JPH01500461A - Nucleic acid probe assay methods and compositions - Google Patents

Nucleic acid probe assay methods and compositions

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JPH01500461A JP62505240A JP50524087A JPH01500461A JP H01500461 A JPH01500461 A JP H01500461A JP 62505240 A JP62505240 A JP 62505240A JP 50524087 A JP50524087 A JP 50524087A JP H01500461 A JPH01500461 A JP H01500461A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 核酸プローブアッセイ法および組成物 技術分野 本発明は核酸プローブアッセイ法およびそれに用いる組成物に関する。 より詳細には本発明は分析される試料中の標的核酸系被分析体を、固形支持体に 結合した第１１０−ブにハイブリダイゼーションすることにより溶液から捕獲す る方法に関する。これらの方法にサンドイッチアッセイ法が含まれる。その場合 、標的は第２プローブにより検出され、これは検出のため標識されており、第１ プローブにハイブリダイズしたセグメント以外の標的被分析体セグメントにハイ ブリダイズする。 本発明が目的とするアッセイ法においては、固形支持体に結合したプローブは約 １５〜約１００塩基のオリゴヌクレオチドである。 発明の背景 試料を特定の核酸系被分析体の存在につき試験するための核酸プローブアッセイ 法、ならびにこの種のアッセイ法を動物および植物の病気を診断し、血液、食品 その他とウィルス性または微生物性汚染につき試験し、遺伝子を分離、特性判定 および工学的処理し、ならびに他の目的に利用することは周知である。 たとえばマインコスおよびワール、アナリ６バイオケミ、（Ａｎａｌ。 Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ　、　）１３８　、２６７−２８４　（１９８４）　；マニ アチスら、分子クローニング法：実験用便覧、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−１二ニーヨーク（１ ９８２）；オーウェンズおよびディーナー、米国特許第４．４８０，０４０号明 細書；ならびにファルコーおよびモーズリ−１米国特許第４，３５８，５３５号 明細書を参照されたい。 核酸プローブアッセイ法には前記の“サンドイッチアッセイ法”がある。サンド イッチアッセイ法においては捕獲工程を標識付は工程の前に行うか、または捕獲 および標識付けを同時に行いうることが認められている。たとえばラングゾール およびマルコーム、ジーン３６．２０１−２１０（１９８５）　、ランキら、ジ ーン２１．７７−８５（１９８３）　；ダンおよびハッセル、セル１２．２３− ３６（１９７７）　；ランキおよびソーダーランド１米国特許第４，４８６，５ ３９号および第４．５６３，４１９号明細書を参照されない。 サンドイッチアッセイ法は分析される試料の核酸が固形支持体に直接に固定化さ れる必要がないという利点を持つ０代わりに捕獲プローブ（ｃａｐｔｕｒｅ　ｐ ｒｏｂｅ）が固形支持体に固定化され、これはアッセイを実際に行う当事者より もむしろ供給業者によって行うことができる。サンドイッチアッセイ法は被分析 体への２回のハイブリダイゼーションを伴うため、被分析体への標識プローブの １回のハイブリダイゼーションを伴う非サンドイッチアッセイ法よりも高い特異 性をも約束する。 約１００ヌクレオチド以下の短いオリゴヌクレオチドを核酸プローブアッセイ法 におけるプローブとして使用することも一定の利点を与える。プローブと被分析 体間のハイブリダイゼーションに必要な時間は、プローブが短いほど短縮される 。現在の化学合成および精製技術によれば、配列決定された約１００ヌクレオチ ドまでの一重鎖オリゴヌクレオチドを高純度で、アッセイにおけるルーチン用と して十分な量で十分な速度において製造することができる。これらの製法は、経 費がかかり、生物学的プロセス（たとえばクローニング）を採用しなければなら ない長鎖プローブの製法よりも簡単であり、核酸プローブアッセイ法における感 度および特異性という目的に関してより高い質をもつプローブを与える。 固相結合した”捕獲プローブが約２００塩基よりも短鎖のものであるサンドイッ チアッセイ法についての研究は報告されていない。 固形支持体への一重鎖核酸の固着、アフィニティークロマトグラフィー（核酸と 相補的配列体とのハイブリダイゼーションにより分離が行われる）、および核酸 プローブアッセイ法（サンドイッチアッセイ法を含む）について各種の方法が報 告されている。たとえばラングゾールおよびマルコーム（前掲）；ブーネマンお よびウェス１〜ホフ、メソ、エンザイモ、　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ−）１００ ．４００−４０７（１９８３）　；ブーネマン、ヌクレ、アシッズ、リサ、（Ｎ ｕｃｌ。 、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１０．７１８１−７１９６（１９８２）；ブーネマン ら、ヌクレ、アシッズ、リサ、１０，７ｔ６３−７１８０（１９８２）：クレリ シら、ヌクレ、アシッズ、リサ６，２４７−２５８（１９７９）を参照されたい 、しかし、アミン誘導体およびカルボキシル誘導体にした固形支持体への核酸の 付着、特に核酸プローブ調製物の少なくとも約３０％が末端デオキシリボーズま たはりポーズ部分の水酸基の酸素原子のみによって共有結合している付着につい ては報告されていない。 本発明はサンドイッチアッセイ法、および約１００塩基以下の短鎖オリゴヌクレ オチドをアッセイにおけるプローブとして用いることの双方の利点を実現するこ とを目的とする。 発明の要約 １５〜１００塩基のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション溶液からの核 酸系被分析体の捕獲のために用いる核酸プローブサンドイッチアッセイ法に使用 するのに特に好適な固形支持体が見出された０本発明の固形支持体は、高い割合 の（一般に少なくとも約３０％）結合オリゴヌクレオチド型“捕獲プローブが、 支持体におよびオリゴヌクレオチドの５′末端ヌクレオシドの５′−酸素原子ま たは３′末端ヌクレオシドの３′−酸素原子に共有結合したリンカ−のみを介し て支持体に共有結合しており、このためたとえば非共有性会合または反応性塩基 部分を介しての共有結合など、被分析体捕獲に関する利用率が著しく低下するか または失われさえする様式で支持体に会合した場合と異なり、十分に被分析体の 捕獲に利用されることを特色とする。 本発明の固形支持体は下記のものである。（１）アミノ末端基付きリンカ−によ り誘導体にされたマクロ孔質架橋デキトラン、多孔質ゲイ酸塩ガラス、ポリスチ レン、またはラテックス（リンカ一部分の末端アミン基がホスホルアミデー）　 （ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）基を介してオリゴヌクレオチド型捕獲プロ ーブの末端ヌクレオシドに共有結合しており、ホスホルアミデート基を介してオ リゴヌクレオチド型捕獲プローブの末端ヌクレオシドに共有結合していないアミ ７基は実質的にすべて、オリゴヌクレオチドとの非特異的相互作用がアシル基で ブロックされている）；（２）マクロ孔質架橋デキストランを臭化シアンで活性 化したのち、オリボヌクレオチド型捕獲１０−ブの末端ヌクレオシドへ誘導体形 成されたアミノアルキルホスホルアミデート基のアミノ基と反応させて、架橋デ キストランをプローブで共有結合により誘導体にしたちの；（３）カルボキシル 末端基付き、または活性エステル末端基付きリンカ−で誘導体にされたマクロ孔 質架橋デキストラン、多孔質ケイ酸塩ガラス、ポリスチレンまたはラテックス（ カルボキシル基の部分は結合用ジアミノアルキルまたはジアミノアルキルジスル フィド（たとえばシスタミニル）部分の１個のアミン基に対しアミド結合で結合 しており、その他方のアミノ基はホスホルアミデートに関与しており、このホス ホルアミデートはオリゴヌクレオチド型捕獲プローブの末端ヌクレオシドに直接 に結合している）；ならびに（４）スルフしドリル末端基付きリンカ−により誘 導体にされた架橋デキストラン、多孔質ケイ酸塩ガラス、ラテックスまたはポリ スチレン（スルフヒドリル基の部分は、一端に活性ジスルフィド基（たとえば２ −ピリジルまたは４−ピリジルにより活性化）をもちがつ他端にアミノ基をもつ リンカ−に由来するイオウ原子に対しジスルフィド結合で結合しており、上記ア ミン基はホスホルアミデート基の一部をなし、ホスホルアミデート基はプローブ の末端ヌクレオシドに直接に結合しており、上記ジスルフィド結合はデキストラ ン、ケイ酸塩、ラテックスまたはポリスチレンに対し誘導体形成したスルフヒド リル基とプローブに結合したリンカ−の活性ジスルフィドとのジスルフィド交換 によって生じる）。 本発明による固形支持体を製造するための好ましい支持材は下記のものである。 長鎖アルキルアミン誘導体にされた、およびカルボキシル誘導体にされた制御細 孔ガラス：パース・ケミカル社（米国イリノイ州ロックフォード）によりそれぞ れ製品番号２４８７５および２３７３５において、公称細孔直径５００オングス トロームおよび粒径約１２５〜１７７ミクロンのビーズ状で販売されている；な らびにマクロ孔質架橋デキストラン材料であるセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ ｌ）Ｓ−５００：ファルマシア社（米国ニューシャーシー州ビスカッタウェイ） により、コードＮｏ、１７−０４７５−０１において、湿潤直径約４０〜約１０ ５ミクロンおよび分子量約２Ｘ１．０’ダルトン以上のデキストランに関する排 除体積（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｖｏ　ｌ　ｕｍｅ）をもつビーズ状で販売されてお り、このセファクリルが後記のように臭化シアンにより、またはアミノ末端基付 き、カルボキシル末端基付き、または活性エステル末端基付きリンカ−により誘 導体にされるべく改質される。 好ましい支持材と好ましい捕獲プローブ（それらの５′末端に結合した適切な結 合用部分をもつべく改質されたプローブである）との反応については後述する。 本発明の新規な、かつ有利なサンドイッチアッセイ法は、種々の方法で行われる サンドイッチアッセイ法における支持体の性能に関連して本発明による固形支持 体がもつ種々の予期されなかった特性が見出されたことに基づく。 先行技術によれば標的核酸系被分析体が結合している固形支持体くたとえばニト ロセルロースフィルター）と非相同（ここでは時に“不活性”と呼ぶ）核酸（た とえば切断されたサケ精子もしくはニシン精子ＤＮＡ、または煮沸したｔＲＮＡ など、検出のための標識付けがなされておらず、標的核酸系被分析体に対し配列 上の相同性をほとんどもたないもの）（これは支持体上の標的核酸に溶液中のプ ローブ核酸をハイブリダイズさせる目的でハイブリダイゼーション条件下に固形 支持体と共にインキュベートされる溶液中に含まれる）とのプレハイブリダイゼ ーションはプローブの非特異的結合を減少させ、これによりバックグラウンド信 号を減少させることが示唆される。たとえばマニアチスら（前掲）を参照された い。先行技術には、オリゴヌクレオチドにより誘導体にされた固形支持体と非相 同核酸とのプレハイブリダイゼーションが相同配列をもつ核酸のハイブリダイゼ ーションに際してオリゴヌクレオチドによる捕獲効率を高めることは示唆されて いない。本発明者らはきわめて意外なことに、本発明による固形支持体と非相同 核酸とのプレハイブリダイゼーションによって、標的を含有する溶液とのハイブ リダイゼーションに際して標的被分析体の捕獲効率がほぼ倍加することを見出し た。 さらに先行技術によれば、短鎖（１００ヌクレオチド以下）オリゴヌクレオチド が存在するハイブリダイゼーション溶液中に硫酸デキストランを含有させても、 オリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドの配列に対し相補的な配列をもつ 核酸との間でハイブリダイゼーションが行われる効率には影響がないことが示唆 される。窓外にもこれと逆に、本発明者らは被分析体が長鎖くすなわち約５００ 塩基以上）である場合、本発明の固形支持体に結合したオリゴヌクレオチドの捕 獲効率はハイブリダイゼーション溶液中に約５〜２０％（、／Ｖ）、奸才しくけ 約９〜１１％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストランを用いることによって著しく改良さ れることを見出した。また本発明者らはプレハイブリダイゼーション溶液中にお けるこの濃度の硫酸デキストランが、非相同ＤＮＡを除いても捕獲効率と高める ことを見出した。しかし著しく短鎖の被分析体（約３０塩基）については硫酸デ キストランは捕獲効率にほとんど効果を与えないことが認められた。さらに本発 明者らは、硫酸デキストランが長鎖被分析体に対する捕獲効率に与える効果は先 行技術において仮定されるような体積排除効果（ｖｏｌｕｍｅ−ｅｘｃｌｕｓｉ ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）ではないことを見出した。 ポリエチレングリコールが捕獲効率に与える効果は、はるかに小さいからである ０本発明の固形支持体による捕獲効率に対し硫酸デキストランが与えることが見 出された有利な効果についての根拠は明らかではないが、これは電荷に関係があ ると思われる。　また本発明者らは意外にも、被分析体の捕獲、および標識プロ ーブと被分析体とのハイブリダイゼーションが同時に起こるサンドイッチアッセ イ法により得られた結果（すなわち捕獲プローブによってビーズに結合した被分 析体にハイブリダイズした標識プローブからの信号の強度；バックグラウンドに ついて補正されたもの）は、まず被努析体がかなりの程度、溶液中の標識プロー ブとハイブリダイズし、次いで被分析体（全部または一部が標識プローブと複合 体を形成している）の捕獲が行われるサンドイッチアッセイ法の場合と本質的に 等しいことを見出した。捕獲工程が標識プローブとのハイブリダイゼーション工 程の前に行われた場合に得られる結果は、他の２方法の場合より明らかに劣る。 これは、ビーズ結合した被分析体は溶液中の標識プローブにより結合されにくい ためと思われる。 ｉ＆後に、下記の表１に挙げた多数のオリゴヌクレオチドがラトナーら、ネイチ ャー、３１３．２７７−２８４（１９８５）によりめられた配列から、ＨＩＶ− １（エイズの原因物質）についての核酸プローブハイブリダイゼーションアッセ イ法（本発明によるアッセイ法を含む）においてプローブとして用いるのに適切 であることが確認された。特にこれらのオリゴヌクレオチドは、サザーンハイプ リダイゼーションにおいて本発明によるアッセイに採用されるものに匹敵するス トリンジエンシー条件下でＨＩＶ−１ゲノム（プロウィルスＤＮＡとして感染細 胞のゲノム中へ組込まれるＲＮＡ）またはその断片にはハイブリダイズするが、 ヒト、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）またはｐＢＲ３２２ＤＮＡにはハイブリダイズ しないことが認められた。 表　Ｉ オリゴ８５−２３３：５’　−ｃ＾＾＾＾＾ＣＴＡＴＴＣＴＴ＾八八ＣＣＴＡＣ Ｃ＾＾ＧＣＣＴへへ３’オリゴ８５−２４１：５’　−ＴＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴ Ａに＾八へＣ（：Ｃ＾＾＾＾ＣＣＡＧＣＣ−３’オリゴ８６−３０：　５’　− ＴＡＧにＴＴＴＣＣＣＴＣ：＾＾＾Ｃ八ＴＡへＡＴＡＴＧＣ：Ｔｌ；Ｔ−３’オ リゴ８６−３２：　５’　−ＴＧ（：ＴＣＴにＣＴＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＣＴＡ ＣＴＴＧＴにＴにＣ−３’オリゴ８６−３４：　５’　−ＣＡＣＣＴＡにＧＧＣ Ｔ＾＾ＣＴＡＴ（：ＴにＴＣＣＴ＾＾Ｔ＾＾Ｇに−３’オリゴ８６−３６：　５ ’　−ＴＴＴＣ（：Ｔ＾＾ＣＡＣＴＡＣＣ：Ｃ＾＾＾にＧＴ（１；にＣＴＴＴＡ ＴＣ−３’オリゴ８６−３８：　５’　−ＴＧにＴＣＴＴＣＴＧＧＧにＣＴＴに ＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＣ−３’オリゴ８６−４０：　５’−＾ＣＧＧ＾＾ ＾＾ＴＧＴＣＴ＾＾ＣＡにＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴ＾＾Ｃ−３′オリゴ８６−４２ ７５’−＾＾＾ＴにＧＡＴ＾＾＾ＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴ（：ＣＡＧ＾＾ＴＴＣ −３’オリゴ８６−４４：　５’　−ＴＣＧＡＧＴ＾＾ＣＧＣＣＴＡＴＴＣＴに ＣＴＡＴＧＴＣ（：ＡＣＡＣ−３”オリゴ８６−２７０：５’　−ＣＴＧＴＧＴ ＾＾ＴＧＡＣＴｔｌ；ＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＴＧＴ−３’オリゴ８６−２ ７２：５’　−ＴＣＴ＾＾ＴＴＡＣＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡにＡＣ Ｔ−３’、ｔ　！、ｌ　コ８７−８４：　５”　−ＡＡＴＡＴにＴＴＧＴＴＡＴ ＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡにＣＡＴ−３”オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ のいずれであってもよいが、試験にはＤＮＡを用いた。もちろんＲＮＡであるオ リゴヌクレオチドについては、上記配列のＴはウリジンを表わす。 検出すべき被分析体が感染リンパ球由来のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ、また はＨＩＶ−ＩＲＮＡから逆転写されたＤＮＡである場合には、表■に挙げたオリ ゴ体の配列に相補的な配列をもつオリゴ体もプローブとして適切であろう。 発明の詳細な記述 本発明はその一観点においては、それに結合した１５〜１００塩基の一重鎖オリ ゴヌクレオチドブローブを含み、（Ａ）ケイ素原子において （１）次式の基 （ＣＨ２）ｎ（Ｎ　Ｈ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および−（ＣＨｚ）ｎ（Ｎ　 Ｈ）（Ｐ　Ｏ２）　Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にさ れたケイ素原子は実質的に無く、式中のＣは０〜５であり、ｎは２〜８であり、 Ｒ８はメチルまたはベンジルであり、−〇−（オリゴ）はオリゴヌクレオチド型 プローブであり、（オリゴ）に結合した酸素原子はプローブの５′−ヌクレオシ ドの５′−酸素原子または３′−ヌクレオシドの３′−酸素原子である）；もし くは（２）次式の基 −Ｌ、−ＣＯ２Ｈおよび （ｉ）　Ｌ、＋　（Ｃｏ）（ＮＨ）（ＣＨｚ）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）。 もしくは く式中の−Ｌ＋−は−（ＣＨ２）ｎ（Ｎ　ＨＤＣＯ）（ＣＨ２）ＩＩ−であり、 ここで基−（ＣＨｚ）ｎはケイ素原子に結合しており；ｍ、ｎ、ｐおよびｒは同 一かまたは異なりそれぞれ２〜８である）；もしくは（３）次式の基 ＮＨ（Ｃｏ）ＣＨっ −（ＣＨ２）ｎ（Ｎ　Ｈ）（ＣＯ）（ＣＨ）（ＣＨ２）　Ｓ　Ｓ　（ＣＨｚ）ｐ Ｎ　Ｈ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）および ＮＨ（Ｃｏ）ＣＨ３ ■ （ＣＨｚ）ｎ（Ｎ　Ｈ）（Ｃｏ）（ＣＨ）（ＣＨ２）ＳＨ；により誘導体にされ た多孔質ケイ酸塩ガラス；または（Ｂ）誘導体にされていない水酸基をもつ隣接 炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子に おいて、 （１）次式の基 Ｃ（＝　Ｎ　Ｈ）　Ｎ　Ｈ（ＣＨ２）　ｑ　（Ｎ　Ｈ）　（ＣＯ）　（ＣＨｔ　 ）　ｃ　Ｒ＋（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子 は実質的に無い）、もしくは （２）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）り（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）、もしくは （３）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨｚ）ｑｃｏ、Ｈおよび（ｉ）　Ｒ２ＮＨ（Ｐｏｔ）Ｏ （オリゴ）２もしくは（ｉｉ）　Ｒ２−ＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（Ｐｏ２）Ｏ＜、 ｔリボ）（式中のＣ２Ｑ＋ｐおよびｒは同一かまたは異なり、ｑは２〜１ｏであ り、Ｒ２は −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）Ｑ（Ｃｏ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここ で−〇（＝ＮＨ）基はデキストランの水酸基の酸素原子に結合している〉；もし くは （４）次式の基 Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨｚ）ｎＳＨおよびにより誘導体にされた架橋デキストラ ン系マクロ孔質材料；ならびに （Ｃ）ジビニルベンゼンなどの架橋剤により架橋されていてもよく、かつフェニ ル基において、 （１）次式の基 （ＣＨ２）ＳＣＯ２Ｈおよび （＋　）　Ｒ３ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）、もしくは（ｉｉ）　Ｒ３５Ｓ（Ｃ Ｈｚ）ｎＮＨ（Ｐｏｔ）Ｏ（オリゴ）（式中）Ｌ　ｓは−（ＣＨｚ）ｓ（ＣＯ） （Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）Ｉｊ　Ｃア’）、ココで（ＣＨ２）ｓ基はポリスチレンの フェニル基に結合しており、ｓ。 ｐおよびｎは同一がまたは異なり、Ｓは２〜１ｏである）；もしくは（２）次式 の基 （ＣＨ２）Ｓ（ＣＯ）（Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）ｐ（Ｎ　Ｈ）（ＣＯ）　（ＣＨ２） ｃ　Ｒ。 および −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）ｌ）（Ｎ　Ｈ）（Ｐ　Ｏ２）Ｏ− （オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたフェニル基は無い） ；もしくは （３）次式の基 −（ＣＨｚ）ｓ（Ｃｏ）（ＮＨ）（ＣＨｚ）ｐＳＨ，およびにより誘導体にされ たボリスチ】／ンから選ばれる、固形支持体である。 他の観点においては本発明は （＆）被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ１５〜１００ 塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドである第１１０−ブ（“捕獲プローブ）を含む 固形支持体であって、固形支持体の一部である第１１０−ブの実質的部分がもっ ばら支持体に末端結合しているもの（すなわち支持体に共有結合により、かつ５ ′末端ヌクレオシドの５′−酸素原子または３′末端ヌクレオシドの３′−酸素 原子に結合したリンカ−のみを介して結合しているもの）、および （ｂ）　被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ一重鎖オリ ゴヌクレオチドでありかつ検出のために標コされている第２プローブであって、 ただし第２プローブの配列は第１プローブの配列に対し非相補的であり、第２セ グメントが第１セグメントと重複しないものを用いて試料中の一重鎖核酸系被分 析体を検出する方法であって、（１）上記固形支持体をプレハイブリダイゼーシ ョン条件下で、（ｉ）非相同核酸もしくは＜ｉｉ）約５〜２０％（、／Ｖ）の濃 度の硫酸デキストラン、または（ｉ）および（ｉｉ）の両者からなるプレハイブ リダイゼーション液と共にインキュベートし；（２〉　工程（１）に従ってプレ ハイブリダイズされた固形支持体をハイブリダイゼーション条件下で、約５〜２ ０％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストラン；アッセイされる試料からの核酸（試料中に 存在する場合には被分析体を含む）；およびハイブリダイゼーション液中の被分 析体の量に対し過剰モルの第２１０−ブからなるハイブリダイゼーション液と共 にインキュベートし；（３）工程（２）の後に固形支持体を洗浄して、これから 被分析体に安定にハイブリダイズしていない第２プローブを除去し；そして （４）工程（３）の後に、被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の検出 可能な標識に起因する信号が固形支持体に付随するか否かを測定する ことよりなる方法である。 上記の節に記載した本発明方法における工程く２）の前で、第２プローブを所望 により溶液中でハイブリダイゼーション条件下に被分析試料からの核酸と共にイ ンキュベートしてもよく、これにより試料中に標的被分析体が存在する場合には 標的被分析体の少なくとも一部分はすでにハイブリダイゼーション液中の第２プ ローブにハイブリダイズし、これと固形支持体が工程（２）に従って該工程（２ ）の開始時に結合することを理解すべきである。すなわち標識第２プローブと被 分析体の溶液ハイブリダイゼーションは固形支持体の捕獲１０−ブによる標的の 捕獲の前に行うこともできる。 本発明による他の方法は、 （ａ）　被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ１５〜１０ ０塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドである第１１０−ブ（“捕獲プローブ）を含 む固形支持体であって、固形支持体の一部である第１１０−ブの実質的部分がも っばら支持体に末端結合しているもの（すなわち支持体に共有結合により、かつ ５′末端ヌクレオシドの５′−酸素原子または３′末端ヌクレオシドの３′−酸 素原子に結合したリンカ−のみを介して結合しているもの）、および （ｂ）　被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ一重鎖オリ ゴヌクレオチドでありかつ検出のために標識されている第２１０−ブであって、 ただし第２１０−ブの配列は第１１０−ブの配列に対し非相補的であり、第２セ グメントが第１セグメントと重複しないものを用いて試料中の一重鎖核酸系被分 析体を検出する方法であって、（１）　上記固形支持体をプレハイブリダイゼー ション条件下で、（ｉ＞非相同核酸もしくは（ｉｉ）約５〜２０％（ｗ／ｖ）の 濃度の硫酸デキストラン、または（ｉ）および（ｉｉ＞の両者からなるプレハイ ブリダイゼーション液と共にインキュベートし；（２）工程（１）に従ってプレ ハイブリダイズされた固形支持体をハイブリダイゼーション条件下で、約５〜２ ０％（−／ｖ）の硫酸デキストラン；アッセイされる試料からの核酸（試料中に 存在する場合には被分析体を含む）からなる第１ハイブリダイゼーシヨン液と共 にインキュベートし、この第１ハイブリダイゼーシヨン液は実質的に第２プロー ブを含ます；（３）工程（２）の後に、ハイブリダイゼーション条件下で固形支 持体を第２ハイブリダイゼーシヨン液中の被分析体の量に対し過剰モルの第２プ ローブからなる第２ハイブリダイゼーシヨン液と共にインキュベートしく第１プ ローブへのハイブリダイゼーションにより固形支持体に結合した被分析体を含む ）；（４）工程く３）の後に固形支持体を洗浄して、これから被分析体に安定に ハイブリダイズしていない第２プローブを除去し；そして （５）工程（４）の後に、被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の検出 可能な標識に起因する信号が固形支持体に付随するか否かを測定する ことよりなる方法である。 本発明はさらに、試料中の一重鎖核酸系被分析体を検出するための本発明方法を 実施するための試験キットを提供する。このキットは本発明による固形支持体、 固形支持体上に捕獲される被分析体に対する標識プローブ、および標識プローブ からの信号を発生させるのに必要な試薬（必要な場合には）（たとえば、標識が ビオチンである場合には酵素結合アビジン；標識がキレート化ユーロピウムイオ ンである場合には蛍光増強液（ムッソら、国際特許出願公開Ｗ　Ｏ８７７０２７ ０８号明細書参照））からなる。 さらに他の観点においては、本発明は前記衣１に挙げたオリゴヌクレオチド配列 をもつＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの相補体くすなわち上記オリゴヌク レオチドの配列に対し相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド）を提供し、これ らのＤＮＡまたはＲＮＡは所望により検出のために標識されていてもよい。オリ ゴヌクレオチドを検出可能にすべく標識するために当技術分野で知られている多 数の方法をいずれも、本発明のＤＮＡおよびＲＮＡについて採用できる。たとえ ばＤＮＡもしくはＲＮＡを５′−ヌクレオシドの５′炭素原子にあるボスフェー ト基においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２ｐにより：ＤＮＡもし くはＲＮＡの５′末端にあるリンアミデート基にジアミノアルキルリンカ一部分 を通して（チューおよびオルゲル、Ｄ　Ｎ　Ａ　４．３２７−３３１（１９８５ ）の記載による）、もしくは改質ヌクレオチド塩基にリンカ−を通して（たとえ ばドライヤーおよびダーバン、ブロシ、ナショナル、アカデ、サイ、（Ｐｒｏｅ 。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）（Ｕ　Ｓ　Ａ）８２，９６８−９７２（１９ ８５）の記載による）結合したビオチンにより；またはキレート化ユーロピウム イオンによりくムッソら、国際特許出願公開Ｗ　０８７１０２７０８号明細書の 記載による）標識することができる。 捕獲プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは下記の方法により固形支持 材に結合させることができる。（］）各種の非共有型相互作用くたとえば核酸が ニトロセルロースまたはナイロンフィルターなどの月利に結合するもの）、（２ ）支持材」二の、または支持材に共有結合により誘導体形成された基土の反応性 基と、オリゴヌクレオチドのピリミジンまたはプリン塩基部分上の反応性基との 共有結合ならびに（３）支持材上の、または支持材に共有結合により誘導体形成 された基土の反応性基と、オリゴヌクレオチドの一末端ヌクレオシドもしくは他 方に誘導体形成された基（たとえば５′ヌクレオシドの５′−酸素原子または３ ′末端ヌクレオシドの３′−酸素原子を介して）上の反応性基との共有結合、捕 獲プローブは支持体への共有結合の唯一の手段が上記（３）型のものである場合 には、固形支持体に“末端結合”していると言われる。特に捕獲プローブを含む 固形支持体を核酸プローブアッセイ法に用いるためには、高い割合の捕獲プロー ブが末端結合していること、および末端結合プローブと支持材との非共有型相互 作用を最小限に抑えることが有利である。この種の末端結合した捕獲プローブは 標的を捕獲するために最大限に利用されるからである。支持体において捕獲１０ −ブの約１０％以上が末端結合している場合、固形支持体において“実質的割合 ”の捕獲プローブが末端結合している。少なくとも約３０％が末端結合している ことが好ましい。 捕獲プローブが本発明に用いられる固形支持材（たとえばケイ酸塩ガラスピーズ 、架橋デキストラン、ポリスチレン）に、核酸の末端にジスルフィド結合または ホスホルアミデート基を与えるリンカ−によって結合している固形支持体につい ては、末端結合の程度の測定は可能である。ジスルフィド結合は緩和な条件下で 容易に還元されて末端結合しているプローブを放出するが、１個または２個以上 の塩基を介して共有しているプローブは放出しないからであり、またホスホルア ミデート結合は酸不安定性であり、同様に適切な酸性条件下で、末端結合してい るプローブを放出するが、１個または２個以上の塩基を介して共有結合している プローブは放出しないからである。非共有結合は捕獲プローブを支持材と共に、 リンカ−などにより共有結合しない条件下でインキュベートし、支持材により吸 収されたプローブの量を測定するだけで推定できる。これらの共有結合および非 共有結合の測定に際しては、３２ｐ標識された捕獲プローブを用いることが好都 合である。この場合、支持体に付随するプローブおよびそれから除かれたプロー ブの量を容易に測定しうるからである。 特に前記のように、捕獲プローブが各種支持材に各種リンカ−によって結合して いる様式を判定することにより、前記のグループ（Ｂ）（３）による固形支持体 （特定の水酸基酸素原子において、式 ％式％ の基により誘導体にされた架橋デキストラン系マクロ孔質材料）の優れた特性が 見出された。これらの支持体のうちきわめて好ましいデキストラン系材料はセフ ァクリルＳ−５００である。ジスルフィドを含まないリンカ−がより好ましい。 好ましいセファクリルＳ−５００以外のマクロ孔質架橋デキストラン系材料も本 発明による固形支持体に使用できることを認識すべきである。たとえばセファク リルＳ−２００およびセファクリルＳ−１０００（ファルマシア社により販売） も、他のマクロ孔質架橋デキストラン系材料、特にセファクリル類のように、ア リルデキストランをＮ、Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することによ り製造された材料（ファルマシアその他の会社により販売）と同様に使用できる 。 本発明をここにＨＩＶ−１の検出について説明するが、当業者には本発明があら ゆる核酸系被分析体、特にアッセイされる試料中に一重鎖の形で存在するもの（ すなわち相補的配列をもつ連鎖を大幅に上回る一本の連鎖をもつもの）について 適用でき、ＨＩＶ−１に限定されないことが明らかであろう。 さらに本発明による固形支持体は、ここでは主としてそれらを核酸プローブアッ セイに用いることにつき記述したが、アフィニティークロマトグラフィー（“オ リゴｄＴカラム”が長い間使用されているように）に用いて目的核酸を単離する こともできる。 オリゴｄＴカラムはポリＡティル付きＲＮＡの単離に限定されているが、本発明 の支持体と用いると、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであっても、またポリアデニ ル化されていてもいなくても、目的とする特定の核酸を単離することができる。 捕獲プローブがジスルフィド結合をもつリンカ−によって支持材′に結合してい る本発明の支持体は、目的とする核酸をアフィニティークロマトグラフィーによ り得るために有利に用いられる場合がある。これらのジスルフィド型リンカ−を 含む支持体から捕獲プローブ（目的とする核酸にアニールしたもの）を分離する のに必要な条件が緩和であり、実施しゃすいからである。 ここで“活性エステル”とは当技術分野で理解されるように、カルボキシレート 基とＮ−しドロキシスクシンイミド、５−２−ピリジンなどの化合物により形成 されるエステルを表わす。 本発明のアッセイ法が適用される試料は、通常は粗製検体、たとえば血液その他 の体液、植物または動物から得た組織試料、食品試料、微生物培養物などを、当 技術分野で知られている方法により処理して、これから核酸、または少なくとも 核酸系被分析体（すなわち“標的”）を含むと思われる核酸画分を分離すること によって得られるであろう、単離過程で、アッセイを妨害し、特定の酵素の場合 は核酸系被分析体およびオリゴヌクレオチド型プローブを破壊する可能性のある 他の物質（たとえば蛋白質）から核酸が分離されるであろう。 被分析体が存在する場合に、これがアッセイの検出限界以下の濃度で存在すると 思われる場合には、たとえばサイキら、サイエンス２３１．１４３４−１４３６ （１９８５）から採用される方法に従って被分析体の量を増幅する必要があろう 。 プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの条件、ならびに不 安定な状態でハイブリダイズしたプローブまたはハイブリダイズしていないプロ ーブを洗浄除去するための方法は、核酸プローブアッセイの技術分野の専門家に は周知である。 第２プローブは、存在すると思われる被分析体の最大量が経験から分かっている 大部分の場合、ハイブリダイゼーション液中の被分析体の量に対し過剰モル量で 供給することは容易である。この最大量がもし分かっていない場合には、第２プ ローブ濃度が広範に変化した幾つかのアッセイを異なる試料部分につき実施する ことにより、第２プローブが過剰モルであるアッセイに確実に行うことができる 。 被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の標識からの信号が固形支持体に 付随するものであるか否かの判定は、支持体においてその標識に適した測定を行 って支持体からのこの種の信号を検出することによる。８ましくは、被験試料に 由来する被分析体が結合している可能性のある支持体からの信号を、対照支持体 、すなわち被験試料について採用されたと実質的に同じ方法で処理されているが 、それに被分析体は結合していないことが分かつている支持体からの信号と比較 する。被験試料からの信号が対照支持体からの信号よりも規模が大きい場合、ア ッセイが双方の支持体について操作可能であることが分かつている限り、被験試 料支持体からの信号は被験試料中の被分析体に起因することが確認される。