JPH01500005A - 複製型ｒｎａリポーター・システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複製型ＲＮＡリポーター・システム 本発明は、ポリ核酸及びポリペプチドを含む生体高分子のアッセイに向けられた ものであり、より詳細には、ＥＮＡ依存性ＡＮＡポリメラーゼにより触媒される 自己複製の鋳型となるＲＮＡに基くリポータ−・システムを用いるアッセイに関 するものである。

本発明の背景 非常に大量の非関連物質を背景に含むサンプル中にある特定の小量の生体高分子 を検索することが時々必要となる。い（つかの重要なケースとしては、感染した 患者の血液や他の体液中に微小量存在するウィルスや抗病原菌抗体についてのイ ムノ・アッセイとか、細胞表百に散在するレセプターについてのアッセイ、さら に、食品中に微小量存在する病原菌、体液中に小量存在する病原性原生寄生動物 、バクテリア、ウィルス、或いは、ある種の全遺伝子ＤＮＡ中の遺伝子の異常を 示す決められた配列の短い断片についての核酸プローブ・ハイブリダイゼーショ ン・アッセイなどがある。

そのようなアッセイの特異性は、サンプル中に試検されている本体（例えばウィ ルスとか、他の微生物、特別なし七ブタ−をもった細胞、異常遺伝子）が存在し ている限りにおいて、サンプル中に存在する生体高分子検体（即ち、特定の標的 生体高分子、又は、特定の標的部位、又は生体高分子の一部分）に特異的に結合 する親和性分子を用いることに依存している。親和性分子の例としては抗体を誘 導するのに用いられる抗原となっているタンパク質の標的に対する抗体、又は、 標的ＤＮＡ又はＲＮＡの標的部分と相補的な配列をもつオリが・ヌクレオチド、 又は、抗原により誘導される抗体となっている抗体の標的に対する抗原、さらに 、標的糖タンパク又は標的ポリ多糖のある特定の炭化水素部分に特異的に結合す るレクチンなどがある。

アッセイしているサンプル中に存在する生体高分子検体のいずれかと結合した親 和性分子の検出は、典型的には、リポータ−・システムの一部分として検出しう るシグナルを発生しうるリポータ−・グループを親和性分子と複合させるか、と りこませることによってなされる。

アッセイの感度は、アッセイ系における親和性分子と生体高分子検体の結合の特 異性、と、アッセイ系における親和性分子だけからシグナルを生じさせるリポー タ−・システムの特異性、さらに、アッセイ系におけるリポータ−・システムか ら生じたシグナルの強度に依存することになろう。

典型的なリポータ−・システムでは、リポータ−・グループとして螢光有機分子 や３２Ｆでラベルしたリン酸基を用いている。リポータ−・グループから直接生 じるシグナルが係わってくる、このようなタイプのリポータ−・システムによっ て達成され５る感度は、根本的には検出しうるだけの強度のシグナルを生じさせ るのに必要とするリポータ−・グループの数によって制限を受ける。従って、こ れらのグループでは、約１０５個以下の標的分子又は標的部分をアッセイして検 出することはできない。

生体高分子検体に対する非放射活性アッセイの感度は、親和性分子を連結した酵 素を用いることにより改善されてきた。例えば、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉ％ｙ ｌａｔａｄ　）　シたオリゴヌクレオチド又はＤＮＡ＠和性分子０プローブ（ｐ ｒｏｂａ）″は、酵素に連結したアビジン（ａｖｉｄｉ％）リポータ−・グルー プをビオチニル・グループと複合体を形成させ、次に、酵素によって触媒される 反応生成物を検出することにより検出される。Ｌａ％ｇａｒら、　Ｐｒｏｃ。

Ｈａｔｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７８巻、６６３３−６ ６３７ページ（１９８１）　；　Ｌａａｒｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８０巻、４０４５−４０４９ページ （１９８３）。また、酵素に連結させたアビジンをイムノ・アッセイにおけるリ ポータ−・グループとしたものに関しては、ＨｇｖｇｙとＭａ１ｍｒｏ８．米国 特許魔４．２２８，２３７を参照せよ。酵素を親和性分子と結合させ、さらにそ の酵素により触媒される反応の基質を供することにより、それぞれの酵素−親和 性分子一検体の複合体について大量の数の生成分子を蓄積させ、それ故、原則的 には、少数のリポータ−分子を直接用いることによるよりもずっと大きな感度を 得ることが可能となる。

感度の高い色素法によって容易にアッセイできるペルオキシダーゼ（ｐａｒｏｚ ｉｄα８−）やホスファターゼ（ｐｈｏａｐｈａｔａｓｍ　）などの酵素は、ｍ 素ｒｒ結合ｔ、タリホーター・グループとして広（利用されている。Ｌｇａｒｙ 　ら先に引用。

しかしながら、アビジンを連結したホスファターゼが係わってくるような酵素付 加リポータ−・システムは、根本的には、リポータ−・グループの酵素によって 触媒される反応がおこりうる速度によって、感度において制限を受けることにな る。実際の問題として、酵素触媒反応の生成物の検出しうる量とは、大体１時間 から１００時間といった適正な時間内のアッセイで生産されるものでなければな らない。実際には、酵素−付加リポータ−・システムは、ｎｐ崩壊に基く、リポ ータ−・システムより約１０倍から１００倍感度が劣る。

より感度に富み、標的生体高分子の単一分子、又は標的生体高分子断片の単一断 片の存在までが、原則として、数時間たらずのアッセイで検出しうる程度のリポ ータ−・システムが必要とされている。そのようなリポータ−・システムでは、 反応を通じて、検体分子又は断片あたり比較的短い時間内に漠大な数の生成分子 を生産するような被検体の存在が必要となってくる。

酵素によって触媒される核酸の重合反応は鋳型から、相補配列をもつ鎖を生成し 、この頌はまた関連するポリメラーゼの基質になる。こうしてくり返し反応がお こることにより、特定のヌクレオチド鎖の数が対数的に増大するのである。従っ て核酸の自己複製をリポータ−・システムの感度の向上に用いるのは、有利であ る。

核酸の重合反応を、検出し５る微量の検体の検出に利用した例が、Ｒ，に、５ａ ｉｋｉら、５ｃｉｏｎ。、２３０巻、１３５０−１３５４ページ（１９８５年） 及びヨーロッパ特許出願広報Ａ６０１６４０５４に記載されている。

５ａｉｋｉら、上述、はＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼｌとともに、ｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、と、さらに２つの合成オリゴヌクレオチ ドプライマー即ち、１つは、センス釧の３′末泡の近くの部分に相補的な配列を もつもの、そしてもう一方は検体ＤＮＡ断片のアンチ・センス鎖の３′末端の近 くの部分に相補的な配列をもつものを用いており、サンプル中の検体の量を標準 的なりＮＡプローブ・アッセイ技術で容易に検出できるレベルまで増大させるの である。５ａｉｋｉらの方法には、多数のサイクルからなるＤＮＡポリメラーゼ −触媒複製、鎖の分離、さらにプライマー・アニーリングが含まれる。検体の量 は、サイクル数に伴って対数的に増加し、少な（とも複製の開始断片の濃度が、 ポリメラーゼ分子の濃度を上回わるまでになる。５ａｔｋｉらにより記述される 方法では、少なくとも３つの合成オリゴヌクレオチドが必要であり、２つはプラ イマーで、また少なくとも１つは検体を検出するプローブである。ｇａｉｋｉら の方法における複製の各サイクルは、３ステツプからなる。従って、ｇａｉｋｉ らの方法ではＤＮＡの自己複製を利用して検体の量を増大させることにより、Ｄ ＮＡプローブ・アッセイの感度を増大させるのであるが、その一方で核酸の自己 複製を通じて、生体高分子又はその特定の断片又はその部位に対するアッセイの 感度を増大させるような、より簡便で、より一般的に応用可能な方法が依然とし て必要とされているのである。

酵素に工り触媒される、ＲＮＡ配向性の、ＲＮＡ重合は、相補鎖を迅速に生産し 、しかもプライマーを必要としないのである。ＲＮＡ鎖の数は、ＲＮＡ配向性の 、ＲＮＡ重合の反応サイクルのくり返えしにつれて対数的に増加していく。イン ・ビトロの他の重合反応と異なり、ＲＮＡ配向性のＲＮＡ重合は、サイクル間に 鎖の分離とプライマー・アニーリングを必要とすることなく、連続的に進行する 。酵素によって触媒される、ＲＮＡ配向性のＲＮＡ重合は１自動触媒複製”と呼 ばれてきた。

ＨａｒｓｎａとＳｐｉｍｇａｌｔｎａｎ、　！；ａｉａｎｃＢ　１５０巻、８８ ４−８８６ページ（１９６５年）。本発明があるまでは自動触媒複製を生体高分 子検体の簡便で、広く応用可能で高感度のリポータ−・システムに利用すること ができることは考えられていなかった。

Ｍｉａｌ−ら、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１７１巻、２８１−２９５ページ（ １９８３年）では、デカアデニル酸部分を、突然変異中間変種−Ｉ　ＲＮＡの、 バクテリオファージＱβのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（＠レプリカーゼ″ ）の機能には必須ではない位置への挿入を記述しており、さらに、組み換え中間 変種−Ｉ　ＲＮＡが、レプリカーゼによる複製の鋳型として活性でありつづける ことを報告している。Ｋｒａｔｎａｒら、米国特許出願４６１４．３５０（１９ ８４年５月２５日整理）も参照せよ、これはここで参考文献に含まれている。Ｋ ｒａｍ−ｒらの出願は、中間変種及び同類のＲＮＡに基く、Ｑβレプリカーゼ活 性による複製のための組み換えＲＮＡ鋳型と、さらに、そのような鋳型の、核酸 ハイブリダイゼーション・プローブとしての利用について記述している。Ｍｉｍ ｌらの報文も、Ｋｒａｍａｒらの特許出願も、ともに、生体高分子検体のアッセ イのリポータ−・システムの基礎としての複製型ＲＮＡ及びこれに関連し九ＲＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼの利用について示唆していない。さらに、報文と特 許出願のどちらも、標的核酸断片のプローブとして用いらｒ５る組み換え複製型 ＲＮＡが、標的とのハイブリダイゼーションにつづいて複製され、プローブを用 いたアッセイの感度を増大させることについては示唆していない。

本発明の要約 本発明は、ある種のＲＮＡのイン・ビトロでの自動触媒複製が、生体高分子検体 のアッセイの高感度のリポータ−・システムとして利用可能である、という我々 の発見に基いている。

従って、本発明は、特定の生体高分子検体を検出するアッセイで、感度を高度に 増強させたリポータ−・システムに関係している。このリポータ−・システムは 、バクテリオ・ファージＱβのＲＮＡポリメラーゼによるイン、ビトロでの複製 が可能な、中間変種−Ｉ　ＲＮＡ及びその突然変異体を含む、ＲＮＡ配向性のＲ ＮＡポリメラーゼによるイン・ビトロでの複製が可能なＲＮＡの、迅速な、対数 的な、酵素触媒による複製に基いている。

本発明のリポータ−・システムは、そのような複製型ＥＮＡを親和性分子に加え 、これがアッセイ中の生体高分子検体と特異的に結合することに係わっている。

もし検体がポリヌクレオチドの断片である場合には、複製型ＲＮＡは、それによ って検体断片とハイブリダイゼーションがおこるような検体断片と相補的な配列 をもつ、ＤＮＡまたはＲＮＡで、断片を含むポリヌクレオチドあるいは、オリゴ ヌクレオチド親和性分子と、連結させることができる。もし検体が、例えば、ウ ィルスの外被タンパクとか、培養中の細胞の溶解に際して放出される興味あるタ ンパクなどのタンパク質である場合には、ＲＮＡはアッセイ・システム中の検体 タンパクと特異的に結合する抗体親和性分子と連結させることができる。もし検 体が、炭化水素残基を含む糖タンパクとか、ポリ多糖のような分子である場合、 複製型ＲＮＡは、炭化水素残基と特異的に結合するレクチン親和性分子と連結さ せることができる。

複製型ＲＮＡは、親和性分子がアッセイ・システム中に存在するいずれかの生体 高分子検体と複合体をっ（る前に、又はつくった後でも、親和性分子と結合させ ることができる。

なぜならば、複製型ＲＮＡが親和性分子と結合した後で、検体に結合した親和性 分子を検出するためには、このＥＮＡの複製が必要となるからである。ここでα ）ＲＮＡは、結合している間でも、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより複製 されることができるような様式で親和性分子と結合しているか、あるいは、ｂ） ＲＮＡは、分離したＲＮＡがＥＮＡ依存性ポリメラーゼによって複製されること ができるような形で、親和性分子から分離できるよ５な様式をとって親和性分子 と結合しているのである。

親和性分子に結合した複製型ＲＮＡから複製されたＲＮＡ、即ち、今度はアッセ イ・システム中の検体に結合しているＲＮＡの検出は、数多くの既知の技術のい ずれかを用いて行うことができる。例えば、ＲＮＡの複製は、放射活性で標識し たりボスクレオすド−５′−三リン酸を用いて行なうことができ、次に複製の結 果生じた放射活性をもつＲＮＡを検出するのである。別の方法としテ、ビオチニ ル化したりボスクレオすド−５′−三リン酸を複製過程の基質として用いること ができ、さらに、その結果生じたビオチニル化し九ＲＮＡは、例えばＬｍａｒｙ ら（先に引用）により開示されるよ５に、酵素−アビジン付加物を利用して検出 することができる。また、複製されたＲＮＡは紫外線吸収や又は染色により、直 接に検出することができる。

本発明の詳細な記述 一面からみて本発明はサンプル中の検体の存在を決定する方法であり、これは、 １）親和性分子と検体の間で結合がおこるような条件下で、サンプルを上述の検 体親和性分子にさらし、ｉ）もし上述の親和性分子、それ自体が、複製型ＡＮＡ ではない場合、ステップ１）の前又は後で、複製型ＲＮＡを、ステップＩ）で用 いた親和性分子に結合させ、１ｉｉ）　ＲＮ　Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用 いて、検体に結合した親和性分子に結合している、又は、した複製型ＲＮＡある いは、検体に結合している親和性分子である複製型ＲＮ　、４の複製を触媒させ る、そしてｉｖ）　ステップ１１１）の反応で生成したＲＮＡを検出する、以上 ステップから構成される。

他の側面からみると、本発明は親和性分子−複製型ＲＮＡ混成分子、即ち、複製 型ＲＮＡに結合した親和性分子を伴っている。親和性分子は複製型ＲＮＡに、Ｒ ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる複製型ＲＮＡの複製をおこさせなくするこ とがないように、複製型ＡＮＡに共有結合した第１の連結部分を介して、さらに 、親和性分子とその検体との特異的な結合を妨げないように複製型ＲＮＡに結合 した第２の連結部分を介して、結合させることができるのである。また、ここで 述べた第１と第２の連結部分は、お互いに共有結合しており、特異的な結合対を 形成しているかあるいは、通常の第３の連結部分とも特異的な結合対を同時に形 成しているのである。

本発明はまた、′スマートプローブ（ｓｍａｒｔ　ｐｒｏｂｅ　）”を必然的に 伴っており、即ち、これは、核酸である親和性分子が複製型ＲＮＡに結合してい て、さらに、親和性分子が、その検体と結合していない場合には、複製型ＲＮＡ がＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる複製の鋳型として不活性であるように 、複製型ＲＮＡ部分と結合している化合物である。

本発明はさらに、塩基対を介して、複製型ＲＮＡに非共有的に結合している親和 性分子を必然的に伴っている。

さらにまた−面からみると、本発明はＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼによる 複製型ＲＮＡの複製を妨げることなく、連結部分に結合した複製型ＲＮＡに係わ っており、ここでいう連結部分とはこれにより、他の連結部分対に結合した複製 型ＡＮＡと親和性分子との間の連結が特異的な結合対として、連結部分の共有的 な結合により、あるいは、連結部分の相互作用により生じる、１対の連結部分の ことである。

本発明に従う、一対の連結部分の１つに結合した、そのような複製型ＲＮＡは、 検体との結合の特異性を失わないように他の連結部分対に結合したいがなる親和 性分子に対しても、普遍的なリポータ−・グループである。

０検体”とは、サンプル中でのその存在や濃度量をアッセイで決定される物質の ことを意味する。検体は時には、アッセイの標的物質、あるいは標的断片のこと をさしている。本発明に従うアッセイでは、検体とは通常、生体高分子あるいは 生体高分子の断片のことである。検体には、例えば糖タンパク、リポタンパク、 酵素、ホルモン、レセプター、さらに抗原、抗体などのタンパク質や、核酸（Ｄ ＮＡ、ＲＮＡ）、核酸の断片、そしてポリ多糖などを含んでいる。

