JPH02245663A - 高度な特異的活性を有するヌクレオチドプローブの化学的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術的背景 特異的オリゴヌクレオチド配列（５ｅｑｑｅｎｃｅｓ）
は相補的ヌクレオチド配列を検出する極めて有用な手段
である。核酸プローブの二つの必要条件は、配列特異シ
グナル及び単一のハイブリッド形成（１１ｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔ　１ｏｎ）事例を多重的検出可能な事例に変換す
る要素の形成である。標識プローブを製造する現在の酵
素的方法においては、放射性又はビオチン化された（ｂ
ｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ヌクレオチドがＤＮＡポリメ
ラーゼ又は末端転移酵素のような重合酵素の使用により
プローブ中に導入されている。単一な酵素又はハブテン
分子を化学的にＤＮＡ中に導入する多くの方法が利用で
きるが、これらの単一に標識されたグローブは充分なシ
グナル（ｓｉｇｎａｌ）を発生せず、従って生物学的試
料中の相補的配列を検出するのに必要な感度を欠いてい
る。

例えばワード（Ｗａｒｄ）等の米国特許第４，７１１゜
９５５号は化学的決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）
を用いてヌクレオチドを誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚ
ｅ）する方法を開示している。＠導体化されたヌクレオ
チドは次いで酵素的に重合される。こうしてこれらの類
似体は核酸ポリメラーゼに対し基質として作用する。こ
の目的のためには化学的決定因子が環上の位置に置かれ
ず立体的に、言い換えれば、塩基の正常のワトンン・ク
リック（Ｗａｔｓｏｎ　Ｃｒｆｆ１ｃｋ）水素結合ポテ
ンシャルを妨害することが重要である。

本発明の総括 本発明は当技術分腎に既知の標識された核酸プローブの
合成とは別な方法を提供する。本文に記載される方法は
下記の： ａ）少なくとも約１０のヌクレオチド塩基のヌクレオチ
ド配列から成り、該配列が少なくとも一つの“５′端（
ｅｎｄ）”及び“３′端”を含む、第一″標的認識成分
“を提供すること、 ｂ）該第一標的認識成分を該５′端又は３′端、又はそ
の両者に“反応的官能基”が含まれるように化学的に改
質すること、及び Ｃ）該第一標的認識成分上に与えられた少なくとも一つ
の反応官能基と反応することができる官能基を含む少な
くとも一つの末端を有する第二の“シグナル発生成分”
を提供すること、及びｄ）少なくとも一つの反応的官能
基を含む該第一の標的認識成分を該第二シグナル発生成
分の少なくとも一つの該末端と化学的に反応させ、これ
らの二つの成分を化学的ｔこ結合し、該ｓｍされたヌク
レオチドプローブを製造することの段階から成る標識さ
れた“ヌクレオチドプローブの化学的合成である。

或具体化においては、シグナル発生成分の一つ又は両末
端が標的認識成分の反応的官能基の一つ又は両方と反応
する官能基を含むように化学的に改質される。

本発明は又この二成分の化学的結合体から形成された標
識されたヌクレオチドプローブ、及び該プローブを含む
診断用及び研究用試薬を提供する。

本文で使用されるような“ヌクレオチドプローブという
用語は配列の一部として、被検ヌクレオチド配列に、少
なくとも部分的にハイブリッド形成することができ、及
び該被検配列を検出し、監視し、局所化し、単離する等
に使用できる成分を有する、標識されたヌクレオチド配
列を意味する。この用語はオリゴヌクレオチド、ホモポ
リヌクレオチド、ポリヌクレオチド等を含むものとして
広義に解されねばならない。

本文に用いられる“ハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ）“という用語は、標的核酸配列の全部又
は一部に結合する相補的塩基対結合を称する、即ちニブ
ローブは少なくとも成程度の相補性を含まなければなら
ない。この結合は完全に合致する必要はないことを理解
すべきである。実際内部ループ、バルジ（ｂｕｌｇｅ）
ループ、ヘアピンルーズ、十字形結合をもたらす不対領
域、又は他の不適合領域が存在してもよい。ハイブリッ
ド形成は標的の検出を可能とするのｌこ必要な程度に起
こる必要性があるだけである。

本文で使用されるように、′標的認識成分”　（ＴＲＭ
）という用語は被検試料とハイブリッド形成又は結合す
るプローブの部分を意味する。標的認識成分はヌクレオ
チド配列から成り、ヌクレオチド塩基の特異的配列、ホ
モポリヌクレオチド配列等である、該被検体（ａｎａｌ
ｙｔｅ）と結合する任意の適当な形態をとることができ
る。

本文で使用される“シグナル発生成分”　　（ＳＧＭ）
は放射性１ｉ１ｉｉｉ１１に１酵素的標識、化学的標識
、免疫的標識等によるシグナルを発生することができる
プローブの一部を意味する。

本文で使用される“標的被検体配列”は生物学的、生理
学的、環境的試料等に見いだされる、生物的物質中に含
まれるか又はそれに関係する核酸の全部又は一部を称す
る。

本文で使用される“５′端“及び３′端”は技術上一般
に受容されている意味、即ちヌクレオチド配列の一端の
末端ヌクレオチドが燐の酸素の一つがペントースの第五
又は第＝炭素厚子の夫々のいずれかに自由に結合し得る
、遊離の５′及び３′基を有するという意味に解釈すべ
きである。

