JPH0149900B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ラジオイムノアツセイおよび他の放射性リガン
ドアツセイは、結合放射性リガンドと遊離放射性
リガンドを別の相に分離して、それらの相の一方
に移行した放射能の測定を可能とする最終分離段
階を包含する。大部分の分析で、この分離は２つ
の操作、すなわち第１に遠心分離、ついで、第２
に、傾瀉、吸引または類似の方法による可溶相の
分離を包含する。このような操作は、大きな労力
を要し、そして、完全自動化ラジオイムノアツセ
イシステムの開発の障害となつている。

上清の除去は分析を正確にするのに最大の障害
である。そして、アツセイ試験管の外部を汚染さ
せる危険がある。これらの難点を克服すると別法
として、遊離放射性リガンドから結合放射性リガ
ンドを別の相に分離し、両相がなおアツセイ用の
試験管中に存在するまま、それらの相の一方から
の放射を選択的に遮蔽する方法がある。ラジオイ
ムノアツセイにおいて最も頻繁に用いられている
トレーサーである¹²⁵Iの低エネルギーガンマー放
射（27―35KeV）は、きわめて高密度の材料を
ほとんど透過しない。アツセイにおいて放射を遮
蔽させる材料を用いることにより、生じる相の一
方の放射の試験管からの漏出を防止することが可
能である。

アメリカ合衆国特許No.4158135には、放射性物
質を液相と固体粒子相とに分配させ、一方の相か
らの放射をその相に放射吸収性材料を提供するこ
とにより遮蔽させ、他方の相からの放射を測定す
る方法が記載されている。このようにすると、ラ
ジオアツセイを、２つの相を物理的に分離するこ
となく実施しうる。適当な放射吸収性の材料は、
大部分は、アツセイに使用する放射性アイソトー
プの種類に応じて選択される。たとえば、広く用
いられているアイソトープである¹²⁵Iを用いる時
には、比較的低いＺ数を有するものを含めた広範
囲の多様な元素を用いて、放射の効果的な遮蔽が
達成される。適当な元素には銀、カドミウム、タ
ングステンおよびビスマスがある。上記特許記載
の具体例では、遮蔽材料にタングステン粉末を用
いている。

適当な遮蔽材料およびその物理的形状の選択に
際しては、そのような材料が抗原―抗体結合を妨
害せず、また、不溶であればアツセイの試剤をそ
の表面に吸着しないことが望ましい。結合または
非結合放射性リガンドを不溶化して測定のために
それらの成分を分離するには、上記の特許では、
本技術分野で知られている技術および試剤、すな
わち二重抗体分離、化学的沈殿などの使用、また
は粒子状の水不溶性重合体に結合した抗体または
抗原の使用が行われている。別法として、未反応
の放射性材料を、粒子吸着材料に吸着させ不溶化
する方法もある。それには通常、好ましくはデキ
ストランで処理された活性炭が使用される。活性
炭を放射吸収材料と物理的に混合しておくことも
可能で、これは、上記特許のさらに別の具体例と
なつている。最後に、上記の特許で用いられてい
るさらに別の材料は、未反応の放射性材料の吸着
もできる放射吸収材料である。このような材料の
例としては、炭酸ビスマスの粉末がある。

本発明は、ラジオイムノアツセイおよび類似放
射性リガンドアツセイにおける改良された内部試
料遮蔽剤カウント法に用いる試剤として有用な、
新規遮蔽剤組成物に関する。これらの組成物は、
第１の活性成分として、放射された放射線を吸収
する能力の高い遮蔽剤材料と、第２の活性成分と
して、アツセイ操作における試剤（抗原または抗
体）または反応生成物と相互作用する材料とを各
粒子が含有する、個別状の粒子から構成される。

