JPH0527064B2 - - Google Patents
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Description
この発明は、Ｂ型ウイルス性肝炎の診断に用い
ることができる試薬、その製造方法、及びそれを
用いでＢ型肝炎ウイルスに特徴的な抗原を極めて
高感度に定量する方法に関する。 ウイルス性肝炎はウイルスによつて引き起こさ
れる極めて一般的な伝染性感染性疾病であつて、
通常、肝臓の壊死及び炎症によつて特徴ずけら
れ、しばしば黄疸を伴う。この疾病は一般的に回
復しやすいが、１％近くが死に至り、約５％が長
期化又は慢性化する。 Ｂ型肝炎は非常にしばしば非経口的に伝染し、
主として経口的に（食物、飲物）伝染するＡ型肝
炎とは異なつており、他の形態の肝炎（ＡでもＢ
でもない）とも異なつている。Ｂ型肝炎に最も患
りやすい人は、輸血又は血液透析を受ける人、医
療又は準医療関係者、及び輸血センターで働く人
である。明らかに健康な人の血液中にもこのウイ
ルスは長期間存在するので、血液提供者は、Ｂ型
肝炎ウイルスの有無を事務的に調べられる。 分析技術の感度が高まると輸血後の肝炎が減少
することが観察されているので、実施が容易で反
応時間が短かく、安価な高感度の分析方法及び分
析試薬が強く望まれている。 特にアフリカ人に見られる、血液中のＢ型肝炎
ウイルスの存在と初期肝臓がんとの相関関係にも
注目する必要がある。この事実からも、これらの
民族において集団検診を可能にすることが望まれ
る。 HBS抗原又はオーストラリア抗原と呼ばれる、
Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原は、このウイルスの
最も重要なマーカーであると一般的に認められて
おり、血液中で定量しようとするのはこの抗原で
ある。要求される感度（検出閾値は血清１ml当り
1nｇ未満でなければならない）を達成すること
ができる、現在実施可能な方法はすべて放射免疫
分析である。放射免疫分析は放射性物質を用いる
ので種々の欠点を有する。すなわち、特殊で高価
な設備を要すること、異物混入の問題（分析結果
の正確さ及び取扱い者の安全に悪影響を与える）、
高度の技術を有する人員を確保し、医療的及び放
射能毒性的見地からその健康をチエツクしなけれ
ばならないこと、このこと及び安全性を確保する
ことが法的に義務ずけられていること、試薬の保
存可能期間が短いことなどである。 この発明の試薬及び方法は放射免疫分析とは本
質的に異なつている。なぜなら、ユーザーが放射
性物質を取り扱うことがなく、そのため上述の欠
点の全てを有さないからである。この発明の定量
分析法の原理は、微粒子支持体上の極めて高感度
な比濁計測法に基づく。 比濁計測は分析化学の分野において極めて広く
知られた物理的方法である。この原理が抗原抗体
反応の定量に用いられると、それは比濁免疫分析
と呼ばれる。これは主として、タンパク質とこれ
に対応する抗血清との間で形成される不溶性免疫
複合物によつて散乱される光の強度を測定するこ
とにより、血清中の当該タンパク質の特異的定量
に用いられている。設備の改善、特にレーザー光
線を用いることにより、生物学的流体１ml中1μ
ｇのオーダーのタンパク質をも定量することが可
能になつた。 この種の装置は研究所に普及したが、その感度
はHBS抗原の定量にとつては未だ全く不十分であ
る。 早くも1976年に、ボネフオイとグランジ（C.R.
Acad.Sc.Paris Ｄ 283、1976、115−118）は、
調べるべき抗原抗体反応の成分の一方を担つたポ
リスチレン製の微粒子を用いることにより、比濁
免疫分析の性能を改善することを提案した。この
修飾により、比濁免疫分析に微粒状支持体を用い
るという原理が導入された。 同様な研究が刊行物（特にJ.Immunol.
Methods 18、1979、214−224；ibid 33、
1980、159−173；Immunochemistry 13、1976、
955−962及び963−966；Molec.Immunol.17、
1980、81−92参照）及び特許（特にインサーム
（発明者G.A.コーシユ）の名で1979年６月３日に
フランス国に出願された特許出願）に記載されて
いる。これらの技術は、調べるべき抗原抗体反応
にとつて適当な成分が結合（吸着又は共有結合に
よつて）されたポリスチレン微粒子を好ましくは
採用する。 しかしながら、この支持体は疏水性で、自己凝
集して徐々に沈殿するという不安定さを有してお
り、特に非特異的吸着による危険をはらんでい
る。これに対し、親水性の微粒状支持体を用いる
ことにより、性能がさらに改善された。これらの
新しい親水性微粒状支持体はレンバウムらによつ
て記載され、特許されている（レンバウムら、
Macromolecules ９(2)、1976、328−336；レン
バウム、J.Macromol.Sci.Chem.A 13(5)、1979、
603−632；フランス国特許第2258406号、1975年
１月17日；米国特許第4206094号、1980年１月３
日）。しかしこれらは生物医学的目的のものであ
つて、比濁免疫分析にもHBS抗原の定量にも関し
ない。同種の支持体がデユヘイルらによつて、循
環性免疫複合物の比濁免疫分析にも用いられた
（モンタグネら、レーザーベーリング研究班、
1979年９月；モンタグネら、第４回国際免疫学学
会、1980年７月21日〜26日、パリ）。しかしなが
ら、この種の技術のいずれもHBS抗原の定量に用
いられたことはない。 比濁計測的信号の形成を、分散粒子の大きさ、
数、性質の関数として追跡研究している際、出願
人会社は、比濁計測的信号の注目すべきインジケ
ーター及び増幅器として働く新規な微粒状支持体
の大きな利点を見出した。この発明の主題は、ま
さにこれらの支持体及びHBS抗原の定量へのその
応用である。これらの新規な支持体は次のような
性質及び利点を有する。 (イ) これらは、制御的に大きさを変えることがで
きる電荷を有する、多官能的親水性球状微粒子
であつて、その大きさは極めて均一であり、平
均直径を約10nｍないし約10μｍの範囲内で完
全に制御できる。 (ロ) 所望の目的にとつて非常に望ましく、全体と
しては先に開示されたいずれの支持体も有して
いないこれらの性質は、これらの粒子の化学的
性質に起因するものである。すなわち、これら
の性質は、水溶性の架橋及び界面活性剤の存在
下で厳密な水性媒体中で行なわれる、少なくと
も３種の水溶性アクリル系モノマーの共重合に
起因する。 これらの粒子の全ての性質、すなわち幾何学
的性質（平均粒径及び粒度分布）、物理的性質
（親水性及び表面荷電密度）及び化学的性質
（表面に存在する化学的官能基）は、反応媒体
の成分、その相対比率、及び共重合が起こる際
の条件を選ぶことにより、完全に制御すること
ができる。 (ハ) 用いられるアクリル系モノマーは次に規定す
る物質から選ばれる。 (a) 次の一般式で示されるアクリル系アルデヒ
ド 式中、R1は水素又は低級アルキル基である。
このモノマーは、全てのモノマーの５ないし
95重量％、通常40ないし60重量％を占めるこ
とができる。 これは、重合中に保存され、得られた微粒
子の表面に存在するアルデヒド基を提供す
る。これにより、微粒子上に存在するタンパ
ク質、糖タンパク質、又は他の適当な天然若
しくは半合成高分子若しくは分子を共有結合
によつて結合する操作を単純化及び多様化す
ることが可能になる。 (b) 次の一般式で表わされるアクリル系カルボ
ン酸誘導体 式中、R2は水素又は低級アルキル基であり、
R3は水素である。 このモノマーは、全てのモノマーの０ない
し15重量％を占めることができ、微粒子にカ
ルボキシル基を与える。生理学的PH下におけ
るカルボキシルの陰イオン性は微粒子の表面
荷電の制御、従つて懸濁液中での試薬の安定
性にとつて必須的である。これらのカルボキ
シル基の全部又は一部はまた、微粒子上に固
定されるべき分子を、従来の化学的手法に従
つて共有結合するのに利用される化学的官能
基としても用いることができる。 (c) 次の一般式で表わされる他のアクリル酸誘
導体 式中、R2は上述の意味を表わし、COOR3は
次の式で表わされる構造を有する 式中、R4、R5及びR6は同一又は異なる低級
アルキル基を表わす。 このモノマーは、全モノマーの０ないし15
重量％を占めることができ、微粒子に第３ア
ミン基を与える。第３アミン基は、生理学的