本文で記載されるようにプローブの化学合成は一層制御
された量の標識がシグナル発生成分中に組み込まれると
いう利点を提供する。こうしてシグナルの増幅が容易に
完遂される。標識はシグナル発生成分がポリヌクレオチ
ドである時には、該成分の各種の位置に付けることがで
きる。好適な＾体化においては、シグナル発生成分はポ
リヌクレオチドであり、標識はこのヌクレオチドがハイ
ブリッドを形成する能力を妨害し、かくて標的認識成分
のみが標的被検体とハイブリッド形成することを確実す
るようなポリヌクレオチド上の位置に取り付けられる。

シグナル発生成分が核酸のハイブリッド形成に利用出来
る必要はなく、或具体化においては、シグナル発生成分
はポリヌクレオチド以外の重合体をも含み、従ってハイ
ブリッド形成に利用できない。

主１１トλ色座 本発明はグローブの二種の成分、即ち標的認識配列成分
及びシグナル発生成分の化学的カップリング又は結合体
（ｊｏｉｎｄｅｒ）による、標識されたヌクレオチドプ
ローブの化学的合成方法を提供する。

本発明の標識されたヌクレオチドプローブの第一成分は
、少なくとも約１０個のヌクレオチド塩基のヌクレオチ
ド配列から成る標的認識配列成分である。この成分は標
的被検体と全体的に又は部分的にハイブリッド形成する
ことが可能である。

それは任意の各種の方法で与えることができる。

例えば、検出することを必要とする生物体のゲノムＤＮ
Ａから単離することができ、組換え的に製造してもよく
、又は標準のオリゴヌク１７オチド合成方法によって化
学的に合成してもよい。後者に対する適当な方法につい
ての良い記述は、メン・ンズ・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５
４巻、２２１−３２８頁、アカデミツク・プレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｎ、Ｊ、、１９８７、レ
ー・つ（Ｒａｙ　ｌ＃ｕ）及びり、グロスマン（Ｇｒｏ
ｓｓｍａｎ）、編集、に見いだすことができる。少なく
とも成程度、被検体の核酸の少なくとも一部と結合でき
る限り、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラ
シル、又はメチルシトシンを含む任意の形態の窒素塩基
が、この成分のヌクレオチド配列を形成することが予想
される。

結合事象は標的被検体の検出を行うのに適当な程度まで
の任意の相補的塩基対の結合である。これに関しては、
標的認識成分のヌクレオチド配列の長さも数百の塩基か
ら約１００の塩基に亙る広範囲に変わることができ、及
び好適には約５−７５、より好適には約５−６０であり
、及び約１５−５０の塩基が最も好ましい。この時点で
、以上のうち後者の配列長さは、この長さであれば使用
が容易になることが見出されたので、好適である。

これは、一般に１５ないし５０の範囲のヌクレオチド塩
基の配列は、便利に合成することが容易であり、費用が
効率的であり、且つ各種の操作及び処理に耐える安定な
二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｒｎｄｅｄ）構造を与え
るのに充分な水素結合性能を有しているという現象によ
るものである。約１００塩基より大きい配列は、その合
成が困難であり、費用効率が少なく、分子内に二次構造
が発生する機会が増加する点で使用の際に困難を伴う。

ポリヌクレオチド配列の長さが成長さを超えても、ハイ
ブリッドには殆ど安定性が追加されることがないことは
濁知である。当業者にはこの結合成分に対する適当な長
さが、又或程度被検体の配列それ自体の結合特性によっ
て支配されることが認められよう。

或場合には直接又は間接にリポータ−（ｒｅｐｏｒｔｏ
ｒ）分子として役立つというような各種の理由から、標
的認識成分のヌクレオチド配列中の色々な位置に誘導体
又は化学的成分を組み込むことが望ましいことを理解す
べきである。例えば５置換ピリミジン及び７置換プリン
のような誘導体が要望される。配列中の各種の位置にこ
うした化学的誘導体を付加することが、標的認識成分の
被検体への結合を事実上妨害しない限りにおいて、任意
のこれらの誘導体は本発明の範囲内にある。

プローブの第二成分はシグナル発生成分である。

これは検出可能な標識を含むことができ、更に少なくと
も一つの末端上の官能性基によって、標的認識成分に化
学結合が可能である任意の重合体を包含する。この見地
から見た適当な重合体の例は、アルブミン及びゼラチン
のような蛋白質、誘導体化したラテックス　ビーズ、デ
キストラン、他の合成又は天然生体高分子、及びホモポ
リヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチ
ド等である。これらの高分子の間で、シグナル発生成分
として使用するのに好適なものはヌクレオチド配列であ
る。これはその合成及び標識の容易さ及び制御可能な増
幅によるものといえる。これらのヌクレオチド配列は、
プローブの標的認識成分部分の被検体への結合をシグナ
ルすることができる標識を含む限り、それらの特定の配
列内で広範に変えることができる。ヌクレオチド配列は
ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。好適なシグナル発生
成分であるポリヌクレオチド配列によりもたらされる大
きな利点の一つは、使用者が配列中の一定の場所に多重
標識を与えることができることである。これにより従来
可能であったよりも、多くの使用者の制御が可能となる
。シグナル発生成分中の高分子の標識は、通常の放射性
同位元素標識、化学的標識、免疫学的標識、又は光散乱
効果（ａｆｆｅａｔ）等を用いる標識を含む多くの形態
をとることができる。

