JPH0218064B2 - - Google Patents
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- JPH0218064B2 JPH0218064B2 JP56186183A JP18618381A JPH0218064B2 JP H0218064 B2 JPH0218064 B2 JP H0218064B2 JP 56186183 A JP56186183 A JP 56186183A JP 18618381 A JP18618381 A JP 18618381A JP H0218064 B2 JPH0218064 B2 JP H0218064B2
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- cdh
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本発明は、NAD（Ｐ）依存性コレステロール脱
水素酵素（Cholesterol dehydrogenase：以下
「NAD（Ｐ）−CDH」と略す）に関する。さらに
詳しくは、微生物を好気的条件下で培養し、その
菌体もしくは培養液からNAD（Ｐ）−CDHを採取
する方法に関する。 本発明方法により得られたNAD（Ｐ）−CDH
は、コレステロールの定量法およびコレステロー
ルの定量用試薬として有用である。ここでいう
NAD（Ｐ）−CDHとは、補酵素としてNAD（ニコ
チンアミドアデニン、ジヌクレオチド）、NADP
（ニコチンアミドアデニン、ジヌクレオチドリン
ン酸）を要求し、電子供与体（コレステロール）
から水素をうばい、電子受容体（NAD又は
NADP）に付加する反応を触媒する酵素をいう。
従来好気性微生物が、コレステロールオキシダー
ゼ、コレステロールデヒドラターゼを生産するこ
とは既に知られている。また、ノカルジア・エリ
スロポリスがコレステロールの酸化を触媒する酵
素を生産するとの報告（Ann.Clin.Biochem.，10
巻、79頁、1973年）がある。この酵素の場合は、
NAD（Ｐ）への依存性は認められない。また、マ
イコバクテリウム・コレステリカム（J.Biol.
Chem.，206巻、511頁、1953年）、ブレビバクテ
リウム・ステロリカム（特公昭48−1190）につい
ても同様のことがいえる。さらには、絶対嫌気性
微生物である、オイバクテリウムsp.ATCC21408
がNAD（Ｐ）−CDHを生産するとの報告（特開昭
53−56090）もあるが、酵素学的性質等の記載は
ほとんどなされていないばかりか、NAD（Ｐ）依
存性の記載があるにもかかわらず、NAD（Ｐ）の
存在なしにも反応が進行する例が記載されてい
る。したがつてこの酵素は、本発明でいうところ
のNAD（Ｐ）依存性脱水素酵素とはいえない。 従来酵素によるコレステロールの定量は、コレ
ステロールオキシダーゼを使用する方法が広く用
いられているが、発色系に導くためにパーオキシ
ダーゼ等が必要であり、操作が繁雑である。しか
も血中のビリルビン、アスコルビン酸等により影
響をうけ、これにより誤差が生じやすいという欠
点を有している。 コレステロールの定量において、NAD（Ｐ）の
存在なしには反応が進行しないNAD（Ｐ）−CDH
を用い、下記反応式に示される反応により生ずる
NAD（Ｐ）Ｈを直接光度計で測定できれば、操作
が簡単であり、前記のコレステロールオキシダー
ゼを用いる方法の種々の問題も解決される。 コレステロール＋NAD（Ｐ）コレステノン＋
NAD（Ｐ）Ｈ 本発明者等は、上記反応に適した酵素すなわ
ち、コレステロールに特異性が高く、NAD（Ｐ）
依存性である脱水素酵素を広く自然界に求めたと
ころ、意外にも好気的条件下に生育する微生物
が、著量のNAD（Ｐ）−CDHを生産することを見
い出した。その中で、特に優れた菌株として、ノ
カルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia sp.No.Ch2−
１）、アリカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）、およびプロテウス・ブルガリス
IAM1025Proteus vulgaris IAM1025が例示され
る。 次にノカルジアsp.No.Ch2−１およびアルカリゲ
ネスsp.No.４の菌学的性質を以下に述べる。 (1) ノカルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia sp.No.
Ch2−１）の菌学的性質 (A) 形態的性質 １ 細胞の形および大きさ：培養初期菌糸状に
生育し分岐を生じる。その後、不規則な分断
が生じ細胞は桿菌状となる。大きさは0.8〜
1.0μ×1.5〜4.0μ位である。気菌糸を形成せず
胞子のう胞子も形成しない。 ２ グラム染色性：陽性 ３ 抗酸性：陽性 ４ 運動性：無し (B) 化学的組成分析 細胞壁中にmeso−ジアノピメリン酸、アラ
ビノース、ガラクトースが含まれＬ，Ｌ−ジア
ミノピメリン酸、グリシンは含まない。 (C) 各培地における生育状態 １ 肉汁寒天平板培地：30℃で４日培養後、直
径0.5〜1.0mmの円形コロニーを形成する。周
辺は全縁もしくは波状である。表面は平滑で
半球状であり、中心部が凸状に隆起する場合
もある。色は薄いクリーム色で不透明であ
る。培地中に色素は出さない。 ２ シユークロース削酸塩寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ３ グルコース、アスパラギン寒天培地 生育中程度で集落の色はクリーム色であ
る。水溶性色素は出さない。 ４ グリセリン、アスパラギン寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ５ スターチ無機寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ６ チロシン寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ７ 栄養寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。
水溶性色素は出さない。 ８ イースト麦芽寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。
水溶性色素は出さない。 ９ オートミール寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 (D) 生理的性質 １ 生育温度：15℃〜43℃で生育する。10℃、
45℃で生育しない。最適温度は30〜35℃であ
る。 ２ 硝酸塩還元性：陽性 ３ カタラーゼ：陽性 ４ オキシダーゼ：陰性 ５ ウレアーゼ：陽性 ６ デンプン加水分解：陰性 ７ ゼラチン液化：陰性 ８ チロシン加水分解：陰性 ９ カゼイン加水分解：陰性 10 キサンチン加水分解：陰性 11 DNAの分解：陰性 12 リトマスミルク：アルカリ性、ペプトン
化、凝固共にしない。 13 メラニン様色素の生成：無し 14 エスクリン加水分解：陽性 15 Tween20、40、60、80加水分解：すべて
陽性 16 ペニシリン耐性試験：耐性 17 酸素に対する態度：好気性 18 無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸
塩共に利用する。 19 NaCl生育範囲：０〜６％で生育する。７
％で生育しない。 20 各種炭素源の同化法（プリドハム、ゴドリ
ーブ寒天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マン
ノース、グリセリン、トレハロースを同化す
る。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、サ
ツカロース、イノシツト、Ｌ−ラムノース、
ラフイノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ニツト、マルトース、ソルビツトを同化しな
い。 21 各種糖から酸の生成 Ｄ−グルコース、マンノース、Ｄ−フラク
トース、トレハロース、グリセリンから酸を
生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ―キシロー
ス、Ｄ−ガラクトース、マルトース、サツカ
ロース、ラクトース、Ｄ−ソルビツト、Ｄ−
マンニツト、イノシツト、デンプンから酸を
生成しない。 以上の菌学的性質をBergey′s Manual of
Determinative Bacteriology第８版を参考に検
討した結果、細胞壁中にmeso−ジアミノピメリ
ン酸、アラビノース、ガラクトースを含み、Ｌ，
Ｌ−ジアミノピメリン酸、グリシンが含まれない
こと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分断し
て菌状となること、抗酸性であること、胞子のう
胞子および気菌糸を着生しないこと等から本菌は
Nocardiaに属する菌である。 よつて本菌は、本発明者らがノカルジアsp.No.