PH下におけるその陽イオン性の故に微粒子の
表面荷電を制御し、従つて、懸濁液中での試
薬の安定性を制御する。 (d) 次の一般式で表わされる他のアクリル酸誘
導体 式中、R2は上述の意味を表わし、R3は低級
ヒドロキシアルキル基を表わす。 このモノマーは、全モノマーの５ないし90
重量％を占めることができ、通常40ないし70
重量％を占める。これは多数の水酸基を与え
る。水酸基は微粒子に親水性を与えて微粒子
を水性溶媒中で完全に濡れさせる。これもま
た試薬の安定性に寄与する。 この発明の生産物は、少なくとも３種のモノ
マー、すなわち(b)、(c)の少なくともいずれか一
方と、(a)と(d)から得ることができる。換言する
と、(b)と(c)の量が同時に０にはなり得ない。 (b)、(c)及び(d)群に属するモノマーの比率を慎
重に選択することによつて、微粒子の親水性及
び正味荷電の両方を完全に所望の程度に制御す
ることができることは明らかである。この制御
は、試薬による定量の感度を最大にするために
必須的である。実際、微粒子間の静電的反発が
自己凝集を丁度防止する程度に十分強し、しか
し最も弱い高原抗体反応によつても２つの微粒
子が特異的に凝集できる程度に十分弱くなるよ
うに微粒子の荷電を調節すると、定量の感度が
最も高くなる。この条件はまた、特異的な凝集
反応の加速にとつて有利であり、このことは実
際に定量を行なう際に極めて好ましい要素であ
る。 最後に、疎水性のモノマーが全くないため、
重合の開示時及びその後の過程における均一さ
にとつて有利な、均一な水性反応液を得ること
ができる。その結果、所望の平均粒径がどの程
度であろうとも、粒径が非常にそろつた微粒子
を得ることができる。 (ニ) 上述のアクリル系モノマーに加え、重合反応
液は、アクリル系ポリマーの直鎖間に橋を架
け、３次元コポリマー網を与える架橋剤を含
む。この架橋剤は水溶性の非共役ジエン、特に
Ｎ，N′−メチレン−ビス−アクリルアミドで
あり、モノマー全量に対し0.1ないし10重量％、
通常0.5ないし５重量％用いられる。架橋剤の
比率を選択することによつて、得られる微粒子
の多孔性を調節することができる。 (ホ) 最後に、重合反応液はイオン性界面活性剤
（特にドデシル硫酸ナトリウム）又は非イオン
性界面活性剤を含む。界面活性剤は全反応液に
対して0.01ないし５重量％の濃度で用いられ
る。その役割は、重合中の粒子の成長の態様を
制御することであり、従つて、得られる微粒子
の最終粒径を制御することである。 (ヘ) 微粒子の最終粒径は、一方で界面活性剤の濃
度を変え、他方で重合反応液中の全モノマー混
合物の終濃度を変えることによつて最も好まし
く制御できることがわかつた。他の条件を同一
にすれば、得られる微粒子の直径は、界面活性
剤の濃度が低く、全モノマー濃度が高いほど大
きくなる。反応液中のモノマー濃度は４ないし
16重量％に設定し得る。 (ト) 選択されたモノマー、架橋剤及び界面活性剤
を、所望の性質を有する微粒子を得ることがで
きる条件下で混合し、この反応液を適当な大き
さのホウケイ酸ガラスのアンプルに分け、次に
真空中で密封する。これらのアンプルを往復型
又は回転型振盪器に固定し、全体をコバルト60
貯蔵用鉛容器である照射室内に置いた。重合反
応を開始させる照射は、１時間１cm3当り0.01な
いし0.5メガラドの率で行なう。照射時間は15
分未満であつてはならず、長い場合は10時間で
あつてもよい。 放射線量を一定にすれば、微粒子の粒径は、
単位時間当りの放射線量が少なく、それに応じ
て照射時間が長い場合に大きくなることを見出
した。 照射後、アンプルを開け、重合反応を停止さ
せかつ微粒子上に存するアルデヒド基の酸化を
防止するために、反応液を等体積の還元性水性
溶液（特に１ｇ／のヒドロキノンを含む溶
液）で希釈する。得られた製剤は完全に安定で
あり、以後の使用のためにこの条件下で４℃の
温度下で貯蔵する。得られた微粒子は電子顕微
鏡で調べることができ、それによつて平均粒径
と粒度分布を測定することができる。上述の条
件下では、ある製剤の粒径の標準偏差は常に平
均粒径の1/10未満である。 HBS抗原の定量に用いるために、HBS抗原に
対応し、比濁信号の基礎となる特異的凝集反応
を引き起こす抗体を、得られた微粒子に化学的
に結合しなければならない。 この発明には、精製されたHBS抗原で免疫化
された動物から得られた特異的抗血清から既知
の方法によつて分離された多クローン抗体も、
HBS抗原に対して免疫化された動物のプラズマ
細胞と適当な性質を有するミエローマ細胞との
融合によつて得られる融合細胞（ハイブリドー
マ）を作つた後、既知の方法で精製して得られ
る単一クローン抗体をも抗体として用いること
ができる。 抗原の希な変異体が定量から漏れることを防
止するため、HBS抗原に対して特異的ないくつ
かの免疫グロブリンの混合物を抗体として用い
ることもできる。 抗HBS抗体を微粒子に結合するために、予め
微粒子懸濁液を透析して過剰の反応物質を除
き、等張緩衝液１ml当り１ないし50mg（乾燥重
量）の粒子を含む既知濃度に調整し、これを同
じ溶媒中に抗体を含む溶液で処理する。タンパ
ク質のアミノ基と、微粒子上のアルデヒド基と
の間でイミン結合が形成されることにより、結
合は、室温で数時間のうちに自動的に起こる。 反応が必要な程度完了した後（１ないし30時
間）、過剰のアルデヒド基を第１アミン、好ま
しくはエタノールアミンのような第１ヒドロキ
シアミンとの反応によりブロツクする。第１ヒ
ドロキシアミンの水酸基はまた、このようにコ
ートされた微粒子の親水性を調節する。この工
程は、室温でさらに１ないし10時間インキユベ
ートすることによつて行なわれる。 あるいは、過剰のアルデヒド基は、金属水素
化物、特に水素化ホウ素ナトリウムを用いて還
元することによつてブロツクすることもでき
る。この処理によつてイミン基が第２アミンに
還元されて抗体と微粒子との結合が安定化さ
れ、同時にアルデヒド基が水酸基に還元され
る。この水酸基は、上述のように、粒子の親水
性にとつて有利である。 このようにして得られた微粒子の懸濁液を次に
適当な密度勾配（例えば10ないし60％のシヨ糖勾
配）の存在下で遠心することによつて精製するこ
とができる。粒子を含む層を回収し、最後に等張
緩衝液に対して透析する。 この型の免疫微粒子（特異的抗体を担つた微粒
子）は、適当に希釈されているであろうあらゆる
ヒトの生物学的流体、特に血清又は血漿中のHBS
抗原の比濁定量にそのまま用いることができる。
操作は従来から採用されているものと同じであ
る。すなわち、抗原抗体反応を起こさせた後、未
知試料を含む容器から得られた比濁信号を、既知
量の標準抗原に存在下で得られた信号を測定する
ことによつてつくられた標準曲線と比較する。 最新式のレーザー比濁計測器に備えられる全て
の技術的設備、すなわちブランクの自動控除、動
的測定又は終点測定を行なう可能性、オートメー
シヨン、小型化、内蔵コンピユーター、電気的信
号処理等を最高精度の結果を得るために、もちろ
ん利用することができる。さらに、異なる機器は
同一の特性及び機能を有さないことを考慮し、こ
の発明の方法の非常に大きな柔軟性を利用して、
最大の性能特性を確保するためにそれぞれの機器
に応じて試薬の製造を最適化することができる。 実施例 １ 平均直径50、110、及び190nｍの微粒子の製造 全ての試薬は市販品であり、使用直前に注意深
く蒸留した。採用した一般的手法は次のとおりで
ある。直径35mm、全内容量150mlのホウケイ酸ガ
ラスの密封アンプルを準備し、予め真空中で脱ガ
スした所望量のモノマー、架橋剤、界面活性剤及
び水を、第１表に示す組成を有し全量が100mlに
なるようにそれぞれのアンプルに加えた。窒素流
を泡として通した後、反応液を液体窒素に漬けて
凍結させ、直ちにアンプルを真空中で密封した。
重合を、コバルト60貯蔵用鉛容器中でγ線を照射
することによつて引き起こした。単位時間当りの
放射線量及び照射時間は第１表に示す通りであつ
あ。照射中、アンプルは20rpmで回転するプレー
トを有する振盪器に取り付け、照射が最も均一に
なるように配置した。照射室内に配置された放射
線計により、放射線量をチエツクした。重合後、
アンプルを開け、内容を１ｇ／のヒドロキノン
を含む等体積の水溶液に注いだ。微粒子の直径は
電子顕微鏡で測定した。
ることができる試薬、その製造方法、及びそれを
用いでＢ型肝炎ウイルスに特徴的な抗原を極めて
高感度に定量する方法に関する。 ウイルス性肝炎はウイルスによつて引き起こさ