このように、シグナル発生成分の標識は放射線標識（例
えば”０％　”Ｐ％　”Ｈ等）、酵素（例えばペルオキ
シダーゼ、アルカリ又は酸ホスファターゼ、等）、細菌
標識、蛍光標識、抗体標識（二重抗体系において使用す
ることがでさる）、抗原（標識された抗体と共に使用さ
れる）、ビオチン（アヴイジン、ストレプトアヴイジン
又は抗ビオチン系と共に使用される）の類のハプテンの
ような小分子、杭フルオレッセインと共に使用されるフ
ルオレッセインのようなハプテン、ラテックス粒子（浮
力又はラテックス凝集系において使用される）、フェリ
チンのような電子高密度化合物（電子顕微鏡と共に使用
される）、又はコロイド金のような光散乱粒子、又は任
意の組み合わせ又はそれらの入れ替え、を含むことがで
きる。

シグナルは任意の種類の普通の技術でシグナル発生成分
により発生される。例えばシグナル発生成分の標識部分
が抗原であれば、該抗原を抗体／酵素コンジュゲー）　
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と複合させ、続いて酵素の基質
を加えることによりシグナルを発生することができる。

シグナル発生成分の標識部分が抗体であれば、抗抗体又
はプロティンＡのようなＦ６結合蛋白質をそれらと複合
させることによって発生することができる。これらの第
二抗体又はプロティンＡは既に酵素とコンジュゲートし
ているものである。

プローブの取り扱いにおける容易性及び安全性の理由か
ら、シグナル発生成分は化学的に、特に免疫原的に又は
酵素的に標識することが好適である。より好適な具体化
において、選りすぐられた化学的＊識はビオチン、イミ
ノビオチン、フルオレッセイン等のようなハプテンであ
る。これらは現在合成の容易さ、並びに特異的な高活性
の二次試薬及びそれらの使用技術の利用が可能であるこ
とによって好適である。例えば、シグナル発生成分はア
ルキルジアミンと処理するような普通の技術により、ハ
プテンで標識することができる。ビオチン−ＮＨＳエス
テル、フルオレッセインイソチオシアアネート（ＦＩＴ
Ｃ）等のような活性化されたハプテンが、アミン官能基
により化学的に結合できる。このようにして存在する活
性ハプテンの量は、この目的のために使用者により与え
られるアミンを能基のアルキルジアミンとの処理による
利用可能性によって調節される。

シグナル発生成分がヌクレオチド配列から成る一つの好
適な具体化において、シグナル発生成分はビオチン／ス
トレプトアヴイジン系に基づくシグナルを発生する。こ
の系は各種の手段によりシグナル発生成分中に組み込む
ことができる。例えば、シグナル発生成分のヌクレオチ
ド部分はシトクロムＣブリッジ（ｂｒ　ｉｄｇｅ）を経
てビオチンに共有結合的に結合することができ、（マニ
ング［Ｍａｎｎｉｎｇ］等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｓ　１６：１３６４−１３７０　（１９７７）、マニン
グ等、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、　５３：１０７−１１７
　（１９７５）、ソジャ−［５ｏｄｊａｌ、Ａ、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ％５：３８
５−４０１　（１９７８））　、又はビオチンは特異的
なヌクレオチド残基に共有結合的に結合することができ
、（ランガー［Ｌａｎｇｅｒ］　Ｐ、Ｒ，、Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ
　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ＩＪＳＡ、　７８：６６
３３−６６３７　（１９８１））、又は上で言及したよ
うに、ビオチンはジアミン（例えばペンタンジアミン）
ブリッジによりポリヌクレオチドに結合できる（ブロー
カー［Ｂｒｏｋｅｒ］Ｔ、Ｒ，等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、巨！３６３−３８４　（
１９７８））。シグナル発生成分中のビオチン分子とア
ヴイジン、ストレプトアヴイジン又は抗ビオチン抗体と
の相互作用が次いで行われるが、この場合アヴイジン、
スト１〆プトアヴイジン又は抗体は、ラテックス粒子（
ソジャー、Ａ１等、前掲、又はマニング等、Ｃｈｒｏｍ
ｏｓｏｍａ、前掲）、フェリチン（ブローカー、前掲）
、フルオレッセインのような蛍光ＪＩＫ　（ｆ　ｌｕｏ
ｒｏｇｅｎ）、酵素、二次抗体、磁性粒子等のようなシ
グナル発生成分にコンジュゲートしている。

シグナル発生成分の機能は被検体への結合の存在でシグ
ナルを発することであるにも留意すべきである。従って
この成分内のヌクレオチドが被検体、又は分析時に試料
中に存在するかもしれない任意の他の塩基とハイブリッ
ド形成することは、発生するシグナルを消すかも知れな
いので望ましくないことを理解すべきである。それ故こ
の塩基の通常のハイブリッド形成機能を防ぐために、第
四炭素原子上のシトシン塩基をビオチン、免疫ビオチン
、フルオレッセイン等のようなハブテンで置換すること
が好適である。

シグナル発生成分は市販により得られるか又は天然給源
からの変性−重鎮ＤＮＡ、物質源からのＲＮＡ、オリゴ
ヌクレオチドの化学合成、ホモポリヌクレオチド及びホ
モオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含めた
任意の適当な原料から製造できる。この配列は必要なシ
グナル増幅及び取り付ける可き標識の量に相応した方式
により長さが変わる。しかし約５０ないし２００の長さ
が生物学的試料の検出及び長い配列を合成する上の実際
的な制約のために必要な増幅によって特に有用であるこ
とが見出された。又非常に長い尾部（ｔａｉｌ）はハイ
ブリッド形成速度に影響を及ぼす傾向があることも理解
すべきである。好適な長さ範囲は約５０ないし２００、
最も好適には約ｌＯＯないし約１５０である。

