JPH0147154B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0147154B2 JPH0147154B2 JP56120544A JP12054481A JPH0147154B2 JP H0147154 B2 JPH0147154 B2 JP H0147154B2 JP 56120544 A JP56120544 A JP 56120544A JP 12054481 A JP12054481 A JP 12054481A JP H0147154 B2 JPH0147154 B2 JP H0147154B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glutathione
- gsh
- activity
- strain
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はグルタチオンの製造法に関し、更に詳
しくはグルタチオンの合成酵素系の制御機構が解
除されたエシエリヒア属に属する微生物の菌体よ
り抽出法によつてグルタチオンを製造する方法に
関する。 グルタチオンはＬ−グルタミン酸、Ｌ−システ
イン及びグルシンより成るトリペプチドであり、
肝疾患治療剤、解毒剤などとして有用な物質であ
り、また生化学的試薬としても有用な物質であ
る。 従来、微生物を用いてグルタチオンを製造する
方法としては、酵母菌体よりグルタチオンを抽出
する方法、膜透過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタ
ミン酸、Ｌ−システイン及びグリシンを含有する
基質溶液を接触させてグルタチオンを生成させる
方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液を接触させ
てグルタチオンを生成させるに際しATP再生系
を共役させる方法などが知られている。しかしな
がら、工業的製法としてみた場合、これらの方法
はグルタチオンの生産量が必ずしも満足しうるも
のでなかつた。 本発明者らは、かかる状況に鑑み、微生物を用
いて工業的有利にグルタチオンを製造する方法を
見い出すべく種々研究を重ねた結果、エシエリヒ
ア属に属し、γ−グルタミルシステイン合成酵素
活性及びグルタチオン合成酵素活性を有し、かつ
グルタチオンによるγ−グルタミルシステイン酵
素への阻害が解除された微生物が菌体内に著量の
グルタチオンを蓄積することを見い出し、本発明
を完成するに至つた。 即ち、本発明は上記微生物を培養し、かくして
得られた菌体よりグルタチオンを抽出することか
らなるグルタチオンの製造法である。 本発明で使用する微生物は、エシエリヒア属に
属し、γ−グルタミルシステイン合成酵素（E.
C.6.3.2.2.、以下本酵素をGSH−と称する）活
性及びグルタチオン合成酵素（E.C.6.3.2.3.、以下
本酵素をGSH−と称する）活性を有し、かつ
グルタチオンによるGSH−への阻害が解除さ
れた微生物であればいずれも使用することがで
き、かかる微生物の代表的な例としてはGSH−
活性及びGSH−活性を有し、かつグルタチ
オンによるGSH−への阻害が解除されたエシ
エリヒア・コリが好適に挙げられる。 上記菌株は例えば次の如くして取得することが
できる。まず、GSH−活性及びGSH−活性
を有するエシエリヒア・コリの野性株（例えば、
エシエリヒア・コリB355）に変異を誘起せしめ
てシステイン要求株及びメチルグリオキサール耐
性株を取得する。変異の誘起は通常の変異誘起処
理により行なうことができ、例えばＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変
異誘起剤で処理することにより実施することがで
きる。システイン要求株の取得は変異誘起処理し
て得られる菌株をシステイン２×10-5Mを含む最
少培地（例えば、K2HPO40.7％、KH2PO40.3％、
（NH4）2SO40.1％、グルコース0.5％の組成の培
地、以下DM培地と称する）で培養し、生じた小
コロニーを釣菌分離することにより取得すること
ができる。一方、メチルグリオキサール耐性株は
前記の変異誘起処理して得られる菌株をメチルグ
リオキサールを含むDM培地に培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌分離することにより取得する
ことができる。次いで、上記で取得したシステイ
ン要求株を含む最少培地に上記メチルグリオキサ
ール耐性株を培養し、コロニーの周辺にハローを
