DK143287B - Fremgangsmaade til fremstilling af enzympraeparater med l-alfa-aminoacylamidaseaktivitet og fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-aminosyre og d-alfaaminosyreamid - Google Patents

Description

(19) DANMARK CÉD

|p π« FREMLÆGGELSESSKRIFT nu 1U3287 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 64/77 (51) Int.Ct.3 C 12 N 9/80 (22) Indleveringsdag 7· jan. 1977 C 12 P 13/00 (24) Løbedag 7. jan. 1977 (41) Aim. tilgængelig 9. jul. 1977 (44) Fremlagt 3· aug. 1981 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 8. jan. 197 6, 74l42, LU

(71) Ansøger NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsværd, DK.

(72) Opfinder Wilhelmus Hubertus Joseph Boesten, NL: Lucia Re= dempta Maria Meyer-Hoffman, NL.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af enzympræparater med L-alfa-amino= acylamidaseaktivitet og fremgangs^ måde til fremstilling af L-alfa-aminosyre og D-alfa-aminosyreamid.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af enzympræparater med L-a-aminoacylamidaseaktivitet ved dyrkning af en mikroorganisme under tilstedeværelse af et næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og phosphor.

Det er kendt, at nogle mikroorganismer, såsom Aspergillus qj oryzae, Aspergillus parasiticus, Mycobacterium phlei, Aeromonas pro- O teolytica, Bacillus subtilis og Bacillus stearothermophilus kan danne ^ enzymer, som er i stand til at hydrolysere α-aminosyreamider til dan- 00 nelse af α-aminosyre i et vandigt medium.

y— Disse kendte enzymer,som i det følgende betegnes som a-ami- noacylamidaser, udviser en kraftig stereospecifik aktivitet og hydro-q lyserer kun L-a-aminoacylamider. Således påvirkes D-a-aminoacylamider i det væsentlige ikke af disse enzymer.

2 143287

Som følge heraf er de nævnte a-aminoacylamidaser anvendelige til frembringelse af en optisk opløsning af DL-a-aminosyrer. Ved en sådan fremgangsmåde bringes a-aminoacylamidase i kontakt med DL-a-ami-nosyreamid til frembringelse af en hydrolyse af L-a-aminosyreamidet under dannelse af den tilsvarende aminosyre, og den dannede aminosyre og/eller det resterende D-a-aminosyreamid isoleres [Greenstein &

Winitz: "Chemistry of the amino acids", bind 3, side 1778-1781 (New York 1961)1.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et enzympræparat med en forbedret L-a-aminoacylamidaseaktivitet sammenlignet med de præparater, som opnås ved ovenfor nævnte kendte fremgangsmåde, og uden uønskede enzymatiske sideeffekter, hvilket præparat kan anvendes til fremstilling af L-a-aminosyre og/eller D-a-aminosy-reamid ud fra DL-a-aminosyreamid.

Dette opnås med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes en mikroorganisme tilhørende en af arterne Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora eller Pseudomonas arvilla.

Ved at dyrke disse mikroorganismer på en i og for sig kendt måde opnås der præparater med en exceptionelt stor amidaseaktivitet.

De mikroorganismer, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Baltimore 1975).

Foretrukne stammer er Pseudomonas putida ATCC 12633, ATCC 25571, ATCC 17390, ATCC 17426 og ATCC 17484, Pseudomonas reptilivora ATCC 14039 og Pseudomonas arvilla ATCC 23974.

Disse stammer kan fås fra American Type Culture Collection, Washington DC, U.S.A.

Pseudomonas putida, og navnlig stammen ATCC 12633 er en særligt foretrukket mikroorganisme.

I litteraturen er det beskrevet, at Pseudomonas putida er i stand til at producere mandelsyreracemase. Det er derfor overraskende, at Pseudomonas putida producerer et enzym med en stereospecifik amidaseaktivitet og ikke frembringer en racemisering af f.eks. phenylglycin, som er nært beslægtet med mandelsyre.