もち ろん当技術分野において理解されるように、アッセイされる核酸を含有すること が知られている陽性対照試料をも被験試料および陰性対照試料と平行使用して、 そのアッセイ系が本発明を以下の実施例に若干詳細に説明する。 実施例Ｉ プローブの調製および精製 短鎖オリゴヌクレオチド（溶液からの被分析体の捕獲に関与する成分を含む）を 用いるサンドイッチアッセイにおいては、感度および特異性、従って信頼性のた めに、プローブが高純度でありかつ均一な配列をもつことが重要である。十分な 品質をもつオリゴヌクレオチドを得るために当業者にとっては多数の合成法およ び精製法があるが、本発明者らは下記の方法を受容しうろことを認めた。すなわ ちオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｃｌｅ　Ｂ　 ｉｏｓｙｓｔｅｍ）３８０Ａ型自動合成装置を用いて、シアノエチルホスホルア ミデート化学により合成される０合成は１Ｍモルの規模で９分間の短い結合サイ クルを用いて行われる。各結合サイクル独自の収率は比色ア・ンセイ法を用いる トリチル検出により測定して９８％である。この方法によって３０ヌクレオチド のＤＮＡプローブが３時間で合成され、次いで塩基保護基の除去およびトリチル 化オリゴヌクレオチドの精製にさらに１８時間を要する。精製プロトコール終了 時に得られるオリゴヌクレオチドの量は合成１回当たりオリゴヌクレオチド４０ ０〜６００μ２である。 特異的標的核酸である被分析体を確実に検出するためには純粋な全長プローブが 必須であるため、本発明者らはオリゴヌクレオチド精製のプロトコールを開発す ることに特別な注意を払った。トリチル化オリゴヌクレオチドの精製はＣ−１８ 逆相半調製用クロマトグラフイー（１０Ｘ　２５０＋＊＋＊のカラム）により行 う、Ｃ−１８クロマトグラフイーの前に脱トリチル化されたオリゴヌクレオチド を単離する試みは、オリゴヌクレオチドの疎水性がより低いためより効率の低い 精製手段であることが証明された。４０分間にわたって０．１Ｍ　）ジチルアン モニウムアセテート中１５〜３５％のアセトニトリルの濃度勾配を用いて、トリ チル化された全長オリゴヌクレオチドを溶離した。このオリゴヌクレオチドを次 いで水中の８０％酢酸により１時間脱トリチル化した。脱トリチル化ののちＧ− ５０セフアデツクスクロマトグラフイーを行った。単離されたオリゴヌクレオチ ドをさらにＲＰＣ−５カラム上でのＨＰＬＣにより判定した＜４．６Ｘ２５０ｍ ｍのカラム；溶剤Ａ。 ２−Ｍトリス、ｐＨ１２、溶剤８．２＋ｍＭ）リス、２００諭Ｍ過塩素酸塩、ｐ Ｈ１２，濃度勾配置０％Ｂから５０％Ｂまで、４０分間）、この最後の工程は少 量のオリゴヌクレオチドについては付加的な精製工程にもなる。 比較的長鎖のオリゴヌクレオチド（〉５０ヌクレオチド）については、全長オリ ゴヌクレオチドの単離は１２〜２０％のゲルを用いる調製用ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により行われる（マニアチスら（前掲）に記述されるプロトコール に従う）。 前記の方法（５０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに関するもの）を採用 して、表ＩにＤＮＡとして挙げられるオリゴヌクレオチドを調製した。 実施例■ プローブのリン酸化 オリゴヌクレオチド型プローブを３′−ヌクレオシドの３′−炭素原子（“３′ 末端”）または５′−ヌクレオシドの５′−炭素原子（“５′末端”）において 標準法によってリン酸化する。 ３′末端におけるリン酸化についてはバネットおよびコラナ、ジェイ、バイオロ 、ケミ、（Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、）２４９．５２１３−５２２１を参照 されたい。 オリゴヌクレオチドはそれらの５′末端においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ を用いて標準プロトコールに従ってルーチンにリン酸化されたくマニアチスら（ 前掲）を参照されたい）。 ３２ｐ標識プローブを調製するためには、適宜な位１に３２ｐ含有ホスフエート を含む基質をリン酸化に用いる。 実施例■ プローブの標識付けおよび検出 検出のためのプローブ標識付けは放射性または非放射性標識により行うことがで きる。 放射性標識付けを採用する場合、実施例Ｈに記載した３２ｐ標識付けが好ましい が、他の同位体、たとえば１２８工または”Ｃを用いた既知の方法に従う標識付 けも採用できる。 被分析体（固形支持体に結合した捕獲プローブと複合体を形成）と複合体を形成 した放射性標識プローブを検出するためにはシンチレーション計数法が採用され る。 多数の非放射性標識付けおよび付随する検出のプロ１〜コールが知られている。 標識オリゴヌクレオチド型プローブとこのプローブの配列に相補的な配列をもつ 被分析体セグメントとの間の塩基対合に対する妨害が最小であるこれら標識付は 技術はいずれも本発明に採用できる。たとえばビオチンに結合し、かつホスホル アミデート結合によりオリゴヌクレオチドの５′末端のホスフェートに結合した ジアミン系リンカ−を介するビオチンによる標識付けを採用しうる（チューおよ びオーゲル、ＤＮＡ、４巻、３２７−３３１（１９８５）に従う）、ビオチンの 代わりにＥＤＴＡキレート化蛍光Ｅｕ”を用いる同様な標識付けも採用し、うる （ムッソら、国際特許出願公開Ｗ　Ｏ８７１０２７０８号明細書に記ｔＩ’、） 。 ヌクレオシド塩基に結合したビオチン（ドライヤーおよびダーバン（前掲）によ り報告されたもの）による標識付けも採用できる。 実施例■ 多孔質ケイ酸塩ガラスの誘導体形成 （Ａ＞“長鎖アルキルアミン”誘導体型の制御細孔ガラスはパース・ケミカル社 （米国イリノイ州ロックフォート）から購入された。製品Ｎｏ、２４８７５．こ の多孔質ゲイ酸塩ガラスは式（ＣＨｚ）ａＮ　Ｈ２の基で誘導体にされたケイ素 原子を含む。 （Ｂ）　カルボキシル誘導体型の制御細孔ガラスはパース・ケミカル社（米国イ リノイ州ロック７オード）から購入された。製品Ｎ　ｏ　、２３７３５　、この 多孔質ケイ酸塩ガラスは式−（ＣＨ２＞３８Ｈ（Ｃ○）（ＣＨ２）２Ｃ○２Ｈの 基で誘導体にされたケイ素原子を含む。　（Ｃ）　チオール誘導体型の制御細孔 ガラスもパース・ケミカル社（米国イリノイ州ロックフォード）から購入された 。製品Ｎ　ｏ、２３７４８．この多孔質ケイ酸塩ガラスは次式の基で誘導体にさ れたケイ素原子を含む。 （Ｄ）　スクシンイミドエステル誘導体型の多孔質ケイ酸塩ガラスは前記のカル ボキシル誘導体型ガラスを用いて調製される。 カルボキシル誘導体型ガラスをアセトンで３回、次いで乾燥アセトン（４人の分 子篩上に置くことにより乾＠）で３回洗浄することにより乾燥させる。これらの ビーズを次いで焼結ガラスろうとにより濾過し、真空中で１０時間乾燥させる。 乾燥Ｎ、Ｎ”−ジメチルホルムアミド（“ＤＭＦ”）　］、５　ｚ　１中の乾燥 ビーズ５００＋ｙにジシクロへキシルカルボジイミド５００１９およびＮ−ヒド ロキシスクシンイミド３００３＋１７を添加する。混合物を１６時間攪拌し、乾 燥ＤＭＦ＜３回、各２０ａ＋１）および塩化メチレン（２回、各２０ｚ１）で洗 浄して、過剰の試薬およびジシクロヘキシル尿素を除去する。得られた支持体を 次いで真空中で３時開乾燥させる。 実施例Ｖ マクロ多孔質架橋デキストラン系支持体の誘導体形成（Ａ）　セファクリルＳ− ５００はファルマシア社（米国ニューシャーシー州ビスカッタウェイ）からコー ドＮ　ｏ　、１．７−０４７５−　ＯＸで購入された。 （Ｂ）　セファクリルＳ−５００をブーネマンら（前掲）の方法に従って臭化シ アン活性化した。製造業者により供給された湿潤材料１００ｇを大過剰の蒸留水 および焼結ガラスフィルターを用いて洗浄した。オーバーヘッドかい形攪拌機お よびｐＨ［極を備えた１０００１Ｎのビーカーに湿潤ケーキを移した。水冷しな 水５００Ｒ１を添加し、混合物を激しく攪拌し、その間木片を時々添加すること により１０℃以下に保った。固体臭化シアン４０ｇを添加し、ｐＨを反復監視し 、５　Ｍ−ＮａＯＨの添加により約２０分間、１０．５〜１１．５に維持した０ 次いでビーズ材料を５容量の氷冷水ののち１容量の氷冷した１０ｍＭリン酸カリ ウム（ｐＨ８，０）で速やかに洗浄した。 当業者に理解されるように、ＣＮＢｒ活性化には隣接炭素原子上に水酸基を必要 とする。 （Ｃ）　カルボキシル誘導体型の材料は下記により調製された。 １０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）２００ｚｉ中の新たに調製した２０９のＣＮ Ｂｒ活性化セファクリルＳ−５００の懸濁液に６−アミノカプロン酸１６ｇを４ 回に分けて３０分毎に添加し、得られた混合物をかい形攪拌機で２０分間攪拌し た。（あるいは６−アミノカプロン酸の代わりにヘキシレンジアミンを用いて、 そのアミン誘導体型支持体を得ることができる）。 得られた誘導体型セファクリルを焼結ガラスろうとにより枦通し、１０＋ｍＭリ ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）　；　Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８ ，０）；Ｉ　Ｍ−ＫＣｌ、０．１Ｍ−ＮａＯＨ５最後に水で徹底的に洗浄した０ 次いで湿潤ゲータを０．１Ｍ　−Ｍ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ６，０）に懸濁し、４℃に 保存した。 （Ｄ）　スクシンイミド誘導体型のマクロ孔質架橋デキストラン材料は下記によ りカルボキシル誘導体型の材料から調製された。０．１Ｍ　−ＭＥ　Ｓ［衝液（ ｐＨ６）に懸濁したカルボキシル誘導体型セファクリル５−ｓｏｏを焼結ガラス ろうとに移し、順次氷、７０：３０．５０：５０次イテ３０ニア０（’）　Ｈ２ ０／　７　セ）　７　テ洗浄したのち、アセトンで３回、次いで４オングストロ ームの分子篩で乾燥させたアセトンで３回洗浄した。−過したのちセファクリル を高真空下に（０，０１）ル）１０時間乾燥させた０次いで乾燥したカルボキシ ル誘導体型材料を実施例ＩＶ（Ｄ）にカルボキシル誘導体型の多孔質ガラスにつ き記載したと同様に処理して、スクシンイミドエステル誘導体型セファクリルを 得た。 （Ｅ）　チオール誘導体型セファクリルＳ−５００は下記により調製される。　 １０＋ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８，０）中の新たに調製した１５２のＣＮＢｒ 活性化セファクリルＳ−５００の懸濁液にシスタミンジ塩酸塩５ｇを添加し、混 合物をかい形攪拌機で２０時間攪拌する。得られた誘導体型セファクリルをＶ（ Ｃ）の場合と同様に濾過し、洗浄する。使用前に誘導体型材料のリンカ−である シスタミンのジスルフィド結合は、この材料を１１００ｅａジチオトレイ１〜− ル（ＤＴＴ）、５０ｒａＭ　−ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ７，７＞に２５℃にお いて１時間懸濁し、次いでこの材料を脱泡した０、２Ｍ　−ＨＥ　ＰＥ　Ｓ　（ ｐＨ７，７）、０．１Ｍ　−Ｋ（Ｊで十分に洗浄し、最後に０．２Ｍ・ＨＥ　Ｐ 　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ７，７＞で再び洗浄することにより解裂される。 実施例■ ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン系支持体の誘導体形成（Ａ）　１％架橋ジビ ニルベンゼン−ポリスチレンクロルメチル樹脂（１，１ｍＭｅ！／１？、２００ −４００メツシュ）は、ニー・ニス・バイオケミカル社（米国オハイオ州クリー ブランド）から購入された。 １２％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ（メツシュサイズ２００〜４０ ０）はポリサイエンス（ペンシルベニア州ワリントン）から購入された。 （Ｂ）１２％架橋ジビニルベンゼン−ポリスチレンビーズを下記によりカルボキ シル誘導体にした。 上記ビーズ１０ｇを１．２−ジクロルエタン１５０ｚｌに添加し、混合物を還流 した。ニトロベンゼン１０１Ｒ中の塩化アルミニウム２０ミリモルおよびグルタ ル酸モノメチルエステルクロリド１０ミリモルの濾過混合物を５分間にわたって 添加し、反応混合物をさらに４時間還流した。樹脂を焼結ガラスろうとで濾過し 、ジオキサン：４Ｎ　−Ｈ（Ｊ（３：１）、ジオキサン；水（３：１）、ジオキ サン、エタノール、アセトン、最後にメタノールで洗浄し、次いでデシケータ− 内で真空下に乾燥させた。三日フラスコ中のＫＯＨ２ｙにエチレングリコール１ ００ｙ／を添加し、混合物を１００℃に加熱した。ＫＯＨが十分に溶解したのち 、乾燥した誘導体型樹脂５ｇをヒドラジン水化物３ｙｔ（ｌと共に添加した。混 合物を還流させ、３時間還流したのち還流温度が１９８℃に達するまで液体の一 部を留去した０次いでフラスコを密栓し、１２時間還流を続けた６次いで樹脂を 前記（グルタル酸モノメチルエステルクロリドによる誘導体形成後）と同様に洗 浄した。 （Ｃ）１２％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズを下記によりアミン誘導 体にした。カルボキシル誘導体型ビーズ５ｇにジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　 Ｆ　＞５０ｚｌ中のジシクロへキシルカルボジイミド１ｆＩおよびＮ−ヒドロキ シスクシンイミド１．２５９を添加した。３０分間攪拌したのち、１，８−ジア ミノオクタン７ｆＩを添加し、混合物をさらに３時間攪拌した０次いで樹脂を濾 過したのち、順次メタノール、水、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ　２、最後にアセト ンで洗浄した。 （Ｄ）　１％ジビニルベンゼン架橋したクロルメチル誘導体型ポリスチレン樹脂 を下記によりアミノ誘導体にした。ＤＭＦ８０１１１中の１％架橋したクロルメ チル誘導体型樹脂（ニー・ニス・バイオケミカル社により供給）　１０．にＮ− ｔ−ブチルオキシカルボニル−６−アミノカブロンＭ２．６１？およびフッ化カ リウム１．２８２を添加し、混合物を８０℃で１６時間攪拌した。次いで樹脂を 濾過し、順次ＣＨ２Ｃｌｘ、メタノールおよびアセトンで洗浄したのち、高真空 （０，０１）ル）を３時間施した。ＣＨ２（Ｊ２中の３０％トリフルオル酢酸を 用いてアミノ基の脱保護を行い、アミン誘導体型の支持体を得た。アミノ酸のピ クリン酸滴定によって０．１７ミリモル／９（樹脂〉の置換水準が示された。 実施例■ オリゴヌクレオチドの５′−アミノアルキル、５′−カルボキシルアルキル、お よび ５′−シスタミニルホスホルアミデート誘導体（Ａ）　５’−アミノアルキルホ スホルアミデート誘導体アミノアルキル誘導体は一般に１〜２０μＭの濃度で１ 〜１０ナノモルの規模において調製された。以下のプロトコールはチューら、ヌ クレ、アシッズ、リサ、（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＞１１．６５１３− ６５２９（１９８３）のものであり、修飾されたオリゴヌクレオチドはエタノー ル沈澱法により単離された（コレットおよびカワシマ、ヌクレ、アシッズ、リサ 、（Ｎｕｃｌ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、Ｈ３，１５２９−１５４１（１９８５）に 従う。 すなわちオリゴヌクレオチドのアミノ−へキシル付加物を調製するために、シリ コナイズしたエッペンドルフ試験管内でオリゴヌクレオチド（５′末端において リン酸化されたもの）４ナノモルを、０．３肩βの０　、２４　Ｍ・１．６−ジ アミツヘキサン、０．１Ｍ・Ｎ−メチルイミダゾールおよび０．１Ｍ・１−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノブロビル）カルボジイミド（“ＣＤＩ”）（ｐＨ ６，０）中に入れ、２０時間反応させた。得られたＤＮＡを３回エタノール沈殿 させて過剰のジアミンを除去し、次いで０．１Ｍ　−ＭＯＰＳ　（ｐＨ７，５） に入れた。オリゴヌクレオチドが反応中に試験管の側面に非特異的に結合するの を防ぐために、オリゴヌクレオチドを反応させる際には常に試験管をシラナイズ 液で前処理するのが必須であることが認められた。 同じ方法により、ただし１，６−ジアミツヘキサンの代わりに１．２−ジアミノ エタンまたは１．８−ジアミノオクタンを用いると、６−アミノヘキシル付加物 の代わりにそれぞれ２−アミノエチルまたは８−アミノオクチル付加物が得られ る。 （Ｂ）　５′−カルボキシアルキルホスホルアミデート誘導体表組の誘導体をグ リシンまたはアミノカプロン酸により調製するために、下記の方法を採用した。 シラナイズしたエッペンドルフ試験管内で５′−リン酸化オリゴヌクレオチド４ ナノモルを、０．３ｘｌの０．１Ｍイミダゾール、０．１Ｍ−ＣＤ　Ｉ　（ｐＨ ６，０）中に２５℃で入れ、ホスホルイミダゾリドを９０分間かけて生成させた ０次いでオリゴヌクレオチドをエタノール沈澱させたのち０．１Ｍグリシンまた は０．１Ｍアミノカプロン酸の溶液（ｐＨ８，０）０．３ｘＲに再溶解し、５０ ℃に３時間加熱した。次いで得られた付加物をエタノール沈澱法により単離し、 最後に０．０５Ｍ　−Ｍ　ＯＰＳ（ｐＨ７，５）に入れた。 （Ｃ）　５’−シスタミニルホスホルアミデート誘導体シラナイズしたエッペン ドルフ試験管内で５′−リン酸オリゴヌクレオチド１ナノモルに０．３ｄの０． １Ｍイミダゾールおよび０．１５Ｍ　−ＣＤ　Ｉ　（ｐ）４６．００）を添加し 、得られた溶液を２３℃で１．５時間インキュベートした。５′イミダゾリド誘 導体をエタノール沈澱法により単離し、次いで０．２５Ｍシスタミン（ｐ　Ｈ７ ，７）０．３１１に入れ、そこで反応を５０℃において３時間進行させた０次い でシスタミニルホスホルアミデート誘導体を３回エタノール沈澱させて過剰のシ スタミンを除去した０次いでＤＮＡベレットを０．０５Ｍ　−Ｍ　ＯＰ　Ｓ　（ ｐＨ７，５＞４ｍ入ｉ７’、：　。 （Ｄ）　３’誘導体 ５′末端においてリン酸化されたものの代わりに３′末端においてリン酸化され たオリゴヌクレオチドを用いて実施例■（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の場合と同 じ方法に従って、５′誘導体型のものの代わりに３′誘導体型ホスホルアミデー ト付加物を得る。 実施例■ オリゴヌクレオチドによるアミノ誘導体型多孔質ケイ酸塩ガラスの誘導体形成 表題の誘導体形成に用いられる標準反応は下記のものである。 長鎖アルキルアミン誘導体型の制御細孔ガラス（バース・ケミカル社、製品Ｎ　 ｏ、２４８７５）　（アミノ基２０〜３０マイクロモル／ｇ＜ガラス）を含む） Ｌｏｇをシラナイズされた工・ンベンドルフ試験管内で０．１１＋６の０．１Ｍ 　−Ｎ−メチルイミダゾール、０．１Ｍ　−ＣＤ　Ｉおよび５ｘｉｏ−’〜２０ Ｘ１０−’Ｍ・５′−リン酸化オリゴヌクレオチドと混和する。攪拌しながら２ ４時間反応を続け、次１１でビーズをＮ　ａｏ　Ｈ（ｐＨ１２）で１分間洗浄し て、非特異的に結合したＤＮＡを除去する。最後に、誘導体にされたビーズをＴ Ｅ緩衝液（１０綿トリス、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）中に保存する。 使用前にビーズを１００μ！の５０ＴａＭ酢酸−またはプロピオン酸−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル、０．２Ｍ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，７）と混和し 、１５分間反応させ、次いで０．２Ｍ　−ＨＥ　ＰＥ　Ｓ　（ｐＨ７，７）で３ 回洗浄し、最後にＴＥ緩衝液中に保存することにより、ビーズの未反応アミノ基 をプロ・ツクする。この処理はビーズの遊離アミン基を実質的にすノくてプロ・ ツクするのる二十分である。 アミン誘導体型多孔質ケイ酸塩ガラスピーズへのオリゴヌクレオチドの結合収率 は、３２Ｐ標識５′−リン酸化オリゴヌクレオチド２５ピコモルとビーズ５０す を０．５５ｚｌの０．１Ｍ・メチルイミダゾール、Ｏ，ｔＭ　−ＣＤ　Ｉ　（ｐ Ｈ６，ｏｏ）中で攪拌下に２４時間反応させ、次いでＮ　ａｏ　Ｈ（ｐＨ１２＞ で１分間洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去することによって測定された 。非特異的（すなわち非共有）結合は反応をＣＤＩの不在下に行うことにより測 定された。次いでビーズからのチェレンコフ計数をベックマンＬ　Ｓ　７８００ 液体シンチレーションシステム（ベックマン・インスツルメンツ社）により測定 した。“結合収率”はビーズに結合した２５ピコモルの両分である。結合収率は オリゴヌクレオチドの長さの間数であることが認められた。一般にアミン誘導体 型多孔質ガラスピーズに対し１７−ｍｅｒについては７５〜８０％の収率が得ら れ；２５−　ｖｅｒについては４０〜４５％の収率が得られた。非特異的結合度 は４〜６％であった。ホスホルアミデート結合の酸加水分解により支持体から本 質的に完全にオリゴヌクレオチドが離脱した。これはこの節に記載した方法によ って非特異的に結合していないオリゴヌクレオチドはすべて末端結合しているこ とを示す。 実施例■ ５′−アミノアルキルホスホルアミデート誘導体型オリゴヌクレオチドによる臭 化シアン活性化マクロ孔質架橋デキストラン系支持体の誘導体形成新たに調製し たＣＮＢｒ活性化セファクリル５−ｓｏｏビーズ５００１？（湿潤）を０．５ｚ ｌの０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ，，０，５Ｍ−Ｎａ（１！（ｐＨ８，３）、および０ ．０２５ｚｆの５′−６−アミンへキシルホスホルアミデート誘導体型オリゴヌ クレオチド（約５ｘｌＯ−’Ｍ）と０．０５Ｍ・Ｍ　ＯＰ　Ｓ　（＋）Ｈ７，５ ）中で混和する。反応を２０時時間待させる。 次いで試験管を遠心分離し、上層液を除去したのち、０．１Ｍ・トリス（ｐＨｓ 、ｏｏ）と１時間混和して、臭化シアン誘導体形成から残された未反応部位を不 活化する０次いでビーズをＮ　ａ　ＯＨ（ｐＨ１２）で４回洗浄し、最後にＴＥ ［衝液中に保存する。この場合、セファクリルの水酸基の酸素原子とオリゴヌク レオチドの５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を連結するリンカ−は次式の構 造をもつ。 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）−６−アミノエチルホスホルア ミデート誘導体にされる代わりに２−アミノエチルホスホルアミデート誘導体に されたオリゴヌクレオチドを用いて同じ処理を行うことにより、デキストランの 酸素原子とオリゴヌクレオチドの５′−ヌクレオシドの５′酸素原子とのリンカ −が次式の構造をもつ固形支持体が得られる。 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＰＯ□）一実施例Ｘ ５′−アミノアルキルホスホルアミデート誘導体型オリゴヌクレオチドによるカ ルボキシル誘導体型固形支持材の誘導体形成前記カルボキシル誘導体型の多孔質 ゲイ酸塩ガラス、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、およびマクロ孔質架橋デ キストラン系の支持体につき下記の１０トコールを適用した。 カルボキシル誘導体型の支持体５０〜７５ａｙ　（セファクリルの場合は湿潤重 量）に、２５〜３０ピコモルの５′−アミノアルキルホスホルアミデート−また は５′−シスタミニルボスボルアミデート誘導体型のオリゴヌクレオチドと、０ ．７５ｚ１の０．１５Ｍ　−ＣＤＩ、０．１Ｍ・ＭＥＳ（ｐＨ６）中において添 加し、混合物を回転ミキサーにより１時間（セファクリルの場合）または１６時 間（ガラスおよびポリスチレンの場合）Ｍ和に攪拌する。（セファクリルとの反 応速度がより大きいことはこの材料の著しい利点である。）反応後に支持体をＮ 　ａｏ　Ｈ（ｐＨ１２）で４回洗浄し、最後に、オリゴヌクレオチド誘導体型の 材料をＴＥＭ衝液中に保存する。 これらのカルボキシル誘導体型支持体についての結合収率は、上記の例に示した ように３２ｐ標識オリゴヌクレオチドを使用し、ビーズのチェレンコフ計数を測 定することによりめられた。 非特異的結合はＣＤＩの不在下で結合反応を行ったのち支持体における放射能を 測定することにより評価された。オリゴヌクレオチドに結合したリンカ−の末端 アミノ基を介したものではなく塩基のアミノ基を介した結合は、リン酸化された くただし他の点では誘導体にされていない）オリゴヌクレオチドを支持材と反応 させることにより評価された。末端結合度はホスホルアミデート結合をＨＣｌ（ ｐＨ２＞中で３７℃において４時間加水分解したのち支持体をＮａＯＨ（ｐＨ１ ，２＞で洗浄することによりめられた。これにより支持体上の残留放射能が末端 結合が推定値を与える。５′−シスグミニルホスホルアミデート誘導体型オリゴ ヌクレオチドを含む支持体については、末端結合度はジスルフィド結合をＤＴＴ で解裂させることにより測定された。すなわちオリゴヌクレオチド誘導体にされ た支持体５０１９を２３℃で０．２ｚｌ（７）０．１Ｍ　−ＤＴＴ　、０．１Ｍ 　・ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、オよＬ’１ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ７，７）と共に１時 間インキュベートした０次いで支持体をＮ　ａｏ　Ｔ４　（ｐＨ１２）で洗浄し て、離脱したオリゴヌクレオチドを除去した。一般に、シスタミニル誘導体型オ リゴヌクレオチドについての末端結合の測定結果はアミノアルキル誘導体型オリ ゴヌクレオチドについてのものと一致した。 シスグミニル誘導体型オリゴヌクレオチドを脱離するために用いられる条件が緩 和であることは、本発明の固形支持体を核酸の単離に適用するにつき、注目すべ きである。 本発明のきわめて好ましい固形支持体は５’−（６−アミノへキシルホスホルア ミデート）誘導体型オリゴヌクレオチドで誘導体にされたカルボキシル誘導体型 セファクリルＳ−５００である。 この例の方法を採用すると、カルボキシル誘導体型セファクリル５−ｓｏｏのａ ｇ＜湿潤重量）当たり約１．２ピコモルのオリゴヌクレオチドが誘導体形成され る。約半量のオリゴヌクレオチドがもっばら末端結合しており（オリゴヌクレオ チドに結合した６−アミノへキシルホスホルアミデートの６−アミン基とセファ クリルに結合したカルボキシルとの間のアミド結合の形成のみによって共有結合 ）、わずか約０．５％が支持体に非共有結合により結合しており、約半量はオリ ゴヌクレオチドの塩基（たとえばシトシン）のアミン基を介して共有結合してい ると考えられる（支持体のカルボキシル基と６−アミノへキシルホスホルアミデ ートのアミノ基との間のアミドの形成を伴うと思われる）。 支持材のカルボキシル基がそれらのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとし て活性化されている場合、末端結合の水準はより高く、ヌクレオシド塩基を介し た結合は低下する。一般的な固定化法によれば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 活性化したセファクリル系支持体１０１ｇ（乾燥）を、５′−アミノアルキルホ スホルアミデート−または５′−シスタミニルホスホルアミデートー誘導体型の オリゴヌクレオチド２０〜２５ピコモルを含有する０、２Ｍ　−ＨＥ　Ｐ　Ｅ　 Ｓ　（ｐＨ７，７）０．７ｍｌに懸濁し、混合物を回転ミキサーで１時間攪拌す る０次いで支持体をＮａＯＨ（ｐｉ−（ｔ２．０）で４回洗浄し、次いでＴＥ中 に保存する。（水和すると乾燥材料１０１ｆＩから５０１１９の湿潤支持体が得 られる。）これらの条件下で固定化すると、５０〜５５％の結合効率および８０ ％以上のオリゴヌクレオチド末端結合が得られた。しかし結果はＮ−ヒドロキシ スクシンイミド活性化された支持材については変動する傾向があった。これはス クシンイミドエステル部分が加水分解を受けやすいことによると思われる。従っ てスクシンイミドエステル活性化された支持体の調製に際して水分を厳密に除く こと、および真空乾燥したものをＮ２下に４℃で保存することが、この支持体に ついて良好な結果を保証するために有用である。 実施例］ ＨＩＶ−１ゲノムの検出 この例は本発明のオリゴヌクレオチド誘導体形成した固形支持体を核酸系被分析 体、特にヒトにおける後天性免疫不全症候群の原因物質であるＨＩＶ−１ウイル スのゲノムの検出に使用する方法につき説明する。 本発明による固形支持体く”ビーズ）はカルボキシル誘導体型セファクリルＳ− ５００および５’−（６−アミノヘキシル）ホスホルアミデート誘導体型オリゴ ヌクレオチド８５−２４１（捕獲プローブ）を用いて調製された。デキストラン の酸素原子とオリゴヌクレオチドの５′−チミジンの酸素原子との間のリンカ− は次式の構造をもつ。 −Ｃ（＝　Ｎ　Ｈ）Ｎ　Ｈ（ＣＨｚ）ｓ（ＣＯ）（Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）ＩＮ　Ｈ （Ｐ　Ｏ２）−オリゴヌクレオチド８５−２３３を第２の標識プローブとして用 いるためにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２ｐ含有ホスフエートによ り５′−リン酸化した。 以下の方法は８５−２４１および８５−２３３以外の、ＨＩＶ−１ゲノムの重複 ないし各セグメントの配列に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド対を用いて 行うことができる点を留意すべきである。たとえば表１に挙げたオリゴヌクレオ チド対をいずれも使用できる。さらにビーズの調製に用いられる他の固形支持体 を用いて、また第２１０−ブ上に検出のための非放射性標識を用いて行うことも できる。 ＨＩＶ−１について検査すべき者から得た血液１０ｚ＆のリンパ球画分からの総 核酸をいずれかの標準法により分離する。ヒトＤＮＡｌ０μバ約１０８のゲノム の相当）の試料を、ＨＩ　Ｖ−１ゲノムにつき検査すべき核酸試料と平行して陰 性対照としてアツセハイプリダイゼーション液（Ｈ３；５Ｘ　５ＳＰＥ（０，７ ５Ｍ　ＮａＣ１，５０μＭ　ＮａＨ２ＰＯ，、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ） 、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ）を使用前に３７℃に置いて昇温させる。 ２０ｘＳＳＣを希釈して２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，３Ｍ　・ＮａＣ１，３０−Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）となし、その後の使用のために３７℃に置く 。 ビーズの原液をＴＥｇ衝液に再懸濁し、この懇濁液２５０μ！を取出してビーズ ５０３＋１？　（湿潤重量）を得る０次いでこの２５０μｌをエッペンドルフ試 験管に入れ、ビーズを遠心分離して（５秒間）、ビーズ５０ｍｇのベレットとな す、各アッセイは５０ｚｇのビーズを用いて行わなければならない。 次いで下記に従ってプレハイブリダイゼーションを行う。ビーズが保存されてい た緩衝液を５〜１０秒間の遠心骨Ｎ後に除去する。予熱されたＨ　Ｓ　（３７℃ ）２５０μ！をビーズに添加し、ビーズを再懸濁する。このプレハイブリダイゼ ーション混合物を３７℃に１５〜６０秒間置く。 次いでサンドイッチハイブリダイゼーションを行う。 溶液ハイブリダイゼーション工程： ビーズをプレハイブリダイズする間に、標識オリゴヌクレオチド（第２１０−ブ ）を試料（または対照）核酸のアリコートに添加する。このハイブリダイゼーシ ョン液の容量は５０μｌを越えてはならず、ＴＥ緩ｉ液中で行うことができる。 プローブ量と標的量の比率は約５：１（モル対モル）とずべきである。 この標識プローブー標的−ハイブリダイゼーション液（５０μりを６５℃に移し 、５分間置く。 標識プローブ−標的液す４２℃に移す０次いでＨ３を添加して最終ハイブリダイ ゼーション液２５０μ！となし、４２℃で３０〜６０分間ハイブリダイゼーショ ンを続行させる。 捕獲工程： ビーズを捕獲に用いる直前に、ビーズをプレハイブリダイゼーション温度から取 出し、ビーズを試験管底に遠心分離し、ブレハイブリダイゼーション液を除去す る０次いでビーズを３７℃に置き、ハイブリダイゼーション液（標的および標識 プローブ）２５０μｌをビーズに移す、ビーズをハイブリダイゼーション液に再 懸濁させ、５分毎に振とうする。３７℃に６０分間保持する。 洗浄： ビーズがハイブリダイゼーション複合体を捕獲している闇に、シンチレーション バイアルおよびピペットを用意する。 ６０分間の捕獲ののち、ビーズを遠心分離しく５〜１０秒間）、ハイブリダイゼ ーション液を除去する。 予熱く３７℃）した２ＸＳＳＣ１ｍｌをビーズに添加し、試験管を振とうし、５ 〜１０秒間遠心分離する。洗液を除去し、さらに２回洗浄を繰返す。 ｉ＆後の洗液を除去したのち、シンチレーション計数計（たとえばベックマンＬ 　Ｓ　７８００）を用いて各試料につきビーズを計数する。 ビーズから標識プローブの溶ｗＬ： 同位体標識プローブをビーズから回収するために、ビーズを水１００〜１０００ μ！に再懸濁し、１００℃に５分間加熱する。 この懸濁液を使い捨てカラム（クイックーセブ−Ｑ　ｕｉｃｋ−３ｅｐ）に移し 、溶出液を採取する。 この溶液はビーズに付随する標識の８０％を含むと思われる。 この標識を凍結乾燥により濃縮することができる。 使用したヒトＤＮＡ陰性対照を含む固形支持体より得られるバックグラウンドカ ウントを、被分析体を含有すると思われる試料核酸を含む固形支持体より生じる カウントから差引くことによって、試料核酸を含む固形支持体からの信号（被分 析体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド上の標識に起因する）が測定され る。 前記のように、硫酸デキストラン（濃度５〜２０％、好ましくは約１０％）を少 なくとも捕獲ハイブリダイゼーションに用いると、本発明の固形支持体を核酸系 被分析体の検出に使用する際のＳＮ比が著しく高められるこを見出した。これは 被分析体とシテのＨＩＶ−１ゲノムを検出するためにこの例で用いたビーズにつ いて当てはまる。 さらにこの例に示したように、硫酸デキストラン（濃度５〜２０％、好ましくは 約１０％）をプレハイブリダイゼーション液中に用いると、本発明の固形支持体 を核酸系被分析体の検出に使用する際のＳＮ比を高めるのに有利であることも認 められた。 これより好ましさの程度は低いがこの例の上記方法の変法においては、非相同（ 本明細書においては“不活性”ともいう）核酸、たとえば音波処理したサケ精子 ＤＮＡをプレハイブリダイゼーション液に約１１１ｇ７ｍ１の濃度で含有させる ことができる。 本発明を各種の例につき説明したが、詳細に例示された対象の種々の変更および 拡張が当業者に自明であろう、この種の変更および拡張も、ここに開示され、請 求範囲に示された本発明の精神および範囲に包含される。 本発明の種々の観点も以下の請求の範囲に開示される。 国際調査報告 ＰＣＴ／Ｕ３８７１０１９６６ Ａ＝ａＣｈＯｅｒ＋ｅ　！＋Ｏｒｏｒ：ｌ　？Ｃτ／ＺＳＡ１０１９６６　Ｐａ ｒ：　Ｖ工。