Ch2−１（Nocardia sp.No.Ch2−１）と命名し、
工業技術院微生物工業技術研究所に菌寄第6217号
（FERM−ＰNo.6217）として寄託されている。 (2) アルカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）の菌学的性質 (A) 形態 １ 細胞の形および大きさ：0.4〜0.6μ×0.8〜
1.2μの菌である。 ２ 細胞の多形性の有無：多形性は認められな
い。 ３ 運動性の有無：周鞭毛を有し運動する。 ４ 胞子の有無：胞子は形成しない。 ５ グラム染色性：陰性 ６ 抗酸性：陰性 (B) 各培地における生育状態 １ 肉汁寒天平板培養 円形ローニーで表面は平滑、半レンズ状の
隆起、全縁状で薄クリーム色、半透明、光沢
あり ２ 肉汁寒天斜面培養 生育中程度、糸状に生育、薄クリーム色で
半透明 ３ 肉汁液体培養 菌膜をつくらない、やや濁り沈渣も少しあ
る。 ４ 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは液化し
ない。 ５ リトマスミルク培養：アルカリ性になるが
ペプトン化しない、凝固しない。 (C) 生理的性質 １ 硝酸塩の還元：陽性 ２ 脱窒反応：陰性 ３ MRテスト：陰性 ４ VPテスト：陰性 ５ インドールの生成：陰性 ６ 硫化水素の生成：弱陽性 ７ デンプン加水分解：陰性 ８ クエン酸塩の利用：Koserの培地と
Christensenの培地で共に利用する。 ９ 無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニ
ウム塩を利用する。 10 色素の生成：水溶性色素を生成しない。 11 ウレアーゼ：陽性 12 オキシダーゼ：陽性 13 カタラーゼ：陽性 14 生育範囲PH：PH5.0〜10.0で生育する。温
度：５℃〜37℃で生育する。42℃で生育しな
い。 15 酸素に対する態度：好気性 16 OFテスト（Hugh−Leifson法）：フラクト
ースから好気的に酸を生成する。 17 糖類から酸およびガスの生成の有無 Ayers，Rupp and Johnson培地でフラク
トースとグリセリンから酸を生成するかガス
は生成しない。 アラビノース、キシロース、グルコース、
マンノース、ガラクトース、麦芽糖、シヨ
糖、乳糖、トレハロース、ソルビツト、マン
ニツト、イノシツト、デンプンからは酸もガ
スも生成しない。 18 独立栄養的生育：水素ガス、炭酸ガス、酸
素ガスを含有する気体中で生育しない。 19 Tween80の分解性：陽性 20 資化性：Ｄ−フラクトース、Ｌ−フエニル
アラニン、レブリン酸カルシウム、Ｌ−スレ
オニンを資化する。マンノース、マルトー
ス、マンニツト、ベタインを資化しない。 以上の菌学的諸性質からBergey′s manual of
Determinative Bacteriology（第８版）の記載に
照合して検討すると短桿菌で周ベン毛により運動
すること、グラム陰性、好気性であること、栄養
要求性はなく、アンモニウム塩、硝酸塩を利用す
ること、カゼインおよびゼラチンを分解しないこ
と、オキシダーゼ陽性であること等から
Alcaligenes属に分類される。 種については、Alcaligenes eutrophus、A.
paradoxus、A.ruhlandiiおよびA.latusとは主に
独立栄養的生育の点で異なる。またA.faecalisと
は主に42℃における生育、Ｄ−フラクトースの資
化性で、A.aquamarinusとは、主にデンプンの
分解性、マルトースの資化性で、A.pacificusと
は、主にスレオニン、ベタインの資化性で、A.