本発明の組成物の一態様においては、第２の活
性成分は、ラジオイムノアツセイの試剤（抗原ま
たは抗体）または反応生成物と免疫的に反応する
材料から選択される。例えば、適当な材料には、
ラジオイムノアツセイにおいて分析しようとする
物質に特異的な抗体（第１抗体）、抗原、および
第１抗体を生成させた宿主種の血清に対し第２の
種において生成させた抗体（第２抗体）がある。
第２の活性成分はまた、非免疫型の生物活性結合
体たとえば、チロキシン（サイロキシン）結合性
グロブリンのような輸送蛋白質または細胞由来の
リセプターたとえば細胞質性エストロジエンリセ
プターまたは細胞質膜よりのホルモンリセプター
がある。

第１の活性成分は、放射性リガンドにより放射
される放射線を吸収する能力の高い、本技術分野
で知られている遮蔽剤材料でありうる。特に、そ
れらの材料には、この目的に用いられる既知の遮
蔽剤材料たとえば銀、カドミウム、タングステ
ン、ビスマスまたはこれらの元素を含有する化合
物たとえばそれらの酸化物がある。特に有利な第
１の活性成分は、ビスマス、特に、酸化ビスマス
（Bi₂O₃）である。

本発明のこの態様においては、第１の活性成分
および第２の活性成分を、ひとつの支持マトリツ
クスに抱合した形態で提供することが好ましい。
このようなマトリツクスは、生物活性分子を固定
化するために本技術分野で従来用いられて来たゲ
ル、ガラスまたは重合体材料からうることができ
る。この目的に有利なマトリツクス材料には、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、殿粉またはポリ
ビニリデン―フルオライドがある。

本発明のこの態様における組成物を調製するた
めの便利な方法として、第１の活性成分の存在で
マトリツクス材料を不溶化するか、ゲル化するか
または重合させて、第１の活性成分を含有する重
合体材料の粒子、好ましくはミクロ粒子とする方
法がある。ついで、第２の活性成分を粒子表面に
共有結合でカツプリングさせるか、または、粒子
のマトリツクスに共有結合でカツプリングさせる
かもしくは、包入させる。それには、固体担体材
料に生物活性物質をカツプリング、包入またはそ
の他の方法で固定化するのに際して本技術分野で
知られている方法を用いる。

このような粒子の大きさおよび性質は、第１の
活性成分の性質によつて大部分が決定される。最
大の結晶の大きさが５ミクロンを超えない微結晶
状の形状とするのが有利である。しかし、より大
きな粒子も用いてかまわないが、もつとも有利な
のは２ミクロンの大きさの結晶である。たとえば
酸化ビスマスのような適当な第１の成分は、酸化
ビスマスの存在下にアクリルアミドモノマーを重
合させることによりポリアクリルアミドゲル中に
包入させることができる。重合は、水―有機溶媒
エマルジヨン中で実施するのが有利である。酸化
ビスマス含有粒子は高密度なので、有機相として
四塩化炭素のような高密度有機溶媒を用いて重合
させるのが有利である。別法として、トルエンの
ような低密度有機溶媒を使用し、重合中に粒子が
沈降していくようにしてもよい。

重合反応混合物には、上記の成分に加えて、さ
らに、使用単量体に対する慣用の重合誘起剤およ
び慣用の乳化剤たとえばマニタンモノオレエート
を含有させてもよい。この乳化剤は、Serva
（Heidelberg）よりArlacelとして販売されてい
る。代表的重合反応混合物は、以下の成分を以下
の重量部含有するものである。0.4から2.0好まし
くは1.9部のアクリルアミド；0.2から0.4好ましく
は0.4部のＮ，N′―メチレンビスアクリルアミ
ド；0.1から2.0好ましくは1.0部の酸化ビスマス；
約10.0部の水；および50から250mlの、１から４
好ましくは２％のArlacelA含有四塩化炭素。ポ
リアクリルアミドのマトリツクスへの重合は、50
％過硫酸アンモニウム水溶液の0.1部およびＮ，
Ｎ，N¹，N¹―テトラメチルエチレンジアミンの
0.4から0.5部で活性化され、約０から10℃、好ま
しくは約２℃の温度で実施される。