本発明の第一段階において、標的認識成分のヌクレオチ
ド配列の５′又は３′末端又はその両者は、この標的認
識成分がプローブの第二成分であるシグナル発生成分の
一つ又は両末端との化学結合を可能とする、反応性官能
基を組み込むように化学的に改質される。適当な官能基
は広範囲に変わるが、一般に標的配列の３′端又は５′
端のいずれかにおいて二成分の化学的な結合を可能とす
るようなものとして記載することができる。本文中に記
載したようなプローブを形成するシグナル発生成分の標
的認識成分へのこの化学結合は、引き続いてプローブを
ハイブリッド形成検定に使用する際これら二成分の解離
に対し強力である。言い換えれば、プローブの二つの成
分はプローブの標的配列成分ハイブリッドｙｆｌ戊に際
し、相互に分離してはならない。こうしてグσ−プが標
的被検体にハイブリッド形成する時に、この複合体を標
識するシグナル成分を一緒に帯動し、その標識が後で検
出される。

標的認識成分の一方又は両末端において種々の官能基を
生成するｔ＝めに多数の方法が使用される。

こうして生成したこれらの反応性官能基の利用可能性に
ついて、プローブの二成分を一緒に結合するために多数
の化学反応が使用できることを理解するべきである。好
適な官能基の中でカルボキシル基、燐酸基、チオール基
、アミノ基、ヒドロキシル基等を挙げることができる。

一つの成分を他の成分に結合する好適な化学結合の中で
、エステル結合、燐酸エステル結合、７オスフアミド結
合、ジスルフィド結合等を挙げることができる。

尚業者は又シグナル発生成分は、標的認識成分の一方又
は両末端に生成する官能基と反応できる適当な官能基を
含まなければならないことを容易に理解されよう。こう
して或場合には、適当な反応基が既に存在していなけれ
ば、適当な反応基をシグナル発生生成の一方又は両末端
に生成させなければならない。下記の表は標的認識成分
又はシグナル発生成分の末端に付与できる代表的な官能
基、及び得られる化学結合を示している。

シル基 上記に示唆された組み合わせは各夫々の分について記載
された官能基に関して完全に反対であることもできる。

例えば標的認識成分が末端ヒドロキシル基を含み、一方
シグナル発生成分が燐酸基を含むか又は含むように改質
される。

上記に記載した表の最初の例を参照すると、標的認識成
分の一方又は両末端に化学的手段又は酵素的手段によっ
て燐酸官能基が与えられる。これはポリヌクレオチドキ
ナーゼ及びＡＴＰを用いるか、又は化学合成による燐酸
化を行う等のような技術上周知の燐酸化方法の使用によ
り実施することができる。シグナル発生成分は末端ヒド
ロキシル基を含んでいても良い。一方、周知の燐酸化方
法により燐酸基を含むように改質し、慣用の化学反応を
用いてそれをアミン、カルボキシル、又はチオール基に
転換する。適当な末端反応性官能基を含む二つの成分を
水溶性カルボイミドとカップリングするか、又はヘテロ
ニ官能性試薬の使用により二成分を結合させるような慣
用の方法を用いて反応させる。

次いで反応方式が第１図にも例示されている、第二の代
表的な組み合わせを参照すると、標的認識配列が一方又
は両末端においてカルボキシル官能基を含むように改質
される。好適な具体化において、これは３′端又は５′
端のいずれかを最初に燐酸化することによって行うこと
ができる。燐酸化ＤＮＡの燐酸基をイミダゾール／エチ
ル−シアメチルアミノ−プロビルカルポジアミド（ＥＤ
ＡＣ）で活性化し、次いでε−アミノカプロン酸のよう
な過剰のアミノ酸と反応させてカルボキシル基を生成す
る。次いで標的認識成分を過剰のＥＤＡＣの存在におい
て反応性末端ヒドロキシル基を含むシグナル発生成分と
反応させて、二つの成分を化学的に結合するエステル結
合を形成する。

更に反応式が第２図に例示されている第三の交換法を参
照すると、燐酸化された標的認識成分は活性化された燐
酸とジアミンの反応によってアミノ官能基が与えられる
。第二の例の場合に上に記載されたように、ＥＤＡＣと
の反応、及び引き続いてヘキシルジアミンのようなアル
キルジアミンの過剰量との反応が好適である。

上表記載の第四番目に例示された組み合わせにおいて、
燐酸化された標的認識成分がまず上記のようにアミン化
され、次いでアミノ官能基がＮ−スクシンイミジル　３
−（２−ピリジルジチオ）グロビオネエート（ＳＰＤＰ
）のような適当なヘテロニ官能性試薬の使用によりチオ
ール基に変換される。この組み合わせにおいては、シグ
ナル発生成分の−又は両末端基にはスルフヒドリル基が
付与される。次いで酸化的カップリングを用いて、二成
分を反応させ、ジスルフィド結合を形成するか、又は一
端上にマレインイミド基及び他端にＳＨ基を使用するこ
とにより反応させる。

上記に引用したように、シグナル発生成分は検出可能な
標識を含むことができる任意の高分子から成り、該重合
体は更に標的認識成分の一方又は両末端に化学°的に結
合することができる。多官能性高分子がこの成分を構成
するのに適当に使用される。例えばビオチン等のように
標識部分にカルボキシル基を含み、及び標的認識配列に
化学的に結合する少なくとも一つの末端アミン官能基を
含む高分子を使用することができる。

末端単糖上のヒドロキシル基がアルデヒド基に変換され
、次いで末端アミノ基を含む標的認識成分と反応するこ
とにより、多糖類も適当に使用することができる。

３′端にジオール基を何するリボヌクレオチドもジアル
デ・ヒトを生成する慣用の過沃素酸反応により同様に改
質することができる。次いでジアルデヒドを還元アミノ
化によりアミノ基に変換して次いで標的認識成分と反応
させ、ホス７アミド結合又は任意の他の適当な結合させ
ることができる。