cupidusとは、主にオキシダーゼおよびマンニツ
ト、マンノースの資化性で、A.venustusとは、
主にレブリン酸塩、スレオニン、ベタインの資化
性で、A.aestusとは、主にマンニツト、スレオニ
ン、フエニルアラニンの資化性で異なる。よつて
本菌をアルカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）と命名し工業技術院微生物工業技術研究所に
菌寄第6216号（FERM−ＰNo.6216）として寄託
されている。 次にこれらの菌を用いてNAD（Ｐ）−CDHを製
造する方法について詳述する。これらの菌はいづ
れも構成的にNAD（Ｐ）−CDHを生産する能力を
有し、通常のペプトン、酵母エキス、又は硫酸ア
ンモニウム等のチツソ源及びグルコース、グリセ
ロール等の炭素源、その他無機塩等を含有する培
地でもNAD（Ｐ）−CDHを生産するが、コレステ
ロールを培地に添加することによりさらに多重に
NAD（Ｐ）−CDHを生産する。この際コレステロ
ールの添加は、培養開始時あるいは途中からのい
ずれでもよい。また、その他培養条件に関して
は、通常行なわれる範囲で実施できる。これらの
菌により生産されたNAD（Ｐ）−CDHは、菌体の
みならず、培養液中にも蓄積され、その何れから
でも酵素を回収することができる。これらの培養
濾液又は菌体抽出液を硫酸アンモニウム等による
塩析又は、アセトン、エタノール等の溶剤沈澱し
て得た粗酵素は、そのままコレステロールの定量
に使用するか、あるいは更に精製して使用するこ
ともできる。例えば精製については、イオン交換
クロマトグラフイー、分子篩クロマトグラフイー
等公知の方法により可能である。 ここで得られるNAD（Ｐ）−CDHは、コレステ
ロール含有物質中のコレステロール定量等に有利
に使用できる。 本発明に使用するNAD（Ｐ）−CDHの活性測定
法を以下に示す。 NAD（Ｐ）−CDHの酵素活性は、コレステロー
ルとNAD（Ｐ）を基質として反応した場合の
NAD（Ｐ）Ｈの生成量を、340nmにおける吸光度
の増加として、分光光度計で測定し算出する。す
なわち、0.1Mトリス・塩酸緩衝液（PH8.6）2.65
ml、28mMNAD溶液0.1ml、（８％トリトンＸ−
100溶液0.15ml）、１％コレステロール溶液0.05ml
及びNAD（Ｐ）−CDH水溶液0.05mlを混合し、30
℃で反応させ、反応開始後１分間の340nmにおけ
る吸光度の増加を測定する。 対照として上記組成でコレステロールの代りに
水を用い同様の操作を行ない、対照液の340nmに
おける吸光度の増加を試験液のそれから差し引
く。得られた値からNAD（Ｐ）Ｈの生成量を求
め、これより試料中のNAD（Ｐ）−CDH活性を算
出する。 酵素活性の表示は、PH8.6、30℃の条件下で１
分間に1μmoleのNAD（Ｐ）Ｈを生成する酵素を
１単位とした。 次に本発明に使用するNAD（Ｐ）−CDHの作用
を示す。 コレステロール＋NAD（Ｐ）コレステノン＋
NAD（Ｐ）Ｈ 本発明におけるNAD（Ｐ）−CDHは全てこの反
応を触媒する。 以下に本発明に使用するNAD（Ｐ）CDHの一
般的性質をノカルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia
sp.No.Ch2−１）FERM−P6217およびアルカゲネ
スsp.No.４（Alcaligenes sp.No.４）FERM−P6216
の生産するものについて示す。 (1) ノカルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia sp.No.
Ch2−１）FERM−P6217の生産するNAD（Ｐ）
−CDH １ 至適PH：9.0付近（第１図に示される。） ２ PH安定性：37℃、15分の条件においてPH６
〜７で安定である。（第２図に示される。） ３ 至適温度：25〜35℃（第３図に示される。） ４ 熱安定性：PH7.0，15分の条件において35
℃以下で安定である。（第４図に示される。） ５ 基質特異性 本素は、3β位に水酸基をもつステロイド
に反応し、コレステロールを100とするとス
テイグマステロール35、β−シトステロール
25、その他デヒドロエピアンドロステロン、
エルゴステロール等にわずかに作用する。 ６ 補素 NADを要求する。 (2) アルカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）FER−P6216の生産するNAD（Ｐ）−CDH １ 至適PH：8.5付近（第５図に示される。） ２ PH安定性：37℃，15の条件においてPH67で
安定である。（第６図に示される。） ３ 至適温度：25〜35℃（第７図に示される。） ４ 熱安定性：PH7.0，15分の条件で30℃まで
安定である。（第８図に示される。） ５ 基質特異性 本素は3β位に水酸基をもつステロイドに
反応し、コレステロールを100とするとβ−
シトステロール36、ステグマステロール20、
その他、デヒドロエピアンドロステロン、エ
ルゴステロール等にわずかに作用する。 ６ 補素 NADを要求する。 次に本発明のNAD（Ｐ）−CDHを使用したコレ
ステロールの定量について詳述する。 コレステロールを定量する場合、実際には緩衝
液、NAD（Ｐ）、基質（血清、コレステロール等）
及び、NAD（Ｐ）−CDHを混合し、一定時間反応
し、生成するNAD（Ｐ）Ｈの増加を吸光度340nm
で測定する。また必要に応じて、生成したNAD
（Ｐ）Ｈの水素をフエナジンメソサルフエート
（PMS）、ジアフオラーゼ等により、ホルマザン
色素等の発色系に導くことも可能である。さらに
は、反応系にコレステロールエステラーゼ、界面
活性剤及び、安定化剤等の添加も可能である。反
応時のPHは６〜10の範囲で実施できるが、優れて
いるPH範囲は７〜９である。 次にNAD（Ｐ）−CDHによるコレステロール定
量用試薬の量的組成についての１例を述べれば、
反応系３ml当り、NAD（Ｐ）−CDH0.1〜10単位、
NAD（Ｐ）10〜100mM、トリトンＸ−100 1.0％
以下、コレステロールエステラーゼ（ベーリンガ
ー社製）0.1〜10単位が有利である。しかし本発
明はこれらの量的組成に限定されるものではな
い。本発明の測定法における特別な利点は生成す
るNAD（Ｐ）Ｈを直接測定できることであり、ま
た完全に定量できることである。 次に試験例及び実施例につき述べる。 試験例 本発明における菌株３種につき、コレステロー
ル５ｇ／、肉エキス５ｇ／、酵母エキス0.2
ｇ／、少量の消泡剤の組成よりなる培地（PH
7.2）100mlを入れた500ml容坂ロフラスコに植菌
し、30℃で40時間振盪培養した。培養液50mlを遠
心分離（8000rpm10分間）により集菌し、0.1M
リン酸緩衝液PH7.0、50mlで洗浄した。 次に同じ緩衝液50mlに菌体を懸濁し、超音波に
て菌体を破砕した。この破砕液を塩心分離
（10000rpm、10分間）し、清澄液を得た。得られ
た清澄液のNAD（Ｐ）−CDH活性を測定し次の結
果を得た。
水素酵素（Cholesterol dehydrogenase：以下
「NAD（Ｐ）−CDH」と略す）に関する。さらに
詳しくは、微生物を好気的条件下で培養し、その
菌体もしくは培養液からNAD（Ｐ）−CDHを採取
する方法に関する。 本発明方法により得られたNAD（Ｐ）−CDH
は、コレステロールの定量法およびコレステロー
ルの定量用試薬として有用である。ここでいう
NAD（Ｐ）−CDHとは、補酵素としてNAD（ニコ
チンアミドアデニン、ジヌクレオチド）、NADP
（ニコチンアミドアデニン、ジヌクレオチドリン
ン酸）を要求し、電子供与体（コレステロール）
から水素をうばい、電子受容体（NAD又は
NADP）に付加する反応を触媒する酵素をいう。
従来好気性微生物が、コレステロールオキシダー
ゼ、コレステロールデヒドラターゼを生産するこ
とは既に知られている。また、ノカルジア・エリ
スロポリスがコレステロールの酸化を触媒する酵
素を生産するとの報告（Ann.Clin.Biochem.，10
巻、79頁、1973年）がある。この酵素の場合は、
NAD（Ｐ）への依存性は認められない。また、マ
イコバクテリウム・コレステリカム（J.Biol.