本発明のアッセイでは検体は、もしそれが存在していれば、あるいは存在してい さえすれば、サンプル中に存在する生物本体に関連していることもしばしばであ る。

そのような生物本体には、ウィロイド（検体は核酸又はその断片である）；ウィ ルス（検体は例えばウィルス外被タンパク、ウィルス・ゲノム、ウィルス・ゲノ ムの断片、あるいはウィルスに対する抗体などである）；他の微生物（検体は例 えば、微生物のゲノムの断片又は、ＲＮＡ、微生物により生産される毒素、微生 物に遺伝子工学を施したときに生産される異糧タンパクなどである）（原生動物 寄生虫に関しては、Ｌｉｔａｄｉ　Ｎｏｇｓｔａｒａ。

ヨーロッパ特許出願公報４０１３５１０８を参照のこと）；がん細胞のような異 常細胞（検体は例えば異常細胞の細胞表面抗原である）；あるいは、異常遺伝子 （検体は例えば、遺伝子異常をおこす変調塩基を含む遺伝子断片とか、異常遺伝 子から転写された結果生じる変調塩基を含むメツセンジャーＲＮＡ断片とか、又 は、異常遺伝子が発現して生じた異常タンパクである）、以上が含まれる。

検体はまた、例えば、ホルモンのような特定のタンパクでもありえ、その血清中 や体液中の存在や濃度をアッセイで決定することになる。必然的に２つの抗体を 使うことになるイムノ・アッセイの場合、検体は、（サンドイッチアッセイの場 合には）第一の抗体に結合した抗原であり、又は、（イムノソルベントアッセイ の場合には）抗原に結合した第一の抗体になるであろ５゜多（の他のタイプの検 体が技術に精通した者にとっては明らかであろう。

検体の記述から、本発明はイムノ・アッセイや核酸プローブ・ハイブリダイゼー ション・アッセイに用いる応用も含んだ広い応用の可能性がある。こうして、他 の応用の中でも、本発明は植物や、人間を含む動物の病気の診断に有用であり、 さらに食物や血液、組織培養のような試料の汚染の検査に有用である。

検体に対する１親和性分子”とは、検討に親和性をもつ物質（あるいは、異った 名前をつげると、特異的に結合する物質）の分子のことである。特定の検体に特 異的に結合する物質や、それらの調製方法は、本技術分野においてよ（知られて いるところである。

抗原検体（それ自体抗体であるかもしれぬ）に対しては、モノクローナル抗体を 含む抗体が、特異的結合物質として利用可能である。唯一つの抗体を含むサンプ ル中のある種の抗体検体に対しては、ブドウ球菌プロティンＡのような抗体結合 タンパクを特異的結合物質として用いることができる。

核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ　）あるいはその断片の検体については、検体の断片と 相補的な配列の部分を含む、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（双方と も、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を特異的結合物質として用いることができる。そうした 親和性分子は自動合成技術を含むイン・ビボ（ｉｎ　ｖｔｖｏ　）又はイン・ビ トロ（住り一を二〇）の多くの既知の方法のいずれかにより合成することができ る。技術分野において理解されているように、ＤＮＡ又はＲＮＡ親和性分子が、 アッセイにおける前もって決定された特異性を発揮するために持たなければなら ない長さは、部分的には、アッセイしているサンプル中の核酸の量や複雑さに依 存している。そのような親和性分子は通常、少なくとも１０ヌクレオチドを必要 とする。１つの糖タンパク又は一連の糖タンパク、あるいは、１つのポリ多糖又 は一連のポリ多糖のような、レクチンに、特異的に結合する炭化水素部分をもつ ことによりサンプル中の他の物質と区別される検体については、適当な特異的結 合物質はレクチンである。

ホルモンの検体については、ホルモンのレセプターを特異的結合物質として用い ることができる。逆に、ホルモンのレセプターが検体のときは、ホルモンを特異 的結合物質として用いることができる。

酵素の検体については、酵素の阻害物質を特異的結合物質として用いることがで きる。検体が酵素の阻害物質のときは、酵素を特異的結合物質として用いること ができる。

通常、検体分子と検体分子に対する親和性分子は、特異的結合対として、即ち、 これらの相互作用は非共有結合（例えば塩橋、水素結合、疎水的相互作用）のみ を介しているものとして関係している。

熟練者は、サンプル中の親和性分子と、存在するかもしれぬ検体との間の結合が おこる条件を容ＡＫ決定することができる。詳細には、熟練者は技術分野におい て１特異的結合”と考えられている、親和性分子と検体との間の結合を生じさせ ることができる条件を容易に決定することができる。技術分野において理解され ているように、そのような特異性は通常親和性分子がサンプル中の他の物質と構 成物（例えば器壁や固体担体）よりも、検体に対してより高い特異性を示すこと による。

本発明のアッセイ方法を実行するサンプルは、血清や、他の体液、又は組織培養 培地や食料品のような生体物質の生のままの標本であることもありえる。より典 型的には、本方法は、生の標本を親和性分子の非特異的結合を生じさせるなどし て、検体の検出を妨げるような物質を取り除く各種の処理を施すことにより得ら れた、加工した標本のサンプルについて実施される。生の標本を加工して、本発 明のアッセイ方法により適したサンプルを得るための方法は、技術分野において よく知られている。

こうして、本方法は、Ｇｒｓ％５ｔａｉｎとＨｏｇ％ｍｓ、Ｆｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓａｉ、　（Ｕ、　Ｓ　、　Ａ、）　７２巻、　３ ９６１−３９６５ページ（１９７５年）（例えばＦａＬｋｏｗとＭｏ５ａｌｅｙ ｒ米国特許／％４，３５８，５３５　；及び５ｈａｆｒｉｔｚ。

米国特許Ａ４，５６２，１５９なども参照せよ）のコロニーハイブリダイゼーシ ョン法や、あるいは、Ｂ＃％ｔｏ％とＤａｔｔａ、　：Ｅａｉａｎｃａ、　１９ ６巻、１８０−１８２ページ（１９７７年）のブレーク・リフト法に従って細胞 から得た核酸について実行することができる。本方法は、また、ウィロイドやウ ィルス、あるいは標本の細胞から単離され、固体担体上（計量棒（ｄｉｐａｔｉ ｃｋ）上の固体担体や、ミクロ稀釈プレート・ウェルの内壁なども含んでいる） に付着させた（Ｇｉｌｌａａｐｉ−とＳｐｉｍｇｇｌｍａｓ、　Ｊ。

Ｍｏ１．　ＥｉｏＬ、　１２巻、８２９−８４２ページ（１９６５年））核酸に ついても行うことができる。本方法はまた標本から単離され、１ドツト（ｄａｔ ）”・プロッティングＣＫａｆａｔｏｓら、Ｎｃａｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｉ’ｋｓ −７巻、１５４１−１５５２ページ（１９７９年）：Ｗｈｔｔ−とＢａ５ｃｒｏ ｆｔ。

Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈａｍ、　２５７巻、８５６９−８５７２ページ（１９８ ２年）；サザン・プロッティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。

Ｊ、Ｍｏ１．　Ｅｉｏｌ、９８巻、５０３−５１７ページ（１９７５年））；１ ７−ザン”プロッティング（Ｔｈｏｔｎａａ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　７７巻、５２０１−５ ２０５ページ（１９８０年））；さらに、エレクトロ・プロッティング（Ｓｔｍ ｌｌｗａｇとＤａｈｌｂａｒｇ：Ｎ５ｃ１．　Ａａｉ　−ｄ畠、Ｒｍｓ、８巻、 ２９９−３１７ページ（１９８０年））により固体担体上に固定された核酸につ いても行うことができる。

標本の核酸はまた、本発明を水層ハイブリダイゼーション（Ｂｒｉｔｔｍ外とＫ ｏｈｒｇ、　５ｃｉｅ％ｃｅ　１６１巻、５２７−５４０ページ（１９６８年） ）及び水／有機中間層ノ・イブリダイゼーション（Ｋｏｈｒ−ら、Ｂｉｏｃｈａ ＠１ｔｔｔｒｙ　１６巻、５３２９−５３４１ページ（１９７７年）に応用した 方法によりアッセイすることもできる。水／有機中間層ハイブリダイゼーション は大変速い速度で進行する利点があるが、ビオチンの工５な有機層に可溶性の連 結部分かり酸親和性分子に結合している場合は適していない。

本発明のアッセイ方法はまた、標本から単離され、ドツト・プロッティングや１ ウエスタン”プロッティング（例えば、実施例Ｘ■を参照せよ）、又は、ミクロ 稀釈プレート・ウェルや計量棒上の固体担体に吸着させることにより、固体担体 上に固定されたタンパクやポリ多糖についても行うことができる。

さらにまた、本発明の方法は、標本の細胞性タンパクや全細胞表面のポリ多糖（ 例えば、実施例ＸＩを参照のこと）、するいは、レプリカ・プレートのバクテリ アや簿冊のような、固体担体上に固定した微生物由来のタンパクやポリ多糖など の検出に応用できる。

親和性分子が、アッセイしているサンプル中に存在するかもしれない検体と結合 する前か、又は後に、複製型ＲＮＡは親和性分子に結合しなければならない。

１複製型ＲＮＡ”とは、イン・ビトロで自動触媒的に複製される、即ち、イン・ ビトロでＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応により複製さ れうるいかなるＡＮＡでもよい。本発明の実践に適したＲＮＡポリメラーゼ及び 複製型ＲＮＡは以下の実施例１に記述されている。

これに関連して、ここで述べるバクテリオファージＱβは、特定の変種や突然変 異体やその個体群に限定されない。そのような言及は特に制限しないならば、バ クテリオファージＱβの感染が疑われるＥ、　ｃｏｌｔの感染に際して、ＲＮＡ 依存性のＲＮＡポリメラーゼの生産を起こすいかなる変種や突然変異体やその個 体群に対してなされている。

それによる感染が疑われるバクテリアの感染に際して、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリ メラーゼ及び、それに関連した本発明に利用可能な、イン・ビトロで自動触媒的 に複製されることができる複製型ＲＮＡを生産する他のファージについては、例 えばＭ　ｉ　ｙ　ａ　ｋ−ら、Ｆｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　６８巻、２０２２−２０２４ページ（１９７１年 ）を参照せよ。

複製型ＲＮＡは多くの異なる方法により親和性分子に結合させることができるが 、そのうちのいくつかについては実施例に記述されている。

もし、複製型ＲＮＡが、親和性分子が検体に結合する前に、親和性分子に結合す るのであれば、熟練者によく理解されているように、親和性分子の検体に対する 特異性が失われていないことが必須であり、即ち複製型ＲＮＡＫ結合した親和性 分子は、アッセイにおいて試験されている検体にいくらかの：４異性をもって結 合する能力を維持していなければならない。

もし複製型ＲＮＡが、親和性分子が検体に結合した後で親和性分子に結合するの であれば、これも熟練した者にはよ（知られているように、複製型ＲＮＡの結合 した親和性分子を、親和性分子しで結合していない複製型ＲＮＡから分離できる ことが必須である。このことは重要な問題ではない。通常の場合、検体に結合し 、さらに固体担体に結合した親和性分子について、そのような分離は単に洗浄す ることにより容易に達成される、なぜならば、複製型ＲＮＡが、結合した親和性 分子に結合することは。

親和性分子と固体担体との関係を大きくこわしてしまうことがないからである。

もし通常のケースが得られない場合には、そのような分離は、よく知られたクロ マトグラフィーや電気泳動の技術のいずれかにより容易に達成される。

最後に、複製型ＲＮＡの親和性分子への結合は、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラ ーゼによるＲＮＡの複製能を失わせないようなものでなげればならない。即ち、 親和性分子に結合している複製型ＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに よる複製のｍ型であるか、あるいは、親和性分子から分離されて、ＲＮＡ依存性 ＲＮＡポリメラーゼによる複製の鋳型の形態をとっていることができるのである 。

複製型ＥＮＡと親和性分子との間の関係の１つのタイプは、親和性分子自体が複 製型ＲＮＡで、主に適当な配列をもった部分を含む組み換えＲＮＡであるもので ある。

そのような親和性分子は、核酸やその断片である検体にむいているであろう。親 和性分子は複製型ＲＮＡから、好ましくは、Ｍｉａｌ−ら、先に引用、及びＫｒ ａ爲ａｔら、米国特許出願番号Ａ６１４，３５０の方法により、検体の部分配列 と相補的な配列を含むように調製された組み換えＲＮＡでおろう。この相補配列 の部分は、特異性を与えるためには少なくとも、長さは１０リボヌクレオチドあ り、複製能を失わないためには長さは約４５００ヌクレオチドまでのものである 。実施例■に組み換えＲＮＡを親和性分子として用いる例が説明されている。

複製型ＲＮＡと親和性分子との間の結合は、非共有又は共有的な結合でありうる 。

親和性分子と複製型ＲＮＡ０間の非共有的な結合は、親和性分子に、複製型ＲＮ Ａ断片の相補的な配列の核酸部分が結合するかとりこまれるかして、さらに複製 型ＲＮＡが親和性分子に結合するかとりこまれた部分とノーイブリダイズするこ とにより形成されることができる。

そのような核酸断片を、タンパクの親和性分子に結合させるものについては、例 えばＤａｔｔａｇｑｔａら、ヨーロッパ特許出願広報４０１５４８８４を参照せ よ。核酸の親和性分子については、そのような断片を結合させたり、とりこませ たりする方法は、技術分野においてよく知られている。親和性分子と複製型ＥＮ Ａとの間のそのような結合を用いて、複製型ＥＮＡが複製されて検出が可能にな るような複製型ＲＮＡの検体に結合した親和性分子からの分離は、復製型ＲＮＡ 部分と親和性分子に結合した、あるいは、とりこまれた核酸部分との複合体の融 解温度以上に加熱することにより達成される。

複製型ＲＮＡと親和性分子との間の非共有的な結合は、また、複製型ＲＮＡに結 合した１番目の連結部分と、親和性分子に結合した２番目の連結部分の結合を通 じて行われ、ここでいう連結部分とは特異的な結合対をさしている。

複製型ＲＮＡと親和性分子との間の共有的な結合は、唯一つ共有的な両者の間の 結合（複合体の２次又は３次構造から生じた結合は除く）を通じて行われる。通 常、共有的な結合は複製型ＲＮＡに共有結合した１番目の連結部分と、親和性分 子に共有結合した２番目の連結部分と、さらに１番目と２番目の連結部分との間 の共有結合が係わっている。

ここで述べた複製型ＲＮＡ又は親和性分子に対する連結部分の”共有的な結合” 又は”共有的な連結”又は１共有的な接合”とは、連結部分とそれぞれの複製型 ＲＮＡ又は親和性分子との間の、２次又は３次構造から生じる結合以外のすべて の結合が、共有的なものであることを意味している。ここで述べた、連結部分の 複製型ＲＮＡ又は親和性分子へσ結合（ｊｏｉ％ｉｎｇ　）″、１連結（ｌｉｎ ｋａｇｅ）”、あるいは接合（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）”　とは１無条件に、連 結部分が”共有的に”又は１非共有的に”、それぞれ複製型ＲＮＡや親和性分子 と結合したり連結したりすることを意味している。′非共有的な″結合、又は連 結、接合とは、連結部分と（ｌ裏型ＲＮＡや親和性分子との間の、２次、３次得 造による結合以外の、少なくともいくつかの結合が非共有的なものであることを 意味している。

連結部分と復製型ＲＮＡとの間の共有的な結合で、それによってＲＮＡの複製能 が失われないもののいくつかの例として以下のものが含まれる。

（α）　連結部分は、リン酸基であり、結合は、リン酸と複製型ＲＮＡの５′− ヌクレオチドの５′−炭素との間の厘接釣なもの。複製型ＲＮＡの５′−ヌクレ オチドの５′−炭素に結合したリン酸連結部分は、通常、核酸親和性分子の３′ −ヌクレオチドの３′−炭素へのあるいは、核酸親和性分子の３′−末端に結合 していると考えられている連結部分で、さらに、その５′−ヌクレオチドの５′ −炭素におけるリン酸を介して親和性分子の３′−ヌクレオチドの３′−炭素に 共有結合している核酸断片の３′−ヌクレオチドの３′−炭素への直接の共有結 合が、係わっている。複製型ＲＮＡの５′末端ヌクレオチドは、技術分野におい て既知の方法により、５′炭素を１４ポリヌクレオチド・キナーゼでリン醸化す ることができる。実汎例Ｔも参照せよ。

親和性分子、あるいは親和性分子の伍酸連結部分は、次に、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ を用いる既知の方法により、複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−リン酸 に接紐することができる。この後者の反応は、もし、リボヌクレオチドが親和性 分子（又は親和性分子の連結部分）の３′−末端であればより効率的に進行する ；技術分野において知られているように、単一のりボヌクレオチドは末端デオキ シヌクレオチド転移酵素を用いて、ＤＮＡの３′−末端に付加させることができ るのである。