ポリアクリルアミド以外に、マトリツクスとし
ては、１〜５％好ましくは２％アガロース、また
は40〜80％好ましくは60％殿粉を選択できる。加
熱融解させた状態のマトリツクス（アガロースま
たは殿粉）は、第１の活性成分と混合して均一な
懸濁液とする。ポリアクリルアミドの場合と同様
に、上記懸濁液は水―有機溶媒系の中でゲル化さ
せて粒子とする。殿粉またはアガロースゲル生成
物またはポリアクリルアミド重合体の液滴はつい
で固化させて、１から100ミクロン好ましくは10
ミクロン以下の粒子径の所望の大きさの固体粒子
とする。これらの粒子は、１cm³あたり1.2から8.0
グラムまでの密度を有する。固化するあいだに粒
子を分離させるには、かくはんのような方法で有
機溶媒相を混合してもよいし、また音波処理して
もよい。

別のマトリツクスとしてポリビニリデンフルオ
ライド（PVF）がある。0.4から3.0グラム好まし
くは2.0グラムのPVFを20mlのジメチルホルムア
ミドに溶解し、10から50グラム好ましくは40グラ
ムの酸化ビスマスと混合する。生成する材料の液
滴は、１から100ミクロンの粒子の大きさの、所
望の微小粒子に固化させる。それには、上記材料
を、200から500mlのイソプロパノール、エタノー
ルまたは水に混入する。粒子の大きさは、ホモジ
ナイズすることによつてさらに小型にすることが
できる。

本発明のこの特徴のさらに別の具体例として
は、第１および第２の活性成分を、融解、溶解ま
たは非重合の形状のゲルまたは重合体材料と緊密
に混合し、ついでその混合物を鋳型成型するかま
たは別法で固体マトリツクスに不溶化し、つい
で、磨砕のような方法で微細化して所望の粒子の
大きさとすることができる。別法として、マトリ
ツクスをまず粗く粉砕し、水相に懸濁させ、ホモ
ジナイザー（たとえばPolytron）でホモジナイ
ズして所望の粒子の大きさとする。

粒子を製造する方法とは無関係に、この方法で
生成するよりせまい範囲に粒子の大きさを揃える
ことも望ましい。この場合、生成粒子を篩にかけ
るか、又は液体中もしくは空気流中で沈降させて
大きさにより分別することもできる。

種々の型の粒子について所望の沈降特性を得る
には、粒子を含有する懸濁液に、Tween―20、
デキストランポリエチレングリコールまたは蛋白
質のような表面活性剤を、懸濁液中の粒子の凝集
に影響することが知られている濃度において添加
してもよい。

ゲルまたは重合体マトリツクス中に第１の活性
成分を分散含有する生成した粒子への第２の活性
成分のカツプリングは、臭化シアンまたは２価の
カツプリング剤たとえばジアルデヒド、好ましく
はグルタルアルデヒドのような結合剤を用いて達
成できる。この結合剤は、マトリツクスの表面に
存在する反応性基と第２の活性成分の反応性基と
を結合する基として作用する。

PVFをマトリツクスに用いる場合、抗血清の
形状の第２の活性成分のカツプリングには、
PVF被覆酸化ビスマス粒子をイソプロパノール
で１時間処理し、ついで粒子を0.15モルの塩化ナ
トリウムを含有するPH7.0のリン酸緩衝液で３回
洗浄する。ついで粒子を、室温で24時間インキユ
ベートする。