Mikroorganismerne, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan dyrkes på kendte næringsmedier, f.eks. som beskrevet 3 143287 af Hegeman i Journal of Bacteriology, 91, side 1140 (1966) .

Mikroorganismerne dyrkes fortrinsvis ved en temperatur i området mellem 30 og 35°C under aerobe betingelser.

I de fleste tilfælde er tilsætningen af vækstfaktorer og induktorer unødvendig. Tilsætningen af gærekstrakt synes at have en gunstig indflydelse på produktionen af enzymet. Efter en inkuberings-periode på mellem ca. 2 og ca. 30 timer kan cellerne fraskilles, fortrinsvis under den eksponentielle vasks tperiode.

Et præparat med α-aminoacylamidaseaktivitet kan opnås ved at udfælde cellerne, eventuelt ved at anvende et flokkuleringsmiddel. Cellerne kan også tværbindes eller bindes til eller absorberes på en bærer. I nogle tilfælde kan det være ønskeligt at modificere cellevæggene, f.eks. ved varmebehandling, for at gøre enzymet lettere tilgængeligt. Et råpræparat kan også opnås ved at ødelægge cellerne og udvinde enzymet ved ekstraktion, filtrering og eventuelt forstøvningstørring.

Et præparat bestående af rent enzym kan også udvindes på kendt måde fra det ovenfor beskrevne råprodukt. Det rene enzym eller enzympræparater kan ligeledes opnås udfra dyrkningsmediet ved velkendte metoder.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af L-a-aminosyre og D-a-aminosyreamid udfra DL-a-aminosyreamid ved at bringe DL-a-aminosyreamidet i kontakt med et præparat med L-a-amino-acylamidaseaktivitet.

Denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes et præparat opnået ved dyrkning af en mikroorganisme tilhørende en af arterne Pseudomonas putida, Pseudomonas reptilivora eller Pseudomonas arvilla i nærværelse af et næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og phosphor.

Præparatet med L-a-aminoacylamidaseaktivitet bringes fortrinsvis i kontakt med DL-a-aminosyreamidet i et vandigt medium ved en temperatur på mellem 0 og 60°C, og særligt foretrukket ved en temperatur på mellem 20 og 40°C, samt ved en pH-værdi på mellem 6 og 10,5, og særligt foretrukket på mellem 7,5 og 9,5.

Uden for disse områder er aktiviteten og/eller stabiliteten af enzymet almindeligvis utilstrækkeligt til praktisk anvendelse. Enzymet kan aktiveres på kendt måde, f.eks. ved tilsætning af en metalforbindelse, såsom en magnesium-, mangan- eller zinkforbindelse.

Vægtforholdet mellem det (urensede) enzym og substratet kan variere inden for vide grænser, f.eks. mellem 1:25 og 1:750. Hvis der anvendes et rent enzym, kan der anvendes et større forhold.

4 143287 Når hydrolysen af L-a-aminosyreamidet er afsluttet, kan den frie syre skilles fra det resterende D-a-axninosyreamid, og sidstnævnte forbindelse kan derpå hydrolyseres til dannelse af D-a-aminosyre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er anvendelig til isolering af optisk aktive naturlige eller syntetiske α-aminosyrer, såsom D-og/eller L-formen af phenylalanin, 3,4-dihydroxyphenylalanin, tyrosin, methionin, leucin, alanin, phenylglycin, 4-hydroxyphenylglycin, 4-alk-oxyphenylglycin og andre substituerede phenylglyciner.

Opfindelsen skal herefter beskrives nærmere under henvisning til følgende eksempler.