（ｂｌ　連７７８部分がビオチン又はイミノビオチン（匈ｆｆ１％ｏ−ｂｔｏｔ ｉ＊ｙｌ　）で式−ＮＨ（ＣＨｚ）　ＮＨ（ＰＯ，）Ｏ−１式ＮＨ（ＣＨｚ　） 　ｂ　ｂＳ　Ｓ　（ＣＨｚ　）　、　ｃＭＥ　（Ｆ　Ｏｘ　）　Ｏ、又は式％式 ％ サー・グループを介した１１製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に連 結したもの、ここで、それぞれ、リン酸アミド基は５′−ヌクレオチドに、そし て、アミン基はビオチン又はイミノビオチンに結合してお９．ａａは２から２０ 、ｂｂと６６は同じか又は異っておシ、それぞれ２から２０でろる。式−Ｎｆｆ （Ｃｏｔ）ａ、ＮＨ（Ｆｏｇ）Ｏ−のスペーサー・グループをもった複製型ＲＮ Ａは、　ＣｈｓとＱ　ｒ　ｇ　ｇ　ｌ　＋　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋　４巻、３２７−３ ３１ページ（１９８５年）の方法に従い合成することができる。式−ｍ（ｃｇｚ 　）　ｂ　ｂＳ’；　（ＣＨｚ　）　ｃ　ｃＮＨ（Ｐ　（ｈ　）　Ｏ−のスペー サー・グループをもったａ製型ＲＮＡは、実施例Ｉに説明されている。式％式％ サー・グループをもったｌ裏型ＲＮＡは、複製型ＲＮＡを、５′−ヌクレオチド のｓ’−伏素に結合した式−０（Ｆｏｘ　）ＮＨ（ＣＨｚ　）　ｃ　ｃＮＨｚ基 と弐ＮＨ，（ＣＨ，）　６　ｂＣＯ２Ｈのアミン・カルボン酸の活性エステルと 反応させることにより合成される。１級アミノ基をもったビオチン・アミド又は イミノビオチンアミド結合を生成させるビオチン又はイミノビオチンのＮ−ヒド ロキシスクシンイミノ・エステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｚｙｓｓｅｃｉｎｔｍｉｓｏ ）の反応は、技術分野において知られておｐ１実施例で説明されている。

ｌｃｌ　式−（ＣＨｚ）ａａ（ＮＨ）　（Ｐｏ２）Ｏ−又は−（ＣＨ２）　６　 ｂ８Ｂ　（ＣＨｚ　）ＮＨ（ＰＯ，）Ｏ−のスペーサー・グループを介して連結 したアミノ基連結部分のものでここでリン酸アミド基は、ＱＱ型ＲＮＡの５′− ヌクレオチドの５′−炭素に結合しており、ασ、　ｂｂ、及びｅｃは前述のよ うに定義される。

そのような′ｇＬ製型ＲＮＡの調製には、Ｃ五ＵとＯｒｇａｌ　＋ＤＮＡ　、４ 巻、３２７−３３１ページ、及び以下の冥施例Ｉの方法が用いられる。

（（至）式−（ＣＨｚ　）　ｃ　ｅＮＨｃＰＯｚ　）Ｏ−のスペーサー・グルー プにより結合したイオウ連結部分のもので、ここでリン酸アミド基は複製型ＲＮ Ａの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合しており、ｃｃは前述のように定義 される。芙施例■とＸでは、そのような運ＭＳ分とスペーサーグループをもった 複製型ＲＮＡの合成について説明している。

アビジ／やストレプトアビジンの遅頚部分と、複製型ＲＮＡの間の”非共有ｗ話 合の例は、アビジン又は、ストレプトアビジンがビオチン又はイミノビオチンと 複合体を（ここで述べる複合体には非共有的な相互作用のみが係わっている）形 成し、ざらに、このビオチン又はイミノビオチンが先に述べたスペーサー・グル ープの１つにより覆製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合して複 製型ＲＮＡにビオチン又はイミノビオチンを共有的に結合させたもので６ろう。

核酸の観相性分子については、連結部分との共有結合は、５′−ヌクレオチドの ５′−炭素、３′−ヌクレオチドの３′−炭素、めるいはピリミジン又はプリン 環基の各種原子を介して形成させることができる。連結部分は、検体の断片の配 列と相補的な配列をもった観相性分子の断片のそれぞれ３／−１Ｓ／−末端から 伸長する残酸断片の３′又は５′宋端のヌクレオチドである。連結部分は、例え ば、上述のスペーサー・グループの１つを介して、複製型ＲＮＡの５′−ヌクレ オチドの５′−炭素に結合するように１親和性分子の５１−ヌクレオチドの５′ −炭素に結合した、ビオチン又はイミノビオチン、あるいは、硫黄原子であろう 。ビオチン連結部分（′（！数のこともめる）は、それにより親和性分子が検体 にノ・イブリダイズする、検体の断片の配列と相補的な配列をもつ断片以外のｉ ｆｆ親和性分子の部分において、各種のスペーサー・アームを介してウラシル（ ５ｒａｃ４１　）残基（複数のこともある）の５−炭素あるいはアデニン（ａｄ ｓ％ｉｎｎ　）残基（複数のこともるる）の８−炭素又は６−炭素に結合してい ることもあろう。例えばＲ％ｔｈ、特許協会条約広報４８４１０３２８５　；　 ＢｒａｋｍＬと５ｔａｒｖｉａｎｏｐｏｓＬｏｓｓ　、ヨーロツノぐ特許出願広 報／％０１２２６１４を参照せよ。複製型ＲＮＡについては、親和性分子に適当 な物に親和性分子の検体に対する親和性を失わせないような、多くの他の連結部 分やスペーサー・グループ、さらに、そのような連結部分やスペーサー・グルー プをもった親和性分子の調製方法などが、技術分野において知られている。

抗体、抗原あるいは、レクチンの親和性分子については、多くの連結部分（例え ば、ビオチン、複製型ＲＮＡのハイブリダイゼーションに用いる核酸断片、硫黄 原子など）や、それらを、直接、又はスペーサー・グループを介して親和性分子 に共肩壓合させる適当な方法が技術分野において知られている。例えば多くのビ オチニル化された抗体やレクチンが購入可能である。

アビジン又はストレプトアビジンのような連結残基と、抗体、仇原、又はレクチ ン親和性分子との間の”非共有”和合の１つの例は、アビジン又はストレプトア ビジンがビオチンやイミノビオチンと複合体をつくっており、これが、親和性分 子に非共有的あるいは、共有的に連結したものである。例えばビオチンは、技術 分野において理解されているように、ビオチニル化した抗−抗体、又は、ビオチ ニル化したブドウ球菌プロティンＡと、抗体親和性分子の複合体を形成させるこ とにより、非共有的に抗体親和性分子に結合させることができる。

技術における補促的な情報として、タンパクや核酸に連結残基を結合させる方法 に関しては、例えばＤｒｇｙｅデとＤａｒｖａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８２巻蔦９６８−９７２−Ｆ−ジ（１９８５年 ）　；　Ｆｏｒｓｔｇｒら、Ｎ５ｃ１．Ａｅｉｄａ＊Ｒａｘ、　１３巻、７４５ −７６１ページ（１９８４年）　：　Ｗａｒｄら、ヨーロッパ特許出願広報腐０ ０６３８７９　：Ｅｎｇｌｇｈａｒｄｔら、　ヨー０７パ特許出願広報Ａ　００ ９７３７３　：　ＡｌａｇｏｎとＫｉｎｇＪｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ１９巻、４ ３４１−４３４５ページ（１９８０年）：Ｉｔｎａｔｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａ ｍ、　４５巻、２６３−２７１ページ（１９８５年）を参照せよ。

複製型ＲＮＡＶＣｆｉＳ合した１番目の連結部分と親和性分子に結合した２番目 の連結部分は、（２つの硫黄原子連結部分から形成されるジスルフィド残基や、 覆製型ＲＮＡの５１−末端のリン酸に結合したａｍ親和注分子の３′−末端から 伸長したヌクレオチドのように）相互に共有結合したり、するいは、（アとジン 又は、ストレプトアビジンに結合したとオチンやイミノビオチン、対応する抗体 に結合した仇原、又は、酵素に結合した譚素阻害剤のように）特異的な結合刈と して相互に非共有的に相互作用することにより、複製型ＲＮＡと親和性分子との 間の結合を形成する。

先に示したように、親和性分子と複製型ＲＮＡとの間の共有結合の１つの例は、 親和性分子がイン・ビトロで合成される間か、又は、末端デオキシヌクレオチド 転移酵素を用い、そして矢に、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、５′末端を介して （１つ又はそれ以上の）プリンの伸長３’−末端に複製型ＲＮＡを結合させる間 に、ＤＮＡ親和性分子の３′−末端に付加された伸長プリン残基を介して形成さ れる結合である。技術分野において理解されているように、この連結部分の３′ −末端におけるプリン・ヌクレオチドは、複製型ＲＮＡへの付加を効率よく進行 させるためには、リボヌクレオシドであるべきである。そのような親和性分子− 複製型ＲＮＡノ〜イブリッドが検体に結合した後で、もし、これがＲＮＡＮプレ カーゼの鋳型として活性でないときには、酸膜プリン反応、次にβ−説離により リン酸ジエステル結合を開裂させて、ＥＮＡｆＤＮＡから解離させることができ 、そこでＮプレカーゼの鋳型として用いることができる。

他の例には、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて、ＲＮＡ親和性分子を複製型ＲＮＡの どちらかの末端に結合させるものがある。そのよりな分子は、複製型ＲＮＡと、 検体とハイブリダイズする親和性分子の断片との間に、多少のりボヌクレオテド をもつよりに調製される。その結果得られたＲＮＡは、もし親和性分子ＲＮＡが ′Ｉｘ製型ＲＮＡの５′−末端に付刃しているのであれば、それ自体ＲＮＡＮプ レカーゼの鋳型となることができる。もし、その結果得られたＲＮＡが、Ｎプレ カーゼの鋳型とはならない場合、親和性分子部分は、複製型ＲＮＡ部分から解離 させ複製型ＲＮＡｆ：放出させる。そのよっな解裂は、初めに、複製型分子と、 検体にハイブリダイズする親和性分子部分の間の断片と相補的な配列をもつオリ ゴデオキシリボスレオテドと、分子なノ・イブリダイズさせ、（検体にハイブリ ダイズさせるか、又は検体にハイブリダイズさせた後、加熱する（又は融解する ）ことにより遊離させ）、次に、ＥＲＡがＤＮＡとノ・イブリダイズする位置テ 特異的にＲＮＡを切断するりボヌクレアーゼＨな用いて、開裂させるのでめる６ 　Ｄｏｖｔａ−ｇａｌｌｅｙ、Ｎ５ｅ１．ＡａｔｄａＲａｍ、　７巻、１７９− １９２ページ（１９７９年）を参照せよ。

本発明に従う、親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド化合物（即ち、親和性分 子が複製型ＲＮＡＫＷｓ合している化合物）の中には、１スマート・プローブ” ２する。

１スマート・プローブとは、親和性分子が核酸でろり、２誉目の連結部分が親和 性分子に共有結合しており、１番目の連結部分が複製型ＲＮＡに共有結合してい て、さらに１番目と２番目の連結部分が相互に共Ｎ１１８合している親和性分子 −複製型ＲＮＡハイブリッド分子のことでるる（即ち、２次、３次両造による顔 合を除いて、２つの連結部分の間のすべての結合は共有的である）。さらにスマ ート・プローブでは、親和性分子と２つを結合している１番目と２番目の遅煤部 分、さらにこの２つの連結部分を結合しているいかなる部分も、理想的には、も し親和性分子部分が検体にハイブリダイズしていれば、あるいは、しているとき だけハイブリッド分子の複製型ＲＮＡが、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼに より複製されるようになっているのである。要するに、このプローブはそれ目体 検体と結合して検出を可能にするから”スマート”なのである。

本発明に従ったスマートプローブの１つの具体例は、複製型ＲＮＡ部分が親和性 分子部分の３７−末端断片の配列と相補的な配列をもつ、ＦｌｌＯから３０のり ボヌクレオチドの短い断片を含む組み喚え？Ｊ１＃型ＲＮＡのものでろる。この 組み換え複製型ＲＮＡは、例えば、Ｍｉｎｉら、先に引用、及び、クラマー（Ａ ’ｒａｍｓｒ）ら１米国特許出願番号４６１４．３５０先に引用、の方法に従っ て合成する。

親和性分子部分は、典型的には＋Ｆ１７５から１５０ヌクレオチドの長さで、こ れは、複製型ＲＮＡ部分に組み換えられた部分の配列と相補的な配列をもつ部分 よりもいくぶん長く、さらにこれは、技術分野において既知の多くのインゼトロ やイン・ビボの方法のいずれかにより合成される。組み換え複製型ＲＮＡの５′ −ヌクレオチドの５′−炭素と親和性分子部分の５′−ヌクレオチドの５′−炭 素は、冥施例■及びＸの方法に従い、式−〇（ＦＯ２）ＮＨＣＣＨｚ　）　ａＳ Ｅ　（ＣＨｚ　）　ｂ　ＮＨ（Ｐ　０２　）　Ｏ−の部分によりスマート・プロ ーブ中に結合させる。ここでａとｂは同じか、または異なるものであり、それぞ れ２から２０でろる。そのようなスマート・プローブでは、親和性分子部分が何 か他のものとよ！ｌｌ安定に結合していない場合（そのような結合は、実質的に は、検体との特異的な結合か又は、非特異的な結合だけである）、親和性分子部 分の３′−末端は、組み換えＲＮＡ部分とハイブリダイズしたままになっている 。

プローブの使用ｌＣ際しては、初のにサンプルの核酸とのハイブリダイゼーショ ンを行い、次にリボヌクレアーゼＨの溶液を加えると、親和性分子部分が複製型 ＲＮＡ部分から解離していないスマート・プローブの、複製型ＲＮＡ部分の開裂 と複製能の喪失がおこる（　Ｄｏｏｎｉａ−Ｋａｌｌｇｒ　（１９７９年）、先 に引用、を参照せよ）；次に結合していないスマート・プローブを除くために短 い洗浄を行い、さらに親和性分子部分が、複製型ＲＮＡがリボヌクレアーゼＨに よる開裂を受けないように、複製型ＲＮＡから解離してしまっている、少量の非 特異的結合をおこしたスマート・プローブの霊を減する；そして最後に、ジチオ スレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒａｉｔｏｌ　）でジスルフィド結合を開裂し て、複製型ＲＮＡを親和性分子から解離させた後で、ＲＮＡを複製し、複製した ＲＮＡを検出することにより検出を行うのである。

不発明のスマート・プローブのもう１つの具体例では、標的とハイブリダイズし ていないプローブの複製型ＲＮＡを不活性化するのにリボヌクレアーゼＨによる 開裂を必要としていない。この具体例では、親和性分子部分の５′−ヌクレオテ ドの５′−炭素は、他の具体例と同様に、式％式％ り、複製型ＲＮＡ部分の５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合している。この 具体例では、どんな複製型ＡＮＡをも用いることができる。親和性分子部分に対 応する組み換え複製型ＲＮＡを調製する必要はない。しかしながらこの具体例で は、親和性分子部分は、本質的に以下の３つの部分から構成されている：即ち、 親和性分子がハイブリダイズする検体の部分配列と相補的な配列中の約５０から １５０ヌクレオチドからなる１検体−結合”部分；親和性分子の５′−ヌクレオ チドから、検体結合部分の５′−ヌクレオチドへ伸長し、（シかしこの部分を含 んではいない）、複製型ＲＮＡの部分の配列と相補的な配列中の約３０から６０ ヌクレオチドからなる″５′−クランプ（ｃｌａｓｐ）’″部分；そして、検体 −結合部分の３７−ヌクレオチド（しかし、この部分は含まない）から、親和性 分子の３７−ヌクレオチドへ伸長し、親和性分子の５′−クランプ部分がハイブ リダイズする部分よりも、さらに、複製型ＲＮＡの５′−末端に近接する複製型 ＲＮＡの部分と相補的な配列中の、約３０から６０ヌクレオチドからなる１３′ −クランプ部分である。

技術分野において知られている方法による、この具体化では随意に、親和性分子 の５′−クランプ部分及び３′−クラ７１部分とハイブリダイズする複製型ＲＮ Ａ部分の少な（ともいくつかのグアノシン塩基はイノシンで置換することができ る。この効果は、（クランプしていない）複製型ＲＮＡを複製の鋳型として活性 なものとし、さらに、これら複製型ＲＮＡ部分で、ＤＮＡ−ＲＮＡ塩基対を安定 化し、逆にＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対を不安定なものにすることである。この具体例 の親和性分子は、他の場合と同様に、既知のイン・ビトロ又はイン・ビボの方法 により合成される。複製型ＲＮＡ部分の親和性分子部分への連結は、実施例■及 びＸ　Ｋ従って行う。この具体例では、親和性分子の３′−クランプ部分と５′ −クランプ部分の双方が、複製型ＲＮＡにハイブリダイズしている間、複製型Ｒ ＮＡは非複製型に１クランプされており、複製の鋳型として不活性である。一度 、スマート・プローブが、１つ、又は、他のクランプ部分が複製型ＲＮＡから解 離するようにして親和性分子部分が十分な安定性をもって結合するような何物か と、（それは本質的に検体だけであろ５）遭遇すれば、ＲＮＡはとたんに複製可 能になり検出可能な形をとる。本発明のスマート・プローブの具体例の利用に際 して、まず初めに、サンプルの核酸とのハイブリダイゼーションを行い、次ニ、 短い洗浄を行なって結合していないスマート・プローブを除き、さらに、一方又 は両方のクランプ部分が複製型ＥＮＡから遊離している、少量の非特異的な結合 をしたスマート・プローブを減少させ、最後に、ジチオスレイトールでジスルフ ィド結合を開裂して複製型ＲＮＡを親和性分子から解離させた後、随意に、ＲＮ Ａを複製させ、複製したＲＮＡを検出することにより検出を行うのである。