本発明のひとつの具体例として、慣用の沈降操
作を用いる際の、第１および第２の活性成分を含
有する粒子の沈降速度は、第２の活性成分の反応
速度に適合するように選択される。粒子の大きさ
および粒子の密度の組合せを上記した範囲に選択
することにより、緩衝塩含有水性懸濁液中で粒子
が所定の時間すなわち１から180分、好ましくは
15から30分の間に試験管の底部に沈降するよう
に、粒子の沈降速度を特定できる。粒子の第２の
成分の結合能力は非常に高いので、粒子の沈降の
間に、所望の免疫反応が起こる。この具体例では
別法として、粒子の第１の成分を、上記に示した
材料と同様の高密度をするが、放射吸収能がずつ
と低い材料でおき代える。適当な放射性アイソト
ープには、放射性のバリウムおよびヨードを含有
する化合物が含まれる。粒子が試験管の底部に沈
降してしまつた場合は、上清の放射能含量の測定
を可能とするかまたは沈降物に伴う放射能の測定
を可能とするため、試験管より上清を除去しなけ
ればならないことになる。

本発明の特殊な形態においては、第１および第
２の成分を含有する粒子は、乾燥または凍結乾燥
した形状の個別用量単位に分割する。各用量単位
は圧縮して錠剤とする。錠剤はさらに、錠剤の形
状を保ちそして水中に懸濁させた時の崩壊を促進
するように充填媒体を含有する。このような錠剤
組成物は製薬産業でよく知られており、殿粉、乳
糖または炭酸マグネシウムのような充填剤を包含
する。このような形状にしておくと、各試験管
に、あらかじめ定められた量の活性成分を正確に
添加するのが容易となる。

本発明の特徴の特殊な具体例として、酸化ビス
マスをポリアクリルアミド中に分散含有する粒子
に、上記のようにグルタルアルデヒドを利用して
羊抗−ウサギ第２抗体を結合させた。得られた材
料を、固体相―遮蔽二重抗体分離による、ヒト絨
毛性ゴナドトロピン（HCG）のラジオイムノア
ツセイに使用した。このアツセイでは、標準
HCG（0.1ml）¹²⁵I―HLH（ヒト黄体形成ホルモン）
（0.2ng）およびウサギ抗HCG血清（１対4000）
を全容量0.5ml中、室温で１時間インキユベート
した。ついで、第２抗体―酸化ビスマス―ポリア
クリルアミド粒子の0.1mlおよび酸化ビスマスの
0.4ｇを１mlの緩衝液中に含有する懸濁液を添加
した。試験管はゆつくりと３時間回転した。15分
間放置して沈降させ、ウエルカウンター中でカウ
ントした結果は、第１図に標準曲線として示し
た。

別の具体例においては、HCGに対するウサギ
抗体を、酸化ビスマス含有ポリアクリルアミド粒
子にカツプリングさせた。この粒子の一定量を標
準HCGおよび¹²⁵I―HLH全容量１ml中でインキ
ユベートした。試験管は１液ゆつくり廻転させ
た。ついで15分間放置して粒子を沈降させた。ウ
エルカウンター中でカウントした。結果は、第１
図と本質的に同じであつた。

第２の活性成分についての第２の具体例とし
て、放射イムノアツセイ反応混合物中の放射性リ
ガンド成分と吸着により相互作用する材料を用い
た。この具体例では、炭末が有利な活性成分であ
る。炭末および第１の活性成分を含有する適当な
組成物は、これらの成分を、アガロースのような
結合剤とともに混合し、ついでその組成物を所望
の粒子サイズ成型することにより容易に得られ
る。所望の大きさおよび密度の粒子の製造および
（または）選択により、放射性リガンド成分の至
適吸着が達成される沈降速度が選択される。ひと
つの具体例として、以下のような操作で、アガロ
ースを結合剤に用いて、酸化ビスマスを炭末で被
覆した。酸化ビスマス100ｇを1.0から100ｇ好ま
しくは2.5ｇの活性炭と混合した。全体で25mlの
融解1.5％アガロースを添加し、混合物はかくは
んして均一とした。冷蔵庫中に１夜放置した。ゲ
ルは、乳鉢で注意深く粉砕した。粉砕ゲルは、
0.25％の牛血清アルブミンおよび0.05％のデキス
トランT70を含有する0.075Mバルビタール緩衝
液250ml中に懸濁させた。別法としては、前記し
たような他のマトリツクス材料たとえば殿粉、ポ
リアクリルアミドゲルおよびPVFを、炭末とと
もに第２の活性成分として使用することもでき
る。粒子が酸化ビスマスおよびマトリツクス材料
のみを含有する時には、炭末は酸化ビスマスと上
記の割合に混合し、それから、マトリツクスの粒
子を記載したように製造する。