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Nucleic acid probe assay methods and compositions TECHNICAL FIELD The present invention relates to nucleic acid probe assay methods and compositions used therefor. More specifically, the present invention captures target nucleic acid-based analytes in a sample to be analyzed from solution by hybridization to a 110-band bonded to a solid support. Regarding how to These methods include sandwich assays. In that case, the target is detected by a second probe, which is labeled for detection and hybridizes to a target analyte segment other than the segment hybridized to the first probe. Bridize. In the assay methods contemplated by the present invention, the probe attached to the solid support is an oligonucleotide of about 15 to about 100 bases. BACKGROUND OF THE INVENTION Nucleic acid probe assay methods for testing samples for the presence of specific nucleic acid-based analytes, and the use of assays of this type for diagnosing diseases in animals and plants, blood, food, etc. and viral or microbial diseases. It is well known to test for contamination, isolate, characterize and engineer genes, and utilize them for other purposes. For example, Meinkos and Wahl, Anal. Biochem, 138, 267-284 (1984); Attis et al., Molecular Cloning Methods: A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1st Knee York (1 982); Owens and Diener, U.S. Pat. No. 4,480,040. and Falkow and Moseley 1 U.S. Pat. No. 4,358,535. Nucleic acid probe assay methods include the aforementioned "sandwich assay method." sand It is recognized that in the switch assay, the capture step may be performed before the labeling step, or the capture and labeling may be performed simultaneously. For example, Langsall and Malcolm, Gene 36.201-210 (1985), Ranki et al. No. 21.77-85 (1983); Dunn and Hassell, Cell 12.23-36 (1977); Lanki and Soderlund 1 U.S. Pat. is not referenced. In the sandwich assay method, the nucleic acids of the sample to be analyzed are directly immobilized on a solid support. Alternatively, the capture probe is immobilized on a solid support, which has the advantage that it does not have to be undone, and this can be done by the supplier rather than the party actually performing the assay. Because sandwich assays involve two hybridizations to the analyte, they also promise higher specificity than non-sandwich assays, which involve a single hybridization of a labeled probe to the analyte. The use of short oligonucleotides of about 100 nucleotides or less as probes in nucleic acid probe assays also provides certain advantages. The time required for hybridization between probe and analyte is reduced as the probe is shorter. According to current chemical synthesis and purification techniques, approximately 100 nucleotides have been sequenced. High purity single-stranded oligonucleotides up to can be manufactured in sufficient quantity and at sufficient speed. These manufacturing methods are It is expensive and requires the use of biological processes (e.g. cloning). It is simpler than the production method of long-chain probes, and has improved sensitivity in nucleic acid probe assays. It gives a probe of higher quality with respect to the objectives of degree and specificity. “Sandwich” where the capture probe attached to the solid phase is shorter than about 200 bases. No studies have been reported on this assay. Various methods have been reported for anchoring single-stranded nucleic acids to solid supports, affinity chromatography (separation is achieved by hybridization of nucleic acids with complementary sequences), and nucleic acid probe assays (including sandwich assays). It has been tell. For example, Langsohl and Malcolm (ibid.); Booneman et al. and Wes 1 ~ Hoff, Meth, Enzymo, (Meth, Enzym-) 100. 400-407 (1983); Booneman, Nucle, Acids, Lisa, (Nucl., Ac1ds Res,) 10.7181-7196 (1982); Booneman et al., Nucle, Acids, Lisa, 10,7t63-7180 (1982) :Cleri See Shi et al., Nukule, Ashiz, Lisa 6, 247-258 (1979), but the attachment of nucleic acids to amine- and carboxyl-derivatized solid supports, particularly when at least about 30% of a nucleic acid probe preparation is terminal deoxyribose Regarding the attachment that is covalently bonded only by the oxygen atom of the hydroxyl group in the Tatari pose part. has not been reported. The present invention relates to sandwich assays and short oligonucleotides of about 100 bases or less. Realizing the benefits of using otides as probes in assays aimed to. SUMMARY OF THE INVENTION Oligonucleotides of 15 to 100 bases are added to nuclei from a hybridization solution. Solid supports of the present invention have been found to be particularly suitable for use in nucleic acid probe sandwich assays used for the capture of acid-based analytes. ) A bound oligonucleotide-type “capture probe” is attached to the support and to the 5′-oxygen atom of the 5′-terminal nucleoside of the oligonucleotide. or covalently attached to the support only through a linker covalently attached to the 3'-oxygen atom of the 3'-terminal nucleoside, thus allowing for example non-covalent association or covalent attachment via a reactive base moiety. is characterized by being fully utilized for the capture of the analyte, unlike when associated with the support in a manner in which the utilization rate for analyte capture is significantly reduced or even lost. The solid supports of the present invention are as follows. (1) Linker with amino terminal group macroporous cross-linked dextran, porous silicate glass, polystyrene derivatized oligonucleotide-type capture protein via the phosphoramidate group. It is covalently attached to the terminal nucleoside of the probe, and the phosphoramidate group (2) Macroporous cross-linked dextran After activation with cyanogen bromide, the derivatized form of the terminal nucleoside of the oligonucleotide-type capture 10-bu By reacting with the amino group of the formed aminoalkyl phosphoramidate group, the crosslinked (3) macroporous cross-linked dextran, porous silicate glass, polystyrene, or latex derivatized with carboxyl-terminated or active ester-terminated linkers; The carboxyl group is diaminoalkyl or diaminoalkyl disulfide for bonding. It is attached to one amine group of the fido (e.g. cystaminyl) moiety through an amide bond, and the other amino group is involved in the phosphoramidate. (4) the phoramidate is attached directly to the terminal nucleoside of the oligonucleotide-based capture probe); Conductorized cross-linked dextran, porous silicate glass, latex or poly Styrene (the sulfhydryl moiety has an active disulfide group (e.g. activated by 2-pyridyl or 4-pyridyl) at one end and an amino group at the other end) is bonded by a disulfide bond to the sulfur atom derived from the linker. and the above The amine group forms part of the phosphoramidate group, which is directly bonded to the terminal nucleoside of the probe, and the disulfide bond is derivatized sulfhydrides to silicates, latex or polystyrene. (produced by disulfide exchange between the lyl group and the active disulfide of the linker attached to the probe). Preferred support materials for producing solid supports according to the invention are as follows. Long-chain alkylamine-derivatized and carboxyl-derivatized controlled pore glasses: manufactured by Perth Chemical Co., Rockford, IL, USA. Product numbers 24875 and 23735 have a nominal pore diameter of 500 oz. It is sold in the form of troms and beads with a particle size of approximately 125-177 microns; and Sephacryl S-500, a macroporous cross-linked dextran material, manufactured by Pharmacia, Biscataway, New Chassis, USA, under code No. 17-0475-01, with a wet diameter of about 40 to about 10 Exclusion for dextran of 5 microns and molecular weight of approximately 2 x 1.0' Daltons or greater. It is sold in beads with an exclusion volume. This sephacryl is treated with cyanogen bromide or with amino-terminated groups as described below. linked with a carboxyl-terminated or active ester-terminated linker. It is modified to become a conductor. A preferred support material and a preferred capture probe (with a suitable linkage attached to their 5' end) The reaction with the probe (which is a probe modified to have a compatible moiety) will be described later. The novel and advantageous sandwich assay method of the present invention is characterized by the discovery of various unexpected properties of the solid support according to the present invention related to the performance of the support in sandwich assays performed in a variety of ways. Based on what was done. According to the prior art, a solid support to which a target nucleic acid-based analyte is attached, such as a nitride cellulose filters) and heterologous (sometimes referred to here as “inert”) nucleic acids ( (e.g., cleaved salmon or herring sperm DNA, or boiled tRNA, which is not labeled for detection and has little sequence homology to the target nucleic acid analyte) (This is because the target nucleic acid on the support is exposed to the protein in solution.) (contained in a solution that is incubated with a solid support under hybridization conditions for the purpose of hybridizing the lobe nucleic acids) tion reduces nonspecific binding of the probe, thereby reducing background signals. It is suggested to reduce the number of See, for example, Maniatis et al. stomach. The prior art includes solid supports derivatized with oligonucleotides and non-compatible Hybridization of a nucleic acid whose prehybridization with the same nucleic acid has a homologous sequence It has been suggested that the capture efficiency of oligonucleotides can be increased during not present. The present inventors have quite surprisingly found that by prehybridization of a solid support according to the present invention with a heterologous nucleic acid, hybridization with a solution containing a target is possible. We found that the capture efficiency of target analytes almost doubled during redization. Further, according to the prior art, even if dextran sulfate is included in a hybridization solution in which a short (100 nucleotides or less) oligonucleotide is present, the oligonucleotide and a nucleic acid having a sequence complementary to the sequence of this oligonucleotide can be combined. This suggests that there is no effect on the efficiency of hybridization between the two. Conversely, outside the window, we have found that when the analyte is long (i.e., approximately 500 bases or more), the capture of oligonucleotides bound to the solid support of the present invention is effective. The capture efficiency was significantly improved by using about 5-20% (/V) and about 9-11% (w/v) dextran sulfate in the hybridization solution. I found out that it can be done. In addition, the present inventors have We found that this concentration of dextran sulfate increases the capture efficiency even when non-homologous DNA is removed. However, for extremely short-chain analytes (approximately 30 bases), sulfuric acid Kytran was found to have little effect on capture efficiency. Furthermore, the main issue The authors suggest that the effect of dextran sulfate on capture efficiency for long-chain analytes is unknown. It was found that this is not a volume-exclusion effect as assumed in the row technology. The basis for the beneficial effect that dextran sulfate was found to have on the capture efficiency of the solid support of the present invention is not clear, as polyethylene glycol has a much smaller effect on capture efficiency. This is related to charge. It seems to be that. The inventors also surprisingly discovered that the capture of analyte and the labeling process Sandwich assay in which hybridization of probe and analyte occurs simultaneously The results obtained by the method (i.e., the analyte bound to the beads by the capture probe) The intensity of the signal from the labeled probe hybridized to the analyte; (corrected for The method was found to be essentially equivalent to a sandwich assay in which hybridization with a labeled probe is followed by capture of the analyte (in whole or in part in complex with a labeled probe). The capture process is a hybridization process with a labeled probe. The results obtained if done earlier than that are clearly inferior to those of the other two methods. This seems to be because the bead-bound analyte is less likely to be bound by the labeled probe in the solution. i & later, a number of the oligonucleotides listed in Table 1 below were published by Ratner et al. A nucleic acid probe hybridization assay for HIV-1 (the causative agent of AIDS) was obtained from the sequence determined by J. It was confirmed that it is suitable for use as a probe in the assay method of the present invention (including the assay method according to the present invention). In particular, these oligonucleotides in redization comparable to that employed in the assay according to the invention. The HIV-1 genome (as proviral DNA) is extracted from infected cells under triviality conditions. It was found that the DNA hybridized to RNA (which is integrated into the genome of the cell) or a fragment thereof, but not to human, E. coli, or pBR322 DNA. Table I Oligo 85-233:5' -c^^^^^CTATTCTT^88 CCTAC C^^To GCCT 3' Oligo 85-241:5' -TATTACATTTT A to ^8 to C (:C^^^ ^CCAGCC-3'oligo 86-30:　5'-TTTCCCTC to TAG:^^^^C8TA ATATGC:Tl;T-3'O Rigo86-32: 5'-TG(:TCT to CTAGTTCAGCGTCTA CTTGT to T-3'Oligo86-34: 5'-CACCTA to GGC T^^CTAT(:T to TCCT^^T^^^G- 3' Oligo 86-36: 5' -TTTC(:T^^CACTACC: C^^^ to GT(1; 'Oligo 86-40: 5'-^CGG^^ ^^TGTCT^^CA CTTCATTCTT^^C-3' Oligo 86-42 75'-^^^T GAT^^^CAGCAGTTGTT(:CAG^ ^TTC -3'oligo 86-44: 5' -TCGAGT^^CGCCTATTCTCTATGTC(:ACAC-3"oligo86-270:5' -CTGTGT^^TGACTtl;AGCTGTTACAACTTGT-3'oligo86-2 72:5' - TCT ^^TTACTACCTCTTCTTCTGCTA to ACT-3', t!, l Co87-84: 5"-AATAT to TTGTTAT TACCAATCTA to CAT-3" The oligonucleotide may be either DNA or RNA, but DNA is used for testing. Of course, RNA, which is For oligonucleotides, T in the above sequence represents uridine. The analyte to be detected is HIV-1 proviral DNA derived from infected lymphocytes, or If the DNA is reverse transcribed from HIV-IRNA, use the original sequence listed in Table ■. Oligobodies having sequences complementary to those of oligobodies may also be suitable as probes. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In one aspect, the present invention provides a single-stranded oligonucleotide with 15 to 100 bases attached thereto. (A) at the silicon atom: (1) a group of the formula (CH2)n(NH)(CO)(CH2)cR1 and -(CHz)n(NH)(PO2)O- (Oligo) (derived from a group with an amino group at the end) In the formula, C is 0 to 5, n is 2 to 8, R8 is methyl or benzyl, and -〇- (oligo) is an oligonucleotide type probe. , (oligo) is the 5′-nucleoside of the probe. 5'-oxygen atom of nucleoside or 3'-oxygen atom of 3'-nucleoside); (2) Groups of the following formula -L, -CO2H and (i) L, + (Co)(NH)(CHz)pNH(PO2)O (oligo). or -L+- in the formula -(CH2)n(N HDCO)(CH2)II-, where the group -(CHz)n is bonded to the silicon atom; m, n, p and r is the same or (3) a group of the following formula: NH(Co)CH -(CH2)n(NH)(CO)(CH)(CH2) S S (CHz)p or (B ) to the oxygen atom of a hydroxyl group on a carbon atom of a sugar moiety that has at least one adjacent carbon atom that has an underivatized hydroxyl group. (1) Group of the following formula C (= NH) NH (CH2) q (NH) (CO) (CHt) c R+ (oxygen of a hydroxyl group derivatized by a group having an amino group at the end) (substantially no atoms), or (2) a group of the following formula -C(=NH)NH(CH2)(NH)(PO2)O-(oligo), or (3) a group of the following formula -C( =NH)NH(CHz)qco,H and (i) R2NH(Pot)O (oligo)2 or (ii) R2-SS(CH2)rNH(Po2)O<, tribo) (C2Q+p and r in the formula are the same or different, and q is 2 to 1o. and R2 is -C(=NH)NH(CH2)Q(Co)(NH)(CH2)p-, where the -〇(=NH) group is bonded to the oxygen atom of the hydroxyl group of dextran. >;if (4) A crosslinked dextra derivatized by the group C(=NH)NH(CHz)nSH and the following formula: (C) may be crosslinked with a crosslinking agent such as divinylbenzene; (1) A group of the following formula (CH2)SCO2H and (+) R3NH(PO2)O (oligo), or (ii) R35S(C Hz)nNH(Pot)O(oligo) (in the formula) L s is -(CHz)s(CO) (NH)(CH2)Ij CA'), where the (CH2)s group is bonded to the phenyl group of polystyrene, and s. or (2) a group of the following formula (CH2)S(CO)(NH)(CH2)p(NH)(CO)(CH2 ) cR. and -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)l)(NH)(PO2)O- (oligo) (no phenyl groups are derivatized with amino-terminated groups); or (3) a solid support selected from the group of the following formula -(CHz)s(Co)(NH)(CHz)pSH, and boristine]/n derivatized by: In another aspect, the invention comprises (&) a 110-base (“capture probe”) which is a single-stranded oligonucleotide of 15 to 100 bases having a sequence complementary to the sequence of the first segment of the analyte. A solid support in which a substantial portion of the 110-b that is part of the solid support is terminally attached to the support (i.e., covalently attached to the support and with a 5' terminal nucleoside attached to the support). (b) complementary to the sequence of the second segment of the analyte; Single-stranded ori with sequence a second probe that is a oligonucleotide and labeled for detection, wherein the sequence of the second probe is non-complementary to the sequence of the first probe; The single-stranded nucleic acid system in the sample is separated using a segment whose segment does not overlap with the first segment. A method for detecting an analyte, the method comprising: (1) prehybridizing the solid support; (i) heterologous nucleic acids or <ii) concentrations of about 5-20% (,/V). dextran sulfate, or a prehive consisting of both (i) and (ii) (2) Incubating the solid support prehybridized according to step (1) with a hybridization solution of about 5-20% (w/v) dextran sulfate; from the sample to be assayed under hybridization conditions; of the nucleic acids (including the analyte, if present in the sample); and the analyte in the hybridization solution. together with a