作らないコロニーを釣菌分離してGSH−欠損
株（例えば、エシエリヒア・コリC912）を取得
する。次いで、このGSH−欠損株に前記と同
様の処理手段で変異を誘起せしめたのち、８−ハ
イドロキシキノリンを含むDM培地で培養し、生
ずるコロニーを釣菌分離することにより、GSH
−活性及びGSH−活性を有し、かつグルタ
チオンによるGSH−への阻害が解除された菌
体を取得することができる。かくして得られる菌
株の例としては、例えばエシエリヒア・コリ
RC912（微工研条寄第47号）が挙げられる。 上記の如くして取得した本発明の微生物を培養
するに際して用いられる培地としては、炭素源、
窒素源、無機物などを程よく含有するものであれ
ば、合成培地または天然培地のいずれも使用でき
る。炭素源としては、例えばグルコース、シユー
クロース、フラクトース、でん粉、でん粉加水分
解物、糖密などの種々の炭化水素が使用でき、そ
の使用量は0.5〜5.0％程度が好ましい。また窒素
源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種の無機および有機アンモニウム類、
あるいはペプトン、酵母エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物などの窒素性有機物
などが使用でき、その使用量は0.5〜2.0％程度が
好ましい。更に無機物としては、例えばリン酸第
一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガンなどが使用でき、そ
の使用量は0.005〜0.5％程度が好ましい。 培養は振とう培養あるいは通気かく拌培養など
の好気的条件下に行なうのが好ましい。培養温度
は25〜37℃が好適であり、培養期間は通常16〜40
時間程度で充分である。かくして菌体内に著量の
グルタチオンが蓄積する。 培養終了後、菌体内のグルタチオンを抽出す
る。グルタチオンの抽出は水で加熱抽出すること
によつて容易に実施することができる。抽出液よ
りグルタチオンを単離するには、該抽出液をイオ
ン交換樹脂処理の如き公知の方法で処理すること
によつて行なうことができる。 以下本発明の実施例を示す。 実施例 １ 下記第１表に示す菌株をグルコース0.5％、リ
ン酸第一水素カリウム0.3％、リン酸第二水素カ
リウム0.7％、硫酸マグネシウム・７水和物0.01
％、硫酸アンモニウム0.1％の組成の培地（PH
7.0）に接種し、37℃で16時間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を集め、0.85％
生理食塩水で洗浄後、菌体中のグルタチオンを水
で加熱抽出した。抽出液中のグルタチオン量を定
量し、菌体１ｇ（湿重量）当りのグルタチオン蓄
積量（μmole）を算出した。その結果は下記第１
表の通りであつた。 【表】
しくはグルタチオンの合成酵素系の制御機構が解
除されたエシエリヒア属に属する微生物の菌体よ
り抽出法によつてグルタチオンを製造する方法に
関する。 グルタチオンはＬ−グルタミン酸、Ｌ−システ
イン及びグルシンより成るトリペプチドであり、
肝疾患治療剤、解毒剤などとして有用な物質であ
り、また生化学的試薬としても有用な物質であ
る。 従来、微生物を用いてグルタチオンを製造する
方法としては、酵母菌体よりグルタチオンを抽出
する方法、膜透過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタ
ミン酸、Ｌ−システイン及びグリシンを含有する
基質溶液を接触させてグルタチオンを生成させる
方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液を接触させ
てグルタチオンを生成させるに際しATP再生系
を共役させる方法などが知られている。しかしな
がら、工業的製法としてみた場合、これらの方法
はグルタチオンの生産量が必ずしも満足しうるも
のでなかつた。 本発明者らは、かかる状況に鑑み、微生物を用
いて工業的有利にグルタチオンを製造する方法を
見い出すべく種々研究を重ねた結果、エシエリヒ
ア属に属し、γ−グルタミルシステイン合成酵素
活性及びグルタチオン合成酵素活性を有し、かつ
グルタチオンによるγ−グルタミルシステイン酵
素への阻害が解除された微生物が菌体内に著量の
グルタチオンを蓄積することを見い出し、本発明
を完成するに至つた。 即ち、本発明は上記微生物を培養し、かくして
得られた菌体よりグルタチオンを抽出することか
らなるグルタチオンの製造法である。 本発明で使用する微生物は、エシエリヒア属に
属し、γ−グルタミルシステイン合成酵素（E.