れる極めて一般的な伝染性感染性疾病であつて、
通常、肝臓の壊死及び炎症によつて特徴ずけら
れ、しばしば黄疸を伴う。この疾病は一般的に回
復しやすいが、１％近くが死に至り、約５％が長
期化又は慢性化する。 Ｂ型肝炎は非常にしばしば非経口的に伝染し、
主として経口的に（食物、飲物）伝染するＡ型肝
炎とは異なつており、他の形態の肝炎（ＡでもＢ
でもない）とも異なつている。Ｂ型肝炎に最も患
りやすい人は、輸血又は血液透析を受ける人、医
療又は準医療関係者、及び輸血センターで働く人
である。明らかに健康な人の血液中にもこのウイ
ルスは長期間存在するので、血液提供者は、Ｂ型
肝炎ウイルスの有無を事務的に調べられる。 分析技術の感度が高まると輸血後の肝炎が減少
することが観察されているので、実施が容易で反
応時間が短かく、安価な高感度の分析方法及び分
析試薬が強く望まれている。 特にアフリカ人に見られる、血液中のＢ型肝炎
ウイルスの存在と初期肝臓がんとの相関関係にも
注目する必要がある。この事実からも、これらの
民族において集団検診を可能にすることが望まれ
る。 HBS抗原又はオーストラリア抗原と呼ばれる、
Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原は、このウイルスの
最も重要なマーカーであると一般的に認められて
おり、血液中で定量しようとするのはこの抗原で
ある。要求される感度（検出閾値は血清１ml当り
1nｇ未満でなければならない）を達成すること
ができる、現在実施可能な方法はすべて放射免疫
分析である。放射免疫分析は放射性物質を用いる
ので種々の欠点を有する。すなわち、特殊で高価
な設備を要すること、異物混入の問題（分析結果
の正確さ及び取扱い者の安全に悪影響を与える）、
高度の技術を有する人員を確保し、医療的及び放
射能毒性的見地からその健康をチエツクしなけれ
ばならないこと、このこと及び安全性を確保する
ことが法的に義務ずけられていること、試薬の保
存可能期間が短いことなどである。 この発明の試薬及び方法は放射免疫分析とは本
質的に異なつている。なぜなら、ユーザーが放射
性物質を取り扱うことがなく、そのため上述の欠
点の全てを有さないからである。この発明の定量
分析法の原理は、微粒子支持体上の極めて高感度
な比濁計測法に基づく。 比濁計測は分析化学の分野において極めて広く
知られた物理的方法である。この原理が抗原抗体
反応の定量に用いられると、それは比濁免疫分析
と呼ばれる。これは主として、タンパク質とこれ
に対応する抗血清との間で形成される不溶性免疫
複合物によつて散乱される光の強度を測定するこ
とにより、血清中の当該タンパク質の特異的定量
に用いられている。設備の改善、特にレーザー光
線を用いることにより、生物学的流体１ml中1μ
ｇのオーダーのタンパク質をも定量することが可
能になつた。 この種の装置は研究所に普及したが、その感度
はHBS抗原の定量にとつては未だ全く不十分であ
る。 早くも1976年に、ボネフオイとグランジ（C.R.
Acad.Sc.Paris Ｄ 283、1976、115−118）は、
調べるべき抗原抗体反応の成分の一方を担つたポ
リスチレン製の微粒子を用いることにより、比濁
免疫分析の性能を改善することを提案した。この
修飾により、比濁免疫分析に微粒状支持体を用い
るという原理が導入された。 同様な研究が刊行物（特にJ.Immunol.
Methods 18、1979、214−224；ibid 33、
1980、159−173；Immunochemistry 13、1976、
955−962及び963−966；Molec.Immunol.17、
1980、81−92参照）及び特許（特にインサーム
（発明者G.A.コーシユ）の名で1979年６月３日に
フランス国に出願された特許出願）に記載されて
いる。これらの技術は、調べるべき抗原抗体反応
にとつて適当な成分が結合（吸着又は共有結合に
よつて）されたポリスチレン微粒子を好ましくは
採用する。 しかしながら、この支持体は疏水性で、自己凝
集して徐々に沈殿するという不安定さを有してお
り、特に非特異的吸着による危険をはらんでい
る。これに対し、親水性の微粒状支持体を用いる
ことにより、性能がさらに改善された。これらの
新しい親水性微粒状支持体はレンバウムらによつ
て記載され、特許されている（レンバウムら、
Macromolecules ９(2)、1976、328−336；レン
バウム、J.Macromol.Sci.Chem.A 13(5)、1979、
603−632；フランス国特許第2258406号、1975年
１月17日；米国特許第4206094号、1980年１月３
日）。しかしこれらは生物医学的目的のものであ
つて、比濁免疫分析にもHBS抗原の定量にも関し
ない。同種の支持体がデユヘイルらによつて、循
環性免疫複合物の比濁免疫分析にも用いられた
（モンタグネら、レーザーベーリング研究班、
1979年９月；モンタグネら、第４回国際免疫学学
会、1980年７月21日〜26日、パリ）。しかしなが
ら、この種の技術のいずれもHBS抗原の定量に用
いられたことはない。 比濁計測的信号の形成を、分散粒子の大きさ、
数、性質の関数として追跡研究している際、出願
人会社は、比濁計測的信号の注目すべきインジケ
ーター及び増幅器として働く新規な微粒状支持体
の大きな利点を見出した。この発明の主題は、ま
さにこれらの支持体及びHBS抗原の定量へのその
応用である。これらの新規な支持体は次のような
性質及び利点を有する。 (イ) これらは、制御的に大きさを変えることがで
きる電荷を有する、多官能的親水性球状微粒子
であつて、その大きさは極めて均一であり、平
均直径を約10nｍないし約10μｍの範囲内で完
全に制御できる。 (ロ) 所望の目的にとつて非常に望ましく、全体と
しては先に開示されたいずれの支持体も有して
いないこれらの性質は、これらの粒子の化学的
性質に起因するものである。すなわち、これら
の性質は、水溶性の架橋及び界面活性剤の存在
下で厳密な水性媒体中で行なわれる、少なくと
も３種の水溶性アクリル系モノマーの共重合に
起因する。 これらの粒子の全ての性質、すなわち幾何学
的性質（平均粒径及び粒度分布）、物理的性質
（親水性及び表面荷電密度）及び化学的性質
（表面に存在する化学的官能基）は、反応媒体
の成分、その相対比率、及び共重合が起こる際
の条件を選ぶことにより、完全に制御すること
ができる。 (ハ) 用いられるアクリル系モノマーは次に規定す
る物質から選ばれる。 (a) 次の一般式で示されるアクリル系アルデヒ
ド 式中、R1は水素又は低級アルキル基である。
このモノマーは、全てのモノマーの５ないし
95重量％、通常40ないし60重量％を占めるこ
とができる。 これは、重合中に保存され、得られた微粒
子の表面に存在するアルデヒド基を提供す
る。これにより、微粒子上に存在するタンパ
ク質、糖タンパク質、又は他の適当な天然若
しくは半合成高分子若しくは分子を共有結合
によつて結合する操作を単純化及び多様化す
ることが可能になる。 (b) 次の一般式で表わされるアクリル系カルボ
ン酸誘導体 式中、R2は水素又は低級アルキル基であり、
R3は水素である。 このモノマーは、全てのモノマーの０ない
し15重量％を占めることができ、微粒子にカ
ルボキシル基を与える。生理学的PH下におけ
るカルボキシルの陰イオン性は微粒子の表面
荷電の制御、従つて懸濁液中での試薬の安定
性にとつて必須的である。これらのカルボキ
シル基の全部又は一部はまた、微粒子上に固
定されるべき分子を、従来の化学的手法に従
つて共有結合するのに利用される化学的官能
基としても用いることができる。 (c) 次の一般式で表わされる他のアクリル酸誘
導体 式中、R2は上述の意味を表わし、COOR3は
次の式で表わされる構造を有する 式中、R4、R5及びR6は同一又は異なる低級
アルキル基を表わす。 このモノマーは、全モノマーの０ないし15
重量％を占めることができ、微粒子に第３ア
ミン基を与える。第３アミン基は、生理学的
PH下におけるその陽イオン性の故に微粒子の
表面荷電を制御し、従つて、懸濁液中での試
薬の安定性を制御する。 (d) 次の一般式で表わされる他のアクリル酸誘
導体 式中、R2は上述の意味を表わし、R3は低級
ヒドロキシアルキル基を表わす。 このモノマーは、全モノマーの５ないし90
重量％を占めることができ、通常40ないし70
重量％を占める。これは多数の水酸基を与え