hybridization solution consisting of a molar excess of No. 210 to the amount of the analyte. (3) washing the solid support after step (2) to remove second probes that are not stably hybridized to the analyte; and (4) after step (3). The method comprises determining whether a signal due to a detectable label on a second probe hybridized to the analyte is associated with the solid support. Prior to step 2) in the method of the invention described in the above section, the second probe is optionally incubated in solution with the nucleic acid from the analyte under hybridization conditions. The target analyte, if present in the sample, may be incubated so that at least a portion of the target analyte is already present in the second protein in the hybridization solution. It should be understood that the solid support is hybridized to the lobes and attached to the solid support according to step (2) at the beginning of said step (2). That is, solution hybridization of the labeled second probe and the analyte may be performed prior to capture of the target by the capture probe on the solid support. Another method according to the invention comprises: (a) using a 110-base (“capture probe”) which is a single-stranded oligonucleotide of 15 to 100 bases with a sequence complementary to the sequence of the first segment of the analyte; Contains a solid support comprising: a solid support in which a substantial portion of part No. 110, which is part of the solid support; terminally attached to the support (i.e., covalently bonded to the support and the 5'-oxygen atom of the 5'-terminal nucleoside or the 3'-acid of the 3'-terminal nucleoside) (b) a single-stranded oligonucleotide with a sequence complementary to that of the second segment of the analyte; a 210-branch which is a oligonucleotide and is labeled for detection, provided that the sequence of the 210-branch is non-complementary to the sequence of the 110-branch; The single-stranded nucleic acid system in the sample is separated using a segment whose segment does not overlap with the first segment. A method for detecting an analyte, the method comprising: (1) subjecting the solid support to prehybridization; (i) a heterologous nucleic acid or (ii) dextran sulfate at a concentration of about 5-20% (w/v), or a prehybridization solution consisting of both (i) and (ii); (2) The solid support prehybridized according to step (1) was subjected to hybridization conditions such as approximately 5-20% (-/v) dextran sulfate; nucleic acids from the sample to be assayed (present in the sample); containing the analyte). The first hybridization solution is then incubated to substantially form the second probe. (3) After step (2), the solid support is The carrier is added to the second polymer in molar excess relative to the amount of analyte in the second hybridization solution. The first plate is incubated with the second hybridization solution consisting of the lobes. (4) After step 3), the solid support is washed and a second analyte that has not been stably hybridized to the analyte is removed. removing the probe; and (5) determining whether, after step (4), a signal attributable to the detectable label on the second probe hybridized to the analyte is associated with the solid support. This is a better method. The present invention further provides a test kit for carrying out the method of the present invention for detecting single-stranded nucleic acid-based analytes in a sample. The kit includes a solid support according to the invention, a labeled probe for an analyte captured on the solid support, and reagents (if necessary) necessary to generate a signal from the labeled probe (e.g., labeled enzyme-linked avidin if the label is biotin; In the case of a fluorescent dye, a fluorescence enhancing liquid (see Musso et al., International Patent Application Publication No. WO87702708)) is used. In yet another aspect, the present invention provides a DNA or RNA having the oligonucleotide sequence listed in Clause 1 above, or a complement thereof, that is, the oligonucleotide sequence mentioned above. oligonucleotide with a complementary sequence to the sequence of leotide), and Their DNA or RNA may be labeled for detection, if desired. Ori There are many methods known in the art for detectably labeling oligonucleotides. Any of a number of methods can be employed with the DNA and RNA of the invention. parable For example, if DNA or RNA is by 32p using T4 polynucleotide kinase at the or by passing a diaminoalkyl linker moiety through the phosphoramidate group at the 5' end of the RNA (as described by Chu and Orgel, DNA 4.327-331 (1985)) or through a linker through a modified nucleotide base (as described in Chu and Orgel, DNA 4.327-331 (1985)). or by chelated europium; ions (as described in Musso et al., International Patent Application Publication No. W087102708). Oligonucleotides used as capture probes can be attached to solid supports by the method described below. (2) various non-covalent interactions, such as those in which nucleic acids are bound to nitrocellulose or nylon filters, etc.; Covalent bonding of reactive groups of the soil with reactive groups on the pyrimidine or purine base moieties of the oligonucleotide and (3) reactive groups of the substrate covalently derivatized on or to the support. and one terminal nucleoside or other of the oligonucleotide. covalent bonding with a reactive group on a derivatized group (e.g., via the 5'-oxygen atom of the 5'-nucleoside or the 3'-oxygen atom of the 3'-terminal nucleoside); A capture probe is said to be "end-bound" to a solid support if the only means of covalent attachment to the support is of type (3) above. In particular, in order to use solid supports containing capture probes in nucleic acid probe assays, it is necessary to It is advantageous for the probe to be end-attached and to minimize non-covalent interactions between the end-attached probe and the support material. This type of end-linked capture probe is maximally utilized to capture the target. A "substantial percentage" of capture probes are end-linked on a solid support if about 10% or more of the capture probes on the support are end-linked. Preferably, at least about 30% is end-attached. A solid support in which the capture probe is attached to the solid support used in the invention (e.g., silicate glass beads, cross-linked dextran, polystyrene) by a linker that provides a disulfide bond or phosphoramidate group at the end of the nucleic acid. About Therefore, it is possible to measure the extent of end-linking. This is because disulfide bonds are easily reduced under mild conditions, releasing end-linked probes, but not probes shared via one or more bases; Midate linkages are acid-labile and similarly under suitable acidic conditions, end-linked This is because probes that are covalently bonded via one or more bases are not released. Non-covalent bonding is achieved by incubating the capture probe with a support material under conditions such as a linker that prevents covalent bonding, and the support material absorbs the probe. This can be estimated simply by measuring the amount of probe collected. When measuring these covalent and non-covalent bonds, it is convenient to use a 32p-labeled capture probe. This is the case. In this case, the probe attached to the support and the probe removed from it This is because the amount of bubbly can be easily measured. In particular, as described above, by determining the manner in which capture probes are bound to various supports by various linkers, solid supports according to group (B) (3) described above (at specific hydroxyl oxygen atoms, formula Excellent properties of cross-linked dextran-based macroporous materials derivatized with the formula % have been discovered. A highly preferred dextran-based material among these supports is It is Acrylic S-500. More preferred are disulfide-free linkers. It should be recognized that macroporous crosslinked dextran-based materials other than the preferred Sephacryl S-500 can also be used in solid supports according to the present invention. For example, Sefaq Ril S-200 and Sephacryl S-1000 (sold by Pharmacia) are also similar to other macroporous crosslinked dextran materials, especially the Sephacryl class. By crosslinking lyldextran with N,N'-methylenebisacrylamide, It can be used as well as other manufactured materials (sold by Pharmacia and other companies). Although the invention is described herein with respect to the detection of HIV-1, it will be appreciated by those skilled in the art that the invention It is applicable to all nucleic acid-based analytes, especially those that are present in single-stranded form in the sample being assayed (i.e., with one chain significantly exceeding the number of chains with complementary sequences), and is applicable to HIV-1. Obviously, there is no limit. Furthermore, the solid supports according to the invention are mainly used here for nucleic acid probe assays. Although we have described the use of affinity chromatography Oligo dT columns (as have been used for a long time) can also be used to isolate the nucleic acids of interest. Although oligo dT columns are limited to the isolation of polyA-tiled RNA, they support the present invention. When used with bodies, whether DNA or RNA, polyadenylene A specific nucleic acid of interest can be isolated whether or not it has been synthesized. The capture probe is attached to the support material by a linker with a disulfide bond. The support of the present invention allows target nucleic acids to be detected by affinity chromatography. In some cases, it can be used advantageously because it can be used to This is because the conditions necessary to separate the capture probe (annealed to the target nucleic acid) from the support containing these disulfide linkers are relaxed and easy to carry out. The term "active ester" herein refers to an ester formed by a carboxylate group and a compound such as N-droxysuccinimide, 5-2-pyridine, etc., as understood in the art. The samples to which the assay methods of the present invention are applied are typically crude specimens, such as blood or other body fluids, tissue samples from plants or animals, food samples, microbial cultures, etc., using methods known in the art. interfering with the assay during the isolation process, from which the nucleic acid, or at least the nucleic acid fraction suspected of containing the nucleic acid-based analyte (i.e., the “target”), is separated; In the case of certain enzymes, the nucleic acid will be separated from the nucleic acid-based analyte and other substances (eg, proteins) that may destroy the oligonucleotide-based probe. If the analyte, if present, is believed to be present at a concentration below the detection limit of the assay, the amount of analyte is determined, for example, according to a method adapted from Saiki et al., Science 231.1434-1436 (1985). will need to be amplified. Prehybridization and hybridization conditions and labile hybridized or unhybridized probes. Methods for washing away probes are well known to those skilled in the art of nucleic acid probe assays. The second probe can easily be provided in molar excess relative to the amount of analyte in the hybridization solution in most cases where the maximum amount of analyte likely to be present is known from experience. If this maximum amount is not known, the second By performing several assays on different sample portions with widely varying lobe concentrations, one can ensure that the second probe is in molar excess in the assay. Determining whether the signal from the label on the second probe hybridized to the analyte is associated with the solid support can be determined by performing a measurement appropriate for the label on the support. by detecting this type of signal from the support. 8. Preferably, the signal from a support to which an analyte derived from a test sample may be bound is detected from a control support, i.e., processed in substantially the same manner as was employed for the test sample. The signal is compared to a signal from a support to which it is known that no analyte is bound. If the signal from the test sample is larger in magnitude than the signal from the control support, then As long as the assay is known to be operable on both supports, the test The signal from the sample support is confirmed to be due to the analyte in the test sample. rice cake Of course, as is understood in the art, a positive control sample known to contain the nucleic acid to be assayed may also be used in parallel with the test sample and negative control sample to ensure that the assay system is This will be explained in some detail in the embodiment. Example I Probe Preparation and Purification In sandwich assays using short oligonucleotides (containing components responsible for capturing the analyte from solution), sensitivity and specificity, and therefore reliability, are important. For this purpose, it is important that the probe has high purity and a uniform sequence. In order to obtain oligonucleotides of sufficient quality, a person skilled in the art has many synthetic methods and methods available. Although there are various purification methods, the present inventors recognized that the following method would be acceptable. Sunawa The oligonucleotides were synthesized using cyanoethyl phosphorase using an Applied Biosystem 380A automatic synthesizer. 0 synthesis by midate chemistry has a short bonding time of 9 minutes on a scale of 1 Mmol. It is done using a kuru. The unique yield for each conjugation cycle is 98% as determined by trityl detection using a colorimetric assay. This method synthesizes a 30 nucleotide DNA probe in 3 hours, followed by an additional 18 hours for removal of base protecting groups and purification of the tritylated oligonucleotide. The amount of oligonucleotide obtained at the end of the purification protocol is 400-600 μ2 oligonucleotide per synthesis. Because pure full-length probes are essential for reliable detection of the specific target nucleic acid analyte, we developed a protocol for oligonucleotide purification. special attention was paid to Purification of tritylated oligonucleotides was performed by C-18 reverse phase semi-preparative chromatography (10X 250+** column). However, attempts to isolate detritylated oligonucleotides prior to C-18 chromatography proved to be a less efficient means of purification due to the lower hydrophobicity of the oligonucleotides. 