C.6.3.2.2.、以下本酵素をGSH−と称する）活
性及びグルタチオン合成酵素（E.C.6.3.2.3.、以下
本酵素をGSH−と称する）活性を有し、かつ
グルタチオンによるGSH−への阻害が解除さ
れた微生物であればいずれも使用することがで
き、かかる微生物の代表的な例としてはGSH−
活性及びGSH−活性を有し、かつグルタチ
オンによるGSH−への阻害が解除されたエシ
エリヒア・コリが好適に挙げられる。 上記菌株は例えば次の如くして取得することが
できる。まず、GSH−活性及びGSH−活性
を有するエシエリヒア・コリの野性株（例えば、
エシエリヒア・コリB355）に変異を誘起せしめ
てシステイン要求株及びメチルグリオキサール耐
性株を取得する。変異の誘起は通常の変異誘起処
理により行なうことができ、例えばＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変
異誘起剤で処理することにより実施することがで
きる。システイン要求株の取得は変異誘起処理し
て得られる菌株をシステイン２×10-5Mを含む最
少培地（例えば、K2HPO40.7％、KH2PO40.3％、
（NH4）2SO40.1％、グルコース0.5％の組成の培
地、以下DM培地と称する）で培養し、生じた小
コロニーを釣菌分離することにより取得すること
ができる。一方、メチルグリオキサール耐性株は
前記の変異誘起処理して得られる菌株をメチルグ
リオキサールを含むDM培地に培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌分離することにより取得する
ことができる。次いで、上記で取得したシステイ
ン要求株を含む最少培地に上記メチルグリオキサ
ール耐性株を培養し、コロニーの周辺にハローを
作らないコロニーを釣菌分離してGSH−欠損
株（例えば、エシエリヒア・コリC912）を取得
する。次いで、このGSH−欠損株に前記と同
様の処理手段で変異を誘起せしめたのち、８−ハ
イドロキシキノリンを含むDM培地で培養し、生
ずるコロニーを釣菌分離することにより、GSH
−活性及びGSH−活性を有し、かつグルタ
チオンによるGSH−への阻害が解除された菌
体を取得することができる。かくして得られる菌
株の例としては、例えばエシエリヒア・コリ
RC912（微工研条寄第47号）が挙げられる。 上記の如くして取得した本発明の微生物を培養
するに際して用いられる培地としては、炭素源、
窒素源、無機物などを程よく含有するものであれ
ば、合成培地または天然培地のいずれも使用でき
る。炭素源としては、例えばグルコース、シユー
クロース、フラクトース、でん粉、でん粉加水分
解物、糖密などの種々の炭化水素が使用でき、そ
の使用量は0.5〜5.0％程度が好ましい。また窒素
源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種の無機および有機アンモニウム類、
あるいはペプトン、酵母エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物などの窒素性有機物
などが使用でき、その使用量は0.5〜2.0％程度が
好ましい。更に無機物としては、例えばリン酸第
一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガンなどが使用でき、そ
の使用量は0.005〜0.5％程度が好ましい。 培養は振とう培養あるいは通気かく拌培養など
の好気的条件下に行なうのが好ましい。培養温度
は25〜37℃が好適であり、培養期間は通常16〜40
時間程度で充分である。かくして菌体内に著量の
グルタチオンが蓄積する。 培養終了後、菌体内のグルタチオンを抽出す
る。グルタチオンの抽出は水で加熱抽出すること
によつて容易に実施することができる。抽出液よ
りグルタチオンを単離するには、該抽出液をイオ
ン交換樹脂処理の如き公知の方法で処理すること
によつて行なうことができる。 以下本発明の実施例を示す。 実施例 １ 下記第１表に示す菌株をグルコース0.5％、リ
ン酸第一水素カリウム0.3％、リン酸第二水素カ
リウム0.7％、硫酸マグネシウム・７水和物0.01
％、硫酸アンモニウム0.1％の組成の培地（PH
7.0）に接種し、37℃で16時間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を集め、0.85％
生理食塩水で洗浄後、菌体中のグルタチオンを水
で加熱抽出した。抽出液中のグルタチオン量を定
量し、菌体１ｇ（湿重量）当りのグルタチオン蓄
積量（μmole）を算出した。その結果は下記第１
表の通りであつた。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エシエリヒア属に属し、γ−グルタミルシス
テイン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵素活
性を有しかつグルタチオンによるγ−グルタミル
システイン合成酵素への阻害が解除された微生物
を培養し、かくして得られた菌体よりグルタチオ
ンを抽出することを特徴とするグルタチオンの製
造法。 ２ 微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素
活性及びグルタチオン合成酵素活性を有し、かつ
グルタチオンによるγ−グルタミルシステイン合
成酵素への阻害が解除されたエシエリヒア・コリ
である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56120544A JPS5820196A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | グルタチオンの製造法 |
| CA000408484A CA1187432A (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Microorganism and its use for the preparation of glutathione |
| ES514571A ES514571A0 (es) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | "un procedimiento para la preparacion de glutation". |
| EP82304039A EP0071485B1 (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione |
| DE8282304039T DE3279950D1 (en) | 1981-07-30 | 1982-07-30 | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione |
| ES522801A ES522801A0 (es) | 1981-07-30 | 1983-05-30 | "un procedimiento para la preparacion de glutation" (como divisional de la solicitud de patente de invencion numero 514.571, presentada el 30 de julio de 1982) |
| US06/670,675 US4596775A (en) | 1981-07-30 | 1984-11-13 | Microorganism and its use for the preparation of glutathione |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56120544A JPS5820196A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | グルタチオンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5820196A JPS5820196A (ja) | 1983-02-05 |
| JPH0147154B2 true JPH0147154B2 (ja) | 1989-10-12 |
Family
ID=14788919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56120544A Granted JPS5820196A (ja) | 1981-07-30 | 1981-07-30 | グルタチオンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5820196A (ja) |
-
1981
- 1981-07-30 JP JP56120544A patent/JPS5820196A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5820196A (ja) | 1983-02-05 |
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