別法として、アルデヒド基を標的認識成分上に付与され
た５゛及び３′アミノ官能基と反応させて、シックの塩
基を形成し、次いで水素化硼素還元に付される。下記図
式はこれらの最後に挙げた機構案を描いたものである： 標的認識成分　　　　　　　標的認識成分本文の全体に
互って言及したように、シグナル発生成分又は標的認識
成分のいずれかの一方又は両方の末端基は、記載された
ような反応性官能基を提供される。標的認識成分の両末
端が反応性であれば、化学結合はシグナル発生成分の両
末端に生成可能であることは想像できる。次いでシグナ
ル発生成分のどちらかの側にある標的認識成分を用いて
プローブが構成される。シグナル発生成分の両側が反応
性であれば、反対側の構成物が形成されよう。ヌクレオ
チドグローブの各々の成分がいずれかに反応性基を有し
ていれば、反復重合体（ｒｅｐｅＬａＬｉｖｅ　ｐｏｌ
ｙｍｅｒ）又は循環標識プローブを形成することができ
る。

シグナル発生成分がヌクレオチド塩基から成る好適な臭
体化において、総ての可能な末端−末端の組み合わせは
本発明の範囲内にある。例えば化学結合は５　Ｊ　−５
＃結合、３’−３’結合、又は５′−３°結倉又は３’
−５’結合であってもよい。各々の予想末端には適当な
方法で他の成分の末端と反応できる官能基が付与される
。

上記のようにして構成されたヌクレオチドグローブは、
本文に記載されるような一種又は多種のヌクレオチドプ
ａ−ブ及び緩衝液から成る試薬溶液として提供すること
ができる。適当な緩衝液は一般に水性であり、加えるべ
き添加剤が引き統いて起こる試薬の標的被検体に対する
ハイブリッド形成物と相溶性であるならば、単独で存在
するか又は任意の組み合わせで存在する、硫酸デキスト
ラン、ＥＤＴＡ及び類似の添加剤を含むことができる。

試薬溶液は標的に結合するプローブの性能を強化する、
適当なハイブリッド強化剤、担体ＤＮＡ及びホルムアミ
ドのような特異性を増強する化合物のような薬剤を含ん
でいてもよい、この溶液の形態でのグローブの保存寿命
は一般に一年以上に互っている。別法として、プローブ
を凍結乾燥することもでき、こうして使用者が試料被検
体についてハイブリッド検査を行う前に、上記のような
緩衝液を用いて再構成できる乾燥試薬をとして供給する
こともできる。

本発明により記載されたハイブリッド形成プローブ及び
試薬の方法及び使用は、被検体標的ポリヌクレオチド配
列の事前の選択を仮定している。

標的ポリヌクレオチド中のプリン及びピリミジン塩基の
特定な配列が生体の突然変異した又は正常な遺伝子に特
徴的であることが既知であるか又は考えられること、及
びこの特定の突然変異した又は正常な遺伝子の存在又は
非存在は感染剤、発癌物質、病気の容体、又は或遺伝的
特徴の存在及び非存在と関連付けることができるから、
多くのＡ体化において、特定の被検体の検出が必要であ
る。

本文に記載されるようなグローブの使用は標的配列を検
出するために、生物学的検体中の核酸にハイブリッド形
成を行う何か特殊な方法又は技術に限定されない。数種
のハイブリッド形成検査技術が技術上既知であり、例え
ばドツト・プロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）ハイブリッド
形成法、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）プロッティング法
；ランキ（Ｒａｎｋｔ）等により米国特許第４．５６３
．４１５号及び４，４８６．５３９号に記載されたよう
なサンドイッチハイブリッド形成検査法；ハンセン（Ｈ
ａｎｓｅｎ）等により欧州特許出願第８４３０６５１３
．７号に記載されたようなビーズ上のサンドイッチハイ
ブリッド形成；国際公開パンフレットＷＯ３７１０３９
１１に記載されたような置換（ｄｉｇｐｌａａｅｍｅｎ
Ｌ）ハイブリッド形成法；ここに記載されたような核酸
プローブを最初に固体の支持体上に固定し、次いで試料
と接触させる捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）技術ＨＰｌｏｅｇ
、　Ｆｏｌｉａ　Ｈｉｓｔ。

ｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｃｙｔｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｓ
　２４巻（１９８６）第３号、１８９−１９４頁に採用
され又は記載されたようなイン・シトウ（ｉｎ　５ｉｔ
ｕ）ハイブリッド形成法等が知られている。

標的被検体ヌクレオチド配列は各種の媒体中に、最も多
くは生物学的、生理学的、又は環境的検体中に存在して
いる。或場合には本発明による分析を行う前に標的被検
体ヌクレオチド配列を含む検体を各種の抽出、精製及び
単離操作に処することが好適である。このような手段は
被検体のハイブリッド形成プローブへの結合を妨害する
試料物質を除去するために望ましい。こうした実験操作
の例は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｔｉｏｎ、Ｂ、ヘイムス（Ｈａｎｇｓ）＆Ｓ、ヒギン
ス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、ＩＲＬ出版、ワシントンＤ、
Ｃ，（１９８５）の第二章に、及び標準的な教科書に見
出される。

合成ポリヌクレオチドが研究の目的によっては往々にし
て望ましいことがある等の理由で、合成ホモ−又はヘテ
ロ−ポリ−ヌクレオチドが、非生物起源であるにも拘ら
ず、標的被検体配列として役立つように、実験室内で製
造することができることは本発明の考慮事項内にある。