検体を含まない部位に非特異的に結合した複製型ＲＮＡから生じるシグナルは、 本発明に従５スマートプローブを用いると減少してしまうので、比較的低いバッ ク・グラウンドを得るためのハイブリダイゼーションの後での長時間の洗浄の必 要性は、技術分野において現在性われている典型的な核酸プローブ・ハイブリダ イゼーション・アッセイに比べて、そのようなプローブを用いたアッセイでは小 さなものとなる。

イムノアッセイや核酸プローブ・ハイブリダイゼーション・アッセイの技術に習 熟した者には理解できることだが、９バツク・グラウンドを生じる、親和性分子 や複製型ＲＮＡの（そのＲＮＡ部分あるいは一番目の連結残基部分を介しての） 不可避的な１非特異的結合”を取り除き、ただ検体に（親和性分子に結合したり 又は結合しつづけて）連結した複製型ＥＮＡｐｌ：けがアッセイ系に存在するよ うに、必要な結合をおこさせ、洗浄のステップを行った後で、系をＲＮＡ依存性 のＲＮＡポリメラーゼを用いる複製からなるプロセスにより、複製型ＲＮＡが検 出可能になる条件にかけるのである。

現在の発明に従ってアッセイを行５上で、アッセイ中の検体に結合する又は結合 している親和性分子に結合した複製型ＲＮＡは、親和性分子に結合している間か 、あるいは、それから分離された後のどちらかにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー ゼにより複製されうることか必要である。複製型ＲＮＡを親和性分子から分離さ せる各１の方法を先に記述したがその中には、複製型ＲＮＡを親和性分子に結合 させている連結部分の中の、又は、間のジスルフィド結合を還元的に切断する方 法が含まれている。

複製型ＲＮＡをＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで複製する方法は、技術分野に おいて知られている。一般に、ＲＮＡは、４つのりボスクレオすド−５′−三リ ン酸、ＡＴＰ、ＣＴＰ％ＧＴＰ及びＵＴＰを含む適当な水系緩衝液中、単に酵素 と混合し、適当な温度でインキュベートしなければならない。例では、好まれる 酵素であるＱβレプリカーゼを用いて複製を行う条件を説明している。Ｋｒａｍ ａｒら、Ｊ、ＭｏＬ、　Ｂｉｏｌ、　８９巻、７１９−７３６ページ（１９７４ 年）　；　Ｋｒａｍａｒら米国特許出願広報屑６１４．３５０　；　Ｍｉａｌら （１９８３年）先に引用、なども参照せよ。

別法として、親和性分子から解離した複製型ＲＮＡは、ＥＣＴＥＯＬＡペーパー のような、正に荷電した担体に結合させることができる（ｇａｒｔｓら、Ｎ％ｃ １．Ａｃｔｄａ　Ｒａｇ。

１０巻、４８３１−４８４３ページ（１９８２年））。

複製型ＲＮＡの結合したそのような担体は、適当な緩衝液ヲ用いて４つのりボス クレオすド−５′−三リン酸とともに適当な温度のもと、ＲＮＡＮプレカーゼ（ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）の溶液に懸濁させると（即ち液相の複製に用 いたのと本質的に同じ条件である）、すると担体に結合したＲＮＡの複製が起き るのである。

５ａｒｉａら（１９８２年）上述；及びＢｒｇｓｓｇｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）　８０巻、６５２３−６５２７ ページ（１９８３年）を参照せよ。簡便なＲＮＡの検出では、複製型ＲＮＡは正 に荷電した担体に結合したままである。

複製型ＡＮＡは多くの異なる方法により検出することができる。

検出は、例えば、接触光プリンティング法（Ｋｓｔａｔａ−１ａｄｔａら、Ａｘ ｃＬｌ　、　Ｂｉｏｃｈｇｍ、　１００巻、１２９−１３５ページ（１９７９年 ））のように複製型ＲＮＡの紫外線吸収により行うことができる。

複製されたＲＮＡが放射活性をもつように、複製反応中、放射活性で標識した（ 例えば、３Ｈラベルとか、α−３２ｐ　Ｑ　４−ラベルなど）リボヌクレオシド −５′−三リン酸を用いることにより、複製されたＲＮＡをその放射活性圧より 多くの既知の方法のいずれかを用いて検出することができる。

ビオチン又はイミノビオチンは複製型ＥＲＡにとりこませることができる、これ はさらに既知の技術を用いて、ＲＮＡの結合したビオチ／に結合し、簡単に検出 することのできる色素の生産を触媒する、酵素−アビジン又は酵素−ストレプト アビジン付加物として検出することができる。Ｍａｔｔｈａｗａら（１９８５年 ）上述：Ｌａａデシら（１９８３年）、上述；Ｗｏｒｄら、上述；　Ｅｎｇｌｍ ｈａｒｄｔら、上述、を参照せよ。ビオチン又はイミノビオチンの複製型ＲＮＡ へのとりこみは、ウラシル残基の５位の炭素にスペーサーを介してビオチニル化 されたＵＴＰを、複製反応のレプリカーゼの基質として用いることにより行うこ とができる。そのよ５なＵＴＰは既知の化合物である。さらに、そのようなＵＴ ＰはＱβレプリカーゼの基質となり、さらに、５位の炭素に結合したスペーサー 。

グループを介してビオチニル化されたウラシルｔｌｔｒＲＮＡは、その合成にそ のようなＵＴＰを用いたために、Ｑβレフリカーゼが触媒する複製の鋳型となる ことが知られている。

複製の過程の結果生じたＡＮＡもまた、Ｆｏｒｓｔａｒら（１９８５年）上述、 の方法に従い、光ビオチン酢酸を用いてビオチニル化することができ、さらに次 に、アビジン−酵素付加物−色素原化合物の系を用いて、複製反応においてビオ チニル化したＵＴＰを使って合成した複製型ＲＮＡと同様に検出することができ る。

複製過程の結果生じたＲＮＡは、Ｔ　４　ＲＮＡ　！ｊガーゼの触媒する反応を 用いて、複製型ＲＮＡの３′末端に螢光修飾した核酸を付加することにより、螢 光をもたせることができる。Ｃｏａａｔｉｃｋら、Ｈｅｅｌ、　Ａｃ１ｄ、　８ １ｇ、　１２巻、１７９１−１８１０ページ（１９８４年）を参照せよ。

その結果得られたＲＮＡの螢光は、いくつかの標準的な技術のいずれかにより、 ＲＮＡの検出に用いることができる。

複製されたＲＮＡの検出に用いることのできるさらに他の方法の中には、核酸と 特異的に結合する受容体物質を、複製が行なわれる系か、あるいは、複製型ＥＮ Ａが単離されているＥＣＴＥＯＤＡペーパーのような正に荷電した担体などの媒 体に添加して、受容体物質から生じるシグナルを測定するものがある。そのよう な物質には以下のものが含まれる：″′′ステインール（Ｓｔａｉｎａα１１） ″のような色素原染料ＣＤａｈｌｂａｒｇら、Ｊ、ＭｏＬ、Ｂｉｏｌ。

４１巻、１３９−１４７ページ（１９６９年）；メチレンブルー（Ｄｉｎｇｍａ ｎとＰｅａｃｏｃｋ、　Ｅｉｏｃｈａｒｎｉａｔｒｙ、　７巻、６５９−６６８ ページ（１９６８年）及び銀染色（Ｓａｍｍｏｎｓら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ ｅｓｉｓ、　２巻、１３５−１４１ページ（１９８１年）、Ｉｇｌｏｉ、　Ａｓ ａｌ、　Ｂｉｏｅｈｒｍ。

１３４巻、１８４−１８８ページ（１９８３年）；例えば臭化エチジウムなどの ＲＮＡＫ結合する螢光原化合物（５ｈａｒｐら、Ｅｉｏｃｈａｍｉｍｔｒｙ、　 １２巻、３０５５−３０６３ページ（１９７３年）　；　Ｂａ１ｌａｙとＤａｖ ｉｄｓｏｎ、　Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｇｍ、　７０巻、７５−８５ページ（１９７６年）；Ｑβレプリカー ゼによる複製の鋳型となるＲＮＡＶＣ特異的に結合する螢光原化合物・・・・・ ・例えばＱβレプリカーゼの感染サブ・ユニットに共役するフィコピリ・プロテ ィン（ｐｈｙｃｏｂｉＬｉｐｒｏｔｇｉｎ）（Ｏｉら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｔｏ ｌ。

９３巻、９８１−９８６ページ（１９８２年）、Ｓ　ｔｒｙｇｒら、米国特許４ ４，５２０，１１０　）などである。

レブリカーゼの濃度が、鋳型ＲＮＡの濃度ふりも濃いｔまであり、さらにリボヌ クレオシド−５′−三リン酸の濃度の制限を受けないと仮定すると、鋳型ＲＮＡ の濃度は、レプリカーゼの触媒によるＲＮＡの複製の間、時間とともに対数的に 増大するであろう。鋳型ＲＮＡの濃度が、レプリカーゼの濃度と等しくなるか、 超えてしまつ・　た後では、リボヌクレオシド−５′−三リン酸の濃度の制限を 受けないかぎり、鋳型ＲＮＡの濃度は、時間に直線的に増加するであろう。例え ばＫｒａｍｍｒら（１９７４年）上述、を参照せよ。

実施例■に特定されるレプリカーゼ触媒による複製の条件下では、ＭＤＶ−Ｉ　 ＲＮＡは３６秒毎にその濃度を倍化し、ついには、鋳型の濃度が酵素の濃度を上 回ってしまうことが示されている。

レプリカーゼ触媒による複製反応系で、一定の反応時間の後の鋳型ＲＮＡの濃度 は、鋳型ＲＮＡの初期濃度に関係することになる。もし、複製反応の間中、レプ リカーゼの濃度が鋳型の濃度よりも高いものと仮定すれば、（さらにリボヌクレ オシド−５′−三リン酸の濃度の制限を受けなければ）、反応終了時の鋳型ＲＮ Ａの濃度の対数は、鋳型の初期濃度（反応開始時点の）の対数に、直接比例する であろう。レプリカーゼの濃度が鋳型の濃度よりも低くなった後では、リボヌク レオシド−５′−三リン酸の濃度の制限を受けないかぎり、反応終了時の鋳型の 濃度は、鋳型の初期濃度の対数に直接比例する。さらに、鋳型の濃度がレプリカ ーゼの濃度に等しくなるまでに要する反応時間は、鋳型の初期濃度の負の対数に 比例する。

複製反応をより長時間進行させることにより、さらに大きな感度を得ることがで きる。

本発明に従うアッセイでは、検体を試験しているサンプルとコントロールサンプ ルの双方のテストサンプルについてできるだけ同じような条件下で同時にアッセ イを行うのである。技術分野において理解されているように、コントロールサン プルは、検体を含まないか、あるいは既知の量の検体を含む魚身外はテスト・サ ンプルと同様なものになるようにする。検体を含まないコントロールは１バツク ・グランドであり、それ以下のときは、検体を含むサンプルと含まないサンプル とを区別することは不可能である。テスト・サンプルのアッセイで複製された複 製型ＲＮＡの量又は濃度を、同時にアッセイしたコントロール・サンプルの量又 は濃度と比較することにより、テストサンプル中の検体の存在をバック・グラン ド以上のレベルで決定することができるのである。もし、既知の濃度範囲の検体 を加えたコントロール・サンプルを用いたときは、テスト・サンプル中の検体の 濃度を推測することができる。

ここで、本発明を実施例によりさらに詳細にわたって記述してみる。

本実施例はビオチン及びアビジン（次に）の中間変種ＲＮＡ（ｒＭＤＶ−ＩＪＲ ＮＡとする）への結合において、該ＲＮＡがＱβＲＮＡポリメラーゼに対する鋳 型として活性を保持し、ビオチンまたはビオチン＋アビジンから分離可能である 、同方法を示す。ビオチン−アビジン特異的結合ペアーを介してアビジンに特異 的に結合する能力のために、ビオチンのみが付いたＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡはアビジ ン骨格が結合されうる（例えば、該親和性分子に直接自身で結合されるビオチン な介して）いずれの親和性分子に対しても普遍的レポーターとなり、その際、親 和性分子の標的生物ポリマー検体に特異的に結合する能力は損わない。ビオチン に特異的に結合する能力（ビオチンとアビジンとの間の特異的結合ペアーに由来 する）のために、ビオチン及びアビジン（ビオチンに対して複合体形成したもの ）を結合したＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡが、ビオチン骨格が結合され５るいずれの親和 性分子に対しても普遍的レポーターとして使用されうるが、その際該ビオチン骨 格自身のアビジンに特異的に結合する能力または該親和性分子の標的生物ポリマ ー検体に特異的に結合する能力は損わない。（アビジンは４つのビオチン−反応 性部位を有しており、それ故ビオチンーアビジンービオチン結合という中間組成 物となりうる。）ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡはミール（Ｊ／＜５Ｊｓ）ら、Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｅｉｏｌ。

１７１巻、２８１−２９５ページ（１９８３年）において示される、中間変５Ｒ ＮＡ変異株と同じ配列を有しており、次の相違点がある。ミールらの配列の４３ 位ＣがＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡにおいてＵに変えられる。ミールらの配列の６１位Ａ がＭＤＶ−ＩＲＮＡにおいてＧに変えられる。

ミールらの配列における１０５位ＡがＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡにおいてＵに変えられ る。ミールらの配列の１３４位ＣがＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡにおいてＵに変えられる 。最後に、ミールらの配列における１３５位ＧがＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ配列におい てＡに変えられる。令達べられた配列をもつ特定のＥＮＡ変異株は本明細書の本 実施例及び他の実施例において使用されたが、本変異株は、単に供給面で簡便に 入手可能であるという理由から使用された。該Ｑβレプリカーゼによる試験管内 での複製に対する鋳型となるいくつかのＲＮＡ（ｒ野生型」中間変種ＲＮＡ、Ｍ ＤＶ−ＩＲＮＡとは異なる中間変種ＲＮＡの変異株、ミニ変種ＲＮＡ、ミクロ変 種ＲＮＡ、ナノ変種ＲＮＡのひとつ、同定はされているが名前がまだ決定されて いない他の変種または上記いずれかの突然変異株で試験管内で該Ｑβレプリカー ゼによる複製をうける能力を保持しているものを含む）もまた使用されうる。

さらに、Ｑ／　ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼは、その試験管内における著 しい安定性のために本発明に対する好適なレプリカーゼであるが、使用されうる 技術において知られている他のＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼがあり、これ は同ポリメラーゼが複製に対する鋳型として認識する複製可能ＲＮＡとともに非 常に数が多い。

これら他の酵素の中にはＳＰレプリカーゼ及びＭＳ２レブリカーゼが含まれる。

Ｑβレプリカーゼを用いる酵素的合成により得られる５′−アｐ、ＭＤＶ−１（ ＋）ＥＮＡは一連の工程；１）５′−末端３リン散基は子ウシ腸アルカルフォス ファターゼとのインキュベーションにより除去され、〔ガンマ−”Ｐ：１ＡＴＰ 及びＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼとのインキュベーションにより５’−末端 １リン酸に換えられた： ２）５′−フオスフオロイミダゾール基がカップリング試薬、１−エチル−３− 〔３−ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミドの存在下イミダゾールとの縮合 により合成された； ３）該イミダゾール基はシスタミン・ジヒドロクロリドとのインキュベーション によりシスタミン基に転換された； ４）ビオチンがビオチニル化試薬、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチンとのイ ンキュベーションによりシスタミンに結合された；そして ５）アビジンがアビジンとのインキュベーションにより５′−ビオチン基に結合 された により５′−ビオチニル化ＭＤＶ−１（＋）ＲＮＡ−アビジン付加物に転化され た。また、６）該５′−ビオチニル化ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ−アビジン付加物は部 分反応した中間体からアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。次の反応 式の初めの４工程は上述の工程２）〜５）を要約する： ト 式に示される５番目の工程は以下で述べるようにビオチン−アビジンからＲＮＡ を分離するための、シスタミン骨格のジスルフィドの還元的開裂を示す。