る。水酸基は微粒子に親水性を与えて微粒子
を水性溶媒中で完全に濡れさせる。これもま
た試薬の安定性に寄与する。 この発明の生産物は、少なくとも３種のモノ
マー、すなわち(b)、(c)の少なくともいずれか一
方と、(a)と(d)から得ることができる。換言する
と、(b)と(c)の量が同時に０にはなり得ない。 (b)、(c)及び(d)群に属するモノマーの比率を慎
重に選択することによつて、微粒子の親水性及
び正味荷電の両方を完全に所望の程度に制御す
ることができることは明らかである。この制御
は、試薬による定量の感度を最大にするために
必須的である。実際、微粒子間の静電的反発が
自己凝集を丁度防止する程度に十分強し、しか
し最も弱い高原抗体反応によつても２つの微粒
子が特異的に凝集できる程度に十分弱くなるよ
うに微粒子の荷電を調節すると、定量の感度が
最も高くなる。この条件はまた、特異的な凝集
反応の加速にとつて有利であり、このことは実
際に定量を行なう際に極めて好ましい要素であ
る。 最後に、疎水性のモノマーが全くないため、
重合の開示時及びその後の過程における均一さ
にとつて有利な、均一な水性反応液を得ること
ができる。その結果、所望の平均粒径がどの程
度であろうとも、粒径が非常にそろつた微粒子
を得ることができる。 (ニ) 上述のアクリル系モノマーに加え、重合反応
液は、アクリル系ポリマーの直鎖間に橋を架
け、３次元コポリマー網を与える架橋剤を含
む。この架橋剤は水溶性の非共役ジエン、特に
Ｎ，N′−メチレン−ビス−アクリルアミドで
あり、モノマー全量に対し0.1ないし10重量％、
通常0.5ないし５重量％用いられる。架橋剤の
比率を選択することによつて、得られる微粒子
の多孔性を調節することができる。 (ホ) 最後に、重合反応液はイオン性界面活性剤
（特にドデシル硫酸ナトリウム）又は非イオン
性界面活性剤を含む。界面活性剤は全反応液に
対して0.01ないし５重量％の濃度で用いられ
る。その役割は、重合中の粒子の成長の態様を
制御することであり、従つて、得られる微粒子
の最終粒径を制御することである。 (ヘ) 微粒子の最終粒径は、一方で界面活性剤の濃
度を変え、他方で重合反応液中の全モノマー混
合物の終濃度を変えることによつて最も好まし
く制御できることがわかつた。他の条件を同一
にすれば、得られる微粒子の直径は、界面活性
剤の濃度が低く、全モノマー濃度が高いほど大
きくなる。反応液中のモノマー濃度は４ないし
16重量％に設定し得る。 (ト) 選択されたモノマー、架橋剤及び界面活性剤
を、所望の性質を有する微粒子を得ることがで
きる条件下で混合し、この反応液を適当な大き
さのホウケイ酸ガラスのアンプルに分け、次に
真空中で密封する。これらのアンプルを往復型
又は回転型振盪器に固定し、全体をコバルト60
貯蔵用鉛容器である照射室内に置いた。重合反
応を開始させる照射は、１時間１cm3当り0.01な
いし0.5メガラドの率で行なう。照射時間は15
分未満であつてはならず、長い場合は10時間で
あつてもよい。 放射線量を一定にすれば、微粒子の粒径は、
単位時間当りの放射線量が少なく、それに応じ
て照射時間が長い場合に大きくなることを見出
した。 照射後、アンプルを開け、重合反応を停止さ
せかつ微粒子上に存するアルデヒド基の酸化を
防止するために、反応液を等体積の還元性水性
溶液（特に１ｇ／のヒドロキノンを含む溶
液）で希釈する。得られた製剤は完全に安定で
あり、以後の使用のためにこの条件下で４℃の
温度下で貯蔵する。得られた微粒子は電子顕微
鏡で調べることができ、それによつて平均粒径
と粒度分布を測定することができる。上述の条
件下では、ある製剤の粒径の標準偏差は常に平
均粒径の1/10未満である。 HBS抗原の定量に用いるために、HBS抗原に
対応し、比濁信号の基礎となる特異的凝集反応
を引き起こす抗体を、得られた微粒子に化学的
に結合しなければならない。 この発明には、精製されたHBS抗原で免疫化
された動物から得られた特異的抗血清から既知
の方法によつて分離された多クローン抗体も、
HBS抗原に対して免疫化された動物のプラズマ
細胞と適当な性質を有するミエローマ細胞との
融合によつて得られる融合細胞（ハイブリドー
マ）を作つた後、既知の方法で精製して得られ
る単一クローン抗体をも抗体として用いること
ができる。 抗原の希な変異体が定量から漏れることを防
止するため、HBS抗原に対して特異的ないくつ
かの免疫グロブリンの混合物を抗体として用い
ることもできる。 抗HBS抗体を微粒子に結合するために、予め
微粒子懸濁液を透析して過剰の反応物質を除
き、等張緩衝液１ml当り１ないし50mg（乾燥重
量）の粒子を含む既知濃度に調整し、これを同
じ溶媒中に抗体を含む溶液で処理する。タンパ
ク質のアミノ基と、微粒子上のアルデヒド基と
の間でイミン結合が形成されることにより、結
合は、室温で数時間のうちに自動的に起こる。 反応が必要な程度完了した後（１ないし30時
間）、過剰のアルデヒド基を第１アミン、好ま
しくはエタノールアミンのような第１ヒドロキ
シアミンとの反応によりブロツクする。第１ヒ
ドロキシアミンの水酸基はまた、このようにコ
ートされた微粒子の親水性を調節する。この工
程は、室温でさらに１ないし10時間インキユベ
ートすることによつて行なわれる。 あるいは、過剰のアルデヒド基は、金属水素
化物、特に水素化ホウ素ナトリウムを用いて還
元することによつてブロツクすることもでき
る。この処理によつてイミン基が第２アミンに
還元されて抗体と微粒子との結合が安定化さ
れ、同時にアルデヒド基が水酸基に還元され
る。この水酸基は、上述のように、粒子の親水
性にとつて有利である。 このようにして得られた微粒子の懸濁液を次に
適当な密度勾配（例えば10ないし60％のシヨ糖勾
配）の存在下で遠心することによつて精製するこ
とができる。粒子を含む層を回収し、最後に等張
緩衝液に対して透析する。 この型の免疫微粒子（特異的抗体を担つた微粒
子）は、適当に希釈されているであろうあらゆる
ヒトの生物学的流体、特に血清又は血漿中のHBS
抗原の比濁定量にそのまま用いることができる。
操作は従来から採用されているものと同じであ
る。すなわち、抗原抗体反応を起こさせた後、未
知試料を含む容器から得られた比濁信号を、既知
量の標準抗原に存在下で得られた信号を測定する
ことによつてつくられた標準曲線と比較する。 最新式のレーザー比濁計測器に備えられる全て
の技術的設備、すなわちブランクの自動控除、動
的測定又は終点測定を行なう可能性、オートメー
シヨン、小型化、内蔵コンピユーター、電気的信
号処理等を最高精度の結果を得るために、もちろ
ん利用することができる。さらに、異なる機器は
同一の特性及び機能を有さないことを考慮し、こ
の発明の方法の非常に大きな柔軟性を利用して、
最大の性能特性を確保するためにそれぞれの機器
に応じて試薬の製造を最適化することができる。 実施例 １ 平均直径50、110、及び190nｍの微粒子の製造 全ての試薬は市販品であり、使用直前に注意深
く蒸留した。採用した一般的手法は次のとおりで
ある。直径35mm、全内容量150mlのホウケイ酸ガ
ラスの密封アンプルを準備し、予め真空中で脱ガ
スした所望量のモノマー、架橋剤、界面活性剤及
び水を、第１表に示す組成を有し全量が100mlに
なるようにそれぞれのアンプルに加えた。窒素流
を泡として通した後、反応液を液体窒素に漬けて
凍結させ、直ちにアンプルを真空中で密封した。
重合を、コバルト60貯蔵用鉛容器中でγ線を照射
することによつて引き起こした。単位時間当りの
放射線量及び照射時間は第１表に示す通りであつ
あ。照射中、アンプルは20rpmで回転するプレー
トを有する振盪器に取り付け、照射が最も均一に
なるように配置した。照射室内に配置された放射
線計により、放射線量をチエツクした。重合後、
アンプルを開け、内容を１ｇ／のヒドロキノン
を含む等体積の水溶液に注いだ。微粒子の直径は
電子顕微鏡で測定した。
【表】
実施例 ２
抗HBS単一クローン抗体と直径50nｍの微粒子
との結合 (a) 単一クローン抗体 この実施例に用いた単一クローン抗体製剤
は、HBS抗原に対して特異的な単一クローン抗
体を生産している５つの異なるハイブリドーマ
をそれぞれ移植（腹膜中）したマウスの腹水か
ら得られ、ブドウ球菌タンパク質Ａが固定され
たセフアロース上で精製された、抗HBS単一ク
ローン性マウス免疫グロブリン（クラスＧ、サ
ブクラス１、2a及び2b）の混合物から成る。 (b) 結合 実施例１で述べたようにしてつくつた直径