前掲の記述にも拘らず、或場合には標的被検体配列が本
発明の方法により形成されるハイブリッド形成プローブ
の標的認識成分へのハイブリッド形成を容易にするため
に、単一鎖状であることが好ましい。標的被検体ヌクレ
オチド配列を含む試料は標的被検体を単一鎖状に転換す
るように旭理されなければならないことが屡々ある。こ
の単一鎖状への転換は技術上慣用されている種々の方法
により達成することができる。例えば、二重鎖核酸の変
性は熱的に、化学的に、又は他の慣用の方法で達成する
ことができる。変性過程はｐＨ，イオン強度、温度及び
周囲媒体の他の性質（例えば尿素、ホルムアミド、グリ
オキサール、メチル水銀水酸化物又は他の薬剤の存在）
に依存し、同様に塩基の組成（即ち、ＧＣ／ＡＴ）配列
、及び二重鎖核酸の長さにも依存する。変性の各種の方
法の概説は標準的な教科書に、及びＪ、マーマー（Ｍａ
ｒ＋ｍｕｒ）、Ｃ，シュルトクラウト（Ｓｃｈｉｌｄｋ
ｒａｕｔ）及びＰ。

トーチ（（Ｄｏｔｙ）のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂａ５ｉ
ｓ　ｏｆ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ。

テキサス大学出版部、オースチン（Ａｕｓｔ　ｉｎ）、
テキサス、１９６２年版に見られる。

ハイブリッド形成の典型例は標的被検体配列が液体媒体
中に存在する状況である。この媒体は多くの形態をとる
ことができ、最も代表的なものは未処理の生物学的液体
である。或具体化においては、未処理の生物学的液体を
、相補的単一鎖核酸の再ハイブリッド形成を支持するこ
とが知られている媒体を生じるように、′第二の溶液”
と混合することができる。

第二の溶液は水性又は非水性又は両者の混合物であるこ
とができる。ハイブリッド形成の速度を増加させ及び／
又は再ハイブリッド形成の平衡範囲（即ち、再ハイブリ
ッド形の安定性）を増大するために、相補的単一鎖核酸
の再ハイブリッド形成に影響することが知られている或
種の無機又は有機添加剤を添加することができる。無機
の添加剤の中ではクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウ
ムが挙げられ；有機化合物中ではホルムアミドのような
化合物が挙げられる。他の有用な添加剤はポリエチレン
グリコール、硫酸デキストラン、ドデシル硫酸ナトリウ
ム及びカゼインである。

プローブは、被検体の標的配列がもしあるとして、それ
がヌクレオチドグローブの標的認識成分中に含まれてい
る相補的領域に全体的に又は部分的にハイブリッド形成
できる条件下で液体と接触する。この接触段階は各種の
方法により、及び様々な“苛酷度”の条件下で行うこと
ができる。再ハイブリッド形成（再会合［ｒｅａｓｓｏ
ｃ　ｉａｔ　１ｏｎｌ　）過程に影響する因子の概説は
、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ、Ｂ、ヘイムス（Ｈａｎｅｓ）＆Ｓ、ヒギンス（Ｈ
ｉｇｇｉｎＳ）編、ＩＲＬ出版、ワシントンＤ、Ｃ，（
１９８５）中で利用できる。プローブ及び被検体標的ポ
リヌクレオチドの長さ、複合性、及び相補性の度合を反
映する因子の外に、因子は温度、ｐＨ１塩濃度及び溶剤
媒体の条件を含んでいる。接触期間は所望の程度までハ
イブリッド形成を行うのに必要な時間の長さに依存して
変わり、これは標的認識成分中の結合領域の長さ並びに
反応条件に一部依存している。

結合した相補的な標的被検体配列を伴ったヌクレオチド
プローブは、所望のハイブリッド形成が生起した後に生
物学的試料から分離される。この分離はクロマトグラフ
ィー（カラム、ゲル等）、濾過、電気泳動（電気溶離を
含む）等を含むが、これらに限定されるものではない。

プローブに結合した再ハイブリッド形成物質から未結合
の物質を充分且つ確実に分離するために、更に洗浄工程
を組み入れることが望ましい。

ハイブリッド形成事象が生起し、結合物質が未結合物質
から分離された後に、シグナル発生成分上の標識の検出
は、結合物質、未結合物質又は丙者を検査することによ
り行われる。

標識が放射性のものであれば、慣用の放射性同位元素定
量技術ににより直接の検出が行われる。

標識が例えばビオチンのような化学的なものであれば、
間接的な検出が行われる。この例は技術上周知の色素形
成基質等との接触を含む。

下記の実施例は本発明の一層特定の具体化を提供するが
、それが本発明を限定するものと考えてはならない。

ｉ履ｊ 総てのオリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成機上でシアノエ
チルホス７オロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄ
ｌｅ）上の５燐酸塩を用いて典型的なホス７オラミダイ
ト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉＬｅ）化学により合成
され、その後保護基を除去するためにオリゴマーを脱ブ
ロック（ｄｅｂｌｏｃｋ）　した。別にポリヌクレオチ
ドキナーゼの作用（脱ブロッキング後）により燐酸基を
添加した。オリゴマーは合成後セファデックスＧ−２５
カラム上で精製された。