ＲＮＡ−ビオチン−アビジン付加物（ＩＩ）の電気泳動上での移動度は、その大 きさのため、５′−ビオチニル化ＲＮＡ前駆体（１）の移動度よりも低かった。

形成したＲＮＡ−ビオチン−アビジン付加物の量（各ゲルのバンド中の放射活性 を測定することにより決定される）はアビジン濃度の関数として漸近的に増加し 、形成付加物２５〜３５％で最大値に対した。ＲＮＡ−ビオチン−アビジン付加 物（ＩＩ）の同定は３つの方法で確かめられた： １）該５′−シスタミンＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡがアビジンとインキュベートされ、 生成物の電気泳動上の移動度が、未反応対照のそれと同定され、遅い移動バンド 中の付加物は非ビオチニル化前駆体でないことを示した：２）同様に、該５′− リン酸化ＭＤＶ−ＩＲＮＡがビオチニル化試薬と反応、電気泳動による精製、ア ビジンとのインキュベートのそれぞれがなされ、その移動度が同一のままであっ た：そして ３）遅い移動度のバンドから溶出される該付加物の８０％以上がビオチニル化ア ガロースに結合していたが、５′−シスタミンを含む対照物の場合では１０％以 下であった。

さらに詳細な記述として、ビオチン及びアビジンのＭＤＶ−１（＋）ＲＮＡの５ ′−末端への結合及び該付加物の同定が、材料を使い、次の方法に従って行われ た：酵素及び化合物 次のものが購入された二子牛腸アルカリフォスファターゼ（ポーリンガ−・マン ハイムバイオケミカルス、インディアナポリス、インディアナ州、米国）、バク テリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ファルマシアＰ−Ｌバイオケミ カルス、ピスキャタウエイ、ニューシャーシー州、米国）；リボヌクレアーゼＴ １及び高重合簿冊ＲＮＡ（キャルバイオケムーベーリング、サンディエゴ、カリ フォルニア州、米国）；Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチン（シグマケイカル 社、セント・ルイス、ミズーリ州、米国）；２，２’−ジチオビス（エチルアミ ン）−ジヒドロクロライド（ｃｒｃオーガエックス、アトランタ、ジョーシア州 、米国）：１−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピル〕カルボジイミド（ アルドリッチ・ケミカル社、ミルウオーキー、ウィスコンシン州、米国）；ビオ チン化アガロースＣＢｍ９アビジン／ｉ結合）　及びアビジンＤＮ（ベクター・ ラボラドリース、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）；及び〔ガンマ− ”Ｐ’ＪＡＴＰ及びＣフル７７−”Ｐ〕ＧＴＰＣ７フーシヤム、アーリントン・ ルイス、イリノイ州、米国）。

Ｑβ　ＲＮＡＮプレカーゼは、ヨーヤング（Ｅｏ　ｙαｎｇ）及びホガスト（Ａ ｕｇｕｓｔ）　（文献、ヨーヤングら、（１９７１）、Ｎｗｃｌａｉｃ　Ａｃ１ ｄ　Ｒｅｓ＃ａｒｃ五、　Ｇ、Ｌ、カントニ（Ｃａｎｔｏｎｉ）及びり、Ｒ，デ ーヴイース（Ｄａヤｉ＃８）の編集による（）−一パー・アンド・ロー、ニュー ヨーク）、第２巻、８２９〜８３９ページ中の操作）の操作により、バクチリオ フアジＱβ感染大腸菌株Ｑ１３から単離され、該ヒドロキシアパタイトの工程は 省かれた。

ＭＤＶ−１ｆＨＲＮＡの調製 容易に同定及び単離が可能な（クラマー（Ｋｒａｍｇｒ）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ、　８９巻、７１９−７３６ページ、９７４年参照）中間変種ＥＮＡの変異 株が芙鬼例において使用され、ここでは「ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ　Ｊとして言及さ れる。

この配列は前述される。７５８μ２のＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡは、７０５　ｎＷのＭ ＤＶ−１ｔ＋ｌＲＮＡ　Ｋ真珠鋳型及び６９μｔのＱβレプリカーゼを、２１０ 分間、３７℃で１ｍｕ　ＡＴＰ、１ｍＭＣＴＰ、１ｍＭＧＴＰ、１ｍＭＵＴＰ。

１５　ｍｕ　ＭｇＣｌ２．１００　ｒｎＭ　）リス−ＨＣ１を含有する１μ中、 　ｐＨ７，５でインキュベートすることにより合成された。該インキュベーショ ン混合物は次にフェノールによる抽出（メソツズ・イン・エンザイモロジー、Ｌ 、グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ　）及びに１モルディグ（Ｍｏｌｄａｖｍ）に よる編集（アカデミツク・プレス、ニューヨーク）、１２巻、パートＢ、８７− １ｏｏベージ、１９６８年におけるに、Ｓ、カーと−（Ｋｉｒｂｙ）　）により 脱タンパクされＪＲＮＡは、２Ｍ酢酸アンモニウム存在下−２０℃で２倍重のエ タノールを用いる沈澱により単離された。

ＭＤＶ−１…ＲＮＡはＭＤＶ−１（−）ＲＮＡから、１常ＭＭＱＣ１ｔ存在下ア クリルアミドゲル電気泳動により分離された（Ｄ、Ｒ，ミルズ（ｑｕｉｌｌｓ） ｈセル、１５巻、５４１〜５５０ページ、１９７８年）。

ＲＮＡ中間体は、１００　ｍｕ　ＮａＣＬ、　１　ｍｕ　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭヘペス（ｐＨ７，５）　（Ｔ、　マニアテイス（ｍａｎｉ−ａｔｉｓ　 ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｓｉ％ｇ　ニラボラトリーマニュアル、コー ルド・スフ”　ＩＪ　ｙグφハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ −、ニューヨーク州、１９８２年）で平衡化させたセファデックスＧ−５０（フ ァルマシア　Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を通す、スピン・カラム・クロマトグラ フィーによって反応混合物から単離された。ＲＮＡは１００　ｍＭ　ＮａＣＬ存 在下、−２０℃で２倍量のエタノール添加により、溶液から沈澱された。電気泳 動は、９０ｍＭトリス−ホウ酸、ｐＨ８，３，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で添加・展開 される、厚さ１龍の６％ポリアクリルアミド・ゲル上で行われた。変性ゲルはま た、７Ｍの尿素を含有した。変性ゲル上での電気泳動前に、ＲＮＡは７Ｍ尿素中 ９０℃で１分間加熱により融解され、ただちに冷却された。ゲルのオートラジオ グラフは、デュポン・クロネツクス・ライトニング・プラス（Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃ ｒｏｎａｚ　Ｌｉｇｈｔｎｉｇ　Ｐｌｓａ　）強化スクリーン存在（あるいは非 存在）下、−８０℃でコダックＸ−オマットＡＲフィルムに露出することにより 得られた。

ＲＮＡは５００愼Ｍ酢駿アンモニウム、ｐＨ７，５，１ｔａｕ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ 　（Ｔ、マニアティスら、前述）により、ゲルから溶出された。

該５′−末端トリフオスフエートグループは２μｔのＭＤＶ−１（＋）Ｒ＃Ａか ら、０．７ＥＵ子牛腸アルカリフオスフアターゼと３０分間、５０℃で、５０μ ｔの５０ｍＭ）リス−ＨＣＬ、ｐＨ８，１００μｔＭＥＤＴＡ中でインキュベー トすることにより除去された。さらに０．７ＥＵ子牛腸アルカリフオスフアター ゼが加えられ、該インキュベーションはさらに３０分間継続された。核反応は、 該インキュベーション混合’ｆｈヲ１００　ｔ＋％Ｍ　ＮａＣＬ及び２％ドデシ ル硫酸ナトリウム中に空け、これを１５分間６０℃で加熱することにより停止さ れた。該溶液は次にフェノール：クロロホルム（１：１）で２度、クロロホルム で２度（Ｔ、マニアティスら、前述）抽出することにより、脱タンパクされた。

該脱リン酸化ＭＤＶ−ＩＲＮＡは次にエタノールによる沈澱により単離された。

２ｔｔｆノ脱リン酸化ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ　は３分間、５０℃で、１０惧Ｍトリ スーＨＣ１２０μｔ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭスペルミジン、１００μＭＥＤＴ Ａ中でインキュベートされ、次いで、迅速に冷却された。該容量は次に１２、２ 　ｐ　ｍｏＬの〔ガン−ｒ　−”Ｐ〕ＡＴＰ　（３００Ｃ４／ｍｏｔ）、３０Ｅ ＵＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ及び、　最終濃度でＭｇＣ４１０惜Ｍ１ジチ オトレイトール１ｍＭ、）リス−ＨＣ１５０常Ｍ（ｐＨ７，５）になる緩衝液を 用いて４０μｔとされた。この溶液は７５分間３７℃でインキュベートされ該混 合物を２０ｍＭＥＤＴＡに空けることにより停止された。該キナーゼは同量のフ ェノール：クロロホルム（１：１）で抽出され、該リン酸化ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ はエタノールを用いる沈澱により単離された。

該ＲＮＡは、セファデックスＧ−５０を通すスピン・カラム・クロマトグラフィ ー、それに続くエタノールによる再沈澱によってさらに精製され、次いで１ｍｕ ＥＤＴＡ−Ｎ　ａ　ＯＨ（ｐＨ８）中に５濁化された。

２μ２の［：５’−”Ｐ）ＭＤＶ−ＩＲＮＡ及び１６μ７の高重合酵母ＲＮＡ　 （１８０μ２の酵母ＲＮＡを５０ＥＵの子牛腸アルカリフォスファターゼと１時 間５０℃でインキュベートすることにより前もって脱リン酸化されたもの）が３ 分間、５０℃で２０μｔの１毒Ｍ　ＥＤＴＡ−ＮａＯＨ（ｐＨ８）中でインキュ ベートされ、次いでただちに冷却された。２５μｔの１ＭイミダゾールＣｐＨ６ ）及び２．５μｔの１．５Ｍ　１−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピル 〕カルボジイミドが次に加えられ、該混合物は１時間２３℃でインキュベートさ れた。ＲＮＡはこの混合物から、セファデックスＧ−５０を通すスピン・カラム クロマトグラフィーにより単離された。〔５′−”Ｐ”ＪＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡの ５′−イミダゾライド（非転化Ｃ５’−”Ｐ）ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡを含む）は１ ００　ｍｕ　ＮａＣＬ、１　ｍ−”ｌ　ＥＤＴＡ、　１０　ｍＭヘペスＣｐＨ７ ，５）　１００μを中で集められた。１Ｍ２．２’−ジチオビス（エチラミン） −ジヒドロクロライド（シスタミン・ジヒドロクロライド、ｐＨ７，７）が次に 加えられ、最終濃度２５ｍＭとされ、該溶液は１時間５０℃でインキュベートさ れた。該ＲＮＡは次にセファデックスＧ−５０を通すスピン・カラムクロマトグ ラフィーにより単離され、エタノールを用いて沈澱された。

該５′−シスタミン−〔”Ｐ”ＪＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ（非転化〔３２Ｐ）ＭＤＶ −Ｉ　ＲＮＡを含む）は２ｏｏｆｌＬＭへベス（ｐＨ７，７）、１　ｍＪ／　Ｅ ＤＴＡ　４０　ｔｔｌＫ溶解され、４０分間、２３℃でインキュベートされた。

過剰のＮ−ヒドロキシサクシニミドピオチンは遠心分離により除去され、該ＲＮ Ａは次にエタノールを用いて沈澱された。該５′−ビオチン化ＭＤＶ−ＩＲＮＡ （１）（非ビオチン化ＲＮＡを含む）は変性ゲル上での電気泳動により過剰のＮ −ヒドロキシサクシニミドビオチンからさらに分離された。

該”Ｐ−標識バンド中のＲＮＡは該ゲルから溶出されエタノールを用いる数回の 沈澱により精製された。

５０から２００μ？の部分５′−ビオチン化〔ＪＰ〕ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡは２か ら１０μ２のアビジンＤＨ（ベクター−ラボラトリ−、バーリンゲーム、カリフ ォルニア州、米国から購入されたアビジンの高純度型）と４５分間、２３℃で１ ０ｍＡｆへペス（ｐＨ７，７）、１−ｓＭＥＤＴＡ中でインキュベートされた。

該５′−ビオチン化Ｃ”Ｐ”ＪＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ−アビジン付加物（Ｉｔ）は 、非ビオチン化〔ｓ２Ｐ：ＲＮＡ及び遊離アビジンから、変性ゲル上の電気泳動 により分離さｎた。該５′−ビオチン化ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ−アビジン付加物は 次に該ゲルから抽出され、エタノールを用いて沈澱された。

５′−ビオチニル化された〔巽〕ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ−アビジン付加物及び５′ −シスタミン−〔”Ｐ：ＭＤＶ−ＩＲＮＡは該ゲルから流出され、エタノールを 用いて数回沈澱された。各付加物はビオチニル化アガロール５０μｔと１５分間 ２３℃、１０ｍＪ／ヘペス；　ｐＨ７，１ｍＭＥＤＴＡ中でインキュベートされ た。該アガロースは遠心分離により沈澱され、緩衝液を用いて２度洗浄された。

該ビオチン化アガロースにより沈澱された、各放射活性付加物のフラクションは シンチレーション・カウンターで測定数〔３２Ｐ）ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ−ビオチ ン−アビジン付加物はジチオトレイトールを用いる還元により、５′−チオ−エ チルアミノ−Ｃ”ＰＪＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡ及びビオチン−アビジン副産物に転化 された。５′−ビオチニル化（”Ｐ）ＭＤＶ−ＩＲＮＡ−アビジン付加物は、１ 時間、２３℃、Ｚｏｏ憔Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）３０μｔ、１鴨Ｍ　Ｅ ＤＴＡ、１０ｓＭヘペス（ｐＨ７，７）中でインキュベートされ、該スペーサー 結合アームのジスルフィド結合を切断する。次にビオチニル化アガロール４０μ ｔが該反応混合物に加えられ、１時間２３℃でインキュベートシ、ビオチン−ア ビジン副産物を結合する。該ビオチニル化アガロースは遠心分離によって該溶液 から除去された。

放射活性の９５％は上清液から回収され、ジスルフィド結合アームが切断された ことを確認する。非還元ＲＮＡ−ビオチン−アビジン付加物がビオチニル化アガ ロースとインキュベートされる対照反応においては、１０％に満たない放射活性 が上清液中に見い出された。

切断されたＲＮＡはエタノールを用いる沈澱により回収され、１００μＭジチオ トレイトール（還元ＲＮＡの二量化を防ぐ）の存在下、非変性ゲル上の電気泳動 により分析された。該５′−チオーエチルアミノ−ＭＤＶ−ＩＲＮＡは、５′− リン酸化ＭＤＶ−１対照ＲＮＡと同じ速度でゲル上を移動したが、非還元付加物 はより遅い速度で移動した。該５′−ビオチニル化ＭＤＶ−ＩＲＮＡ−アビジン 付加物（ｎ）及び該５′−チオーエチルアミノ−ＭＤＶ−ＩＲＮＡはそれぞれ、 ＱβレプリカーゼによるＭＤＶ−ＩＲＮＡ合成に対する鋳型として作用すること が可能かどうかをみるために試験された。

試験されるべき、該修飾〔３す〕ＭＤＶ−ＩＲＮＡ各５μｍは、３７℃で、５０ μ２の４００μＭ　ＡＴＰ１４００μＭＣＴＰ、４００μＭ〔アルファー３２Ｆ ：］Ｇ７’Ｆ（５００ｍｃｉ／ｍｍｏＬ）、４００μＭ　ＵＴＰ、　１２　ｍｕ 　ＭｇＣＬｔ、８４惰ＭトリスーＨＣ１（ｐＨ７，５）中でインキュベートされ た。２μｔの試料が、７分〜１５分の間毎分とられた。

各試料はナンバード・セミサークル（孔径２３ｒ１１１）ノ３ＭＭｆｐ過紙（ワ ットワン）上に吸着され、氷冷３００ｍｕす／酸、２０ｍＭピロリン酸ナトリウ ム、１ｍＭＥＤＴＡを含むビーカー中に空けられた。該ｐ紙は用液を用いて６回 洗浄され、ファイバー中にトラップされた沈澱ＲＮＡから標識前駆体を流出した 。該戸紙は次にエタノールを用いて１回洗浄、空気中で乾燥され、その放射活性 はシンチレーションカウンター中で測定された。

結果は両５′−修飾ＲＮＡがＱβＲＮＡレプリカーゼに対する鋳型として作用す ることを示した。各反応におけるＲＮＡ合成速度は、１００１％２／−非修飾Ｍ ＤＶ−ＩＲＮＡを用いて開始した対照反応においてみられる合成速度と同じであ った。

本実施例は、ビオチンのＭＤＶ−ＩＲＮＡへの結合に含まれる化学的操作もアビ ジンの５′末端ピオチン基への結合も該ＲＮＡ配列の酵素的複製に障害を与えな いことを示す。該５′−末端ビオチンーアビジンが該ＲＮＡの酵素的複製に障害 を与えない、という事は次回：に示される、ビオチンの結合位置及びスペーサー ・アームの長さに帰されうる。ＲＮＡ合或は該鋳型の非修飾３′末端（Ａ、に、 バナージー（Ｂａｎｇｒｊｉｇ）ら、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　４６巻、４４５−４５５ページ、１９６９年）で開始し、該スペー サー・アームは該鋳型の５′末端での複製停止のために適当な長さ以上与えなけ ればならない。