50nｍの微粒子の懸濁液に終濃度14ｍＭの塩化
ナトリウムを加えて等張にし、140ｍＭの塩化
ナトリウムを含む10ｍＭリンパ酸バツフアー
（PH7.2）から成る等張緩衝液に対して徹底的に
透析した。この緩衝液は使用前に慎重に脱ガス
しておいた。得られた懸濁液の一部を純水に対
して透析し、懸濁液中の微粒子の濃度（乾燥重
量）を求めた。 結合のために、PBSバツフアー中の微粒子
懸濁液の一部（11mgの微粒子を含む）を、抗
HBS抗体溶液の一部（同じバツフアー中に10-8
モルの免疫グロブリンを含む）に加え、さらに
PBSバツフアーを加えて全量を１mlにした。
室温で非常にゆつくり振盪しつつ18時間放置し
た後、0.2Mのエタノールアミン（塩酸でPHを
7.2に調整してある）200μをこれに加え、同
一の条件下でさらに２時間保つた。 この反応液を、予めつくられた10ないし60％
（重量／体積）のシヨ糖勾配を含む遠心管に入
れ、４℃で20000rpmで２時間遠心した。微粒
子を含む層を回収し、微粒子を１のPBSバ
ツフアーに対して３回透析した。 実施例 ３ 抗HBS免疫粒子の、HBS抗原の比濁定量への適
用 (a) 用いた機器 実験に用いた機器はPDQハイランドレーザ
ー比濁計測器である。これは出力0.5ｍＷ、
632.8nｍのHe／Neレーザーを備え、入射光軸
に対して31.8°の傾きで光強度を測定するもの
である。容器は、総体積１mlで操作可能なもの
である。 (b) 試験の一般的条件 全ての場合、容器中の液の総体積は１mlであ
つた。該容器中で被試験料を、１ｇ／の子ウ
シ血清アルブミンと１ｇ／のトウイーン80と
を含むPBSバツフアーで適当に希釈し、さら
に同じ希釈液で総体積を900μにした。母懸
濁液を適当に希釈した100μの希釈懸濁液の
形態にある実施例２で得た免疫微粒子をこの混
合物に加えた。比濁信号を発する特異的な凝集
反応は免疫微粒子を加えた後始まり、これは経
時的に追跡（動的観察）することも、一定の時
刻において測定することも可能である。他にこ
とわりがない限り、測定は、容器中で特異的免
疫微粒子と抗原とを接触させてから１時間後に
行なつた。この時間内に特異的な比濁信号の本
質的な部分が得られ、測定時間を８又は16時間
に延長しても実質的な実務上の利益が得られな
いことが実験によつてわかつた。以下に記載す
る全ての結果は、それぞれの試験に対応するブ
ランクを控除した後のものであり、従つて評価
すべき反応の特異的信号を表わす。 (c) 用いたサンプル １ml当り31μｇのHBS抗原を含む標準ヒト血
清及び１ml当り約5μｇのHBS抗原を含む、病
院から得た陽性ヒト血清 (d) 行なつた実験 (1) 免疫微粒子懸濁液の安定性 3.5ないし28μｇ／mlの濃度を有する４つの
異なる抗HBS免疫微粒子自身（抗原を含まな
い）に対応する信号を、容器の内容物を振盪
することなく96時間にわたつて繰り返し測定
した。これらの信号は非常に安定しているこ
とが判明した。なぜなら、濃縮化懸濁液にお
いては観察された最もかけ離れた値の平均値
からのずれが２％以内であり、希釈化懸濁液
においても７％以内であつたからである。こ
の結果から、実務的な使用条件下において、
そして分析に要する時間とは比較にならない
ほど長時間にわたつてこの微粒子懸濁液が安
定であることがわかる。 (2) 定量の標準化 (2‐1) 免疫微粒子の濃度を7μｇに固定する
と、標準血清の希釈液を用いて得られる標
準領域から、極めて広範囲の濃度のHBS抗
原が特異的比濁信号によつて定量すること
ができることがわかる。なぜなら、この範
囲は約0.15nｇ／mlから約80nｇ／mlにわた
るからである。この標準曲線は第１図に示
されている。第１図は、HBS抗原の濃度
（ｎｇ／ml）を軸に、散乱光強度（任意単
位）を縦軸にとつたものである。 この特徴は、実務上極めて貴重な意味を
持つ。なぜなら、ユーザーは、使用可能な
標準範囲内での測定値を得るために未知の
試料の多数の希釈液をつくる必要がなくな
るからである。 (2‐2) 免疫微粒子の濃度を1.4nｇ／mlに下げ
ると、同様な標準曲線から、限界感度を
0.1nｇ／ml又はそれ未満の抗原濃度にまで
容易に下げ得ることがわかる。この標準曲
線は第２図に示されている。第２図におい
て、HBS抗原の濃度（ｎｇ／ml）は横軸
に、散乱光の強度（任意単位）は縦軸にプ
ロツトされている。この結果は極めて重要
である。なぜなら、完成された方法による
と、放射性物質を扱う不利益を伴うことな
く、限界感度を少なくとも現在利用可能な
放射免疫分析の最高感度にまで達せしめる
ことができることがわかつたからである。 (3) 特異性のチエツク （２−１）と同じ条件下で抗原溶液を終濃
度70μｇ／mlの遊離の抗体（免疫微粒子に結
合していない）と24時間インキユベートする
と、ブランクから識別可能な信号が現われな
い。このことは、特異的抗体は免疫微粒子に
結合されなければたとえ高濃度であつても特
異的な比濁信号を発生させることができない
ことを示している。 この同じ容器内に特異的免疫微粒子を加え
ても、特異的信号は現われない。このこと
は、存在する抗原は第１段階において過剰の
遊離抗体によつて完全に中和され、このため
第２段階において免疫微粒子の特異的凝集を
もはや引き起こすことができなくなつたこと
を示している。この結果は、HBS抗原の認識
に関し、用いた免疫微粒子の特異性を示して
いる。 (4) 未知血清の定量 (4‐1) この発明の試薬を、未知強度の血清中
のHBS抗原の定量に用いた際に高度の柔軟
性を与える能力を実際的に評価するため
に、病院から得たヒト血清を用いた。この
血清を公比２の等比数列的に逓減希釈して
14種の希釈液をつくり、全ての希釈液の一
部を（２−１）で記載した条件下で免疫微
粒子と反応させた。第３図の曲線から、機
器の適当な感度領域を選択すれば、血清の
非常に高倍率希釈に至るまでの全ての希釈
液について特異的比濁信号を容易に測定し
得ることがわかる。なぜなら、信号は10万
倍の希釈液でさえ有意であるからである。
この結果から、実務上は、その中の１つの
濃度が1μｇ／mlないし10μｇ／mlとなる最
大５つの希釈液を用いて、未知の血清を１
時間以内の単一工程で定量することができ
ることがわかる。 第３図では、血清の希釈率が横軸に、任
意単位の光強度が縦軸にプロツトされてい
る。測定は免疫微粒子の濃度を７mg／mlと
し、機器の３つの異なる感度を採用して行
なつた。 (4‐2) 実際に用いた血清は、測定範囲内に最
もよく入る希釈液について得られた信号を
第１図の標準曲線と比較することにより、
１ml当り平均5.9mgのHBS抗原を含んでい
ることがわかつた。異なる希釈液を用いて
６回測定したところ、最もかけ離れた値は
3.3mg／ml及び6.4mg／mlであつた。この精
度は、この種の分析においては優れたもの
である。 (5) 結果の再現性 上述したのと同様の条件下で、互いに独立
しているが同一の組成を有する試料を、２つ
の異なる希釈率において、対応する感度範囲
内においてそれぞれ10個ずつ測定した。得ら
れた値を統計学的に分析したところ次の結果
が得られた。
との結合 (a) 単一クローン抗体 この実施例に用いた単一クローン抗体製剤
は、HBS抗原に対して特異的な単一クローン抗
体を生産している５つの異なるハイブリドーマ
をそれぞれ移植（腹膜中）したマウスの腹水か
ら得られ、ブドウ球菌タンパク質Ａが固定され
たセフアロース上で精製された、抗HBS単一ク
ローン性マウス免疫グロブリン（クラスＧ、サ
ブクラス１、2a及び2b）の混合物から成る。 (b) 結合 実施例１で述べたようにしてつくつた直径
50nｍの微粒子の懸濁液に終濃度14ｍＭの塩化
ナトリウムを加えて等張にし、140ｍＭの塩化
ナトリウムを含む10ｍＭリンパ酸バツフアー
（PH7.2）から成る等張緩衝液に対して徹底的に
透析した。この緩衝液は使用前に慎重に脱ガス
しておいた。得られた懸濁液の一部を純水に対
して透析し、懸濁液中の微粒子の濃度（乾燥重
量）を求めた。 結合のために、PBSバツフアー中の微粒子
懸濁液の一部（11mgの微粒子を含む）を、抗
HBS抗体溶液の一部（同じバツフアー中に10-8
モルの免疫グロブリンを含む）に加え、さらに
PBSバツフアーを加えて全量を１mlにした。
室温で非常にゆつくり振盪しつつ18時間放置し
た後、0.2Mのエタノールアミン（塩酸でPHを
7.2に調整してある）200μをこれに加え、同