シグナル発生成分オリゴマーはＤＮＡ合成機上で合成さ
れ、或場合には各カップリング合成のカップリング段階
を省略した。このオリゴマーは長さとして５０−２００
塩基であった：塩基の２０−１００％はシトシンであっ
た。脱ブロッキング後にセファデックスＧ−２５上で脱
塩し、オリゴマーを凍結乾燥し、乾燥したオリゴマーに
２鱈のアミノ基転移混合物を添加し、室温で２７−２４
時間振盪することによりＣの環外（ｅｘｏｃｙｃｌ　ｉ
ｃ）アミノ基のアミノ基転移反応を行った。アミノ基転
移混合物は下記のようにして作成された：５．６７９の
ヘキサンジアミンニ塩酸塩を５０ｍαのねじ蓋付きチュ
ーブ内で５００μａの濃厚水酸化ナトリウム中の０．２
３１ｇのモルフォリノエタンスルホン酸と混合した。温
水で容積を９．５鱈とし、大部分が溶解するまで混合物
を振盪した。１ｇのメタ亜硫酸水素ナトリウムを添加し
て溶解し、ｐＨを６．０−６．２に調節した。２４−７
２時間反応が進行した後、ｐＨを２時間の間８．５とし
、次いで３０分間７に下げた。次いで生成物をＩ×４０
ｃｙａセファデックスＧ−５０カラム上で精製した。

シグナル発生オリゴマーのハプテン化ニアミノ基転移処
理されたシグナル発生成分オリゴマーを、ビオチン又は
フルオレッセイン　インチオシアネー）（ＦＩＴＣ）の
いずれかで、標的認識成分オリゴマーに結合する前又は
後のいずれかの時点でバブテン化（ｈａｐｔｅｎｙｌａ
ｔｉｏｎ）　Ｌ／た。いずれの場合も、ビオチン（ＮＨ
Ｓ−ＬＣ−ビオチン）又はＦｉＴＣをジメチルホルムア
ミドに溶解し、ハプテン対アミノ基の比が少なくとも２
であるように、０．１Ｍ、ｐＨ９の炭酸水素すトリウム
中に溶解しｔ；等容積のアミン基転移処理されたオリゴ
マーと混合しｔ；。混合物を室温で１６時間放置した。

未反応のハプテンをセファデックスＧ−２５クロマトグ
ラフイーにより除去した。一方一回又は二回ブタノール
抽出し、次いでセファデックスＧ−２５クロマトグラフ
イーを行って過剰のＦＩＴＣを除去した。両方の場合共
精製したオリゴマーを凍結乾燥し、水に再溶解した。

′カルボニルオリゴヌクレオチドの　造＝５ナノモルの
燐酸化したオリゴヌクレオチドを１０分の１モルのイミ
ダゾール及び１０分のｌモ／１ｃＦ）ＥＤＡＣ（１００
１２％ｐＨ６，０）を含む水溶液中に溶解し、２０ない
し５０℃に１ないし１６時間放置した。内容物をゲル濾
過カラムに通し、オリゴヌクレオチドを含む１分に等容
積の１０分の４モルのアミノカプロン酸を添加した。■
−１６時間後カシボキシル化されたオリゴヌクレオチド
がゲル濾過により単離された。

５′アミノオリゴヌクレオチドの製造：５′燐酸化オリ
ゴヌクレオチドを含むｌａｄの溶液に、１６μａのＮ−
メチルイミダゾール及び４分の１モルのジアミノヘキサ
ンを４１１９のＥＤＡＣと共に添加し、溶液のｐＨを約
６に調節した。−夜反応後、５′アミノオリゴヌクレオ
チドをゲル濾過により単離した。

エステル結合プローブの製造： 各５ナノモルの５′ヒドロキシルオリゴヌクレオチド及
び５′カルボキシルオリゴヌクレオチドを含むｌａｄの
水溶液に、１０ｍｇのＥＤＡＣを添加した。溶液のｐＨ
を６に調節した後、−夜室温に放置した。標識されたグ
ローブをＣＬ６Ｂ又はセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ
ｌ）　Ｓ　−２００上でクロマトグラフィーにより単離
した。

アミド結合プローブの製造： 各５ナノモルの５′アミノオリゴヌクレオチド及び５′
カルボキシルオリゴヌクレオチドを含むｌ−の水溶液に
、１０諺９のＥＤＡＣを添加した。

溶液のｐＨを６に調節した後、−夜室温に放置した。標
識されたプローブをＣＬ６Ｂ又はセファクリル（Ｓｅｐ
ｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２００上でクロマトグラフィー
により単離した。

ホスフォジアミド及びホスフォジエステル結合プローブ
の製造： 各５ナノモルの５′ヒドロキシルオリゴヌクレオチド及
び５′ホスフエート　オリゴヌクレオチドを含む１ｍｆ
ｆ１の鱈溶液に、ｌ　ＯｍｇのＨＤＡＣを添加した。溶
液のｐＨを６に調節した後、−夜室温に放置した。標識
されたプローブをＣＬ６Ｂ又はセファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）　Ｓ　−２００上でりａマドグラフィーに
より単離した。

ヘテロニ官能性試薬を用いるプローブ成分の化学結合： 官能性プローブを形成するため二成分を結合するために
、市販により入手した多数のへテロニ官能性試薬（ピア
ス・ケミカルズ［Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳ］
製のような）を使用した。これらの試薬舒中でスクシン
イミジル　４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−
１−カルボキシレート（ＳＭｃｃ）、Ｎ−スクシンイミ
ジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）　、Ｎ−スクシンイミジル　（４−ヨドアセチル
）アミノベンゾエート（Ｓ　Ｉ　ＡＢ）　、スクシンイ
ミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル）　ブチレート
（ＳＭＰＢ）等を挙げることができる。これらの試薬は
二成分の別個の反応によってプローブを相互に結合する
のに適合している。