実施例■ ヒト・ガンマ・グロブリンＣＩｙＧ）は、Ａ）風疹に最近感染した被験者及びＢ ）風疹に感染してない被験者から単離され、その抗血清が前もって風疹抗原との 反応に陰性であることが試験された。各試料中のＩｇＧをビオチンに結合させる ために、各試料はホウ酸緩衝生理食塩水（ｐＨｓ、ｓ）中で４ｍ９蛋白／−に希 釈される。ジメチルホルムアミド（１０ｒ−ｐ／−）中に溶解した、ビオチニル −Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル５０マイクロリツトルが該希釈試料１ｗ Ｌｔごとに加えられる。該反応混合物は室温で２時間攪拌され、次いで、１−当 たりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ　、　ｐＨ７，４、４℃）１リツトルに対し て一晩透析される。結果としてできる溶液は、ビオチニル化ＩＱＧを含有し、４ ℃でアジ化ナトリウム存在下保存される。

０．１Ｍ炭酸す）　ＩＪウム緩衝液中、ｐＨ９，８で風疹抗原で被覆されたウェ ルを有する。ポリスチレン・マイクロタイタープレートが、３時間室温でシェル 当たり、１：１０．１：３０．１：１００．１：３００％　１：１０００゜及び １：３０００の希釈比で、上述のように調製されたビオチニル化ＩＱＧ含有溶液 ５０μｔとともにインキュベートされる。風疹抗原で被覆されないウェルをもつ プレートが対照として使用される。ＩｇＧ試料の希釈はＰＥＳ中で５％ウマ血清 が用いられた。ビオチニル化ＩｇＧＫ料の希釈液とのインキュベーション後、該 フレートはＮａＣＬ　−）ウィーン２０を用いて３回洗浄される。

マイクロタイタープレートの各ウェルに、次いで実施例１の場合のように調製さ れたＭＤＶ−１ビオチン−アビジン付加物ｆｌｌ）のＦＥＢ溶液が、１〜１０μ ２／−の濃度で加えられ、該ウェルは次に該溶液とともに２時間室温でインキュ ベートされる。次に該プレートはＮαＣ４−）ウィーン２０を用いて３回洗浄さ れる。

次にトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中０．ＩＭＤＴＴが全てのウェルに加えられ、 結果としてできる混合物は室温で１時間インキュベートされる。

各ウェルは次にＱβレプリカーゼ４．６μ２とともに、３７℃、　４００μＭＡ ＴＰ、４００μＭＣＴＰ、４００μＭ〔アルファー３’Ｐ〕ＧＴＰ　（５００倶 Ｃｉ７侃毒ｏｔ）、４００μＭＵＴＰ、１２ｍｕＭｇＣＬｘ、８４　ｍＭ　）リ ス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）５０μを中でインキュベートされる。２μｔの試料が １分から１５分の間、毎分とられる。各２μｔの試料はナンバード・セミサーク ル（孔径２３ｔｉ）の３ＭＭ濾過紙（ワットマン）上に吸着され、水冷３００ｍ Ｊ／リン酸、２０ｔｈＭピロリン酸ナトリウム、１　ｍｕ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含 むビーカー中に空けられる。該濾紙は用液を用いて６回洗浄され、ファイバー中 にトラップされた沈澱ＲＮＡから標識前駆体を流出する。該濾紙は次にエタノー ルを用いて１回洗浄、空気中で乾燥され、その放射活性はシンチレーションカウ ンター中で測定される。バックグラウンド以上の放射活性は検定血清中の抗−風 疹ＩＱＧの存在を示唆するものである。

実施例■ ５′−ビオチン−へクス−Ｐ　−１６−ｍｇｒ　（５’−ｂｉｏ−ｔｔｓ−ん− ｚ−Ｐ−１６−ｍ−デ）は、ヘキサメチレンジアミンリンカ−を介し１６・マー ５’−ＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＡＡＣ−３′に結合したビオチンから成り、 Ｍ１３ｍｐ　８ＤＮＡ断片と相補的配列をもったもので、Ｂ、Ｃ，Ｆ、チュー（ ＩＪｓ）及びり、Ｅ、オーゲル（Ｏｒｇｅｌ）、ＤＮＡ４．３２７−３３１ペー ジ（１９８５年）に従って調製される。また、本参考文献に従って、単一株のＭ １３ｔｎｐ８ＤＮＡを１０ｓり、０．１　ｓｔ、　０．０１　ｓｔ及び０．００ １ｓり含有するニトロセルロース・プロットが調製され、ＤＮＡを含有しない対 照プロットも同様ＫＭ製される。

該プロットは切断され、実施例Ｉの場合のように調製されｆｃＭＤＶ−１ビオチ ン−アビジン付加物大過剰と反応する、マイクロタイターウェルに移される（シ ェル当り５０μｔ、付加物濃度はＦＥＥ中約１〜約１０μｆ／ｍ／である）。各 該プロットは次にＮａＣ１−トウィーン２０で充分洗浄され、新たなマイクロタ イターウェルへ移行、初めにトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中０．ＩＭＤＴＴと１ 時間インキュベート、次いで先の実施例■において記述されたＱβレプリカーゼ 含有溶液５０μｔ（シェル当たり）とインキュベートされる。２μｔの試料が１ 分〜３０分の間、９０秒ごとにとられ、シンチレーションカウンター中での放射 活性測定のために実施例■で記述されるよ５に濾過紙上にプロットされる。バッ クグラウンド以上の放射活性は該検定プロット上のＭ１３ｍｐＤＮＡを示唆する ものである。

実施例°■ 本実施例は、プロットがＤＴＴとともにインキュベートされないことを除いて、 実施例■と同方法で行われ、結果として、ＭＤＶ−ＩＲＮＡをビオチン−アビジ ンに結合するジスルフィド結合は切断されず、該ＭＤＶ−Ｉ　ＲＮＡは１６−　 ｍａｒプｐ−ブ（及びＭ１３ｍｐ８検体）への結合を残している。しかしながら 、該プロットはＱβレプリカーゼ溶液とインキュベートされ、試料がとられ、実 施例ｍで記述されたように放射活性が測定される。

実施例Ｖ 本実施例は、ＤＴＴとのインキュベーションの代ワリにトリス緩衝液（ｐＨ７， ５）が該ウェルに加えられ、該マイクロタイターが８０℃１０分間加熱され、ニ トロセルロース・プロットＭ１３常ｐ８検体からＭＤＶ−ＩＲＮＡレポーター基 に結合したプロップを遊離させることを除いて実施例■と同方法で行われる。室 温に冷却後、該試料はＱβレプリカーゼ溶液とインキュベートされ、そうでなげ れば実施例■の場合のよ５に処理される。

実施例■ 実施例■〜Ｖで記述される１６−１げオリゴヌクレオチドプローブは、フォース ター（Ｆｏｒｓｔａｒ）ら、Ｎｕｃ−１ａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｎ、　３巻、 ７４５〜７６１ページ（１９８５年）によって記述されるように酢酸フォトビオ チンを用いる光化学反応においてビオチニル化される。該ビオチニル化オリゴヌ クレオチドはＲＰＣ−５を用いる高性能液体クロマトグラフィーによって出発物 質から分離される。該ビオチニル化１６−　ｍａｒは次に実施例■の操作に従っ てＭ１３ｍｐ８．ＤＮＡの同定に供される。

Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡの３００塩基断片がファージから得られ、ビオチンを用いて 化学的に標識されるが、これは上記フォースターらの操作に従って酢酸フォトビ オチンを使用する。上記フォースターらによって記述される。ドツト・プロット 交配の操作が流用される。次に該プロットは実施例■において記述されるように ビオチン−アビジンレポーター付加物とインキュベートされ、実施例■の操作の 残りはＭ　１３　ｍ　ｐ　８　Ｄ　Ｎ　Ａを同定するために流用される。

炭素５位へのスペーサーアームを通してビオチニル化された、ウリジン残基が上 記ランガー（Ｌａ％ｇａｒ　）ら及び上記ラリ−（Ｌａａｒｙ　）らによって記 述されるニック−翻訳の操作により、実施例■において記述されるオリゴヌクレ オチド中に導入される。次に結果としてビオチニル化される１６−ｍａｒについ て、ＭＤＶ−１ビオチン−アビジンレポーター付加物を用いる実施例■の操作に 従い、プロットＭ１３ｍｐ８ＤＮＡに対する検定が行われる。

本実施例は核酸検体に対する「セルフ・レボ−ティンでもある親和性分子として の組換えＲＮＡの使用を示す。

本実施例はまた、同定性を供する複製レポーターグループＲＮＡのビオチニル化 を示す。

ミール（Ｍｉａｌｇ）ら（１９８３年、上記）及びクラマー　（Ｋｒａｍａ　ｒ 　）らの米国特許出願第６１４，３５０号（上記）の操作に従い、３〇−想−デ オリゴリボヌクレオチド５’−ＡＧＵＣＡＧＧＣＡＣＣＧＵＧＵＡＵＧＡＡＵＣ ＵＡＡＣＡＡＵ−３’のついたＭＤＶ−ＩＲＮＡ（ＭＤＶ−１配列の６３位Ｇと ６４位Ｕとの間に挿入されたもの）から成る、組換えＲＮＡが調製される。該３ ０−　ｍａｒはプラスミツドｐＥＲ３２２断片の配列と相補的なそれを有する（ マニアテイスら、上記の付録Ｂにおいて提供されるｐＢＲ３２２配列中の７１〜 １００位をみよ）。

マシューズ（ＭａｔｔＡｓｗ＋）らのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５１巻 、２０５〜２０９ページ（１９８５年）の操作に従い、ニトロセルロースの仲介 により該組換えＲＮＡはｐＥＲ３２２ＤＮＡ２％１〜０．０１ｐｆを含有するプ ロットにハイブリッド形成される。組換えＲＮＡ５ｎｆが各ハイブリッド形成に 使用される。核組換えＥＲＡは煮沸により変性させられ、つづいてハイブリッド 形成溶液（４５％ホルムアミド、２０常Ｍリン酸ナトリウム、５ｘｓｓｃ、ｏ、 １％フィコール４００．０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピ ロリドン、２５０ｍ９／−変性サケ精子ＤＮＡ、ｐＨ６，４）に加えられる。該 ハイブリッド形成は次に１２時間４２℃で行われる。

該ハイブリッド形成及びハイブリッド形成後の洗浄に続いて、該試料に対応する 個々のサークルはプロットから切除、別個に処理され、トリス緩衝液（ｐＨ７， ５）に空けられる。そして該サークルは１０分間、１００℃に加熱され、ハイブ リッド組換えＲＮＡを溶液中に分離する。

ウェル中の溶液は室温まで冷却された後、放射活性標識ＧＴＰが非放射活性ＧＴ ＰＫ換わり、非標識ＵＴＰがビオチニル化ＧＴＰ（ビオチン−１１−ａｒｐがベ セスタ（Ｂａｔｈｍｍｄａ）リサーチ・ラボラトリ−、ガイゼルスブルク、メリ ーランド州、米国から購入される；水晶は１１−アトム・スペーサー・アームを 介してウラシル骨格の炭素５位にビオチンが結合したＵＴＰである、ランガーら 、上記、をみよ；ワード（Ｗａｒｄ）ら、欧州公報第００６３８７９号）に換わ っている、ことを除いて実施例■において記述されているものと同じＱβレプリ カーゼ溶液５０μｔが各ウェルに加えられ、該プレートは３７℃でインキュベー トされる。３０分間９０秒ごとに、９６−指アリコツターを使用し、各ウェルか ら溶液２μｔがニトロセルロースフィルター上にプロットサレ（フィルター上に マークされた、各ウェルに対応するエリアをもつ）、各フィルターは、マシュー ズらの操作に従い化学螢光試薬（１，２５惧Ｍルミノール、２．７　ｍ　ＭＨ， Ｏ，，０，１Ａ／）リス緩衝液、ｐＨ８，６、増強剤として０．１３６Ｍｐ−ヨ ードフェノールまたは０．６８μｍｖ　ｐ−ヒドロキシケイ皮酸を共存）存在下 ストレプタビジンーパーオキシダーゼ複合体とともに展開される。スポットから フィルターに発せられる光は次に螢光マイクロタイター・プレート・リーダーを 使用して感知される。バックグラウンド（すなわちｐＥＲ３２２ＤＮＲ以外の検 体について行われた操作によるスポット由来の放射）以上の放射は検定溶液中の ｐＢＥ３２２検体の存在を示す。

実施例Ｘ 実施例ＵＫ記述される１　６−ｔｈｅテの、−０−ＰＯ，−ＮＨＣＣＨｚ’）ｚ 　Ｓ　’Ｅ　ＣＣＨｔ）ｔＮＨｔグループと５′−ヌクレオチドの炭素５′位で 結合した付加物は、ヘキサメチレンジアミンの代わりにシスタミンが使用される ことを除いて、チュー（（Ｊｓ）及びオーゲル（Ｏｒｇａｌ）、ＤＮＡ４．３２ ７〜３３１ページ、１９８５年の操作により調製される。

本ジスルフィド付加物から、−０−ＰＯ２−ＮＨＣＣＨ，＞２８Ｈと５′−ヌク レオチドの炭素５′位で結合した（２−チオエチル）アミノ付加物が０．ＩＭＤ ＴＴと１時間室温でインキュベートすることにより調製される。該チオ付加物は 次に、１ｍｕ　ＤＴＴ存在下、ＲＰＣ−５を使用する高性能液体クロマトグラフ ィーにより非還元ジスルフィド付加物から単離される。

ＭＤＶ−Ｉ　ＥＮＡの、−０−ＰＯ，−ＮＨ（ＣＨ，）、５Ｓ（ＣＨ，）ＭＨ２ と５′−ヌクレオチドの炭素５′位で結合した付加物は実施例Ｉで記述されるよ うに調製される。同操作由来の生成物を含む、エタノール沈澱ジスルフィド付加 物は次に０、ＩＭＤＴＴ中に溶解され、結果としてできる溶液は１時間室温でイ ンキュベートされ、対応するチオ付加物を与える。

ＭＤＶ−ＩＲＮＡのチオ付加物約５０％２を含有する、０、ＩＭＤＴＴ溶液５０ μｔが、１６−　ｍｇｒのチオ付加物１０倍モル過剰量（すなわち、ＨＤＬＣ精 製に由来する溶液量で、該チオ付加物を約３０％１含有する。）と合わされる。

結果としてできる溶液にＯ１気流が１５分間通され、２つのチオ付加物で生ずる 反応は一晩室温で進行することが許容される。ゲル電気泳動を使用し、ジスルフ ィド含有骨格を介して１６−ｍａｒに結合したＭＤＶ−１ＲＮＡは、他のＭＤＶ −ＩＲＮＡ付加物及び未反応１６−　ｒｎａｒ付加物から分離される。

ジスルフィド含有骨格を介して１６−ｍａｒに結合したＭＤＶ−ＩＲＮＡ付加物 は次に、ＭＤＶ−ＩＲＮＡビオチン−アビジンの代わりに、実施例■の操作に従 いＭ１３ｍｐ８ＤＮＡの同定に供される。

実施例Ｘ１ 本実施例は、本発明に基づくレポーター・システムを使用する、細胞表面上の特 異的抗原の同定を記述する。

ここで記述される操作は一部、ホラシーハンド（Ｈｏｒαｎ−Ｈａｎｄ）ら、Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４３巻、７２８〜７３５ページ（１９８３年） の教示に基づく。

本操作は標準技術によって調製された、検定される抗原に対する、ネズミモノク ローナルＩｇＧ抗体によって例示される。当業者は、該抗原検体に特異的な、他 の型の抗体もまた使用されうるということを把握するだろう。

（、）　単一層培養細胞を使用する操作：試験されるべき細胞は、平均な９６穴 フラツト・ボトム組織培養プレート内に、適当な成長培地とともに植えられ、３ ７℃で２４時間インキュベートされる。成長培地は次に１０％（Ｗ／Ｖ　）ウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する成長培地と交換される。６０分間のインキ ュベーション後、１０％ＢＳＡ含有培地は除去され、ウェルは洗浄媒体（１％（ Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを補った。ＲＰＭ１１６４０溶媒）で洗浄される。該洗浄溶媒は 次に除去され、ウェル当たり、ＰＢＳ中０．１　ｍ９／−で、該抗原検体に対す るモノクローナル抗体５０μｔと交換され、紋理合物は４℃で２時間インキュベ ートされる。インキュベーション後、未結合抗体は抗体溶液のアスピレーション により除去され、続いて洗浄溶媒を用いて洗浄される。