0.1M) dithyluane over 40 minutes Using a concentration gradient of 15-35% acetonitrile in monium acetate, The chilled full-length oligonucleotide was eluted. This oligonucleotide is Detritylation was performed with 80% acetic acid in water for 1 hour. After detritylation, G-50 sepadex chromatography was performed. isolated oligonucleotide <4.6×250 mm column as determined by HPLC on an RPC-5 column; Solvent A. 2-M Tris, pH 12, solvent 8.2+mM) Tris, 200 M perchlorate, pH 12, concentration gradient from 0% B to 50% B, 40 min), this last step For large amounts of oligonucleotides, there is also an additional purification step. For relatively long oligonucleotides (>50 nucleotides), use the full-length oligonucleotide. Isolation of the gonucleotides is performed by preparative polyacrylamide gel electrophoresis using 12-20% gels (following the protocol described in Maniatis et al., supra). The methods described above (for oligonucleotides of 50 nucleotides or less) were employed to prepare the oligonucleotides listed as DNA in Table I. Phosphorylation of Example Probes Oligonucleotide-type probes are phosphorylated at the 3'-carbon atom of a 3'-nucleoside (the "3' end") or at the 5'-carbon atom of a 5'-nucleoside (the "5' end") by standard methods. Phosphorylate. For phosphorylation at the 3' end, see Bannett and Khorana, J. Biol, Chem., 249.5213-5221. Oligonucleotides are routinely phosphorylated at their 5' ends using T4 polynucleotide kinase according to standard protocols (see Maniatis et al., supra). To prepare a 32p-labeled probe, a substrate containing a 32p-containing phosphate at the appropriate position 1 is used for phosphorylation. Example Probe Labeling and Detection Probe labeling for detection can be done with radioactive or non-radioactive labels. Wear. If radiolabeling is employed, 32p labeling as described in Example H is preferred, but labeling according to known methods using other isotopes, such as You can also hire animals. Scintillation counting is employed to detect the radiolabeled probe complexed with the analyte (formed in complex with the capture probe bound to the solid support). A number of non-radioactive labeling and concomitant detection protocols are known. Any of these labeling techniques that minimally interfere with base pairing between a labeled oligonucleotide type probe and an analyte segment having a sequence complementary to that of the probe can be employed in the present invention. For example, labeling with biotin via a diamine-based linker attached to biotin and attached to the phosphate at the 5' end of the oligonucleotide by a phosphoramidate linkage can be employed. Similar labeling using EDTA-chelated fluorescent Eu'' instead of biotin was also employed (Musso et al., International Patent Application Publication No. WO 87102708). Biotin bound to the nucleoside base (described in the book tI'). Labeling based on the information previously reported) can also be adopted. EXAMPLES Derivatization of Porous Silicate Glasses (A>"Long Chain Alkylamine" Derivative Type Controlled Pore Glasses were purchased from Perth Chemical Company (Rockfort, IL, USA). Product No. 24875. The porous silicate glass contains silicon atoms derivatized with groups of the formula (CHz) aN H2. (B) Controlled pore glass of carboxyl derivative type was manufactured by Perth Chemical Company (U.S. Purchased from Rock 7 Ord, Linois. Product No. 23735, this porous silicate glass contains silicon atoms derivatized with a group of the formula -(CH2>38H(C○)(CH2)2C○2H. (C) Control of thiol derivative types Porous glass was also purchased from Perth Chemical Company (Rockford, IL, USA), Product No. 23748. This porous silicate glass was derivatized with the following formula: contains silicon atoms. (D) The succinimide ester derivative type porous silicate glass is Prepared using boxyl derivative type glass. Carboxyl derivative type glass was washed with acetone three times and then with dry acetone (for four people). Dry by placing on a small sieve and washing three times with dry@). These beads are then filtered through a sintered glass funnel and dried in vacuo for 10 hours. Dry N,N"-dimethylformamide ("DMF")], dried beads 500+y in 5 z 1 dicyclohexylcarbodiimide 50019 and N-hyde Add Roxysuccinimide 3003+17. The mixture was stirred for 16 hours and dried. Wash with dry DMF <3 times, 20a+1 each) and methylene chloride (2 times, 20z1 each). to remove excess reagent and dicyclohexyl urea. The support obtained is then dried under vacuum for 3 hours. Example V Derivatization of a Macroporous Crosslinked Dextran-Based Support (A) Sephacryl S-500 was commercially available from Pharmacia, Inc. (Viscataway, New Chassis, USA). Purchased at 1.7-0475-OX. (B) Sephacryl S-500 was added to the bromide compound according to the method of Booneman et al. (supra). Unactivated. 100 g of wet material supplied by the manufacturer was washed using a large excess of distilled water and a sintered glass filter. overhead paddle stirrer The wet cake was transferred to a 10001N beaker equipped with a pH and pH [pole]. 500 R1 of water-cooled water was added and the mixture was stirred vigorously, while being kept below 10°C by occasional additions of wood chips. 40 g of solid cyanogen bromide was added and the pH was repeatedly monitored and maintained at 10.5-11.5 for approximately 20 minutes by addition of 5 M NaOH. The bead material was then diluted with 5 volumes of ice-cold water followed by 1 volume. ice-cold 10mM potassium phosphate Immediately washed with water (pH 8,0). As understood by those skilled in the art, CNBr activation requires a hydroxyl group on an adjacent carbon atom. (C) A carboxyl derivative type material was prepared as follows. To a suspension of freshly prepared 209 CN Br-activated Sephacryl S-500 in 200 zi of 10 mM potassium phosphate (pH 8), 16 g of 6-aminocaproic acid was added in 4 portions every 30 minutes to obtain Stir the mixture with a paddle stirrer for 20 minutes. Ta. (Alternatively, hexylene diamine can be used in place of 6-aminocaproic acid to obtain the amine derivative type support). The obtained derivative-type sephacryl was passed through a sintered glass wax, and 10+mM liquid was added. Potassium phosphate buffer (pH 8,0); IM potassium phosphate buffer (pH 8,0); IM-KCl, 0.1M-NaOH; finally washed thoroughly with water; then the wet gator was washed thoroughly with water; It was suspended in 1M-MES (pH 6,0) and stored at 4°C. (D) The succinimide derivative-type macroporous cross-linked dextran material is as follows: were prepared from carboxyl derivative type materials. The carboxyl derivative type Sephacryl 5-soo suspended in 0.1M-MES solution (pH 6) was transferred to a sintered glass funnel, sequentially poured with ice, 70:30. / 7 CE) 7 After washing, wash with acetone 3 times, then 4 angstroms. Washed three times with acetone dried over molecular sieves. - After drying Sephacryl under high vacuum (0,01) for 10 hours, the dried carboxylic acid The carboxyl derivative type material was used in Example IV (D) for making a carboxyl derivative type porous glass. The succinimide ester derivative type sephacryl was obtained by the same treatment as described above. (E) Thiol derivative type Sephacryl S-500 is prepared as follows. To a freshly prepared suspension of 152 CNBr-activated Sephacryl S-500 in 10+mM potassium phosphate (pH 8,0) was added 5 g of cystamine dihydrochloride and mixed. The mixture was stirred with a paddle stirrer for 20 hours. The obtained derivative sephacryl is filtered and washed in the same manner as in the case of V(C). Before use, the disulfide bonds of cystamine, the linker of the derivative-type material, were removed by incubating the material with 1100 ea dithiothreol (DTT) and 50 raM-HEPES (pH 7.7) at 25°C. The material was then thoroughly washed with degassed 0, 2M-HEPE S (pH 7,7), 0.1M-K (J), and finally 0.2M HEPE S (pH 7,7). cleaved by washing again at pH 7.7>.Example Derivatization of Divinylbenzene Crosslinked Polystyrene Support (A) 1% Crosslinked Divinylbenzene Nylbenzene-polystyrene chloromethyl resin (1,1mMe!/1?, 200-400 mesh) was manufactured by Niss Biochemical Company (Cree, Ohio, USA). purchased from the brand. 12% divinylbenzene cross-linked polystyrene beads (mesh size 200-400) were purchased from Polyscience (Warrington, PA). (B) 12% cross-linked divinylbenzene-polystyrene beads were carboxylated as follows. It was made into a sil derivative. 10 g of the above beads were added to 150 zl of 1,2-dichloroethane and the mixture was refluxed. 20 mmol of aluminum chloride and gluta in nitrobenzene 101R A filtered mixture of 10 mmol of acid monomethyl ester chloride was added over 5 minutes and the reaction mixture was refluxed for a further 4 hours. The resin was filtered through a sintered glass funnel and dioxane:4N-H (J (3:1), dioxane; water (3:1), dioxane Washed with chlorine, ethanol, acetone, and finally methanol, and then dried under vacuum in a desiccator. 100 y/y of ethylene glycol was added to 2 y KOH in a three-day flask and the mixture was heated to 100°C. After KOH was sufficiently dissolved, 5 g of dried derivative resin was added together with 3 yt (l) of hydrazine hydrate. The mixture was refluxed, and after refluxing for 3 hours, part of the liquid was distilled off until the reflux temperature reached 198°C. The flask was then tightly stoppered and reflux was continued for 12 hours. after derivatization with chloride). Purified. (C) 12% divinylbenzene cross-linked polystyrene beads were amine-derivatized by: I made it into a body. 5 g of carboxyl derivative-type beads were treated with 1fI of dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxyl in dimethylformamide (D M F >50 zl). 1.259 g of cis-succinimide was added. After stirring for 30 minutes, 1,8-dia 7fI of minooctane was added and the mixture was stirred for a further 3 hours.The resin was then filtered. After that, methanol, water, methanol, CH2Cl2, and finally acetate were added. Washed with water. (D) A chloromethyl derivative type polystyrene resin crosslinked with 1% divinylbenzene was made into an amino derivative in the following manner. 1% cross-linked chlorme in DMF80111 Chill derivative type resin (supplied by Niss Biochemical Company) 10. N-t-butyloxycarbonyl-6-aminocabrone M2.61? and fluoride 1.282 kg of aluminum was added and the mixture was stirred at 80°C for 16 hours. The resin was then filtered, washed sequentially with CH2Clx, methanol and acetone, and then subjected to high vacuum (0,01) for 3 hours. The amino group was deprotected using 30% trifluoroacetic acid in CH2 (J2) to obtain an amine derivative type support. Cric acid titration showed a substitution level of 0.17 mmol/9 (resin). and 5'-cystaminylphosphoramidate derivative (A) 5'-aminoalkyl phos Sphoramidate Derivatives Aminoalkyl derivatives were generally prepared on a 1-10 nanomolar scale at concentrations of 1-20 μM. The following protocol is based on Chu et al. (Nucl, Acids Res, >11.6513-6529 (1983)), the modified oligonucleotide was (Colette and Kawashima, Nucl, Aeids Res, H3, 1529-1541 (1985)). follow. That is, to prepare amino-hexyl adducts of oligonucleotides, Four nanomoles of the oligonucleotide (phosphorylated at the 5' end) were added to 0,24 M 1.6-di Amitohexane, 0.1M N-methylimidazole and 0.1M 1-ethyl 3-(3-dimethylaminobrovyl)carbodiimide ("CDI") (pH 6,0) and allowed to react for 20 hours. The resulting DNA was precipitated with ethanol three times to remove excess diamine, and then placed in 0.1M MOPS (pH 7.5). It has been recognized that it is essential to pre-treat test tubes with silanization solution whenever reacting oligonucleotides to prevent non-specific binding of the oligonucleotides to the sides of the test tube during the reaction. . By the same method but using 1,2-diaminoethane or 1,8-diaminooctane instead of 1,6-diamithexane, 2-aminoethyl or 8-aminoethyl, respectively, instead of the 6-aminohexyl adduct. Octyl adduct is obtained Ru. (B) Group the derivatives in the 5'-carboxyalkylphosphoramidate derivative table. For preparation with lysine or aminocaproic acid, the following method was adopted. Four nanomoles of the 5'-phosphorylated oligonucleotide were placed in 0.3xl of 0.1M imidazole, 0.1M CD I (pH 6,0) at 25°C in a silanized Eppendorf tube, and the phosphorimidazolide was added. Oligonucleotides generated over 90 minutes were then precipitated with ethanol and then precipitated with 0.1M glycine or was redissolved in a 0.3xR solution of 0.1M aminocaproic acid (pH 8,0) and heated to 50°C for 3 hours. The resulting adduct was then isolated by ethanol precipitation and finally placed in 0.05M-MOPS (pH 7.5). (C) 5'-cystaminylphosphoramidate derivative silanized eppendorf 0.3d of 0.1M imidazole and 0.15M-CD I (p) 46.00) was added to 1 nmole of 5'-phosphate oligonucleotide in a Dorf test tube and the resulting solution was incubated at 23°C for 1. Incubated for 5 hours. 5′ imidazolide The conductor was isolated by ethanol precipitation and then placed in 0.311 0.25 M cystamine (pH 7,7) where the reaction proceeded for 3 h at 50 °C. Cystaminylphosphoramidate derivatives were precipitated with ethanol three times to remove excess cystaminyl phosphoramidate derivatives. Stamine was removed and the DNA pellet was then incubated with 0.05M-MOPS (pH 7, 5>4m i7'): (D) 3' derivative phosphorylated at the 3' end instead of the 5' phosphorylated one. The same procedure as in Examples (A), (B) and (C) was carried out using oxidized oligonucleotides. Following the same method, the 3'-derivatized phosphoramide was substituted for the 5'-derivatized one. Obtain the adduct. Example Derivatization of Amino-Derivative Type Porous Silicate Glasses with Oligonucleotides The standard reaction used for the formation of the title derivatization is as follows. Controlled pore glass of long-chain alkylamine derivative type (Bath Chemical Co., Product No. 24875) (containing 20-30 micromoles of amino groups/g<glass) Mix with 0.11+6 0.1M -N-methylimidazole, 0.1M -CD I and 5xio-'~20 X10-'M.5'-phosphorylated oligonucleotide. The reaction is continued for 24 hours with stirring, and then at step 11 the beads are washed with Nao H (pH 12) for 1 minute to remove non-specifically bound DNA. Finally, the derivatized beads are stored in TE buffer (10 Cotton Tris, 1mM-EDTA, pH 8.0). 100μ beads before use! 50 TaM acetic acid- or propionic acid-N-hydride Roxysuccinimide ester, mixed with 0.2M-HEPES (pH 7,7), reacted for 15 minutes, then washed three times with 0.2M-HEPES (pH 7,7), and finally stored in TE buffer. By doing this, unreacted amino groups on the beads are blocked. This treatment is sufficient to substantially block free amine groups on the beads. The binding yield of oligonucleotides to amine-derivatized porous silicate glass beads was determined by adding 25 pmol of 32P-labeled 5'-phosphorylated oligonucleotide and 50 μmol of beads to 0.55 zl of 0.1 M methylimidazole, O,tM. -CD I (pH 6,00) under stirring for 24 h, followed by a 1 min wash with Nao H (pH 12>) to remove unbound oligonucleotides. Non-covalent) binding is determined by performing the reaction in the absence of CDI. established. Cerenkov counts from the beads were then measured using a Beckman LS 7800 liquid scintillation system (Beckman Instruments). "Coupling yield" is the fraction of 25 pmoles bound to the beads. The conjugation yield was found to be a function of the length of the oligonucleotide. Generally, a yield of 75 to 80% can be obtained for 17-mer in amine derivative-type porous glass beads. For the 25-ver, a yield of 40-45% was obtained. The degree of non-specific binding was 4-6%. Acid hydrolysis of phosphoramidate bonds removes the book from the support. The oligonucleotide was released qualitatively completely. This can be done using the method described in this section. This means that all oligonucleotides that are not nonspecifically bound are end-linked. and Example 5 Derivatization of cyanogen bromide-activated macroporous crosslinked dextran-based supports with oligonucleotides of the aminoalkylphosphoramidate derivative type. CNBr-activated Sephacryl 5-soo beads 5001? (wet) in 0.5 zl of 0.1 M NaHCO, 0.5 M Na (1! (pH 8,3)), and 0.025 zf of 5'-6-aminehexylphosphoramidate derivative oligonucleotide. Mix in 0.05 M.MOPS(+)H7,5) with cleotide (approximately 5xlO-'M). The reaction was allowed to wait for 20 hours. The test tubes were then centrifuged, the supernatant liquid removed, and then mixed with 0.1 M Tris (pHs, oo) for 1 hour to inactivate unreacted sites left from cyanogen bromide derivative formation. The beads were washed four times with NaOH (pH 12) and finally stored in TE buffer. In this case, the oxygen atom of the hydroxyl group of sephacryl and the oligonucleotide The linker connecting the 5'-oxygen atom of the 5'-nucleoside of leotide has the following structure. Has a structure. -C(=NH)NH(CH2)6NH(PO2)-6-aminoethylphosphor By carrying out the same treatment using an oligonucleotide that was made into a 2-aminoethylphosphoramidate derivative instead of a midate derivative, the oxygen atom of the dextran and the 5' oxygen atom of the 5'-nucleoside of the oligonucleotide were combined. A solid support is obtained in which the linker has the following structure. -C(=NH)NH(CH2)2NH(PO□) Example Derivatization of carboxyl derivative-type solid supports. The following 10 protocols were applied to the xistran-based support. Carboxyl derivative type support 50-75ay (in the case of Sephacryl, wet weight amount), 25 to 30 pmol of 5'-aminoalkylphosphoramidate - or is a 5'-cystaminylvosboramidate derivative type oligonucleotide, and 0. 