標識されたプローブは二種の方法により特性決定がなさ
れる。第一はポリアクリルアミドゲル電気泳動によりも
のであり、ここでは生成物の分子量の増大が標識に対す
るプローブの結合が成功した証拠として注目された。第
二に、生成物は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒ
ｒｈｅａ）からＤＮＡを検出する検査において作用性が
あることが示された。この検査においては、プローブが
淋菌にハイブリッド形成した場合にビオチン又はＦＩＴ
Ｃが検出され、標的認識オリゴマーがシグナル発生オリ
ゴマーに共有結合的に結合したことを示した。

本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。

ｌ。

ａ）少なくとも約１０のヌクレオチド塩基のヌクレオチ
ド配列から成り、該配列が少なくとも一つの５″端及び
３″端を含む、第一標的認識成分を提供すること、 ｂ）該第一標的認識成分を該５′端又は３′端、又はそ
の両者に反応性官能基が含まれるように化学的に改質す
ること、及び Ｃ）該第一標的認識成分上に与えられた少なくとも一つ
の反応性官能基と反応することが〒きる官能基を含む少
なくとも一つの末端を有する第二のシグナル発生成分を
提供すること、及びｄ）少なくとも一つの反応性官能基
を含む該第一の標的認識成分を、該第二シグナル発生成
分の少なくとも一つの該末端と化学的に反応させ、これ
らの二つの成分を化学的に結合し、標識されたヌクレオ
チドプローブを製造する 工程から成る標識されたヌクレオチドプローブの化学的
合成方法。

２、段階（ｂ）の該反応性官能基が燐酸基であり、該シ
グナル発生成分の該末端がヒドロキシル基である、上記
ｌに記載の方法。

３、段階（ｂ）の該反応性官能基がカルボキシル基であ
り、該シグナル発生成分の該末端がヒドロキシル基であ
る、上記１に記載の方法。

４、標的認識成分の該５″端又は該３′端の少なくとも
一つが燐酸化されている、上記ｌに記載の方法。

５、＃燐酸化された端がＨＤＡＣで活性化去れ。

次いで過剰のｅ−アミノカプロン酸と反応して、カルボ
キシル基を生じる、上記３に記載の方法。

６、上記５に記載の化学的合成方法により形成された標
識されたヌクレオチドプａ−ブ。

７゜該シグナル発生成分部ハプテンで標識されている、
上記３に記載の方法。

８、咳シグナル発生成分該ハプテンで標識されている、
上記６に記載のプローブ。

９、除ハプテンがビオチンである、上記８に記載のプロ
ーブ。

１０、該ハプテンがフルオレッセインである、上記８に
記載のグローブ。

１１、該標的認識配列の咳３′又は該５′末端が工程（
ｂ）においてアミノ官能基を含むように化学的に改質さ
れ、且つ該第二のシグナル発生成分が多糖類である、上
記ｌに記載の化学的合成方法。

１２、該多糖類の少なくとも一つの末端単糖が該標的認
識配列の該アミノ官能基と反応するようにアルデヒド基
に転換される、上記１１に記載の化学的合成方法。

１３、該シグナル発生成分がリボヌクレオチド配列から
成る、上記ｌに記載の化学的合成方法。

１４、更に該リボヌクレオチド配列の３′末端がジアル
デヒドを含むように改質する工程から成る、上記１３に
記載の化学的合成方法。

１５、該末端の該改質が過沃素酸塩反応である、上記１
４に記載の合成方法。

１６、該ジアルデヒドが還元的アミノ化によりアミノ基
に転換され、及びこの時点で末端アミノ基を含む該リボ
ヌクレオチド配列が標的認識成分と反応して、両成分を
結合するホスフォアミド結合を形成する、上記１４に記
載の合成方法。

１７、上記１に記載の化学的合成方法により形成される
、標識されたヌクレオチドプローブ。

１８、該リボヌクレオチド配列がハプテンで標識される
、上記１６に記載の合成。

１９、上記１８に記載の化学的合成により形成される、
標識されたヌクレオチドプローブ。

２０、該ハゲテンがフルオレッセインである、上記１９
に記載のプローブ。

【図面の簡単な説明】

第１図は標的認識成分が少なくとも一個の末端カルボキ
シル官能基を含むように改質されており、エステル結合
を通じてシグナル発生成分と反応してヌクレオチドプロ
ーブ形成する、本発明の異体化の略図的表現である。 ′！Ｊ２図は標的認識成分がヌクレオチドグローブを形
成するために、シグナル発生成分とホス７オアミド結合
を形成するための少なくとも一つの末端アミノ官能基を
備えている、本発明の方法の第二の臭体化の略図的表現
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、 ａ）少なくとも約１０のヌクレオチド塩基のヌクレオチ
   ド配列から成り、該配列が少なくとも一つの５’端及び
   ３’端を含む、第一標的認識成分を提供すること、 ｂ）該第一標的認識成分を該５’端又は３’端、又はそ
   の両者に反応性官能基が含まれるように化学的に改質す
   ること、及び ｃ）該第一標的認識成分上に与えられた少なくとも一つ
   の反応性官能基と反応することができる官能基を含む少
   なくとも一つの末端を有する第二のシグナル発生成分を
   提供すること、及び ｄ）この時点で少なくとも一つの反応性官能基を含む該
   第一の標的認識成分を、該第二シグナル発生成分の少な
   くとも一つの該末端と化学的に反応させ、これらの二つ
   の成分を化学的に結合し、標識されたヌクレオチドプロ
   ーブを製造する工程から成る標識されたヌクレオチドプ
   ローブの化学的合成方法。 ２、特許請求の範囲１項に記載の化学的合成方法により
   形成される、標識されたヌクレオチドプローブ。