洗浄に続いて、各ウェルに洗浄溶媒を用いて１：　１０００に希釈した、ビオチ ニル化ウサギ抗血清１ｇＧ（ベクター・ラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリ フォルニア州、米国から購入したもの）が加えられ、同溶液はウェル中、４℃で ２時間インキュベートされる。該抗−１ｇＧ抗体溶液は次にウェルから７スピレ ートされ、ウェルは洗浄溶媒を用いて再度洗浄される。次に各ウェルに実施例Ｉ のＭＤＶ−ＩＲＮＡビオチン−アビジン付加物のＰＢＳ溶液５０μｔが、１〜１ ０μｆ／ａｔで加えられ、同溶液はウェル中４　’Ｃで２時間インキュベートさ れる。本溶液は次にウェルからアスピレートされ、ウェルは洗浄溶媒で３回洗浄 される。トリス−ＨＣ１緩衝液（ＰＨ７，５）中０、Ｉ　Ｍ　ＤＴＴ　５０μＬ が次に各ウェルに加えられ、１時間室温でインキュベーションが行われる。次に 、９６指−アリコツターを使用して各ウェルから上清が新しいマイクロタイター ・プレートに除去され、実施例■の操作に従い、同溶液はＱβレプリカーゼ溶液 と合わされて組換えＭＤＶ−ＩＲＮＡに対する検定が行われる。

（ｂ）　Ｍ濁液中の細胞を使用する操作：懸濁液中の細胞は、単一層培養細胞に 対して使用される操作による特異な抗原九対して、次の修飾をすることによって 試験されうる： 細胞が単一細胞懸濁液（例えば、血清由来のリンホサイト）の形で得られない場 合、適当に処理され、そのような憑濁液を調製する。例えば、組織培養由来の細 胞は標準技術によりトリプシン処理され、培養容器表面から解離させることが可 能で、結果としてできる溶液は次に、培養容器から適当な溶媒中にピペットで移 すことが可能である。

単−細胞牙濁液中の細胞は次にマイクロ・タイタープレートのウェルに分けられ 、添加されたＢＳＡを含まないＲＰＭＩ　１６４０溶媒を用いて２度洗浄さｎる 。懸濁液中の同細胞は次に２時間４℃で、ウェル当たり、注目している抗原に対 する抗体のＦＥＢ中０．１ｍ／／−のもの５０μｔとともにインキュベートされ る。

本操作の残りは単一層培養細胞に対する操作と同じである。懸濁培餐中の細胞の 洗浄はペレットを生ずる遠心分離、培地のアスピレーション、次いで、新たな溶 媒（洗浄溶媒）中でのペレットの善悪濁化、再ペレット化及び溶媒のアスピレー トョ／のサイクルによって行われる。

本案尻側の操作に対して、抗原検体を含まないとして知られる、細胞が対照とし て使用されうる。

本実施例で上述される操作は、抗原検体に結合する初期抗体へのビオチニル化舅 ２抗体の結合を含む。又は、初期抗体自体は、ビオチニル化が、その抗原検体に 特異的に結合する能力をなくさないとすればビオチニル化が可能であり、第２抗 体結合工程が避けられる。抗体のビオチニル化は、イマム（Ｉｒｎａｒｎ）ら、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｓｇａｒｃ五４５巻、２６３−２７１ページ（１９８５年） の操作に従い、抗体のＮ−ヒドロキシサクシニミドビオチンとの直接反応により 実行される。

実施例Ｘ■ 本実施例は本発明に基づ（、細胞溶解質、血清または他の溶液から蛋白質を同定 する検定の使用を記述する。

記述される操作は「ウェスターン・プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）Ｊ法の 一型式である。

細胞が関与する場合、細胞溶解質が、２％ドデシル硫酸ナトリウム、２％２−メ ルカプトエタノール及び１０％グリセロールを含有するトリス−ＨＣ１緩衝液（ ｐＨ６，８）溶液（１００℃）を用いて可溶化するような標準操作によって調製 される。

該溶解質（または血清または他の溶液）は次にデーブリケート中ポリアクリルア ミドゲル電気泳動に供されるが、隣接するレーンにマーカーとして同定され５る 蛋白質を移動させる。標準的なプロッティング装置（例えば、トランス−プロッ ト装置、バイオ・ラッド・ラボラドリース、リッチモンド、カリフォルニア州、 米国）を使用し、該蛋白質はゲルからニトロセルロース・シートへ移される。実 験ゲルレーンのひとつ及びマーカーゲル・レーンはクーマーシー・ブルーを用い て染色される。該蛋白質検体を含有する可能性のあるゾーンは、試料中ｉｔ存在 するとすれば次に実験レーンから切断される。検体を含有する可能性のあるゲル ゾーンに対応するニトロセルロースペーパーのゾーンはペーパーから切断され、 蒸留水中３　（Ｗ／Ｖ）Ｂ　Ｓ　Ａを用いて１時間３７℃で浸され全ての非特異 的蛋白質結合部位を飽和させる。

親和性分子として該蛋白質に対するビオチニル化抗体を使用して、該蛋白質検体 がニトロセルロース片上にあるかを試験するために次の実施例の操作が行われる 。

実施例■ 本実施例は本発明に基づく検定を用いる、細胞表面糖蛋白質の同定を例示する。

本実施例の操作はゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）及びペナＣＰ−ｎａ）、Ｅｉｏｃｈ ａｍ、　Ｊ−２０８巻、３５１〜３５８ページ（１９８２年）のそれを変えたも ので、彼らはイイラミニダーゼ処理、培養、正常及び異常それぞれのヒト・皮膚 稙維芽細胞上の特異的細胞表１糖蛋白質を同定するためにビーナツツ凝集素及び ヒマノ実凝集素を使用した。

細胞は培養皿上に約２Ｘ　１０’　ａａｌｌａ／ａｎ”の密度で植えられる。２ ４時間後、同細胞は洗浄され、２％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、２％（ Ｗ／Ｖ）２−メルカプトエタノール、１０％（Ｖ／Ｖ　）グリセロール、０．０ １％ブロモフェノール・ブルーの０．１２５Ｍ）リスーＨＣ１緩衝液（ｐｆｆ６ ．８）溶液（１００℃）を用いて可溶化される。

該溶解質は次に５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供され、蛋白質はト ランス・プロット装置（バイオ・ランドラボラドリース）を使用してニトロセル ロースシートへ移すれる。該ニトロセルロースペーパー約５ｃ！！Ｌｔの大きさ の切片に切断される。結果としてできるニトロセルロース片は３％（Ｗ／Ｖ　） 　Ｂ　Ｓ　Ａ水溶液に１時間３７℃で浸され、全ての非特異的蛋白質−結合部位 を飽和する。該片は次にＨＢＳ溶液（１３７ｍ＆　Ｈａｃｋ、　２．７ｔｎＭ　 ＫＣＬ、　０．９　ｔａｕ　ＣａＣ４，０，５ｔｐｒＭ　ＭｇＣＬ、、３０ａＭ ヘペス、ｐＨ７，４）を用いてすすがれ、ビオチニル化レクチン（該溶解質の糖 蛋白質上の注目している炭化水素骨格に適切なものである）とともに、３％ＢＳ Ａを含有するＨＥＳ溶液中１０＃／−において、１時間室温でインキュベートさ れる。ビオチニル化レクチンは市販品であり、例えばベクター・ラボラドリース （ベーリンゲーム、カリフォルニア州）、から得られる。該片は次に、ＨＥＳ溶 液を用いて３０分間４回浸たすことにより充分洗浄され、実施例ＩのＭＤＶ−Ｉ ＲＮＡビオチン−アビジン付加物０．５−と、ＰＢＳ中約５μが−で１時間、室 温でインキュベートされる。アビジン−ビオチンＭＤＶ−ＩＲＮＡ付加物とのイ ンキュベーション後、過剰の付加物はＥＢＢを用いて３回洗い流される。該片は 次にトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）中０．Ｉ　Ｍ　ＤＴＴ　Ｏ，５−と１時間イ ンキュベートされ、結果としてできる溶液は、ＱβレプリカーゼにＡＮＡ複製を 触媒させて、実施例■の操作によりＭＤＶ−ＩＲＮＡに対する検定が行われる。

実施測定 生物標本（例えば、細胞培養、組織、血液、他の体液、食品材料など）由来の核 酸は、本発明に基づ（検定、すなわち、第一に核酸をひき出す標準技術（例えば 、標本約５μｔを４５℃で２０分間、３０　ｍｕ　）リス−ＨＣ１゜２　ｔｎＭ 　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　３％ドライド７、Ｔ１００．３００　ｔｔｔ／ｗｔプロテ アーゼに％ｐＨ７，５）約５μｔから約１−とともにインキュベートすること） により標本を破壊し、次に結果としてできる溶液を固体担体（例えばニトロセル ロース）上にプロット、そして実施例■〜Ｘに記述されるような操作を行い該核 酸検体を同定することによって検体断片または検体分子に対する検定が行われる 。

このような検定における対照は、検定されている生物標本と同じであるが検体を 含まないことが知られているものでありうる。

標本中の検体量の定量的評価のために、既知量の検体する複製率とを比較するこ とにより評価されうる。

実施例Ｗ 実施例■の操作が、非修飾リボヌクレオシド３リン酸が複製反応において使用さ れ、複製ＲＮＡが次のように同定されることを除いて、流用される：整数比希釈 （等容量のもの）された複製反応溶液が９６−指アリコツターを用いてジエチル アミノエチルセルロースペーパーのシートに移される。

該シートは次に室温で２００　ｒｇＭ　ＮａＣ１，３００ｗＭ酢酸アン七ニウム （、Ｈ６，０）溶液中洗浄され、ＲＮＡ中にとり込まれなかったりボヌクレオシ ドを除去する。

該シートは次に０．３μｆ／ｍｔ臭化エチジウムを用いて染色される。シャープ （５ｈａｒｐ　）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２巻、３０５５〜３０６３ ページ（１９７３年）及びペイリー（Ｂａｉｌａｙ）及びデピッドソン（Ｄａｔ ｒｉｄａｏ％）、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈａｔｎ、　７０巻、７５〜８５ページ（１９７６年）を見よ。

最後に洞々のプロットからの螢光がいくつかの既知技術のいずれかひとつによっ て測定される。対照プロット由来の螢光強度以上の、染色プロット由来のそれは 染色プロットＩＣ対応する試料プロット中の検体（すなわちｐＢＲ３２２）の存 在を示す。

他の染色材料が臭化エチジウムの代わりに使用され５る。これらの中にはメチレ ン・フ゛ルー（ディングマン（Ｄｉμ■）及びピーコック（Ｐ−ａｃｏｃｋ　） 、１９６８年、上記）；銀染色（サモンス（Ｓａｍｍｏｎａ　）、１９８１年、 上記；イブロイ（Ｉｇｌｏｉ）、１９８３年、　上記）：またはフィコピリ蛋白 質−Ｑβレプリカーゼ共役体（オオイ（Ｏ４）ら、１９８２年、上記ニスドライ ヤー（Ｓｔｒｙａｒ）ら、上記）が含まれる。

さらに、螢光測定よりもむしろ、ＲＮＡの染色に由来するプロットの色が評価さ れうる。

実施例店 大腸菌に−１２７６００株の培養物がｐＢＲ３２２を用いて形質転換され、テト ラサイクリン存在下１０＠ｃａｌｌり一まで培養される。０．１艷の培養液が３ ０　ｍ　Ｍ）すｙ、−ＨＣＬ、２ｔｎＭ　ＥＤＴＡ、３％トライトンＸ−１００ ゜３００　Ａｔ／−プロｆナーセＫ　（ｐＨ７，５）溶液ノ０．１　ｄ、１−１ １０ゴ、１００ゴ及び１００ｏ−のそれぞれに合わされ、結果としてできる溶液 ４５℃で２０分間加熱される。

対照溶液がテトラサイクリン非存在下ｐＢＲ３２２を用いて形質転換されていな い大腸菌に一１２７６００株を１０”　ｃａｌｌｓ／−まで培養し、次に同培養 液０．１−と上記で特定したプロテナーゼに溶液０．１−とを合わせ、結果とし てできる溶液を２０分間４５℃で加熱することにより調製される。

次に各５試験溶液の各３試料及び対照溶液の３μｔが、ニトロセルロース担体上 へドツト・プロットされる（標準９６−穴配列中、９６スペースの１８スペース に施される）。該担体は次に４００　ｍ、ｌｆ　ＮａＯＨを用いて飽和させたペ ーパー・タオルの先端におかれ、ＤＮＡを変性、次に連続的に（ＩＳ）４００ｍ ＆）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，０（ｂ）２０×ＳＳＣ及び（ｃ）１０ＸＳＳＣで飽 和させたペーパータオルと接触される。最後に該ニトロセルロースシートは８０ ℃で９０分間焼かれる。

実施例Ｖの３０−常−７が、実施例Ｉ及びＸの操作に従い、式−０（ＰＯ，）Ｎ Ｈ（ＣＨ２）ｔｓＳ（ＣＨｔ）ＪＨ（ＰＣｈ）＊０−　という骨格〔ここで、フ ォスフォラミゾ−トゲループは３０−ｍａｒ親和性分子及び複製可能ＲＮＡの５ ′−ヌクレオチドの炭素５′位に結合している〕によりＭＤＶ−１（＋）ＲＮＡ に結合している。

標準操作に従い、該シートは前ハイブリッド形成され、リッド形成溶液中３μが −で、ハイブリッド形成され、ハイブリッド形成後は洗浄され、ハイブリッド形 成されなかった親和性分子−ＭＤＶ−ＩＲＮＡハイブリッドを除去する。

次に該ニトロセルロースシートはエクテオラ（ＥＣＴ−ＥＯＬＡ）ペーパー（サ リス（Ｓａｒｒｉｓ　）ら、１９８２年、上記）シートの先端（または乾燥ペー パー・タオルの先端）におかれる。０．０５ｊ／）リス−ＨＣ１ＣｐＨ７，５） 中０、ＩＭＤＴＴで飽和した湿ったスポンジが該ニトロセルイブリッドのジスル フィドの還元により遊離され、エクテオラ・ペーパー（ここで、正電荷により付 着される）へ移される複製となる。

該エクテオラペーパーは次に１００μｆ／ｌｄ　Ｂ　ＳＡ浴溶液インキュベート され、蛋白質結合部位をブロックする。

該ペーパーは次に実施例■において記述されるＱβレプリカーゼ溶液と１５分間 インキュベートされる。

１５分間のインキュベーションに従い、該ペーパーは２００　ｍ）ｉ　ＮａＣ１ ，５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）を用いて洗浄され、とり込まれなかっ たりボヌクレオチドを除去する。該エクテオラ・ペーパー上の各プロットの放射 活性は次に例えば、９６−位β−放射スキャナー／ディジタイザ−（ゴウリアノ ス（Ｇｏｓｌｉａ％ｏｎ）ら、Ａ％ａ１．　Ｂｉｏｃｈｇｍ、　１０３巻、６４ −６９ページ、１９８０年）を使用して決定される。

または、該複製は非放射活性リボヌクレオシド３リン酸のみを用いて行われ、Ｒ ＮＡ量はその固有のＵＶ吸収（例えば、クラテラゼ（Ｋｕｌａｔａｌａｄｇａ） ら、１９７９年、上記らのフォトプリンティング法による）により決定されうる し、あるいは該エクテオラ・ペーパー上で直接、実施例Ｗで記述される染色技術 のひとつによっても決定されうる。

検定される溶液中のｐＥＲ３２２の存在は該エクテオラ・ペーパー上の対応する ＲＮＡ複製プロットに由来する、バックグラウンド信号（対照溶液に由来する） 以上の信号により示される。

大腸菌に一１２７Ｃ６００株の培養液ＣｐＢＲ３２２を用いて形質転換されたも の及びされていないもの）が実施例■の湯合のよ５に調製される。

次に未希釈対照液、未希釈ｐＢＲ３２２−形質転換培養液、１：１０希釈ｐＢＥ ３２２−形質転換培養液、１：１００希釈ｐＢＲ３２２−形質転換培養液、ｌ： １０００希釈ｐＢＲ３２２−形質転換培養液及び１：１００００希釈ｐＢＲ３２ ２−形質転換培養液（全ての希釈は細胞非存在培賽培地を用いる）それぞれの各 ３試料がポリプロピレン・ミクロ遠心分離チューブに加えられる。各ウェルに３ ０惟ＭトリスーＨＣ１，２常ＭＥＤＴＡ。

２％トライトンＺ−１００，３００μ？／−ブロテナーゼＫ（ｐＨ７，５）溶液 ５μｔが頒えられる。該プレートは次に２０分間４５℃でインキュベートされる 。２０分の終わりに、温度が１００℃に上げられ、インキュベーションをさらに ５分間続ける。該プレートを室温に冷却後、実施例■の親和性分子−ＭＤＶ−Ｉ ＥＮＡハイブリッドの水性塩溶液／フェノール懸濁液８μｔが５μ２／献で各ウ ェルに加えられ、ハイブリッド形成がコーン（Ｋｏｈ％＃）ら、（１９７７年） 、上記に従い５分間行われる。