Chem.，206巻、511頁、1953年）、ブレビバクテ
リウム・ステロリカム（特公昭48−1190）につい
ても同様のことがいえる。さらには、絶対嫌気性
微生物である、オイバクテリウムsp.ATCC21408
がNAD（Ｐ）−CDHを生産するとの報告（特開昭
53−56090）もあるが、酵素学的性質等の記載は
ほとんどなされていないばかりか、NAD（Ｐ）依
存性の記載があるにもかかわらず、NAD（Ｐ）の
存在なしにも反応が進行する例が記載されてい
る。したがつてこの酵素は、本発明でいうところ
のNAD（Ｐ）依存性脱水素酵素とはいえない。 従来酵素によるコレステロールの定量は、コレ
ステロールオキシダーゼを使用する方法が広く用
いられているが、発色系に導くためにパーオキシ
ダーゼ等が必要であり、操作が繁雑である。しか
も血中のビリルビン、アスコルビン酸等により影
響をうけ、これにより誤差が生じやすいという欠
点を有している。 コレステロールの定量において、NAD（Ｐ）の
存在なしには反応が進行しないNAD（Ｐ）−CDH
を用い、下記反応式に示される反応により生ずる
NAD（Ｐ）Ｈを直接光度計で測定できれば、操作
が簡単であり、前記のコレステロールオキシダー
ゼを用いる方法の種々の問題も解決される。 コレステロール＋NAD（Ｐ）コレステノン＋
NAD（Ｐ）Ｈ 本発明者等は、上記反応に適した酵素すなわ
ち、コレステロールに特異性が高く、NAD（Ｐ）
依存性である脱水素酵素を広く自然界に求めたと
ころ、意外にも好気的条件下に生育する微生物
が、著量のNAD（Ｐ）−CDHを生産することを見
い出した。その中で、特に優れた菌株として、ノ
カルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia sp.No.Ch2−
１）、アリカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）、およびプロテウス・ブルガリス
IAM1025Proteus vulgaris IAM1025が例示され
る。 次にノカルジアsp.No.Ch2−１およびアルカリゲ
ネスsp.No.４の菌学的性質を以下に述べる。 (1) ノカルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia sp.No.
Ch2−１）の菌学的性質 (A) 形態的性質 １ 細胞の形および大きさ：培養初期菌糸状に
生育し分岐を生じる。その後、不規則な分断
が生じ細胞は桿菌状となる。大きさは0.8〜
1.0μ×1.5〜4.0μ位である。気菌糸を形成せず
胞子のう胞子も形成しない。 ２ グラム染色性：陽性 ３ 抗酸性：陽性 ４ 運動性：無し (B) 化学的組成分析 細胞壁中にmeso−ジアノピメリン酸、アラ
ビノース、ガラクトースが含まれＬ，Ｌ−ジア
ミノピメリン酸、グリシンは含まない。 (C) 各培地における生育状態 １ 肉汁寒天平板培地：30℃で４日培養後、直
径0.5〜1.0mmの円形コロニーを形成する。周
辺は全縁もしくは波状である。表面は平滑で
半球状であり、中心部が凸状に隆起する場合
もある。色は薄いクリーム色で不透明であ
る。培地中に色素は出さない。 ２ シユークロース削酸塩寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ３ グルコース、アスパラギン寒天培地 生育中程度で集落の色はクリーム色であ
る。水溶性色素は出さない。 ４ グリセリン、アスパラギン寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ５ スターチ無機寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ６ チロシン寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 ７ 栄養寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。
水溶性色素は出さない。 ８ イースト麦芽寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。
水溶性色素は出さない。 ９ オートミール寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 (D) 生理的性質 １ 生育温度：15℃〜43℃で生育する。10℃、
45℃で生育しない。最適温度は30〜35℃であ
る。 ２ 硝酸塩還元性：陽性 ３ カタラーゼ：陽性 ４ オキシダーゼ：陰性 ５ ウレアーゼ：陽性 ６ デンプン加水分解：陰性 ７ ゼラチン液化：陰性 ８ チロシン加水分解：陰性 ９ カゼイン加水分解：陰性 10 キサンチン加水分解：陰性 11 DNAの分解：陰性 12 リトマスミルク：アルカリ性、ペプトン
化、凝固共にしない。 13 メラニン様色素の生成：無し 14 エスクリン加水分解：陽性 15 Tween20、40、60、80加水分解：すべて
陽性 16 ペニシリン耐性試験：耐性 17 酸素に対する態度：好気性 18 無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸
塩共に利用する。 19 NaCl生育範囲：０〜６％で生育する。７
％で生育しない。 20 各種炭素源の同化法（プリドハム、ゴドリ
ーブ寒天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マン
ノース、グリセリン、トレハロースを同化す
る。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、サ
ツカロース、イノシツト、Ｌ−ラムノース、
ラフイノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マン
ニツト、マルトース、ソルビツトを同化しな
い。 21 各種糖から酸の生成 Ｄ−グルコース、マンノース、Ｄ−フラク
トース、トレハロース、グリセリンから酸を
生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ―キシロー
ス、Ｄ−ガラクトース、マルトース、サツカ
ロース、ラクトース、Ｄ−ソルビツト、Ｄ−
マンニツト、イノシツト、デンプンから酸を
生成しない。 以上の菌学的性質をBergey′s Manual of
Determinative Bacteriology第８版を参考に検
討した結果、細胞壁中にmeso−ジアミノピメリ
ン酸、アラビノース、ガラクトースを含み、Ｌ，
Ｌ−ジアミノピメリン酸、グリシンが含まれない
こと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分断し
て菌状となること、抗酸性であること、胞子のう
胞子および気菌糸を着生しないこと等から本菌は
Nocardiaに属する菌である。 よつて本菌は、本発明者らがノカルジアsp.No.