Eksempel I

Pseudomonas putida ATCC 12633 inkuberedes ved 28 - 30°C i en kolbe, der var anbragt på et roterende rysteapparat. Væksten måltes ved hjælp af et spektrofotometer ved A=680nm. Det anvendte næringsmedium med en pH-værdi på 6,85 fremstilledes ved at sammenblande: 1 liter destilleret vand, .8,95 g sekundært natriumphosphatdodecahydrat, 3,4 g primært kaliumphosphat, 1,0 g ammoniumsulfat, 200 mg nitriltrieddikesyre, 580 mg magnesiumsulfatheptahydrat, 67 mg calciumchloriddihydrat, 2,0 mg ferrosulfatheptahydrat, 0,2 mg ammoniumparamolybdat og 1 ml "Hutner's metals 44" [en fortyndet opløsning af zink-, jern-, mangan- og kobbersulfat, koboltnitrat, natriumperborax og E.D.T.A. - beskrevet i J. Cellular & Compar. Physiol. 49, side 25-68 (1957)]. Blandingen blev derefter steriliseret og derpå afkølet, og til slut tilsattes 2 g asparagin og 2 g DL-mandelsyre.

Cellerne fraskiltes under den eksponentielle vækstfase ved centrifugering (30 minutter ved 10.000 omdrejninger pr. minut under afkøling). Det således opnåede faste stof vaskedes med 0,1 molær phosphatpuffer ved en pH-værdi på 6,8 og centrifugeredes igen (20 minutter ved 10.000 omdrejninger pr. minut). Det opnåede faste stof suspenderedes i phosphatpufferen (40 g fugtige celler i 100 ml puffer), hvorefter cellevæggene blev nedbrudt ved hjælp af en ultralydscelle-desintegrator (20 kc/s i 20 minutter ved 0°C). Et råekstrakt opnåedes ved at fjerne de faste partikler ved centrifugering (30 minutter, 10.000 omdrejninger pr. minut ved 4°C). Udbyttet af celleekstrakt beregnet som tørstof udgjorde 0,8 g pr. liter dyrkningsvæske.

Eksempel II

Fremgangsmåden ifølge Eksempel I blev gentaget med den undtagelse, at der anvendtes et medium indeholdende 10 g gærekstrakt (som 5 143287 tilsattes før steriliseringen) i stedet for asparagin. Udbyttet af celleekstrakt udgjorde ca. 1,2 g tørstof pr. liter dyrkningsvæske.

Eksempel III

Fremgangsmåden ifølge Eksempel I blev gentaget med undtagelse af, at der anvendtes et dyrkningsmedium indeholdende 10 g gærekstrakt i stedet for asparagin og mandelsyre. Udbyttet af celleekstrakt udgjorde 1,25 g tørstof pr. liter dyrkningsvæske.

Eksempel IV

I en kolbe forsynet med en omrører sattes 1,5 ml af 0,125 molært MgCl2, 0,5 ml af 0,025 molært MnCl2 og 0,1 ml råcelleekstrakt (tørvægt 7 mg) fremstillet som beskrevet i Eksempel III til en opløsning af 2,0 g (13,3 mgmol) L-phenylglycinamid i 48 ml vand under omrøring ved 25°C. Under reaktionen steg reaktionsblandingens pH-værdi fra 9,6 til 9,7.

Efter 20 timers forløb syrnedes reaktionsblandingen med 4N saltsyre til en pH-værdi på 6,5. L-phenylglycin, som derpå udkrystalliseredes, fjernedes ved filtrering på et glasfilter og vaskedes på filteret med 2 portioner på 10 ml vand og derpå med 2 portioner på 10 ml acetone. Efter tørring opnåedes 1,6 g L-phenylglycin (udbytte: 80%). Den specifikke rotation for L-phenylglycin var: [a]^ = 157,7° (C = 1,6; 2,6 vægtprocent HC1).

Fra litteraturen er det kendt (se Beilstein 14 III, side 20 1188), at [a]p = 157,5 (C = 1,6; 2,6 vægtprocent HC1).

Eksempel V

I en kolbe forsynet med en omrører sattes 4,0 g (26,6 mgmol) DL-phenylglycinamid, 3 ml af 0,125 molært MgCl2, 1 ml af 0,025 molært MnCl2 og 1 ml råcelleekstrakt (tørvægt 70 mg) fremstillet som beskrevet i Eksempel III til 97 ml vand. Blandingen blev derpå omrørt i 20 minutter ved 25°C.