一の条件下でさらに２時間保つた。 この反応液を、予めつくられた10ないし60％
（重量／体積）のシヨ糖勾配を含む遠心管に入
れ、４℃で20000rpmで２時間遠心した。微粒
子を含む層を回収し、微粒子を１のPBSバ
ツフアーに対して３回透析した。 実施例 ３ 抗HBS免疫粒子の、HBS抗原の比濁定量への適
用 (a) 用いた機器 実験に用いた機器はPDQハイランドレーザ
ー比濁計測器である。これは出力0.5ｍＷ、
632.8nｍのHe／Neレーザーを備え、入射光軸
に対して31.8°の傾きで光強度を測定するもの
である。容器は、総体積１mlで操作可能なもの
である。 (b) 試験の一般的条件 全ての場合、容器中の液の総体積は１mlであ
つた。該容器中で被試験料を、１ｇ／の子ウ
シ血清アルブミンと１ｇ／のトウイーン80と
を含むPBSバツフアーで適当に希釈し、さら
に同じ希釈液で総体積を900μにした。母懸
濁液を適当に希釈した100μの希釈懸濁液の
形態にある実施例２で得た免疫微粒子をこの混
合物に加えた。比濁信号を発する特異的な凝集
反応は免疫微粒子を加えた後始まり、これは経
時的に追跡（動的観察）することも、一定の時
刻において測定することも可能である。他にこ
とわりがない限り、測定は、容器中で特異的免
疫微粒子と抗原とを接触させてから１時間後に
行なつた。この時間内に特異的な比濁信号の本
質的な部分が得られ、測定時間を８又は16時間
に延長しても実質的な実務上の利益が得られな
いことが実験によつてわかつた。以下に記載す
る全ての結果は、それぞれの試験に対応するブ
ランクを控除した後のものであり、従つて評価
すべき反応の特異的信号を表わす。 (c) 用いたサンプル １ml当り31μｇのHBS抗原を含む標準ヒト血
清及び１ml当り約5μｇのHBS抗原を含む、病
院から得た陽性ヒト血清 (d) 行なつた実験 (1) 免疫微粒子懸濁液の安定性 3.5ないし28μｇ／mlの濃度を有する４つの
異なる抗HBS免疫微粒子自身（抗原を含まな
い）に対応する信号を、容器の内容物を振盪
することなく96時間にわたつて繰り返し測定
した。これらの信号は非常に安定しているこ
とが判明した。なぜなら、濃縮化懸濁液にお
いては観察された最もかけ離れた値の平均値
からのずれが２％以内であり、希釈化懸濁液
においても７％以内であつたからである。こ
の結果から、実務的な使用条件下において、
そして分析に要する時間とは比較にならない
ほど長時間にわたつてこの微粒子懸濁液が安
定であることがわかる。 (2) 定量の標準化 (2‐1) 免疫微粒子の濃度を7μｇに固定する
と、標準血清の希釈液を用いて得られる標
準領域から、極めて広範囲の濃度のHBS抗
原が特異的比濁信号によつて定量すること
ができることがわかる。なぜなら、この範
囲は約0.15nｇ／mlから約80nｇ／mlにわた
るからである。この標準曲線は第１図に示
されている。第１図は、HBS抗原の濃度
（ｎｇ／ml）を軸に、散乱光強度（任意単
位）を縦軸にとつたものである。 この特徴は、実務上極めて貴重な意味を
持つ。なぜなら、ユーザーは、使用可能な
標準範囲内での測定値を得るために未知の
試料の多数の希釈液をつくる必要がなくな
るからである。 (2‐2) 免疫微粒子の濃度を1.4nｇ／mlに下げ
ると、同様な標準曲線から、限界感度を
0.1nｇ／ml又はそれ未満の抗原濃度にまで
容易に下げ得ることがわかる。この標準曲
線は第２図に示されている。第２図におい
て、HBS抗原の濃度（ｎｇ／ml）は横軸
に、散乱光の強度（任意単位）は縦軸にプ
ロツトされている。この結果は極めて重要
である。なぜなら、完成された方法による
と、放射性物質を扱う不利益を伴うことな
く、限界感度を少なくとも現在利用可能な
放射免疫分析の最高感度にまで達せしめる
ことができることがわかつたからである。 (3) 特異性のチエツク （２−１）と同じ条件下で抗原溶液を終濃
度70μｇ／mlの遊離の抗体（免疫微粒子に結
合していない）と24時間インキユベートする
と、ブランクから識別可能な信号が現われな
い。このことは、特異的抗体は免疫微粒子に
結合されなければたとえ高濃度であつても特
異的な比濁信号を発生させることができない
ことを示している。 この同じ容器内に特異的免疫微粒子を加え
ても、特異的信号は現われない。このこと
は、存在する抗原は第１段階において過剰の
遊離抗体によつて完全に中和され、このため
第２段階において免疫微粒子の特異的凝集を
もはや引き起こすことができなくなつたこと
を示している。この結果は、HBS抗原の認識
に関し、用いた免疫微粒子の特異性を示して
いる。 (4) 未知血清の定量 (4‐1) この発明の試薬を、未知強度の血清中
のHBS抗原の定量に用いた際に高度の柔軟
性を与える能力を実際的に評価するため
に、病院から得たヒト血清を用いた。この
血清を公比２の等比数列的に逓減希釈して
14種の希釈液をつくり、全ての希釈液の一
部を（２−１）で記載した条件下で免疫微
粒子と反応させた。第３図の曲線から、機
器の適当な感度領域を選択すれば、血清の
非常に高倍率希釈に至るまでの全ての希釈
液について特異的比濁信号を容易に測定し
得ることがわかる。なぜなら、信号は10万
倍の希釈液でさえ有意であるからである。
この結果から、実務上は、その中の１つの
濃度が1μｇ／mlないし10μｇ／mlとなる最
大５つの希釈液を用いて、未知の血清を１
時間以内の単一工程で定量することができ
ることがわかる。 第３図では、血清の希釈率が横軸に、任
意単位の光強度が縦軸にプロツトされてい
る。測定は免疫微粒子の濃度を７mg／mlと
し、機器の３つの異なる感度を採用して行
なつた。 (4‐2) 実際に用いた血清は、測定範囲内に最
もよく入る希釈液について得られた信号を
第１図の標準曲線と比較することにより、
１ml当り平均5.9mgのHBS抗原を含んでい
ることがわかつた。異なる希釈液を用いて
６回測定したところ、最もかけ離れた値は
3.3mg／ml及び6.4mg／mlであつた。この精
度は、この種の分析においては優れたもの
である。 (5) 結果の再現性 上述したのと同様の条件下で、互いに独立
しているが同一の組成を有する試料を、２つ
の異なる希釈率において、対応する感度範囲
内においてそれぞれ10個ずつ測定した。得ら
れた値を統計学的に分析したところ次の結果
が得られた。
【表】
これらの結果から、定量すべき抗原による
特異的免疫微粒子の凝集反応を包含する、分
析の優れた再現性が確保されることがわか
る。 これらの種々の試験は、この発明の試薬及
び方法を用いた、HBS抗原の特徴及び利点を
示している。特に、これらは次のことを示し
ている。 (イ) 検出閾値が少なくとも現在利用可能な最
良の定量方法のそれと同程度（１ml当り抗
原0.1nｇのオーダー）に低いという、極め
て高い定量感度 (ロ) 定量される抗原に対して厳密に特異的な
単一クローン抗体を選択することによつて
得られる高い特異性 (ハ) 所望によりマニユアル又は完全に自動的
に行なうことができる、２、３回のマイク
ロピペツテイングに操作が限定されるとい
う、定量の容易さ (ニ) ４℃において何カ月（おそらく何年）も
保存できるという、極めて高い試薬の性能
補有能力 (ホ) 高度の技術を有する人員を要せず、極め
て微量の試薬（用いる機器に応じて１回当
り2.3μｇないし2.30μｇの免疫微粒子）を
消費するにすぎないという、定量の安価さ (ヘ) 研究室で汎用されている全ての市販のレ
ーザー比濁計に、全体の性能特性を有意に
損失させることなく定量方法を適合させる
可能性 (ホ) 抗原抗体反応に要する時間が最良の場合
でも１時間以下という、分析操作の短い反
応時間 (ヘ) 方法の多能さ。実際、記載した実施例
は、特異的抗体を有する免疫微粒子の凝集
によつて抗原を直接的に定量するもののみ
である。全く同様な原理に従つて、微粒子
に精製抗原を結合することも可能である。
この場合、抗原を担つた微粒子を一定量測
定容器に入れ、比濁信号を発する特異的凝
集を確保するために、また一定量の抗体を
これに加える。得られた系に分析すべき血
清（又は標準血清）を適当に希釈した形態
にある遊離の抗原を加えると、ベース信号
が測定可能に阻害される。従つて、阻害に
よる定量が可能になる。 この発明を実施するために市販される試薬キツ
トは次のものを含む。 (a) 抗原の直接的定量のために 抗原を認識する能力を保有する多クローン性
又は１若しくは２以上の単一クローン性免疫グ
ロブリンの全体又は分画である、特異的抗HBS