Ch2−１（Nocardia sp.No.Ch2−１）と命名し、
工業技術院微生物工業技術研究所に菌寄第6217号
（FERM−ＰNo.6217）として寄託されている。 (2) アルカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）の菌学的性質 (A) 形態 １ 細胞の形および大きさ：0.4〜0.6μ×0.8〜
1.2μの菌である。 ２ 細胞の多形性の有無：多形性は認められな
い。 ３ 運動性の有無：周鞭毛を有し運動する。 ４ 胞子の有無：胞子は形成しない。 ５ グラム染色性：陰性 ６ 抗酸性：陰性 (B) 各培地における生育状態 １ 肉汁寒天平板培養 円形ローニーで表面は平滑、半レンズ状の
隆起、全縁状で薄クリーム色、半透明、光沢
あり ２ 肉汁寒天斜面培養 生育中程度、糸状に生育、薄クリーム色で
半透明 ３ 肉汁液体培養 菌膜をつくらない、やや濁り沈渣も少しあ
る。 ４ 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは液化し
ない。 ５ リトマスミルク培養：アルカリ性になるが
ペプトン化しない、凝固しない。 (C) 生理的性質 １ 硝酸塩の還元：陽性 ２ 脱窒反応：陰性 ３ MRテスト：陰性 ４ VPテスト：陰性 ５ インドールの生成：陰性 ６ 硫化水素の生成：弱陽性 ７ デンプン加水分解：陰性 ８ クエン酸塩の利用：Koserの培地と
Christensenの培地で共に利用する。 ９ 無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニ
ウム塩を利用する。 10 色素の生成：水溶性色素を生成しない。 11 ウレアーゼ：陽性 12 オキシダーゼ：陽性 13 カタラーゼ：陽性 14 生育範囲PH：PH5.0〜10.0で生育する。温
度：５℃〜37℃で生育する。42℃で生育しな
い。 15 酸素に対する態度：好気性 16 OFテスト（Hugh−Leifson法）：フラクト
ースから好気的に酸を生成する。 17 糖類から酸およびガスの生成の有無 Ayers，Rupp and Johnson培地でフラク
トースとグリセリンから酸を生成するかガス
は生成しない。 アラビノース、キシロース、グルコース、
マンノース、ガラクトース、麦芽糖、シヨ
糖、乳糖、トレハロース、ソルビツト、マン
ニツト、イノシツト、デンプンからは酸もガ
スも生成しない。 18 独立栄養的生育：水素ガス、炭酸ガス、酸
素ガスを含有する気体中で生育しない。 19 Tween80の分解性：陽性 20 資化性：Ｄ−フラクトース、Ｌ−フエニル
アラニン、レブリン酸カルシウム、Ｌ−スレ
オニンを資化する。マンノース、マルトー
ス、マンニツト、ベタインを資化しない。 以上の菌学的諸性質からBergey′s manual of
Determinative Bacteriology（第８版）の記載に
照合して検討すると短桿菌で周ベン毛により運動
すること、グラム陰性、好気性であること、栄養
要求性はなく、アンモニウム塩、硝酸塩を利用す
ること、カゼインおよびゼラチンを分解しないこ
と、オキシダーゼ陽性であること等から
Alcaligenes属に分類される。 種については、Alcaligenes eutrophus、A.
paradoxus、A.ruhlandiiおよびA.latusとは主に
独立栄養的生育の点で異なる。またA.faecalisと
は主に42℃における生育、Ｄ−フラクトースの資
化性で、A.aquamarinusとは、主にデンプンの
分解性、マルトースの資化性で、A.pacificusと
は、主にスレオニン、ベタインの資化性で、A.