各ウェル由来の水−フェノール混合物は次にアガロースゲル電気泳動に付され、 ｐＥＲ３２２（親和性分子〜ＭＤＩ！−Ｉ　ＥＮＡとハイブリッド形成したもの 及びしないもの）をはるかに小さい親和性分子−ＭＤＶ−ＩＲＮＡから分離する 。該ゲルは０．ＩＭＤＴＴ、０．０５Ｍ　）リス−する。

該複製ＲＮＡは次に電気プロッティング（ステルワークＣＳｔａｌ１ｗｇ）及び ダールベルク（Ｄａｈｌｂｍｒｇ）、Ｎｂｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｍ、　８巻、２９９−３１７ページ（１９８０年））によりエ クテオラ・ペーパーに移される。

最後に、複製ＲＮＡがエクテオラ・ペーパー中に複製−プロットされる工程後、 実施例■の操作が流用され、複製可能ＲＮＡの複製、該複製ＲＮＡの同定、及び 検定される試料中にｐＥＲ３２２が存在するか否かの確認が行われる。

本発明は、ＲＮＡ−依存性ＥＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ複製に基づくレポー ターシステムの使用により達成されうる感度のために、先行技術のシステムより も有意に進歩した生物検定システムを含む。これらのレポーターシステムを使用 する検定の感度は、親和性分子及び複製可能ＲＮＡの非特異的吸着に由来するバ ックグラウンドのみによって制限されるべきである。そうでなければ、このよう な検定の感度は、試料当たり１分子という理論的制限にとどめられるべきである 。

本発明はある程度の明細をもって記述されてきたが、当業者にとっては自明な修 飾が本発明の方向から逸脱することな（なされ５る。

本発明の様々な特徴は次の特許請求の範囲において提示される。

国際調査報告

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の生体高分子検体の存在を測定する方法であって、 （１）該試料を該検体にとつての親和性分子に、該親和性分子と該検体との間に 結合が生じるような条件下にさらし； （ｉｉ）該親和性分子が複製型ＲＮＡではない場合、段階（１）の前か後のいず れかで、複製型ＲＮＡを段階（１）で使用された親和性分子に結合させ； （ｉｉｉ）ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを使用して、検体に結合される親和性 分子に結合されるかまたは結合されていた、あるいは検体に結合されていた親和 性分子である、複製型ＲＮＡの複製に触媒作用を及ぼし；そして（ｉｖ）段階（ ｉｉｉ）反応によつてつくられたＲＮＡを検出することからなる方法。
2. ２．検体が核酸であり、親和性分子が該検体の断片の配列に対して相補性である 約２０ないし約４０００塩基の配列を有する断片を含む複製型ＲＮＡであり、該 複製型ＲＮＡの複製は検体からの該ＲＮＡの解離後である請求の範囲第１項の方 法。
3. ３．複製型ＲＮＡの親和性分子ヘの結合は、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによ る複製可能性を失うことなく複製型ＲＮＡに結合された第１連結部分および親和 性分子と検体との間の結合の特異性を失うことなく親和性分子に結合された第２ 連結部分によつて行なわれ、該第１および第２連結部分は互いに共有的に結合さ れているか特異的結合対であるかのいずれかである請求の範囲第１項の方法。
4. ４．親和性分子ヘの複製型ＲＮＡの結合が、複製型ＲＮＡと、親和性分子に結合 されるかそれに含まれている少くとも長さ１０塩基の核酸の断片とのハイブリダ イゼーシヨンによつて行なわれる請求の範囲第１項の方法。
5. ５．ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがＱβレプリカーゼであり、組換え複製型Ｒ ＮＡが該レプリカーゼによるインビトロでの複製のための鋳型である請求の範囲 第２項の方法。
6. ６．複製型ＲＮＡの複製が放射能標識リボヌクレオシド−５′−トリホスフエー トによつて行なわれ、得られた複製されたＲＮＡが放射能標識されている請求の 範囲第５項の方法。
7. ７．ＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼがＱβレプリカーゼであり、複製型ＲＮＡ がインビトロでの該レプリカーゼによる複製のための鋳型である請求の範囲第３ 項の方法。
8. ８．複製ＲＮＡの複製は放射能標識リボヌクレオシド−５′−トリホスフエート によって行なわれ、得られた複製されたＲＮＡが放射能標識されている請求の範 囲第７項の方法。
9. ９．親和性分子を試料にさらす前に、第１連結部分および第２連結部分がジスル フィド部分によつて互いに共有的に結合されている請求の範囲第８項の方法。
10. １０．第１連結部分が式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（式中ホスホ ラミデート部分が複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、 ｎが２〜８である）で表わされ、第２連結部分が式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ ２）ｍ−Ｓ−（式中ホスホラミデート部分が核酸親和性分子の５′−ヌクレオチ ドの５′−炭素に結合され、ｍはｎと同じでも異なつていてもよく、２〜８であ る）で表わされる請求の範囲第９項の方法。
11. １１．親和性分子が少くとも１つのプリン残基の断片を有する核酸であり、該断 片は親和性分子の３′−末端にあつて、親和性分子の検体結合断片の外側にあり 、該親和性分子の３′−末端はホスホジエステルによつて複製型ＲＮＡの５′− ヌクレオチドの５′−炭素に結合される請求の範囲第８項の方法。
12. １２．親和性分子及び複製型ＲＮＡがスマートプローブにおいて組合せられる請 求の範囲第９項の方法。
13. １３．第１連結部分と第２連結部分とが特異的結合対である請求の範囲第８項の 方法。
14. １４．第１及び第２連結部分の一方がビオチニルであり、他方が、ビオチニルと 複合体を形成することによつて親和性分子または複製型ＲＮＡに結合されたアビ ジンである請求の範囲第１３項の方法。
15. １５．ビオチニル部分が式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ（ＳＳ）ｑ（ＣＨ ２）ｒＮＨ−（式中上記ホスホラミデート部分は５′−ヌクレオチドの５′−炭 素に結合され、ｐおよびｒは同じか異なつており、各々２〜８であり、ｑは０ま たは１である。）のスペーサーアームによつて複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチ ドに結合されている請求の範囲第１４項の方法。
16. １６．親和性分子がビオチニル化された抗体であり、アビジンが複製型ＲＮＡに 結合された該ビオチニルと複合体を形成する請求の範囲第１５項の方法。
17. １７．親和性分子がビオチニル化したレクチンであつて、アビジンが複製型ＲＮ Ａに結合された該ビオチニルと複合体を形成する請求の範囲第１５項の方法。
18. １８．親和性分子が、光化学的にフオトビチオンで、あるいは酵素的に、ウラシ ル部分のＣ−５によつてビオチニルと結合されているｄＵＴＰまたはＵＴＰある いはアデニン部分のＣ−６またはＣ−８によつてビオチニルに結合されているｄ ＡＴＰで、あるいは化学的に５′−ヌクレオチドの５′−炭素において式−Ｏ− ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ（ＳＳ）ｔ（ＣＨ２）ｕＮＨ−（式中ホスホラミデ ート部分は５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｓおよびｕは同じか異 なつており、各々２〜８であり、ｔは０〜１である）のスペーサーアームでビオ チニル化された核酸であり、アビジンが複製型ＲＮＡに結合されたビオチニルと 複合体形成している請求の範囲第１５項の方法。
19. １９．親和性分子が５′−ヌクレオチドの５′−炭素でビオチニル化されている 請求の範囲第１８項の方法。
20. ２０．複製型ＤＮＡに結合された親和性分子を検体に結合後で複製型ＲＮＡの複 製前に、第１及び第２連結部分を共有的に結合しているジスルフイドを還元する ことによつて親和性分子から複製型ＲＮＡが分離される請求の範囲第９項の方法 。
21. ２１．複製型ＤＮＡに結合した親和性分子を検体に結合後で複製型ＲＮＡの複製 前に、第１および第２連結部分を共有的に結合しているジスルフィドの還元によ つて親和性分子から複製型ＲＮＡが分離される請求の範囲第１０項の方法。
22. ２２．複製型ＤＮＳに結合された親和性分子を検体に結合後で複製型ＲＮＡの複 製前に、酸による脱プリン化とそれにつづβ−脱離によつてホスホジエステル結 合を切断することにより親和性分子から複製型ＲＮＡを分離する請求の範囲第１ １項の方法。
23. ２３．複製型ＤＮＳに結合した親和性分子を検体に結合後で複製型ＲＮＡの複製 前に、第１と第２連結部分を共有的に結合しているジスルフィドの還元によつて 親和性分子から複製型ＲＮＡを分離する請求の範囲第１２項の方法。
24. ２４．スペーサー基のｑが１であり、複製型ＲＮＡに結合された親和性分子を検 体に結合後で複製型ＲＮＡの複製前に、複製型ＲＮＡをビオチニルに結合してい るスペーサーアームのジスルフイドの還元によつて親和性分子から複製型ＲＮＡ が分離される請求の範囲第１５項の方法。
25. ２５．スペーサー基のｑが１であり、複製型ＲＮＡに結合された親和性分子の検 体ヘの結合後で複製型ＲＮＡの複製前に、複製型ＲＮＡをビオチニルに結合する スペーサーアームのジスルフイドの還元によつて親和性分子から複製型ＲＮＡを 分離する請求の範囲第１６項の方法。
26. ２６．スペーサー基のｑが１であつて；複製型ＲＮＡに結合された親和性分子の 検体ヘの結合後で複製型ＲＮＡの複製前に、複製型ＲＮＡをビオチニルに結合す るスペーサーアームのジスルフイドの還元によつて親和性分子から複製型ＲＮＡ を分離する請求の範囲第１７項の方法。
27. ２７．スペーサー基のｑが１であり；複製型ＲＮＡに結合された親和性分子の検 体ヘの結合後で複製型ＲＮＡの複製前に、複製型ＲＮＡをビオチニルに結合する スペーサーアームのジスルフイドの還元によつて親和性分子から複製型ＥＮＡを 分離する請求の範囲第１９項の方法。
28. ２８．ＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼがＱβレプリカーゼであつて、組換え複 製型ＲＮＡがインビトロでの該レプリカーゼによる複製のたりの鋳型である請求 の範囲第４項の方法。
29. ２９．親和性分子が核酸である請求の範囲第２８項の方法。
30. ３０．複製型ＲＮＡに結合された親和性分子。
31. ３１．複製型ＲＮＡの親和性分子ヘの結合は、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに よる複製可能性を失うことなく複製型ＲＮＡに結合された第１連結部分および親 和性分子と検体との間の結合の特異性を失うことなく親和性分子に結合された第 ２連結部分によつて行なわれ、該第１および第２連結部分は互いに共有結合され ているか特異的結合対であるかのいずれかである請求の範囲第３０項の親和性分 子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
32. ３２．複製型ＲＮＡがＱβレプリカーゼによるインビトロての複製のための鋳型 である請求の範囲第３１項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
33. ３３．第２連結部分と第１連結部分が親和性分子および複製型ＲＮＡに各々共有 的に結合し、ジスルフイド部分によつて互いに共有的に結合されている請求の範 囲第３２項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
34. ３４．第１連結部分が式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（式中ホスホ ラミデート部分が複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、 ｎが２〜８である）で表わされ、第２連結部分が式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ ２）ｍ−Ｓ−（式中ホスホラミデート部分が核酸親和性分子の５′−ヌクレオチ ドの５′−炭素に結合され、ｍはｎと同じでも異なつていてもよく、２〜８であ る）で表わされる請求の範囲第３３項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド 。
35. ３５．親和性分子が少くとも１つのプリン残基の断片を有する核酸であり、該断 片は親和性分子の３′−末端にあつて、検体の標的断片の配列に対して相補性で ある配列を有する親和性分子の断片の外側にあり、該親和性分子の３′−末端は ホスホジエステルによつて複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結 合されている請求の範囲第３２項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
36. ３６．第１連結部分を第２連結部分が特異的結合対である請求の範囲第３２項の 親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
37. ３７．第１及び第２連結部分の一方がビオチニルであり、他方が、ビオチニルと 複合体を形成することによつて親和性分子または複製型ＲＮＡに結合されたアビ ジンである請求の範囲第３６項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
38. ３８．ビオチニル部分が式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ（ＳＳ）ｑ（ＣＨ ２）ｒＮＨ−（式中上記ホスホラミデート部分は５′−ヌクレオチドの５′−炭 素に結合され、ｐおよびｒは同じか異なつており、各々２〜８であり、ｑは０ま たは１である。）のスペーサーアームによつて複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチ ドに結合されている請求の範囲第３７項の親和在分子−複製型ＲＮＡハイブリッ ド。
39. ３９．親和性分子はビオチニル化抗体である請求の範囲第３８項の親和性分子− 複製型ＲＮＡハイブリッド。
40. ４０．親和性分子がビオチニル化レクチンである請求の範囲第３８項の親和性分 子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
41. ４１．親和性分子が、光化学的にフオトビオチンで、あるいは酵素的に、ウラシ ル部分のＣ−５によつてビオチニルと結合されているｄＵＴＰまたはＵＴＰある いはアデニン部分のＣ−６またはＣ−８によつてビオチニルに結合されているｄ ＡＴＰで、わるいは化学的に５′−ヌクレオチドの５′−炭素において式−Ｏ− ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ（ＳＳ）ｔ（ＣＨ２）ｕＮＨ−（式中ホスホラミデ ート部分は５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｓおよびｕは同じか異 なつており、各々２〜８であり、ｔは０〜１である）のスペーサーアームでビオ チニル化された核酸であり、アビジンが複製型ＲＮＡに結合されたビオチニルと 複合体形成している請求の範囲第３８項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッ ド。
42. ４２．親和性分子が５′−ヌクレオチドの５′−炭素でビオチニル化されている 請求の範囲第４１項の親和性分子−複製型ハイブリッド。
43. ４３．ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる複製型ＲＮＡのインビトロでの複 製可能性を失うことなしに、連結部分に結合された複製型ＲＮＡであつて；該連 結部分は、親和性分子に結合されている連結部分ヘの共有的結合、あるいはこの 親和性分子に結合された連結部分との特異的結合対の一員であることによつて、 複製型ＲＮＡと親和性分子との間の結合を行うことができるＲＮＡ。
44. ４４．インビトロでのＱβレプリカーゼによる複製のための鋳型である請求の範 囲第４３項の複製型ＲＮＡ。
45. ４５．複製型ＲＮＡが結合されている連結部分が硫黄、ビオチニル、または複合 体形成によつてビオチニルに結合されたアビジン（一方このビオチニルは複製型 ＲＮＡに結合されている）である請求の範囲第４４項の複製型ＲＮＡ。
46. ４６．連結部分がビオチニルまたはアビジンであり、どちらの場合でも、ビオチ ニルが式−Ｏ−ＰＯ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ（ＳＳ）ｑ（ＣＨ２）ｒＮＨ−（式 中上記ホスホラミデート部分は５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｐ およびｒは同じか異なつており、各々２〜８であり、ｑは０または１である。） のスペーサーアームによつて複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドに結合されてい る請求の範囲第４５項の複製型ＲＮＡ。
47. ４７．連結部分が硫黄であつて式−Ｏ（ＰＯ２）ＮＨ（ＣＨ２）ｐ−（式中ホス ホラミデート基は５′−ヌクレオチドの５′−炭素に結合され、ｐは２〜８であ る）のスペーサー基によつて複製型ＲＮＡの５′−ヌクレオチドに結合される請 求の範囲第４５項の複製型ＲＮＡ。
48. ４８．核酸親和性分子に共有的に結合された複製型ＲＮＡからなるスマートプロ ーブ。
49. ４９．複製型ＲＮＡがＱβレプリカーゼによる複製のための鋳型であり、複製型 ＲＮＡの５′−ヌクレオチドの５′−炭素および親和性分子の５′−ヌクレオチ ドの５′−炭素は式−Ｏ（ＰＯ２）ＮＨ（ＣＨ２）ｙＳＳ（ＣＨ２）ｚＮＨ（Ｐ Ｏ２）Ｏ−（式中ｙとｚは同じか異なつており各々２〜８である）の部分によつ て結合されている請求の範囲第４８項のスマートプローブ。
50. ５０．親和性分子が５′−クランプ断片および３′−クランプ断片の両方を有す る請求の範囲第４９項のスマートプローブ。
51. ５１．複製型ＲＮＡが親和性分子の３′−末端における断片の配列と相補性の配 列をもつ断片を有する複製型組換えＲＮＡである請求の範囲第４９項のスマート プローブ。
52. ５２．親和性分子が、該親和性分子に結合された、あるいはそれに含まれた少く とも１０塩基の長さの核酸の断片と複製型ＲＮＡとのハイブリダイゼーシヨンに よつて複製型ＲＮＡに結合されている請求の範囲第３０項の親和性分子−複製型 ＲＮＡハイブリッド。
53. ５３．複製型ＲＮＡがインビトロでのＱβレプリカーゼによる複製のための鋳型 である請求の範囲第５２項の親和性分子−複製型ＲＮＡハイブリッド。
54. ５４．親和性分子が蛋白質である請求の範囲第５３項の親和性分子−複製型ＲＮ Ａハイブリッド。
55. ５５．親和性分子が核酸である請求の範囲第５３項の親和性分子−複製型ＲＮＡ ハイブリッド。