Efter udløbet af den nævnte reaktionstid fjernedes den dannede L-phenylglycin ved filtrering, og filtratet førtes over 75 ml Dowex 21 K ionbytter på OH -formen. Derpå vaskedes ionbytteren med 150 ml vand, og de kombinerede eluater koncentreredes ved inddampning (40°C, 12 mm Hg). Der opnåedes 1,8 g D-phenylglycinamid (udbytte: 90%). Dette produkt var rent ifølge tyndtlagschromatografi.

For at bestemme den optiske renhed og for at foretage en 6 143287 sammenligning med litteraturen omdannedes amidet til det tilsvarende hydrochloridsyresalt. Til dette formål opnøstes 1,0 g D-phenylglycin-amid i 20 ml methanol, hvorefter der filtreredes, og 1,5 ml koncentreret saltsyre sattes til filtratet. 20 ml acetone tilsattes derpå, det dannede D - phenylglycinamid,HCl filtreredes derpå på et glasfilter og vaskedes på filteret med 2 portioner af 20 ml acetone. Der opnåedes 0,9 g D-phenylglycinamid,HCl.

Den specifikke rotation var: [ct]p° = -101,2° (C - 0,8, vand).

Det fremgår af litteraturen (Beilstein 14 III, side 1189), at [a]^ = -100,8° (C = 0,8, vand).

Eksempel VI

I eksemplet sammenlignedes hydrolyseringshastighederne for L-phenylglycinamid og L-leucinamid efter 36 og 60 minutters forløb under anvendelse af et enzympræparat fremstillet udfra Pseudomonas putida ATCC 12.633.

Til en opløsning af 150,0 mg (1,0 mgmol) L-phenylglycinamid i 15 ml vand sattes 0,5 mg MnCl2 og 2 mg MgCl2 og derpå tilsattes 0,10 ml råcelleekstrakt (7 mg tørvægt) fremstillet som beskrevet i Eksempel III. Efter supplering med vand til 25,0 ml udtoges der prøver efter 36 og 60 minutters forløb, og antallet af mgmol L-phenylglycin indeholdt i hver prøve bestemtes ved aminosyreanalyse.

På samme måde og med en tilsvarende mængde celleekstrakt omdannedes 130,0 mg (1 mgmol) leucinamid. Også her blev der udtaget prøver efter 36 og 60 minutters forløb.

Resultater: 36 minutter 60 minutter L-phenylglycinamid 0,63 mgmol/25 ml 0,88 mgmol/25 ml L-leucinamid 0,16 mgmol/25 ml 0,28 mgmol/25 ml

Eksempel VII

1,0 mgmol af hver af de følgende α-aminosyreamider omdannedes ved 20°C ved hjælp af 0,1 ml råcelleekstrakt (tørvægt 7 mg) fremstillet som beskrevet i Eksempel III i 5 ml vand, hvori der var blevet opløst 0,5 mg MnCl2 og 2,0 mg MgCl2· Efter 3 og 18 timers forløb blev der udført aminosyreanalyse.

7 143287

Resultater; _vægtprocent aminosyre_ efter 3 timers efter 18 timers forløb forløb L-phenylglycinamid 98 % 99 % L-methioninamid 97 % 99 % L-p-hydroxyphenylglycinamid 92 % 98 % L-leucinamid 57 % 98 % DL-a-amino-6-cyanovaleramid 42 % 51 % L-phenylalaninamid 34 % 96 % L-tyrosinamid 29 % 96 %

Glycinamid 1 % 3 % DL-a-aminocaprolactam 0 % 0 %

Eksempel VIII

Der fremstilledes substratopløsninger, som hver havde følgende sammensætning; 5 ml vand, 100 mg L-phenylglycinamid, 0,5 mg MnCl2 og 2 mg MgCl2·

Substrater med denne sammensætning behandledes med 0,1 ml råcelleekstrakt (tørvægt 2 mg) af hver af de mikroorganismer, som er angivet i nedenstående tabel. Efter 0,5 og 1,5 timers forløb udførtes der aminosyreanalyser.