cupidusとは、主にオキシダーゼおよびマンニツ
ト、マンノースの資化性で、A.venustusとは、
主にレブリン酸塩、スレオニン、ベタインの資化
性で、A.aestusとは、主にマンニツト、スレオニ
ン、フエニルアラニンの資化性で異なる。よつて
本菌をアルカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）と命名し工業技術院微生物工業技術研究所に
菌寄第6216号（FERM−ＰNo.6216）として寄託
されている。 次にこれらの菌を用いてNAD（Ｐ）−CDHを製
造する方法について詳述する。これらの菌はいづ
れも構成的にNAD（Ｐ）−CDHを生産する能力を
有し、通常のペプトン、酵母エキス、又は硫酸ア
ンモニウム等のチツソ源及びグルコース、グリセ
ロール等の炭素源、その他無機塩等を含有する培
地でもNAD（Ｐ）−CDHを生産するが、コレステ
ロールを培地に添加することによりさらに多重に
NAD（Ｐ）−CDHを生産する。この際コレステロ
ールの添加は、培養開始時あるいは途中からのい
ずれでもよい。また、その他培養条件に関して
は、通常行なわれる範囲で実施できる。これらの
菌により生産されたNAD（Ｐ）−CDHは、菌体の
みならず、培養液中にも蓄積され、その何れから
でも酵素を回収することができる。これらの培養
濾液又は菌体抽出液を硫酸アンモニウム等による
塩析又は、アセトン、エタノール等の溶剤沈澱し
て得た粗酵素は、そのままコレステロールの定量
に使用するか、あるいは更に精製して使用するこ
ともできる。例えば精製については、イオン交換
クロマトグラフイー、分子篩クロマトグラフイー
等公知の方法により可能である。 ここで得られるNAD（Ｐ）−CDHは、コレステ
ロール含有物質中のコレステロール定量等に有利
に使用できる。 本発明に使用するNAD（Ｐ）−CDHの活性測定
法を以下に示す。 NAD（Ｐ）−CDHの酵素活性は、コレステロー
ルとNAD（Ｐ）を基質として反応した場合の
NAD（Ｐ）Ｈの生成量を、340nmにおける吸光度
の増加として、分光光度計で測定し算出する。す
なわち、0.1Mトリス・塩酸緩衝液（PH8.6）2.65
ml、28mMNAD溶液0.1ml、（８％トリトンＸ−
100溶液0.15ml）、１％コレステロール溶液0.05ml
及びNAD（Ｐ）−CDH水溶液0.05mlを混合し、30
℃で反応させ、反応開始後１分間の340nmにおけ
る吸光度の増加を測定する。 対照として上記組成でコレステロールの代りに
水を用い同様の操作を行ない、対照液の340nmに
おける吸光度の増加を試験液のそれから差し引
く。得られた値からNAD（Ｐ）Ｈの生成量を求
め、これより試料中のNAD（Ｐ）−CDH活性を算
出する。 酵素活性の表示は、PH8.6、30℃の条件下で１
分間に1μmoleのNAD（Ｐ）Ｈを生成する酵素を
１単位とした。 次に本発明に使用するNAD（Ｐ）−CDHの作用
を示す。 コレステロール＋NAD（Ｐ）コレステノン＋
NAD（Ｐ）Ｈ 本発明におけるNAD（Ｐ）−CDHは全てこの反
応を触媒する。 以下に本発明に使用するNAD（Ｐ）CDHの一
般的性質をノカルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia
sp.No.Ch2−１）FERM−P6217およびアルカゲネ
スsp.No.４（Alcaligenes sp.No.４）FERM−P6216
の生産するものについて示す。 (1) ノカルジアsp.No.Ch2−１（Nocardia sp.No.
Ch2−１）FERM−P6217の生産するNAD（Ｐ）
−CDH １ 至適PH：9.0付近（第１図に示される。） ２ PH安定性：37℃、15分の条件においてPH６
〜７で安定である。（第２図に示される。） ３ 至適温度：25〜35℃（第３図に示される。） ４ 熱安定性：PH7.0，15分の条件において35
℃以下で安定である。（第４図に示される。） ５ 基質特異性 本素は、3β位に水酸基をもつステロイド
に反応し、コレステロールを100とするとス
テイグマステロール35、β−シトステロール
25、その他デヒドロエピアンドロステロン、
エルゴステロール等にわずかに作用する。 ６ 補素 NADを要求する。 (2) アルカリゲネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.
４）FER−P6216の生産するNAD（Ｐ）−CDH １ 至適PH：8.5付近（第５図に示される。） ２ PH安定性：37℃，15の条件においてPH67で
安定である。（第６図に示される。） ３ 至適温度：25〜35℃（第７図に示される。） ４ 熱安定性：PH7.0，15分の条件で30℃まで
安定である。（第８図に示される。） ５ 基質特異性 本素は3β位に水酸基をもつステロイドに
反応し、コレステロールを100とするとβ−
シトステロール36、ステグマステロール20、
その他、デヒドロエピアンドロステロン、エ
ルゴステロール等にわずかに作用する。 ６ 補素 NADを要求する。 次に本発明のNAD（Ｐ）−CDHを使用したコレ
ステロールの定量について詳述する。 コレステロールを定量する場合、実際には緩衝
液、NAD（Ｐ）、基質（血清、コレステロール等）
及び、NAD（Ｐ）−CDHを混合し、一定時間反応
し、生成するNAD（Ｐ）Ｈの増加を吸光度340nm
で測定する。また必要に応じて、生成したNAD
（Ｐ）Ｈの水素をフエナジンメソサルフエート
（PMS）、ジアフオラーゼ等により、ホルマザン
色素等の発色系に導くことも可能である。さらに
は、反応系にコレステロールエステラーゼ、界面
活性剤及び、安定化剤等の添加も可能である。反
応時のPHは６〜10の範囲で実施できるが、優れて
いるPH範囲は７〜９である。 次にNAD（Ｐ）−CDHによるコレステロール定
量用試薬の量的組成についての１例を述べれば、
反応系３ml当り、NAD（Ｐ）−CDH0.1〜10単位、
NAD（Ｐ）10〜100mM、トリトンＸ−100 1.0％
以下、コレステロールエステラーゼ（ベーリンガ
ー社製）0.1〜10単位が有利である。しかし本発
明はこれらの量的組成に限定されるものではな
い。本発明の測定法における特別な利点は生成す
るNAD（Ｐ）Ｈを直接測定できることであり、ま
た完全に定量できることである。 次に試験例及び実施例につき述べる。 試験例 本発明における菌株３種につき、コレステロー
ル５ｇ／、肉エキス５ｇ／、酵母エキス0.2
ｇ／、少量の消泡剤の組成よりなる培地（PH
7.2）100mlを入れた500ml容坂ロフラスコに植菌
し、30℃で40時間振盪培養した。培養液50mlを遠
心分離（8000rpm10分間）により集菌し、0.1M
リン酸緩衝液PH7.0、50mlで洗浄した。 次に同じ緩衝液50mlに菌体を懸濁し、超音波に
て菌体を破砕した。この破砕液を塩心分離