抗体を担つた免疫微粒子の形態にある特異的試
薬。この試薬は、適当な場合には使用前に希釈
される溶液として提供され得る。あるいは、使
用前に、ユーザーに指示し又はキツト中に含ま
れる溶媒中で再生される凍結乾燥状態として提
供され得る。これらの製剤に保存料や安定剤の
ような添加物を含ませることも可能である。 (b) 阻害による抗原定量のために ２種の特異的試薬、すなわち、 (イ) 特異的抗原を担い、上の(a)における特異的
免疫微粒子について記載したのと同様な状態
で提供される微粒子、及び (ロ) 特異的抗原を認識し、特異的抗原を担つた
微粒子を凝集させる能力を有する、全抗HBS
抗血清又は精製若しくは未精製の特異的多ク
ローン性若しくは単一クローン性抗HBS免疫
グロブリンの全体若しくは分画を含む適当な
製剤のような、凝集を起こさせることができ
る試薬。この試薬は、適当な場合には使用前
に希釈される、緩衝又は非緩衝溶液として提
供され得る。あるいは、使用前に、ユーザー
に指示し又はキツト中に含まれる溶媒中で再
生される凍結乾燥状態として提供され得る。
これらの製剤に保存料や安定剤のような添加
物を含ませることも可能である。 さらに、どちらの定量方法を採用する場合で
も、キツトは次の共通の試薬を含む。 (a) 希釈剤 (b) HBS抗原の標準製剤 (c) 正常な定量範囲の大きさに対応した、低、
中、高濃度の対照血清のような対照製剤 (d) HBS抗原を含まないことが保証された陰性対
照血清 これらの共通試薬は、適当な場合には使用前に
希釈される、緩衝又は非緩衝溶液として提供され
得る。あるいは、使用前に、ユーザーに指示し又
はキツト中に含まれる溶媒中で再生される凍結乾
燥状態として提供され得る。これらの製剤に保存
料、安定剤、界面活性剤、分散剤のような添加物
を含ませることができる。これらの添加剤は、適
当な場合には、高分子（特にタンパク質）であり
得る。
特異的免疫微粒子の凝集反応を包含する、分
析の優れた再現性が確保されることがわか
る。 これらの種々の試験は、この発明の試薬及
び方法を用いた、HBS抗原の特徴及び利点を
示している。特に、これらは次のことを示し
ている。 (イ) 検出閾値が少なくとも現在利用可能な最
良の定量方法のそれと同程度（１ml当り抗
原0.1nｇのオーダー）に低いという、極め
て高い定量感度 (ロ) 定量される抗原に対して厳密に特異的な
単一クローン抗体を選択することによつて
得られる高い特異性 (ハ) 所望によりマニユアル又は完全に自動的
に行なうことができる、２、３回のマイク
ロピペツテイングに操作が限定されるとい
う、定量の容易さ (ニ) ４℃において何カ月（おそらく何年）も
保存できるという、極めて高い試薬の性能
補有能力 (ホ) 高度の技術を有する人員を要せず、極め
て微量の試薬（用いる機器に応じて１回当
り2.3μｇないし2.30μｇの免疫微粒子）を
消費するにすぎないという、定量の安価さ (ヘ) 研究室で汎用されている全ての市販のレ
ーザー比濁計に、全体の性能特性を有意に
損失させることなく定量方法を適合させる
可能性 (ホ) 抗原抗体反応に要する時間が最良の場合
でも１時間以下という、分析操作の短い反
応時間 (ヘ) 方法の多能さ。実際、記載した実施例
は、特異的抗体を有する免疫微粒子の凝集
によつて抗原を直接的に定量するもののみ
である。全く同様な原理に従つて、微粒子
に精製抗原を結合することも可能である。
この場合、抗原を担つた微粒子を一定量測
定容器に入れ、比濁信号を発する特異的凝
集を確保するために、また一定量の抗体を
これに加える。得られた系に分析すべき血
清（又は標準血清）を適当に希釈した形態
にある遊離の抗原を加えると、ベース信号
が測定可能に阻害される。従つて、阻害に
よる定量が可能になる。 この発明を実施するために市販される試薬キツ
トは次のものを含む。 (a) 抗原の直接的定量のために 抗原を認識する能力を保有する多クローン性
又は１若しくは２以上の単一クローン性免疫グ
ロブリンの全体又は分画である、特異的抗HBS
抗体を担つた免疫微粒子の形態にある特異的試
薬。この試薬は、適当な場合には使用前に希釈
される溶液として提供され得る。あるいは、使
用前に、ユーザーに指示し又はキツト中に含ま
れる溶媒中で再生される凍結乾燥状態として提
供され得る。これらの製剤に保存料や安定剤の
ような添加物を含ませることも可能である。 (b) 阻害による抗原定量のために ２種の特異的試薬、すなわち、 (イ) 特異的抗原を担い、上の(a)における特異的
免疫微粒子について記載したのと同様な状態
で提供される微粒子、及び (ロ) 特異的抗原を認識し、特異的抗原を担つた
微粒子を凝集させる能力を有する、全抗HBS
抗血清又は精製若しくは未精製の特異的多ク
ローン性若しくは単一クローン性抗HBS免疫
グロブリンの全体若しくは分画を含む適当な
製剤のような、凝集を起こさせることができ
る試薬。この試薬は、適当な場合には使用前
に希釈される、緩衝又は非緩衝溶液として提
供され得る。あるいは、使用前に、ユーザー
に指示し又はキツト中に含まれる溶媒中で再
生される凍結乾燥状態として提供され得る。
これらの製剤に保存料や安定剤のような添加
物を含ませることも可能である。 さらに、どちらの定量方法を採用する場合で
も、キツトは次の共通の試薬を含む。 (a) 希釈剤 (b) HBS抗原の標準製剤 (c) 正常な定量範囲の大きさに対応した、低、
中、高濃度の対照血清のような対照製剤 (d) HBS抗原を含まないことが保証された陰性対
照血清 これらの共通試薬は、適当な場合には使用前に
希釈される、緩衝又は非緩衝溶液として提供され
得る。あるいは、使用前に、ユーザーに指示し又
はキツト中に含まれる溶媒中で再生される凍結乾
燥状態として提供され得る。これらの製剤に保存
料、安定剤、界面活性剤、分散剤のような添加物
を含ませることができる。これらの添加剤は、適
当な場合には、高分子（特にタンパク質）であり
得る。
第１図ないし第３図は、この発明の方法による
免疫分析の試験結果を示す。
免疫分析の試験結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ HBS抗原を、平均粒径が10nｍないし10μｍ
であり、かつ均一な大きさの抗体保持多官能性親
水性球状粒子と接触させることによつてHBS抗原
を比濁定量する方法であつて、該粒子が、本質的
に (イ) 一般式 （ただし、R1は水素又は炭素数１ないし４の
アルキル基を表わす） で表わされるアクリル系アルデヒドを起源とす
る共重合単位の５ないし95重量％、 (ロ) 一般式 （ただし、R2は水素又は炭素数１ないし４の
アルキル基、R3は低級ヒドロキシアルキル基
を表わす） で表わされるアクリル酸誘導体を起源とする共
重合単位の５ないし95重量％、 (ハ) 一般式 （ただし、R2は上述の意味を表わす） 又は、一般式 （ただし、R2は上述の意味、R4、R5、R6は同
一又は異なる炭素数１ないし４のアルキル基を
表わす） で表わされるアクリル酸誘導体を起源とする共
重合単位の15重量％未満、及び (ニ) 非共役ジエンである架橋剤を起源とする単位
の0.1ないし10重量％、 を重合して得られる共重合体からなり、かつ該
微粒子が、 (a) 精製HBS抗原で免疫した動物より得られる
特異的抗血清から分離された多クローン抗
体、及び (b) HBS抗原で免疫した動物のプラズマ細胞と
ミエローマ細胞との融合によつて得られる融
合細胞から分離された単一クローン抗体、 からなる群より選ばれる抗体と係合している
HBS抗原の比濁定量方法。 ２ 生物学的流体中のHBSの比濁定量を行なう特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記微粒子が、前記抗体と結合した後、遊離
のアルデヒド基をブロツクするために過剰の第１
アミンでさらに処理されている特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ４ 生物学的流体中のHBSの比濁定量を行なう特
許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 前記微粒子が、前記抗体と結合した後、金属
水素化物で処理することによつて還元されている
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 生物学的流体中のHBSの比濁定量を行なう特