Resultater; _vægtprocent aminosyre_ efter 0,5 times efter 1,5 timers forløb forløb

Aspergillus oryzae CBS 134.52 0 % 1 %

Aspergillus parasiticus CBS 115.37 o % 1 %

Bacillus subtilis ATCC 15.841 i % 2 %

Pseudcmonas putida ATCC 12.633 34 % 72 %

Bacillus stearothermophilus NCIB 8924 2 % 3 %

Aeromonas proteolitica ATCC 15.338 21% 48%

Som det fremgår af ovenstående tabel, havde enzympræparater fremstillet ved dyrkning af Pseudomonas putida en betydeligt større aktivitet end enzympræparater fremstillet ved dyrkning af de resterende mikroorganismer.

Eksempel XX

8 143287

Der fremstilledes enzympræparater som beskrevet i Eksempel III under anvendelse af mikroorganismerne Pseudomonas reptilivora ATCC 14039 og Pseudomonas arvilla ATCC 23974. Udbytterne af råcelleekstrakt udtrykt som gram pr. liter dyrkningsvæske var 1,24 g/1, hhv. 0,82 g/1.

a-aminoacylamidaseaktiviteten ved anvendelse af L-phenyl-glycinamid som substrat bestemtes ved at anvende 0,1 ml celleekstrakt (tørvægt 4 mg) og en opløsning bestående af 0,2 g L-phenylglycinamid, 0,3 ml af 0,25 molært MnCl2, 1,2 ml af 0,125 molært MgCl2 og 23,5 ml vand.

Efter én times forløb viste en aminosyreanalyse, at omdannelsen af L-phenylglycin var 46,8% for præparatet fremstillet udfra Pseudomonas reptilivora og 35,7% for præparatet fremstillet udfra Pseudomonas arvilla.

Eksemplet blev gentaget, dog ved at anvende enzympræparater fremstillet udfra Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas fluorescens og Pseudomonas stutzeri. Efter én times forløb var omdannelsen af L-phe-nylglycinen 21,4%, 9,6% henholdsvis 4,2%.

Eksempel X

Den selektive hydrolyse under dannelse af L-4-hydroxyphenyl-glycin bestemtes ved at opløse 0,071 g (0,43 millimol) DL-4-hydroxy-phenylglycinamid i 24 ml vand og ved til denne opløsning at sætte 25,1 mg af et enzympræparat fremstillet ved sprøjtetørring af dyrkningsvæsken opnået udfra en kultur af Pseudomonas putida ATCC 12.633. Blandingens pH-værdi var 8,2. Blandingen holdtes ved 30°C under omrøring i tre timer. Hvert tredivte minut blev der udtaget en 2 ml prøve. Prøven fortyndedes med 2 ml 0,333 N svovlsyre, og indholdet af L-4-hydroxyphenylgly-cin bestemtes ved aminosyreanalyse. Udfra disse resultater kunne mængden af L-aminosyreamid, som var blevet hydrolyseret, beregnes. Resultaterne er sammenfattet nedenfor. Der indtrådte ikke nogen hydrolyse af D-arninosyreamidet.

9 143287 molprocent hydrolyseret tid (timer) L-4-hydroxyphenylglycinamid 0,5 65 1 88 1.5 93 2 99 2.5 99 3 99

Eksempel XI

Hydrolysen af DL-4-methoxyphenylglycinamid bestemtes som beskrevet i Eksempel X under anvendelse af 1,36 g DL-4-methoxyphenyl-glycinamid, 43 ml vand og 49,3 mg af et enzympræparat fremstillet ved at forstøvningstørre en Pseudomonas putida ATCC 12.633 -dyrkningsvæske.

Prøveudtagelsen og bestemmelsen af L-aminosyren udførtes også som beskrevet ovenfor.

Der indtrådte ingen hydrolyse af D-aminosyreamidet.

molprocent hydrolyseret tid (timer) L-4-methoxyphenylglycinamid 0,5 18 1.0 41 1.5 61 2.0 77 2.5 91 3 99