（10000rpm、10分間）し、清澄液を得た。得られ
た清澄液のNAD（Ｐ）−CDH活性を測定し次の結
果を得た。
【表】
実施例 １
Nocardia sp.Ch2−1FERM−ＰNo.6217をグル
コース５ｇ／、肉エキス５ｇ／、酵母エキス
0.2ｇ／、少量の消泡剤の組成よりなる培地
（PH7.2）、200mlを入れた500ml容坂ロフラスコに
植菌し、30℃で24時間振盪培養する。この種培養
液をコレステロール５ｇ／、MgSO47H2O0.2
ｇ／、消泡剤0.5ｇ／の組成よりなる培地
（PH7.2）20を入れた30容ジヤーフアーメンタ
ーに植菌し、30℃で通気、撹拌（0.5v／ｖ／
min、200rpm）しながら40時間培養した。 培養液を遠心分離し、得られた菌体を0.1Mリ
ン酸緩衝PH70に懸濁し、ガラスビーズにより菌体
を破砕した。この菌体破砕液を遠心分離
（1000rpm、10分間）し、清澄な菌体抽出液を得
た。得られた清澄液に硫酸アンモニウムを35％飽
和になるように加え酵素を沈澱せしめた。 沈澱を遠心分離（8000rpm、10分間）で集め
20mMリン酸緩衝液PH7.0、100mlに溶かし、セロ
フアンチユーブで、20mMリン酸緩衝液PH7.0に
対して24時間透析した。 次に得られた透析液を20mMリン酸緩衝液PH
7.0で平衡化した。DEAE・セルロース200mlを充
填したカラムに通し、酵素を吸着せしめた。同様
の緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を0.1M
に上げてNAD（Ｐ）−CDHを溶出した。NAD
（Ｐ）−CDHを含む画分を集め、これを濃縮後
20mMリン酸緩衝液PH7.0に対して透析した。こ
れを同様の緩衝液で平衡化したヘキシルセフアロ
ース20mlを充填したカラムに通し、吸着せしめ
た。このカラムを20mMリン酸緩衝液PH7.0で洗
浄した。次に0.5MNaClを含む同様の緩衝液で
NAD（Ｐ）−CDHを溶出し、活性画分を集め、濃
縮し、50単位／mlのNAD（Ｐ）−CDH溶液5.0ml
を得た。全体の活性収率は30％であつた。 実施例 ２ Alcaligenes sp.No.4FERM−ＰNo.6216をコレス
テロール10ｇ／、グリセロール２ｇ／、コー
ンスチープリカー５ｇ／、KH2PO45ｇ／、
MgSO47H2O0.2ｇ／、消泡剤0.5ｇ／の組成
よりなる培地に培養し、実施例１と同様の操作を
行ない、40単位／mlのNAD（Ｐ）−CDH溶液を
5.0ml得た。全体の活性収率は40％であつた。 実施例 ３ Proteus vulgaris IAM1025を用い、実施例１
に準ずる操作を行ない、37単位／mlのNAD（Ｐ）
−CDH溶液４mlを得た。全体の活性収率は52％
であつた。 実施例 ４ Nocardia sp.No.Ch2−1FERM−ＰNo.6217をグ
ルコース５ｇ／、肉エキス、酵母エキス0.2ml、
少量の消泡剤の組成よりなる培地（PH7.2）200ml
を入れた500ml容坂ロフラスコに植菌し、30℃で
24時間振盪培養する。この種培養液をコレステロ
ール５ｇ／、グルコース２ｇ／、肉エキス５
ｇ／、KH2PO45ｇ／、MgSO4・7H2O0.2
ｇ／、消泡剤0.5ｇ／の組成よりなる培地
（PH7.2）20を入れた30容ジヤーフアーメンタ
ーに植菌し、30℃で通気、撹拌（0.5v／ｖ／
min、200rpm）しながら、72時間培養した。こ
の培養液を遠心分離（8000rpm、10分間）除菌し
た。得られた培養液に、硫酸アンモニウムを40
％飽和になるように加え酵素を沈澱せしめた。 沈澱を遠心分離（8000rpm、10分間）で集め、
20mMリン酸緩衝液（PH7.0）100mlに溶かし、セ
ロフアンチユーブで、20mMリン酸緩衝液PH7.0
に対して24時間透析した。 次に実施例１〜実施例３に準ずる方法で精製を
行ない、30単位／mlのNAD（Ｐ）−CDH溶液を32
ml得た。全体の活性収率は32％であつた。 実施例 ５ Alcaligenes sp.No.4FERM−ＰNo.6216を用い、
実施４に準ずる操作を行ない、25単位／mlの
NAD（Ｐ）−CDH溶液を4.2mlを得た。全体の活
性収率は38％であつた。 実施例 ６ Proteus vulgaris IAM1025を用い、実施例４
に準ずる操作を行ない、18単位／mlのNAD（Ｐ）
−CDH溶液を3.5ml得た。全体の活性収率は49％
であつた。
コース５ｇ／、肉エキス５ｇ／、酵母エキス
0.2ｇ／、少量の消泡剤の組成よりなる培地
（PH7.2）、200mlを入れた500ml容坂ロフラスコに
植菌し、30℃で24時間振盪培養する。この種培養
液をコレステロール５ｇ／、MgSO47H2O0.2
ｇ／、消泡剤0.5ｇ／の組成よりなる培地
（PH7.2）20を入れた30容ジヤーフアーメンタ
ーに植菌し、30℃で通気、撹拌（0.5v／ｖ／
min、200rpm）しながら40時間培養した。 培養液を遠心分離し、得られた菌体を0.1Mリ
ン酸緩衝PH70に懸濁し、ガラスビーズにより菌体
を破砕した。この菌体破砕液を遠心分離
（1000rpm、10分間）し、清澄な菌体抽出液を得
た。得られた清澄液に硫酸アンモニウムを35％飽
和になるように加え酵素を沈澱せしめた。 沈澱を遠心分離（8000rpm、10分間）で集め
20mMリン酸緩衝液PH7.0、100mlに溶かし、セロ
フアンチユーブで、20mMリン酸緩衝液PH7.0に
対して24時間透析した。 次に得られた透析液を20mMリン酸緩衝液PH
7.0で平衡化した。DEAE・セルロース200mlを充
填したカラムに通し、酵素を吸着せしめた。同様
の緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を0.1M
に上げてNAD（Ｐ）−CDHを溶出した。NAD
（Ｐ）−CDHを含む画分を集め、これを濃縮後
20mMリン酸緩衝液PH7.0に対して透析した。こ
れを同様の緩衝液で平衡化したヘキシルセフアロ
ース20mlを充填したカラムに通し、吸着せしめ
た。このカラムを20mMリン酸緩衝液PH7.0で洗
浄した。次に0.5MNaClを含む同様の緩衝液で
NAD（Ｐ）−CDHを溶出し、活性画分を集め、濃
縮し、50単位／mlのNAD（Ｐ）−CDH溶液5.0ml
を得た。全体の活性収率は30％であつた。 実施例 ２ Alcaligenes sp.No.4FERM−ＰNo.6216をコレス
テロール10ｇ／、グリセロール２ｇ／、コー
ンスチープリカー５ｇ／、KH2PO45ｇ／、
MgSO47H2O0.2ｇ／、消泡剤0.5ｇ／の組成
よりなる培地に培養し、実施例１と同様の操作を
行ない、40単位／mlのNAD（Ｐ）−CDH溶液を
5.0ml得た。全体の活性収率は40％であつた。 実施例 ３ Proteus vulgaris IAM1025を用い、実施例１
に準ずる操作を行ない、37単位／mlのNAD（Ｐ）
