δ550×1.0／0.005×ｆ／10 Δ550：検体の吸光度 Δ550：標準液の吸光度（0.1mMNAD） 0.005：検体量（ml） 10 ：反応時間 ｆ ：希釈倍率 次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する
が、これにより本発明を限定するものではない。 実施例 １ 80容ジヤーにペプトン１％、肉エキス１％、
酵母エキス0.2％、NaCl0.3％を含む液体培地（PH
7.3）20を仕込み、120℃20分間滅菌後、上記と
同一組成の培地で予備培養した種菌200mlを接種
し、50℃で16時間通気量20／min撹拌速度
300rpm／minで通気培養した。培養後遠心分離
にて菌体を集め、集めた菌体を0.1％のリゾチー
ムを含有する10mMTris−HCl緩衝液（PH8.0）
２に分散させ、37℃で30分間反応を行い溶菌し
た。この液を500r.p.m10分間遠心し、上清液1.9
を得た。この上清液に硫安を添加し、硫安分画
（0.44〜0.54飽和）を行い、この沈澱を10mMトリ
ス−HCl緩衝液200mlに溶解（473U）し、この緩
衝液12に対して透析した。この透析物中に生じ
た不溶物を遠心分離（12000r.p.m、10分間）にて
除去した。上清液（462U）を10mMトリス−
HCl緩衝液PH8.0で緩衝化したDEAE−セフアロ
ースCL−6Bカラム（５×30cm）にチヤージし、
０〜0.5MNaClの濃度勾配法にて溶出した。0.15
〜0.2MNaClで溶出される画分を集め（120ml、
388U）アミコン社製限外濾過膜PM−10を用い濃
縮した後、セフアデツクスＧ−150（3.6×80cm）
にて精製を行い、その活性画分を集め、精製標品
（86ml、324U）とした。また、この標品に各々牛
血清アルブミン、グルコース、マルトース、マン
ニトール、シユクロース、果糖を１％になるよう
に添加し、凍結乾燥した。無添加のものは活性収
率86％であつたが、添加したものはまつたく活性
の低下が見られず、安定であつた。 参考例 １ 反応液 50mM トリス−HCl緩衝液（PH8.0） 20mM KCl 20mM MgCl₂ 0.05％ 牛血清アルブミン 1mM デアミノ−NAD 50mM （NH₄）₂SO₄ 400mU NAD−合成酵素／ml 反応液 50mM トリス−HCl緩衝液（PH8.0） 20U ジアホラーゼ／ml ３％ エタノール 20U アルコールデヒドロゲナーゼ／ml 0.05％ NTB 0.1％、Triton Ｘ−100 反応液0.2mlを試験管にとり37℃に加温後、
０，５，10，20，30，40μMのATP溶液をそれぞ
れ5μを添加し、37℃で10分間反応した後、反
応液を0.3ml添加し、37℃で正確に５分間反応
したのち、0.1NHCl2.0mlを加えて反応を停止し、
550nmで吸光度測定した。その結果は第４図に示
す通りで良好な直線性が得られた。また本反応に
おけるサイクリング反応率は4800回転／時であつ
た。 参考例 ２ 参考例１に示した反応液と反応液を等量ず
つ混合し、37℃に加温する。この混合物1.0mlを
３℃にセツトされた分光光度計の石英セル（1.0
ml用）にとり、実施例１に用いたのと同濃度
ATD溶液5μを添加し、添加後５分から７分目
までの２分間の吸光度変化を550nmで測定した。
その結果は第５図に示す通りでキネテイクス法に
おいても高感度で良好な直線性が得られた。この
ときの回転率は約2800回転／時であつた。 参考例 ３ 参考例１に示した反応液中に50mM硫安の代
りに5mMATPを添加した反応液に各種濃度の硫
安、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンを添加
し、実施例２と同じ操作を行つた。その結果は第
６図に示す通りで硫安、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ア
スパラギンと共に良好な直線性が得られた。 〇−〇：硫安、●−●：Ｌ−グルタミン、Δ−
Δ：Ｌ−アスパラギン。

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルス・リケンホルミスＢ−0844の
産生するNAD合成酵素の至適PH曲線、第２図は
同酵素のPH安定曲線、第３図は同酵素の熱安定性
曲線を示し、第４図は本発明におけるエンドポイ
ント法によるATPの定量曲線、第５図はキネテ
イクス法によるATPの定量曲線、第６図はエン
ドポイント法によるＬ−グルタミンおよびＬ−ア
スパラギンの定量曲線を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス属に属するNAD合成酵素生産菌を
   培地に培養し、その培養物からNAD合成酵素を
   採取することを特徴とするNAD合成酵素の製造
   法。 ２ NAD合成酵素生産菌がバチルス・リケニホ
   ルミスＢ−0844（FERM BP−601）である特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。