許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 共重合体(イ)及び(ロ)、及び架橋剤の量が、それ
ぞれ40ないし60重量％、40ないし70重量％、及び
0.5ないし５重量％である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ８ 架橋剤がＮ，N′メチレン−ビス−アクリル
アミドである特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 抗原を抗体もしくは抗体断片と接触させるこ
とにより抗原の比濁分析を行なうための試薬キツ
トであつて、平均粒径が約10nｍないし10μｍで
あり、かつ均一な大きさの、抗体もしくは抗体断
片を有する多官能性親水性球状微粒子を具備し、 該多官能性親水性球状微粒子が、本質的に、 (イ) 一般式 （ただし、R1は水素又は炭素数１ないし４の
アルキル基を表わす） で表わされるアクリル系アルデヒドを起源とす
る共重合単位の５ないし95重量％、 (ロ) 一般式 （ただし、R2は水素又は炭素数１ないし４の
アルキル基、R3は低級ヒドロキシアルキル基
を表わす） で表わされるアクリル酸誘導体を起源とする共
重合単位の５ないし95重量％、 (ハ) 一般式 （ただし、R2は上述の意味を表わす） 又は、一般式 （ただし、R2は上述の意味、R4、R5、R6は同
一又は異なる炭素数１ないし４のアルキル基を
表わす） で表わされるアクリル酸誘導体を起源とする共
重合単位の15重量％未満、及び (ニ) 非共役ジエンである架橋剤を起源とする単位
の0.1ないし10重量％、 を重合して得られる共重合体からなり、および 該多官能性親水性球状微粒子が、抗体または
特定の抗原を認識する能力を有する抗体の断片
であり、かつ (a) 精製HBS抗原で免疫した動物より得られる
特異的抗血清から分離された多クローン抗
体、及び (b) HBS抗原で免疫した動物のプラズマ細胞と
ミエローマ細胞との融合によつて得られる融
合細胞から分離された単一クローン抗体 からなる群より選ばれる抗体または抗体断片と
結合している試薬。 １０ 抗原がHBS抗原である特許請求の範囲第９
項記載の試薬。 １１ １ｍ１当り抗原0.1nｇオーダーの感度を有
する特許請求の範囲第９項記載の試薬。 １２ 抗原がHBS抗原である特許請求の範囲第１
１項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8214170 | 1982-08-16 | ||
| FR8214170A FR2531718B1 (fr) | 1982-08-16 | 1982-08-16 | Reactif permettant un dosage de tres haute sensibilite de l'antigene caracteristique du virus de l'hepatite b dans les liquides biologiques humains |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4126369A Division JPH0613582B2 (ja) | 1982-08-16 | 1992-05-19 | 多官能性親水性球状微粒子、その製造方法及びその使用方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59108009A JPS59108009A (ja) | 1984-06-22 |
| JPH0527064B2 true JPH0527064B2 (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=9276892
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58149514A Granted JPS59108009A (ja) | 1982-08-16 | 1983-08-16 | ＨＢｓ抗原の比濁定量方法及びこの方法に用いられる試薬 |
| JP4126369A Expired - Lifetime JPH0613582B2 (ja) | 1982-08-16 | 1992-05-19 | 多官能性親水性球状微粒子、その製造方法及びその使用方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4126369A Expired - Lifetime JPH0613582B2 (ja) | 1982-08-16 | 1992-05-19 | 多官能性親水性球状微粒子、その製造方法及びその使用方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4690906A (ja) |
| EP (1) | EP0104101B1 (ja) |
| JP (2) | JPS59108009A (ja) |
| KR (1) | KR920000193B1 (ja) |
| AT (1) | ATE25527T1 (ja) |
| CA (1) | CA1228446A (ja) |
| DE (1) | DE3369853D1 (ja) |
| FR (1) | FR2531718B1 (ja) |
| GR (1) | GR79632B (ja) |
| IL (1) | IL69393A (ja) |
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| GB8526355D0 (en) * | 1985-10-25 | 1985-11-27 | Alta Diagnostic Machines Ltd | Determination of antibody content of blood |
| US5183766A (en) * | 1986-04-18 | 1993-02-02 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Dispersion polymers, processes for their preparation and their use |
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| US5981719A (en) * | 1993-03-09 | 1999-11-09 | Epic Therapeutics, Inc. | Macromolecular microparticles and methods of production and use |
| US6316185B1 (en) * | 1999-09-29 | 2001-11-13 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Quantitation of viruses by light scattering |
| WO2018023066A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Diazyme Laboratories, Inc. | Methods and compositions for assaying vitamin d |
| CN110907639A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-24 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法 |
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| US3957741A (en) * | 1974-01-17 | 1976-05-18 | California Institute Of Technology | Crosslinked, porous, polyacrylate beads |
| DE2404742A1 (de) * | 1974-02-01 | 1975-08-07 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von copolymeren ungesaettigter aldehyde |
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