−CDH溶液４mlを得た。全体の活性収率は52％
であつた。 実施例 ４ Nocardia sp.No.Ch2−1FERM−ＰNo.6217をグ
ルコース５ｇ／、肉エキス、酵母エキス0.2ml、
少量の消泡剤の組成よりなる培地（PH7.2）200ml
を入れた500ml容坂ロフラスコに植菌し、30℃で
24時間振盪培養する。この種培養液をコレステロ
ール５ｇ／、グルコース２ｇ／、肉エキス５
ｇ／、KH2PO45ｇ／、MgSO4・7H2O0.2
ｇ／、消泡剤0.5ｇ／の組成よりなる培地
（PH7.2）20を入れた30容ジヤーフアーメンタ
ーに植菌し、30℃で通気、撹拌（0.5v／ｖ／
min、200rpm）しながら、72時間培養した。こ
の培養液を遠心分離（8000rpm、10分間）除菌し
た。得られた培養液に、硫酸アンモニウムを40
％飽和になるように加え酵素を沈澱せしめた。 沈澱を遠心分離（8000rpm、10分間）で集め、
20mMリン酸緩衝液（PH7.0）100mlに溶かし、セ
ロフアンチユーブで、20mMリン酸緩衝液PH7.0
に対して24時間透析した。 次に実施例１〜実施例３に準ずる方法で精製を
行ない、30単位／mlのNAD（Ｐ）−CDH溶液を32
ml得た。全体の活性収率は32％であつた。 実施例 ５ Alcaligenes sp.No.4FERM−ＰNo.6216を用い、
実施４に準ずる操作を行ない、25単位／mlの
NAD（Ｐ）−CDH溶液を4.2mlを得た。全体の活
性収率は38％であつた。 実施例 ６ Proteus vulgaris IAM1025を用い、実施例４
に準ずる操作を行ない、18単位／mlのNAD（Ｐ）
−CDH溶液を3.5ml得た。全体の活性収率は49％
であつた。
第１図はノカルジアsp.No.Ch2−1FERM−ＰNo.
6217の生産するNAD（Ｐ）−CDHの30℃における
至適PHを示す図であり、第２図は本NAD（Ｐ）−
CDHの37℃におけるPH安定性を示す図であり、
第３図は本NAD（Ｐ）−CDHの至適温度を示す図
であり、第４図は本NAD（Ｐ）−CDHの熱安定性
を示す図である。 第５図はアルカリゲネスsp.No.4FERM−ＰNo.
6216の生産するNAD（Ｐ）−CDHの30℃における
至適PHを示す図であり、第６図は本NAD（Ｐ）−
CDHの37℃におけるPH安定性を示す図であり、
第７図は本NAD（Ｐ）−CDHの至適温度を示す図
であり、第８図は本NAD（Ｐ）−CDHの熱安定性
を示す図である。
6217の生産するNAD（Ｐ）−CDHの30℃における
至適PHを示す図であり、第２図は本NAD（Ｐ）−
CDHの37℃におけるPH安定性を示す図であり、
第３図は本NAD（Ｐ）−CDHの至適温度を示す図
であり、第４図は本NAD（Ｐ）−CDHの熱安定性
を示す図である。 第５図はアルカリゲネスsp.No.4FERM−ＰNo.
6216の生産するNAD（Ｐ）−CDHの30℃における
至適PHを示す図であり、第６図は本NAD（Ｐ）−
CDHの37℃におけるPH安定性を示す図であり、
第７図は本NAD（Ｐ）−CDHの至適温度を示す図
であり、第８図は本NAD（Ｐ）−CDHの熱安定性
を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ノカルジア属、アルカリゲネス属、プロテウ
ス属に属するNAD（Ｐ）依存性コレステロール脱
水素酵素生産菌を培養し、培養物からNAD（Ｐ）
依存性コレステロール脱水素酵素を採取すること
を特徴とするNAD（Ｐ）依存性コレステロール脱
水素酵素の製造法。 ２ ノカルジア属に属する菌株がノカルジアsp.
No.Ch2−１（Nocardia sp.No.Ch2−１）FERM−
ＰNo.6217である特許請求の範囲第１項記載の
NAD（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵素の製
造法。 ３ アルカリゲネス属に属する菌株がアルカリゲ
ネスsp.No.４（Alcaligenes sp.No.４）FERM−Ｐ
No.6216である特許請求の範囲第１項記載のNAD
（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵素の製造法。 ４ プロテウス属に属する菌株がプロテウス・ブ
ルガリスIAM1025（Proteus vulugaris
IAM1025）である特許請求の範囲第１項記載の
NAD（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵素の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56186183A JPS5889183A (ja) | 1981-11-19 | 1981-11-19 | Ｎａｄ（ｐ）依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56186183A JPS5889183A (ja) | 1981-11-19 | 1981-11-19 | Ｎａｄ（ｐ）依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5889183A JPS5889183A (ja) | 1983-05-27 |
| JPH0218064B2 true JPH0218064B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=16183835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56186183A Granted JPS5889183A (ja) | 1981-11-19 | 1981-11-19 | Ｎａｄ（ｐ）依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5889183A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3059735B2 (ja) * | 1989-10-13 | 2000-07-04 | 旭化成工業株式会社 | Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
| JP2000516454A (ja) * | 1996-07-24 | 2000-12-12 | ヘレナ ラボラトリーズ コーポレイション | コレステロール分離と蛍光分析 |
-
1981
- 1981-11-19 JP JP56186183A patent/JPS5889183A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5889183A (ja) | 1983-05-27 |
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