75z1 in 0.15M-CDI, 0.1M MES (pH 6). and mix the mixture with a rotary mixer for 1 hour (for Sephacryl) or 16:00. (For glass and polystyrene) Stir for a while (for glass and polystyrene). (opposite of cefacryl) The higher response rate is a significant advantage of this material. ) After the reaction, the support is washed four times with Nao H (pH 12) and finally the material in the form of oligonucleotide derivatives is stored in a TEM buffer. Binding yields for these carboxyl-derivatized supports were determined by measuring the Cerenkov counts of the beads using 32p-labeled oligonucleotides as shown in the example above. It was determined by Nonspecific binding was assessed by measuring radioactivity on the support after carrying out the binding reaction in the absence of CDI. The end of the linker attached to the oligonucleotide. Bonding through the amino group of the base, rather than through the amino group, is phosphorylated. was evaluated by reacting oligonucleotides (but otherwise underivatized) with a support material. The degree of terminal binding was determined by hydrolyzing the phosphoramidate bonds in HCl (pH 2) for 4 hours at 37°C, followed by washing the support with NaOH (pH 1, 2). This removed any residue on the support. Radioactivity gives an estimate of terminal binding. For supports containing 5'-cis gminyl phosphoramidate derivative type oligonucleotides, the degree of terminal binding was determined by cleavage of disulfide bonds with DTT. That is, support 5019 made into an oligonucleotide derivative was incubated at 23° C. with 0.2zl(7)0.1M-DTT, 0.1M HEPES, and 1mM EDTA (pH 7.7) for 1 hour. The support was then incubated with Nao T4 (pH 12) to remove detached oligonucleotides. In general, cystaminyl derivatives The results of terminal binding measurements for oligonucleotides are based on aminoalkyl derivative oligonucleotides. The results were consistent with those for gonucleotides. The conditions used to remove cisguminyl-derived oligonucleotides are mild. When applying the solid support of the present invention to the isolation of nucleic acids, it is important to note that It is possible. A highly preferred solid support of the present invention is 5'-(6-aminohexyl phosphorus). carboxyl derivative type Sephacryl S-500, which is derivatized with a derivative type oligonucleotide (midate). Employing this example method, approximately 1.2 picomoles of oligonucleotide are derivatized per ag<wet weight) of carboxyl-derivatized sephacryl 5-soo. Approximately half of the oligonucleotides are end-linked (oligonucleotides). The 6-amine group of 6-aminohexylphosphoramidate attached to only about 0.5% is bound non-covalently to the support, and about half Covalently linked via the amine group of the base of the oligonucleotide (e.g. cytosine) (The carboxyl group of the support and the 6-aminohexylphosphoramide ). The carboxyl groups of the supporting materials act as their N-hydroxysuccinimide esters. When activated, the level of end-joining is higher and is binding is reduced. According to a common immobilization method, 101 g of N-hydroxysuccinimide-activated sephacryl support (dry) is The oligonucleotides of phosphoramidate- or 5'-cystaminylphosphoramidate-derivative type were suspended in 0.7 ml of 0.2 M HEPES (pH 7.7) containing 20-25 pmol of the oligonucleotide and the mixture was mixed in a rotary mixer. Stir for 1 hour The support is then washed four times with NaOH (pi-(t2.0)) and then stored in TE. (Upon hydration, a wet support of 50119 is obtained from the dry material.) When immobilized with N-hydroxysuccinimide, conjugation efficiencies of 50-55% and over 80% oligonucleotide end binding were obtained. However, the results tended to be variable for N-hydroxysuccinimide-activated supports. vinegar This seems to be due to the fact that the succinimide ester moiety is susceptible to hydrolysis. follow Rigorous removal of moisture during the preparation of the succinimide ester-activated support and storage under vacuum at 4°C under N2 are important for this support. This is useful for ensuring good results for Example] Detection of the HIV-1 Genome This example describes how to detect the HIV-1 genome, which is the causative agent of acquired immunodeficiency syndrome in humans, by using a solid support formed with the oligonucleotide derivative of the present invention as a nucleic acid-based analyte. This section describes the method used to detect the genome of a human. A solid support according to the invention (beads) was prepared using carboxyl derivatized Sephacryl S-500 and 5'-(6-aminohexyl)phosphoramidate derivatized oligonucleotide 85-241 (capture probe). The linker between the oxygen atom of dextran and the oxygen atom of 5'-thymidine of the oligonucleotide has the following structure: -C(=NH)NH(CHz)s(CO)(NH)( CH2)IN H (PO2)-oligonucleotide 85-233 was used as the second labeled probe. 32p-containing phosphate using T4 polynucleotide kinase to 5'-phosphorylated. It should be noted that the following method can be performed using oligonucleotide pairs other than 85-241 and 85-233 that have sequences complementary to sequences of overlapping or each segment of the HIV-1 genome. For example, the oligonucleotides listed in Table 1 Any pair of titans can be used. It can also be carried out using other solid supports used in bead preparation and using non-radioactive labels on the 210-band for detection. Total nucleic acids from the lymphocyte fraction of blood 10z& from the person to be tested for HIV-1 are isolated by any standard method. A sample of human DNA (equivalent to approximately 108 μg of genome) was incubated in the negative in parallel with the nucleic acid sample to be tested for the HIV-1 genome. As a sex control, Atsuse hybridization solution (H3; 5X 5SPE (0.75M NaCl, 50 μM NaHPO, pH 7.4, 5mM EDTA), 10% dextran sulfate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)) was used as a sex control. Incubate at 37°C before use. The 20x SSC is diluted to 2X SSC (0,3M NaC1,30-M sodium citrate, pH 7,0) and placed at 37°C for subsequent use. The stock solution of beads was resuspended in TEg buffer, and 250 μl of this suspension was resuspended in TEg buffer. Take out the beads 503+1? Obtain (wet weight) 0 Then add 250 μl of this to the Eppendorf tube. Place the beads in a test tube and centrifuge them (5 seconds) to form a pellet of 50 mg of beads. Each assay must be performed using 50 zg of beads. Prehybridization is then performed as described below. The buffer solution in which the beads were stored is removed after centrifugation for 5 to 10 seconds. Preheated H S (37℃) 250μ! to the beads and resuspend the beads. This prehybridization Place the solution mixture at 37°C for 15-60 seconds. Sandwich hybridization is then performed. Solution Hybridization Step: While prehybridizing the beads, a labeled oligonucleotide (section 210-b) is added to an aliquot of sample (or control) nucleic acid. This hybridization The volume of the solution should not exceed 50 μl and can be done in TE slow solution. The ratio of probe amount to target amount should be approximately 5:1 (mole to mole). Transfer 50μ of this labeled probe-target hybridization solution to 65°C and leave for 5 minutes. Transfer the labeled probe-target solution to 42°C. Then add H3 for final hybridization. 250μ of solution! Hybridize at 42℃ for 30-60 minutes. Allow the process to continue. Capture step: Immediately before using the beads for capture, remove the beads from the prehybridization temperature. Remove the beads and centrifuge them to the bottom of the test tube to remove the hybridization solution. Then place the beads at 37°C and transfer 250 μl of hybridization solution (target and labeled probe) to the beads. Resuspend the beads in hybridization solution and shake every 5 minutes. Hold at 37°C for 60 minutes. Washing: Prepare scintillation vials and pipettes in the dark while beads capture hybridization complexes. After 60 minutes of capture, the beads are centrifuged (5-10 seconds) and hybridized. Remove the solution. Add 1 ml of preheated 2X SSC (37°C) to the beads, shake the tube, and centrifuge for 5-10 seconds. Remove the wash solution and repeat the wash two more times. After removing the post-i& wash, beads are counted for each sample using a scintillation counter (eg, Beckman LS 7800). Dissolution of labeled probe from beads wL: To recover the isotope-labeled probe from the beads, dissolve the beads in 100-1000 μl of water! Resuspend in water and heat to 100°C for 5 minutes. This suspension is transferred to a disposable column (Quick-3ep) and the eluate is collected. This solution will contain 80% of the label associated with the beads. This label can be concentrated by lyophilization. The background color obtained from the solid support containing the human DNA negative control used The signal from the solid support containing the sample nucleic acid (analyte) is determined by subtracting the counts from the solid support containing the sample nucleic acid suspected of containing the analyte. (resulting from the label on the oligonucleotide hybridized to the analyte) is measured. As mentioned above, a small amount of dextran sulfate (concentration 5-20%, preferably about 10%) is added. It has been found that, at least when used in capture hybridization, the S/N ratio when the solid support of the present invention is used for the detection of nucleic acid-based analytes can be significantly increased. This applies to the beads used in this example to detect the HIV-1 genome of the analyte and shite. That applies. Further, as shown in this example, when dextran sulfate (concentration 5-20%, preferably about 10%) is used in the prehybridization solution, the solid support of the present invention can be used for the detection of nucleic acid-based analytes. It is also recognized that it is advantageous in increasing the S/N ratio when I was caught. In a less preferred variation of the above method of this example, a non-homologous (also referred to herein as "inert") nucleic acid, such as sonicated salmon sperm DNA, is added to the prehybridization solution. can be contained at a concentration of about 111g7ml. Although the invention has been described with reference to various examples, various modifications and extensions of the subject matter illustrated in detail will be apparent to those skilled in the art, and such modifications and extensions are also disclosed and requested herein. within the spirit and scope of the invention as set forth in the claims. Various aspects of the invention are also disclosed in the following claims. International search report PCT/U387101966 A=aChOer+e! +Oror:l? Cτ/ZSA101966 Par: V engineering.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．（ａ）被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ１５〜１ ００塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドである第１プローブを含む固形支持体であ って、固形支持体の一部である第１プローブの実質的部分がもっぱら支持体に末 端結合しているもの、および （ｂ）被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ一重鎖オリゴ ヌクレオチドでありかつ検出のために標識されている第２プローブであって、た だし第２プローブの配列は第１プローブの配列に対し非相補的であり、第２セグ メントが第１セグメントと重複しないものを用いて試料中の一重鎖核酸系按分所 体を検出する方法であって、（１）上記固形支持体をプレハイブリダイゼーショ ン条件下で、（ｉ）非相同核酸もしくは（ｉｉ）約５〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度 の硫酸デキストラン、または（ｉ）および（ｉｉ）の両者からなるプレハイブリ ダイゼーション液と共にインキュベートし；（２）工程（１）に従ってプレハイ ブリダイズされた固形支持体をハイブリダイゼーション条件下で、約５〜２０％ （ｗ／ｖ）の硫酸デキストラン；アッセイされる試料からの核酸（試料中に存在 する場合には被分析体を含む）；およびハイブリダイゼーション液中の被分析体 の量に対し過剰モルの第２プローブからなるハイブリダイゼーション液と共にイ ンキュベートし；（３）工程（２）の後に固形支持体を洗浄して、これから被分 析体に安定にハイブリダイズしていない第２プローブを除去し；そして （４）工程（３）の後に、被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の検出 可能な標識に起因する信号が固形支持体に付随するか否かを測定する ことよりなる方法。 ２．第１プローブがそれに結合している固形支持体が（Ａ）ケイ素原子において （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたケ イ素原子は実質的に無く、式中のＣは０〜５であり、ｎは２〜８であり、Ｒ１は メチルまたはベンジルであり、−Ｏ−（オリゴ）はオリゴヌクレオチド型プロー ブであり、（オリゴ）に結合した酸素原子はプローブの５′−ヌクレオシドの５ ′−酸素原子または３′−ヌクレオシドの３′−酸素原子である）；もしくは（ ２）次式の基 −Ｌ１−ＣＯ２Ｈおよび （ｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）， もしくは （ｉｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２ ）−Ｏ（オリゴ）（式中の−Ｌ１−は−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２ ）ｍ−であり、ここで基−（ＣＨ２）ｎはケイ素原子に結合しており；ｍ，ｎ， ｐおよびｒは同一かまたは異なりそれぞれ２〜８である）；もしくは（３）次式 の基 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼； により誘導体にされた多孔質ケイ酸塩ガラス；または（Ｂ）誘導体にされていな い水酸基をもつ隣接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある 水酸基の酸素原子において、 （１）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２） Ｏ−（オリゴ） （アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子は実質的にな い）、もしくは （２）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）、もしくは （３）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈおよび（ｉ）Ｌ２−Ｎ，Ｈ（ＰＯ２） Ｏ−（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ２−ＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２）Ｏ− （オリゴ）（式中のｃ，ｑ，ｐおよびｒは同一かまたは異なり、ｑは２〜１０で あり、Ｌ２は −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここ で−Ｃ（＝ＮＨ）基はデキストランの水酸基の酸素原子に結合している）；もし くは （４）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＨおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ Ｓ（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）により誘導体にされた架橋デキスト ラン系マクロ孔質材料；ならびに （Ｃ）ジビニルベンゼンなどの架橋剤により架橋されていてもよく、かつフェニ ル基において （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈおよび （ｉ）Ｌ２−ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ３−ＳＳ（Ｃ Ｈ２）ｎＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（式中のＬ３は−（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ） （ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここで（ＣＨ２）ｓ基はポリスチレンのフェニ ル基に結合しており、ｓ，ｐおよびｎは同一かまたは異なり、ｓは２〜１０であ る）；もしくは（２）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ １および −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたフェニル基は無い）；もしく は （３）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＨ，および−（ＣＨ２）ｓ（Ｃ Ｏ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）によ り誘導体にされたポリスチレン から選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．第１プローブは５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形支持体に 結合し、第１プローブがそれに結合している固形支持体は （Ａ）直径約１００〜２００ミクロンおよび細孔直径約４００〜６００オングス トロームのビーズ状であり、ケイ素原子において次式の基 −（ＣＨ２）ａ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−（ＣＨ２）ａ（Ｎ Ｈ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた ケイ素原子は実質的に無く、式中のａは３または６であり、ｂは０．１または２ である）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキスト ランをＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することにより調製され、 湿潤直径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１０ ６〜約１０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ隣 接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子 において次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−Ｃ（ ＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリ ゴ）または−（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により 誘電体にされ、アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子 は実質的に無いマクロ孔質材料から選ばれる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．第１プローブは５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形支持体に 結合し、第１プローブがそれに結合している固形支持体は （Ａ）直径約１００〜約２００ミクロンおよび細孔直径約４００〜６００オング ストロームのビーズ状であり、ケイ素原子において次式の基 −（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈおよび−（ＣＨ２）３ＮＨ（ ＣＯ）（ＣＨ２）２（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキストランを Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することにより調製され、湿潤直 径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１０６〜約 １０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ隣接炭素 原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子におい て次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２） ５（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により誘導体に されたマクロ孔質材料；ならびに（Ｃ）約６０〜５００メッシュの粒度であり、 ポリスチレンのフェニル基において次式の基 −（ＣＨ２）４ＣＯ２Ｈおよび −（ＣＨ２）４（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた０〜約１６％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ から選ばれる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ５．第１プローブおよび第２プローブが２５〜５０塩基を有し、第２プローブが 放射性標識されている、請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。 ６．第２プローブ上の放射性標識が５′−ヌクレオシドの５′−炭素原子に結合 したホスフェート基の３２Ｐである、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．プレハイプリダイゼーション液およびハイブリダイゼーション液が双方とも 約８〜約１２％（ｗ／ｖ）硫酸デキストランを含む、請求の範囲第６項に記載の 方法。 ８．請求の範囲第１項に記載の工程（２）の前に、アッセイされる試料からの核 酸をハイブリダイゼーション条件下に、ハイブリダイゼーション液中の被分析体 の温度に対し過剰モルの第２プローブからなる第１ハイブリダイゼーション液中 で、存在する被分析体の実質的部分が第２プローブにハイブリダイズするまでイ ンキュベートし、次いで第１ハイブリダイゼーション液を請求の範囲第１項に記 載の工程（１）に従ってプレハイブリダイズされ、第２ハイブリダイゼーション 液に浸漬された固形支持体と混和することにより請求の範囲第１項に記載の工程 （２）を開始することよりなる、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．被分析体が第１プローブおよび第２プローブに対し相補的な配列をもつセグ メントを含むＨＩＶ−１ウィルスのゲノムまたはその断片である、請求の範囲第 ５項ないし第８項のいずれかに記載の方法。 １０．それに結合した１５〜１００塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドプローブを 含み、 （Ａ）ケイ素原子において （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたケ イ素原子は実質的に無く、式中のＣは０〜５であり、ｎは２〜８であり、Ｒ１は メチルまたはベンジルであり、−〇−（オリゴ）はオリゴヌクレオチド型プロー ブであり、（オリゴ）に結合した酸素原子はプローブの５′−ヌクレオシドの５ ′−酸素原子または３′−ヌクレオシドの３′−酸素原子である）；もしくは（ ２）次式の基 −Ｌ１−ＣＯ２Ｈおよび （ｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）， もしくは （ｉｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２ ）Ｏ−（オリゴ）（式中の−Ｌｌ−は−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２ ）ｍ−であり、ここで基−（ＣＨ２）ｎはケイ素原子に結合しており；ｍ，ｎ， ｐおよびｒは同一かまたは異なりそれぞれ２〜８である）；もしくは（３）次式 の基 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼； により誘導体にされた多孔質ケイ酸塩ガラス；または（Ｂ）誘導体にされていな い水酸基をもつ隣接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある 水酸基の酸素原子において、 （１）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２） Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原 子は実質的に無い）、もしくは （２）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）、もしくは （３）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈおよび（ｉ）Ｌ２−ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ −（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ２−ＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（ オリゴ）（式中のｃ，ｑ，ｐおよびｒは同一かまたは異なり、ｑは２〜１０であ り、Ｌ２は −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここ で−Ｃ（＝ＮＨ）基はデキストランの水酸基の酸素原子に信合している）；もし くは （４）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＨおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ Ｓ（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）により誘導体にされた架橋デキスト ラン系マクロ孔質材料；ならびに （Ｃ）ジビニルベンゼンなどの架橋剤により架橋されていてもよく、かつフェニ ル基において、 （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈおよび （ｉ）Ｌ３−ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ３−ＳＳ（Ｃ Ｈ２）ｎＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（式中のＬ３は−（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ） （ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここで（ＣＨ２）ｓ基はポリスチレンのフェニ ル基に結合しており、ｓ，ｐおよびｎは同一かまたは異なり、ｓは２〜１０であ る）；もしくは（２）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ １および −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたフェニル基は無い）；もしく は （３）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＨ，および−（ＣＨ２）ｓ（Ｃ Ｏ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）んＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により 誘導体にされたポリスチレン から選ばれる、固形支持体。 １１．オリゴヌクレオチドが５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形 支持体に結合し、支持体が（Ａ）直径約１００〜２００ミクロンおよび細孔直径 約４００〜６００オングストロームのビーズ状であり、ケイ素原子において次式 の基 −（ＣＨ２）ａ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−（ＣＨ２）ａ（Ｎ Ｈ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた ケイ素原子は実質的に無く、式中のａは３または６であり、ｂは０，１または２ である）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキスト ランをＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド▽で架橋することにより調製され 、湿潤直径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１ ０６〜約１０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ 隣接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原 子において次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−Ｃ（ ＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子は実質的に 無い）または次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により誘導体に されたマクロ孔質材料 から選ばれる、請求の範囲第１０項に記載の固形支持体。 １２．オリゴヌクレオチドが５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形 支持体に結合し、固形支持体はが（Ａ）直径約１００〜２００ミクロンおよび細 孔直径約４００〜６００オングストロームのビーズ状であり、ケイ素原子におい て次式の基 −（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈおよび−（ＣＨ２）３ＮＨ（ ＣＯ）（ＣＨ２）２（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキストランを Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することにより調製され、湿潤直 径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１０６〜約 １０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ隣接炭素 原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子におい て次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２） ５（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ） により誘導体にされたマクロ孔質材料；ならびに（Ｃ）約６０〜５００メッシュ の粒度であり、ポリスチレンのフェニル基において次式の基 −（ＣＨ２）４ＣＯ２Ｈおよび −（ＣＨ２）４（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた０〜約１６％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ から選ばれる、請求の範囲第１０項に記載の固形支持体。 １３．オリゴヌクレオチドが２５〜５０塩基を有する、請求の範囲第１１項また は第１２項に記載の固形支持体。 １４．オリゴヌクレオチドがＨＩＶ−１のゲノムのセグメントの配列に対し相補 的な配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡである、請求の範囲第１３項に記載の固形 支持体。 １５．（Ａ）請求の範囲第１２項ないし第１６項のいずれかに記載の固形支持体 であって、（オリゴ）が被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列を 有するもの、および（Ｂ）被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な前列 を有する一重鎖オリゴヌクレオチドでありかつ検出のために標識されている第２ プローブからなり、ただし第２プローブの配列は第１プローブの配列に対し非相 補的であり、かつ第２セグメントは第１セグメントと重複しないものである、核 酸プローブサンドイッチアッセイ法において一重鎖核酸系被分析体を検出するた めのキット。 １６．【配列があります】および 上記のものに対し相補的な配列よりなる群から選ばれる配列を有し、ただしＲＮ Ａの場合には上記配列中のＴはウリジンを表わす、ＲＮＡまたはＤＮＡ。 [Claims] 1. (a) a solid support comprising a first probe that is a single-stranded oligonucleotide of 15 to 100 bases with a sequence complementary to the sequence of the first segment of the analyte; Therefore, a substantial portion of the first probe that is part of the solid support is exclusively terminated in the support. (b) a second probe that is a single-stranded oligonucleotide having a sequence complementary to the sequence of the second segment of the analyte and is labeled for detection; Ta However, the sequence of the second probe is non-complementary to the sequence of the first probe, and the second segment A method for detecting a single-stranded nucleic acid system in a sample using a material whose segment does not overlap with the first segment, the method comprising: (1) prehybridizing the solid support; (i) a heterologous nucleic acid or (ii) dextran sulfate at a concentration of about 5-20% (w/v), or a prehybridization consisting of both (i) and (ii). (2) Pre-hybrid according to step (1). The hybridized solid support is subjected to hybridization conditions such as approximately 5-20% (w/v) dextran sulfate; nucleic acids from the sample to be assayed (including the analyte, if present in the sample); and a hybridization solution consisting of a second probe in molar excess relative to the amount of analyte in the hybridization solution. (3) Wash the solid support after step (2) and incubate; and (4) after step (3), the signal due to the detectable label on the second probe hybridized to the analyte is removed from the solid. A method consisting of measuring whether or not it adheres to a support. 2. The solid support to which the first probe is attached has (A) a silicon atom (1) a group of the formula -(CH2)n(NH)(CO)(CH2)cR1 and -(CH2)n(NH) (PO2)O-(oligo) (a compound derivatized with an amino-terminated group) There are substantially no ion atoms, C in the formula is 0 to 5, n is 2 to 8, R1 is methyl or benzyl, and -O- (oligo) is an oligonucleotide type probe. or (2) a group of the following formula -L1 -CO2H and (i) -L1-(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(oligo), or (ii) -L1-(CO)(NH)(CH2)pSS(CH2)rNH( PO2)-O(oligo)(-L1- in the formula is -(CH2)n(NH)(CO)(CH2)m-, where the group -(CH2)n is bonded to the silicon atom. ; m, n, p, and r are the same or different and each is 2 to 8); or (3) a group of the following formula ▲ There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼ and ▲ There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼ ; (B) porous silicate glass derivatized; or (B) non-derivatized; At the oxygen atom of the hydroxyl group on the carbon atom of the sugar moiety that has at least one adjacent carbon atom with a large hydroxyl group, (1) a group of the following formula -C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO) (CH2)cR1 and -C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)pNH(PO2) O-(oligo) (oxygen of hydroxyl group derivatized by amino group-terminated group) Atoms are essentially ), or (2) a group of the following formula -C(=NH)NH(CH2)p(NH)(PO2)O-(oligo), or (3) a group of the following formula -C(=NH)NH( CH2)qCO2H and (i) L2-N,H(PO2)O-(oligo), or (ii) L2-SS(CH2)rNH(PO2)O-(oligo) (c, q, p and r are the same or different, q is 2 to 10, and L2 is -C(=NH)NH(CH2)q(CO)(NH)(CH2)p-, where -C(=NH) group is bonded to the oxygen atom of the hydroxyl group of dextran); if (4) A bridge derivatized by the following groups -C(=NH)NH(CH2)nSH and -C(=NH)NH(CH2)nS(CH2)pNH(PO2)O(oligo) Dexto and (C) may be crosslinked with a crosslinking agent such as divinylbenzene, and (1) The group of the following formula -(CH2)sCO2H and (i) L2-NH(PO2)O-(oligo), or (ii) L3-SS(C H2)nNH(PO2)O-(oligo) ) (L3 in the formula is -(CH2)s(CO) (NH)(CH2)p-, where the (CH2)s group is the phenyl group of polystyrene. s, p and n are the same or different, and s is 2 to 10. or (2) groups of the following formula -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)p(NH)(CO)(CH2)cR 1 and -(CH2)s(CO)(NH)( CH2)p(NH)(PO2)O-(oligo) (no phenyl groups are derivatized with amino-terminated groups); or (3) Groups of the following formula -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)pSH, and -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)pSS(CH2)nNH(PO2)O- (oligo) 2. A method according to claim 1, wherein the polystyrene is derivatized. 3. The first probe is attached to the solid support via the 5'-oxygen atom of the 5'-nucleoside, and the solid support to which the first probe is attached is (A) about 100-200 microns in diameter and pore diameter Approximately 400 to 600 ounces Trohm's bead-like structure, in which the silicon atom contains the following groups -(CH2)a(NH)(CO)(CH2)bCH3 and -(CH2)a(NH)(PO2)O-(oligo)(amino group a controlled pore glass derivatized with a group terminated with (substantially no silicon atoms, where a is 3 or 6 and b is 0.1 or 2); and (B) Allyl dext prepared by cross-linking the oran with N,N'-methylenebisacrylamide, beaded, underivatized hydroxyl groups of about 30 to about 120 microns wet diameter and excluded volume for dextran of about 106 to about 108 daltons. next door with In the oxygen atom of the hydroxyl group on the carbon atom of the sugar moiety that has at least one carbon atom in contact with the group of the following formula -C(=NH)NH(CH2)6NH(CO)(CH2)bCH3 and -C(=NH) NH(CH2)6NH(CO)(CH2)pNH(PO2)O-(oli The macropores are made into a dielectric material by -(=NH)NH(CH2)6NH(PO2)O-(oligo), and the oxygen atoms of the hydroxyl groups derivatized by the amino group-terminated group are substantially absent. 3. The method according to claim 2, wherein the material is selected from quality materials. 4. The first probe is attached to the solid support via the 5'-oxygen atom of the 5'-nucleoside, and the solid support to which the first probe is attached has (A) a diameter of about 100 to about 200 microns and pores. Approximately 400 to 600 ounces in diameter They are Strohm's bead-shaped, and the silicon atoms contain the following groups -(CH2)3NH(CO)(CH2)2CO2H and -(CH2)3NH( CO)(CH2)2(CO)(NH)(CH2)6NH( PO2) controlled pore glass derivatized with O-(oligo); and (B) prepared by cross-linking allyl dextran with N,N'-methylenebisacrylamide and directly wettable. Beads of diameter from about 30 to about 120 microns and excluded volume for dextran from about 10 to about 108 daltons, containing hydroxyl groups on carbon atoms of the sugar moiety having at least one adjacent carbon atom with an underivatized hydroxyl group. oxygen atom smell is derivatized with the following groups -C(=NH)NH(CH2)5CO2H and -C(=NH)NH(CH2)5(CO)(NH)(CH2)6NH(PO2)O-(oligo). and (C) a particle size of about 60 to 500 mesh, containing groups of the following formulas -(CH2)4CO2H and -(CH2)4(CO)(NH)(CH2)6 in the phenyl groups of the polystyrene; 3. The method of claim 2, wherein the method is selected from 0 to about 16% divinylbenzene crosslinked polystyrene beads derivatized with (NH)(PO2)O-(oligo). 5. 5. The method according to claim 3 or 4, wherein the first probe and the second probe have 25 to 50 bases, and the second probe is radioactively labeled. 6. 6. The method of claim 5, wherein the radioactive label on the second probe is 32P, a phosphate group attached to the 5'-carbon atom of the 5'-nucleoside. 7. 7. The method of claim 6, wherein the prehybridization solution and the hybridization solution both contain about 8 to about 12% (w/v) dextran sulfate. 8. Before step (2) according to claim 1, nuclei from the sample to be assayed Under acid hybridization conditions, in a first hybridization solution consisting of a second probe in molar excess relative to the temperature of the analyte in the hybridization solution, a substantial portion of the analyte present is transferred to the second probe. until hybridization. and then the first hybridization solution as described in claim 1. initiating step (2) as claimed in claim 1 by admixing with a solid support prehybridized according to step (1) as described above and immersed in a second hybridization liquid. The method described in item 7. 9. A segment in which the analyte has a complementary sequence to the first probe and the second probe. 9. The method according to any one of claims 5 to 8, wherein the genome of the HIV-1 virus or a fragment thereof contains the genome of the HIV-1 virus or a fragment thereof. 10. a single-stranded oligonucleotide probe of 15 to 100 bases attached thereto, (A) at the silicon atom (1) groups of the formula -(CH2)n(NH)(CO)(CH2)cR1 and -(CH2)n (NH)(PO2)O-(oligo) (a compound derivatized with an amino-terminated group) There is substantially no ion atom, C in the formula is 0 to 5, n is 2 to 8, R1 is methyl or benzyl, and -〇- (oligo) is an oligonucleotide type probe. or (2) a group of the following formula -L1 -CO2H and (i) -L1-(CO)(NH)(CH2)pNH(PO2)O-(oligo), or (ii) -L1-(CO)(NH)(CH2)pSS(CH2)rNH( PO2)O-(oligo)(-Ll- in the formula is -(CH2)n(NH)(CO)(CH2)m-, where the group -(CH2)n is bonded to the silicon atom. ; m, n, p, and r are the same or different and each is 2 to 8); or (3) a group of the following formula ▲ There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼ and ▲ There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼ ; (B) porous silicate glass derivatized; or (B) non-derivatized; At the oxygen atom of the hydroxyl group on the carbon atom of the sugar moiety that has at least one adjacent carbon atom with a large hydroxyl group, (1) a group of the following formula -C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO) (CH2)cR1 and -C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)pNH(PO2) O-(oligo) (oxygen of hydroxyl group derivatized by amino-terminated group) original (substantially no children), or (2) a group of the following formula -C(=NH)NH(CH2)p(NH)(PO2)O-(oligo), or (3) a group of the following formula -C( =NH)NH(CH2)qCO2H and (i) L2-NH(PO2)O-(oligo), or (ii) L2-SS(CH2)rNH(PO2)O-(oligo) (c, q in the formula , p and r are the same or different, and q is 2 to 10. Therefore, L2 is -C(=NH)NH(CH2)q(CO)(NH)(CH2)p-, where the -C(=NH) group is linked to the oxygen atom of the hydroxyl group of dextran. ); if (4) A bridge derivatized by the following groups -C(=NH)NH(CH2)nSH and -C(=NH)NH(CH2)nS(CH2)pNH(PO2)O(oligo) Dexto and (C) may be crosslinked with a crosslinking agent such as divinylbenzene, and (1) a group of the following formula -(CH2)sCO2H and (i) L3-NH(PO2)O-(oligo), or (ii) L3-SS(CH2)nNH(PO2)O-( oligo) (L3 in the formula is -(CH2)s(CO) (NH)(CH2)p-, where the (CH2)s group is the phenyl group of polystyrene. s, p and n are the same or different, and s is 2 to 10. or (2) groups of the following formula -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)p(NH)(CO)(CH2)cR 1 and -(CH2)s(CO)(NH)( CH2)p(NH)(PO2)O-(oligo) (no phenyl groups are derivatized with amino-terminated groups); or (3) Groups of the following formula -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)pSH, and -(CH2)s(CO)(NH)(CH2)pSS(CH2)nH(PO2)O - A solid support selected from polystyrene derivatized with (oligo). 11. the oligonucleotide is attached to a solid support via the 5'-oxygen atom of the 5'-nucleoside, the support being (A) bead-shaped with a diameter of about 100-200 microns and a pore diameter of about 400-600 Angstroms; At the silicon atom, groups of the following formula -(CH2)a(NH)(CO)(CH2)bCH3 and -(CH2)a(NH)(PO2)O-(oligo) (derivatized by a group having an amino group at the end) a controlled pore glass derivatized with substantially no silicon atoms, wherein a is 3 or 6 and b is 0, 1 or 2; and (B) an allyl dextrin. prepared by cross-linking lans with N,N'-methylenebisacrylamide▽ and are beaded, underivatized, with a wet diameter of about 30 to about 120 microns and an excluded volume for dextran of about 106 to about 108 Daltons. Oxygen source of the hydroxyl group on the carbon atom of the sugar moiety that has at least one adjacent carbon atom In the group -C(=NH)NH(CH2)6NH(CO)(CH2)bCH3 and -C(=NH)NH(CH2)6NH(CO)(CH2)pNH(PO2)O(oligo) (There is virtually no oxygen atom in the hydroxyl group derivatized by a group with an amino group at the end) or by the group -C(=NH)NH(CH2)6NH(PO2)O-(oligo) of the following formula. 11. A solid support according to claim 10, wherein the solid support is selected from macroporous materials. 12. The oligonucleotide is attached to the solid support via the 5'-oxygen atom of the 5'-nucleoside, and the solid support is (A) bead-shaped with a diameter of about 100-200 microns and a pore diameter of about 400-600 angstroms. Yes, silicon atom odor derivatives by the groups -(CH2)3NH(CO)(CH2)2CO2H and -(CH2)3NH(CO)(CH2)2(CO)(NH)(CH2)6NH(PO2)O-(oligo) and (B) a controlled pore glass prepared by crosslinking allyl dextran with N,N'-methylenebisacrylamide and Beads of diameter from about 30 to about 120 microns and excluded volume for dextran from about 10 to about 108 daltons, containing hydroxyl groups on carbon atoms of the sugar moiety having at least one adjacent carbon atom with an underivatized hydroxyl group. oxygen atom smell is derivatized by the groups -C(=NH)NH(CH2)5CO2H and -C(=NH)NH(CH2)5(CO)(NH)(CH2)6NH(PO2)O-(oligo). and (C) a particle size of about 60 to 500 mesh, containing groups of the formula -(CH2)4CO2H and -(CH2)4(CO)(NH)(CH2)6 in the phenyl groups of polystyrene. 11. The solid support of claim 10, selected from 0 to about 16% divinylbenzene crosslinked polystyrene beads derivatized with (NH)(PO2)O-(oligo). 13. Claim 11 or wherein the oligonucleotide has 25 to 50 bases. is the solid support according to item 12. 14. 14. The solid support according to claim 13, wherein the oligonucleotide is DNA or RNA having a sequence complementary to the sequence of a segment of the HIV-1 genome. 15. (A) A solid support according to any one of claims 12 to 16, in which the (oligo) has a complementary sequence to the sequence of the first segment of the analyte, and (B) consists of a second probe that is a single-stranded oligonucleotide having a front sequence complementary to the sequence of the second segment of the analyte and is labeled for detection, with the proviso that the sequence of the second probe is similar to that of the first segment; out of phase with the probe array a nucleus that is complementary and the second segment does not overlap with the first segment; For detecting single-stranded nucleic acid-based analytes in acid probe sandwich assays. Me kit. 16. RNA or DNA having a sequence selected from the group consisting of [sequence] and a sequence complementary to the above, provided that in the case of RNA, T in the above sequence represents uridine.