この懸濁液の１mlをサイロキシン（T₄）のラ
ジオイムノアツセイにおける吸着剤―遮蔽剤とし
て用いた。このアツセイでは、標準T₄0.05mlを、
T₄に対するウサギ抗血清（１：100）0.2mlおよび
¹²⁵I―T40.2ml（200pg）と４℃で１夜インキユベ
ートした。0.4ｇの炭末酸化ビスマス―アガロー
ス粒子を１mlの緩衝液に含有する懸濁液を添加し
た。試験管は５秒間回転させ、15分間倒立状態に
放置した。ついで自動ガンマー―カウンター
（LKB―Wallac UItro Gamma）中で測定し
た。この具体例での標準曲線を第２図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法により、絨毛性ゴナドト
ロピンをラジオイムノアツセイする際に作製した
標準曲線を示す。第２図は、本発明方法により、
チロキシン（サイロキシン）（T₄）をラジオイム
ノアツセイする際に作製した標準曲線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ラジオイムノアツセイの放射性リガンドから
   放射される放射線の遮蔽が被験サンプル内で起こ
   るようにしたラジオイムノアツセイにおける使用
   に適合させた組成物において、その組成物は各粒
   子のサイズが１〜100μmの粒子の形状とし、その
   粒子は第１の活性成分と第２の活性成分を支持マ
   トリツクスと組み合せて構成され、粒子サイズお
   よび粒子密度は互いに粒子が緩衝塩含有水性懸濁
   液中で１〜180分の沈降速度を示すように調整さ
   れ、これらの各粒子は第１の活性成分としてラジ
   オイムノアツセイの放射性リガンドから放射され
   る放射線の高い吸収能を有する遮蔽剤を、第２の
   活性成分として抗原または抗体あるいはラジオイ
   ムノアツセイの反応生成物に免疫学的に反応する
   材料を含有することを特徴とする組成物。 ２ 第１の活性成分は支持マトリツクス中に分配
   され、第２の活性成分は共有結合によつて支持マ
   トリツクスの表面にカツプリングされている特許
   請求の範囲第１項に記載の組成物。 ３ 第１の活性成分は酸化ビスマスであり、第２
   の活性成分は第１の抗体であり、支持マトリツク
   スはポリアクリルアミドである特許請求の範囲第
   １項または第２項のいずれか一つに記載の組成
   物。 ４ 第２の活性成分は第２の抗体である特許請求
   の範囲第３項に記載の組成物。 ５ 第２の活性成分は抗原である特許請求の範囲
   第２項に記載の組成物。 ６ 第２の活性成分は、輸送蛋白質、サイロキシ
   ン結合グロブリンおよび細胞起源の受容体からな
   る群より選ばれる非免疫型結合体である特許請求
   の範囲第２項に記載の組成物。 ７ 第２の活性成分は、グルタルアルデヒドを介
   して支持マトリツクスに共有結合でカツプリング
   している特許請求の範囲第２項に記載の組成物。 ８ 第２の活性成分は、ラジオイムノアツセイの
   放射性リガンドと吸着作用により反応する特許請
   求の範囲第１項または第６項のいずれか一つに記
   載の組成物。 ９ 第１の活性成分は酸化ビスマス、第２の活性
   成分は活性炭、支持マトリツクスはアガロース、
   デンプンまたはポリビニリデンフルオライドであ
   る特許請求の範囲第１項に記載の組成物。