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Families Citing this family (173)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5367066A (en) * 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) * 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US7811751B2 (en) 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5047523A (en) * 1988-08-02 1991-09-10 Ortho Diagnostic Systems Inc. Nucleic acid probe for detection of neisseria gonorrhoea
ATE168724T1 (en) * 1988-09-29 1998-08-15 Chiron Corp DETECTION OF A POLYNUCLEOTIDE BY REPLACING A CHAIN ON A CAPTURE PROBE
US5324829A (en) * 1988-12-16 1994-06-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. High specific activity nucleic acid probes having target recognition and signal generating moieties
GR1000347B (en) * 1988-12-21 1992-06-25 Ortho Diagnostic Systems Inc Method of preparing nucleotide probes using a bridging complement
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5514550A (en) * 1989-02-03 1996-05-07 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Nucleic acid test article and its use to detect a predetermined nucleic acid
EP1715064B1 (en) 1989-06-02 2009-02-25 Institut Pasteur Nucleotide sequences derived from the genomes of the retroviruses HIV-1, HIV-2 and SIV, and their application to the amplification of pol sequences in these viral genomes and to the in vitro diagnosis of infections resulting from these viruses
FR2647810B1 (en) * 1989-06-02 1994-07-22 Pasteur Institut OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR THE AMPLIFICATION OF THE GENOME OF HIV-2 AND SIV RETROVIRUSES, AND THEIR APPLICATIONS TO THE IN VITRO DIAGNOSIS OF INFECTIONS DUE TO THESE VIRUSES
US7022814B1 (en) 1992-01-21 2006-04-04 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Nucleotide sequences derived from the genome of retroviruses of the HIV-1, HIV-2 and SIV type, and their uses in particular for the amplification of the genomes of these retroviruses and for the in vitro diagnosis of the diseases due to these viruses
FR2647809B1 (en) * 1989-06-02 1991-09-20 Pasteur Institut OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR THE AMPLIFICATION OF THE GENOME OF HIV-1, HIV-2 AND SIV RETROVIRUSES AND THEIR APPLICATIONS TO IN VITRO DIAGNOSIS OF INFECTIONS DUE TO THESE VIRUSES
US6955915B2 (en) 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6919211B1 (en) 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
WO1991000868A1 (en) * 1989-07-07 1991-01-24 National Research Development Corporation Immobilised polynucleotides
US5856088A (en) * 1989-07-11 1999-01-05 Gen-Probe Incorporated Detection of human immunodeficiency virus type 1
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5215882A (en) * 1989-11-30 1993-06-01 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Method of immobilizing nucleic acid on a solid surface for use in nucleic acid hybridization assays
US5474911A (en) * 1989-12-01 1995-12-12 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Promotion of high specificity molecular assembly
CA2031659A1 (en) * 1990-01-26 1991-07-27 John B. Findlay Water-insoluble reagent, nucleic acid probe, test kit and diagnostic and purification methods
US5695926A (en) * 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
FR2663040B1 (en) * 1990-06-11 1995-09-15 Bio Merieux METHOD OF DETECTING A NUCLEOTIDE SEQUENCE ACCORDING TO THE SANDWICH HYBRIDIZATION TECHNIQUE.
IL99025A0 (en) * 1990-08-15 1992-07-15 Astra Ab Novel process for the detection of pathogens using dna probes
US5474895A (en) * 1990-11-14 1995-12-12 Siska Diagnostics Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
CA2055755A1 (en) * 1990-11-22 1992-05-23 Toshihiko Kishimoto Method of immobilizing single-stranded dna on carrier at terminal
CA2065719A1 (en) 1991-04-30 1992-10-31 John B. Findlay Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle
US5976789A (en) * 1991-07-17 1999-11-02 Bio Merieux System of probes enabling HLA-DR typing to be performed, and typing method using said probes
FR2679255B1 (en) * 1991-07-17 1993-10-22 Bio Merieux METHOD OF IMMOBILIZING A NUCLEIC FRAGMENT BY PASSIVE FIXING ON A SOLID SUPPORT, SOLID SUPPORT THUS OBTAINED AND ITS USE.
WO1993004199A2 (en) * 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
US6849462B1 (en) 1991-11-22 2005-02-01 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
WO1993013223A1 (en) 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Corporation Hiv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US6300058B1 (en) 1992-01-29 2001-10-09 Hitachi Chemical Research Center, Inc. Method for measuring messenger RNA
CA2128891A1 (en) * 1992-01-29 1993-08-05 Cylia Keller Polynucleotide immobilized support
WO1994000600A1 (en) * 1992-06-25 1994-01-06 Microprobe Corporation Solid supports for nucleic acid hybridization assays
US5580971A (en) * 1992-07-28 1996-12-03 Hitachi Chemical Company, Ltd. Fungal detection system based on rRNA probes
WO1994002636A1 (en) * 1992-07-28 1994-02-03 Hitachi Chemical Company Ltd. Gene detection system
KR100325554B1 (en) 1993-03-26 2002-11-02 젠-프로브 인코포레이티드 Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1
US7625697B2 (en) 1994-06-17 2009-12-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
GB9415129D0 (en) * 1994-07-27 1994-09-14 Lynxvale Ltd Oligonucleotides and their use
US6416714B1 (en) * 1995-04-25 2002-07-09 Discovery Partners International, Inc. Remotely programmable matrices with memories
US6017496A (en) 1995-06-07 2000-01-25 Irori Matrices with memories and uses thereof
US6284459B1 (en) 1995-04-25 2001-09-04 Discovery Partners International Solid support matrices with memories and combinatorial libraries therefrom
US6100026A (en) * 1995-04-25 2000-08-08 Irori Matrices with memories and uses thereof
US5961923A (en) * 1995-04-25 1999-10-05 Irori Matrices with memories and uses thereof
US5616465A (en) 1995-08-09 1997-04-01 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using competitive hybridization probes
US6027879A (en) * 1995-08-09 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe
US5811253A (en) * 1995-09-01 1998-09-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Use of vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme for chemiluminescent systems: test kits and analytical methods
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
GB9624165D0 (en) * 1996-11-19 1997-01-08 Amdex A S Use of nucleic acids bound to carrier macromolecules
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US5837860A (en) * 1997-03-05 1998-11-17 Molecular Tool, Inc. Covalent attachment of nucleic acid molecules onto solid-phases via disulfide bonds
ES2271994T3 (en) 1997-05-02 2007-04-16 Gen-Probe Incorporated TWO-STEP HYBRIDIZATION AND CAPTURE OF A POLINUCLEOTIDE.
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
US5994076A (en) * 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
IT1297096B1 (en) * 1997-12-03 1999-08-03 Sorin Diagnostics S R L METHOD FOR THE DETECTION OF SINGLE HELIX DNA ANALYTES
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
ES2322859T3 (en) 1998-05-01 2009-06-30 Gen-Probe Incorporated AUTOMATED DIAGNOSTIC ANALYZER.
JP2002518060A (en) * 1998-06-24 2002-06-25 グラクソ グループ リミテッド Nucleotide detection method
US6902891B2 (en) 1999-12-17 2005-06-07 Bio Merieux Process for labeling a nucleic acid
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
FR2803913B1 (en) 2000-01-13 2002-08-16 Pasteur Sanofi Diagnostics METHOD OF IMMOBILIZING AFFIN (A) REAGENT (S) ON A HYDROPHOBIC SOLID PHASE
AU2001274560A1 (en) * 2000-08-08 2002-02-18 Toyo Kohan Co. Ltd. Substrate activation kit and method of detecting dna or the like by using the same
DE60045932D1 (en) 2000-09-01 2011-06-16 Gen Probe Inc HIV-1 sequence amplification for recognition of sequences related to drug resistance mutations
ATE386821T1 (en) 2000-10-23 2008-03-15 Gen Probe Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS 2 (HIV-2)
KR20050008720A (en) 2002-05-17 2005-01-21 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 Automated system for isolating, amplifying and detecting a target nucleic acid sequence
AU2003253651C1 (en) 2002-06-14 2010-06-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hepatitis B virus
CA2957200C (en) 2002-10-16 2020-05-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
US7833714B1 (en) 2003-04-11 2010-11-16 Affymetrix, Inc. Combinatorial affinity selection
CA2547750C (en) 2003-12-19 2014-04-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting the nucleic acids of hiv-1 and hiv-2
AU2005262317B2 (en) 2004-07-13 2009-07-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of hepatitis A virus nucleic acid
ES2759991T3 (en) 2004-09-30 2020-05-12 Gen Probe Inc Assay to detect and quantify HIV-1
CA2582661C (en) 2004-11-09 2015-08-11 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group a streptococci
US20060177859A1 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group B streptococci
CA2597319C (en) 2005-02-18 2014-09-30 Gen-Probe Incorporated Sample preparation method incorporating an alkaline shock
EP2471805A3 (en) 2005-05-06 2013-01-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to specifically detect nucleic acid of influenza virus A or B
CA2625414A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect legionella pneumophila nucleic acid
JP5071987B2 (en) 2005-11-14 2012-11-14 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド Parametric calibration method
US7588897B2 (en) 2006-05-12 2009-09-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Enterococci nucleic acid
CA2673017C (en) 2006-12-21 2015-08-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
CA2715991A1 (en) 2007-12-26 2009-07-09 Gen-Probe Incorporated Amplification oligomers and methods to detect candida albicans 26s rrna or encoding dna
KR20090081260A (en) * 2008-01-23 2009-07-28 삼성전자주식회사 Micro array hybridization detection method
EP3957754B1 (en) 2008-04-21 2026-01-28 Gen-Probe Incorporated Method for detecting chikungunya virus
EP3118208A1 (en) 2009-02-26 2017-01-18 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus nuleic acid
EP2446057B1 (en) 2009-06-23 2014-11-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
AU2010266234B2 (en) 2009-07-01 2013-07-25 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
WO2011103274A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
WO2011133811A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acid
EP3305920B1 (en) 2010-07-12 2020-02-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h3 influenza a virus nucleic acid
EP2752247A3 (en) 2010-07-23 2016-08-31 Beckman Coulter, Inc. System or method of including analytical units
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
EP2625297B1 (en) 2010-10-04 2018-10-10 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
AU2012249751B2 (en) 2011-04-25 2016-11-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
WO2013012708A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and method for detecting human parvovirus nucleic acid and for detecting hepatitis a virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays
AU2012304327B2 (en) 2011-09-08 2015-07-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
KR20140092378A (en) 2011-11-07 2014-07-23 베크만 컬터, 인코포레이티드 System and method for processing samples
JP6190380B2 (en) 2011-11-07 2017-08-30 ベックマン コールター， インコーポレイテッド Equalizer system and workflow
BR112014011044A2 (en) 2011-11-07 2017-04-25 Beckman Coulter Inc magnetic damping for specimen transport system
US9046506B2 (en) 2011-11-07 2015-06-02 Beckman Coulter, Inc. Specimen container detection
JP6320926B2 (en) 2011-11-07 2018-05-09 ベックマン コールター， インコーポレイテッド Centrifuge system and workflow
JP6165755B2 (en) 2011-11-07 2017-07-19 ベックマン コールター， インコーポレイテッド Robot arm
DE102011120550B4 (en) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits for the detection of adenovirus nucleic acids
US11098375B2 (en) 2012-02-24 2021-08-24 Gen-Probe Prodesse, Inc. Detection of Shiga toxin genes in bacteria
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
US9932628B2 (en) 2012-07-27 2018-04-03 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
EP2890814B1 (en) 2012-08-30 2019-11-13 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
CA2899645C (en) 2013-03-15 2022-08-30 Gen-Probe Incorporated Calibration method, apparatus and computer program product
AU2014241191A1 (en) 2013-03-27 2015-10-22 Sample Technologies, Inc. Recombinant phage and bacterial detection methods
AU2014281406A1 (en) 2013-06-19 2016-01-21 Sample6 Technologies, Inc. Phage-based bacterial detection assay
AU2014306512C1 (en) 2013-08-14 2021-07-08 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
AU2016205179B2 (en) 2015-01-09 2021-06-17 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
AU2016233298B2 (en) 2015-03-16 2021-09-02 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
CN108779499B (en) 2016-01-04 2023-08-11 简·探针公司 Methods and compositions for detecting candida species
EP3469103B1 (en) 2016-06-10 2021-10-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting zika virus nucleic acid
CA3040907A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
EP4671386A3 (en) 2016-11-21 2026-04-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
EP4219771A3 (en) 2017-03-24 2023-08-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for multiplex detection of viral pathogens in samples
EP4282985A3 (en) 2017-03-24 2024-02-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
EP4276201A3 (en) 2017-06-07 2024-01-17 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
CN111032209A (en) 2017-07-10 2020-04-17 简·探针公司 Analysis system and method
CA3072452A1 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting staphylococcus aureus
AU2018369872B2 (en) 2017-11-17 2022-11-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting C1orf43 nucleic acid
EP3724354A1 (en) 2017-12-15 2020-10-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting toxigenic clostridium difficile
EP3746225B1 (en) 2018-01-29 2024-10-30 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods
CN111684077B (en) 2018-02-06 2024-10-11 简·探针公司 Far-red dye probe formulation
CA3103442A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group b streptococcus nucleic acid
JP7470095B2 (en) 2018-07-10 2024-04-17 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids - Patents.com
US12227812B2 (en) 2018-08-01 2025-02-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of Epstein-Barr virus
AU2019319203B8 (en) 2018-08-08 2025-10-09 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting Mycoplasma genitalium
CA3107043A1 (en) 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
KR102937202B1 (en) 2018-08-24 2026-03-11 젠-프로브 인코포레이티드 Compositions and methods for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
CA3112651A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
AU2019365821C1 (en) 2018-10-22 2025-08-14 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus BK virus
TW202030333A (en) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 Compositions and methods for detecting plasmodium species nucleic acid
US20220080425A1 (en) 2018-12-31 2022-03-17 Gen-Probe Incorporated Tray for transfering solid reagents to a multi-well cartridge
US12210028B2 (en) 2019-05-03 2025-01-28 Gen-Probe Incorporated Receptacle delivery system
AU2020299621B2 (en) 2019-07-03 2025-10-30 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of Trichomonas vaginalis in a sample.
AU2020335996A1 (en) 2019-08-23 2022-03-31 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting Treponema pallidum
WO2021046270A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
EP4361284B1 (en) 2019-12-09 2025-09-10 Gen-Probe Incorporated Quantification of polynucleotide analytes from dried samples
AU2021230341C8 (en) 2020-03-04 2026-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting SARS-CoV-2 nucleic acid
CN115698325A (en) 2020-05-07 2023-02-03 盖立复诊断解决方案公司 Methods and compositions for detecting SARS-CoV-2 nucleic acid
CA3177256A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 Gen-Probe Incorporated Fluid container management system
CA3226812A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
EP4282980A1 (en) 2022-05-23 2023-11-29 Mobidiag Oy Methods for amplifying a nucleic acid
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024161179A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Mobidiag Oy Compositions and methods for detecting stx nucleic acids
EP4455303A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
EP4455304A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
EP4454758A1 (en) 2023-04-28 2024-10-30 Mobidiag Oy Nucleic acid amplification process controls
AU2024267362A1 (en) 2023-05-05 2025-11-13 Gen-Probe Incorporated Method and system for improving specificity of analyte detection using real-time nucleic acid amplification
CN117960247B (en) * 2024-01-31 2025-11-14 郑州大学 A rapid detection method for latent malachite green based on nanozyme oxidation and a method for preparing the nanozyme.

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2277A (en) * 1841-09-30 Island
CA1083508A (en) * 1975-11-13 1980-08-12 Jacques Grange Supports having lateral chains, process for obtaining such supports, process for the fixation of organic compounds comprising a glucidic residue on said supports, products and reactives from said chimical fixation
US4302204A (en) * 1979-07-02 1981-11-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Transfer and detection of nucleic acids
SE8003732L (en) * 1980-05-19 1981-11-20 Pharmacia Diagnostics Ab SET FOR DETERMINATION METHODS INVOLVING BIOSPECIFIC AFFINITY REACTIONS
US4358535A (en) * 1980-12-08 1982-11-09 Board Of Regents Of The University Of Washington Specific DNA probes in diagnostic microbiology
CA1180647A (en) * 1981-07-17 1985-01-08 Cavit Akin Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method
FI63596C (en) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy MICROBIA DIAGNOSIS FOERFARANDE SOM GRUNDAR SIG PAO SKIKTSHYBRIDISERING AV NUCLEINSYROR OCH VID FOERFARANDET ANVAENDA KOMBINATIONER AV REAGENSER
CA1222680A (en) * 1983-07-05 1987-06-09 Nanibhushan Dattagupta Testing dna samples for particular nucleotide sequences

Also Published As

Publication number Publication date
WO1988001302A1 (en) 1988-02-25
DE3785658T2 (en) 1993-08-12
DE3785658D1 (en) 1993-06-03
ATE88762T1 (en) 1993-05-15
CA1308372C (en) 1992-10-06
JP2641880B2 (en) 1997-08-20
EP0276302B1 (en) 1993-04-28
EP0276302A1 (en) 1988-08-03
EP0276302A4 (en) 1989-08-16

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