JPH01500461A - 核酸プローブアッセイ法および組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 核酸プローブアッセイ法および組成物 技術分野 本発明は核酸プローブアッセイ法およびそれに用いる組成物に関する。 より詳細には本発明は分析される試料中の標的核酸系被分析体を、固形支持体に 結合した第１１０−ブにハイブリダイゼーションすることにより溶液から捕獲す る方法に関する。これらの方法にサンドイッチアッセイ法が含まれる。その場合 、標的は第２プローブにより検出され、これは検出のため標識されており、第１ プローブにハイブリダイズしたセグメント以外の標的被分析体セグメントにハイ ブリダイズする。 本発明が目的とするアッセイ法においては、固形支持体に結合したプローブは約 １５〜約１００塩基のオリゴヌクレオチドである。 発明の背景 試料を特定の核酸系被分析体の存在につき試験するための核酸プローブアッセイ 法、ならびにこの種のアッセイ法を動物および植物の病気を診断し、血液、食品 その他とウィルス性または微生物性汚染につき試験し、遺伝子を分離、特性判定 および工学的処理し、ならびに他の目的に利用することは周知である。 たとえばマインコスおよびワール、アナリ６バイオケミ、（Ａｎａｌ。 Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ　、　）１３８　、２６７−２８４　（１９８４）　；マニ アチスら、分子クローニング法：実験用便覧、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−１二ニーヨーク（１ ９８２）；オーウェンズおよびディーナー、米国特許第４．４８０，０４０号明 細書；ならびにファルコーおよびモーズリ−１米国特許第４，３５８，５３５号 明細書を参照されたい。 核酸プローブアッセイ法には前記の“サンドイッチアッセイ法”がある。サンド イッチアッセイ法においては捕獲工程を標識付は工程の前に行うか、または捕獲 および標識付けを同時に行いうることが認められている。たとえばラングゾール およびマルコーム、ジーン３６．２０１−２１０（１９８５）　、ランキら、ジ ーン２１．７７−８５（１９８３）　；ダンおよびハッセル、セル１２．２３− ３６（１９７７）　；ランキおよびソーダーランド１米国特許第４，４８６，５ ３９号および第４．５６３，４１９号明細書を参照されない。 サンドイッチアッセイ法は分析される試料の核酸が固形支持体に直接に固定化さ れる必要がないという利点を持つ０代わりに捕獲プローブ（ｃａｐｔｕｒｅ　ｐ ｒｏｂｅ）が固形支持体に固定化され、これはアッセイを実際に行う当事者より もむしろ供給業者によって行うことができる。サンドイッチアッセイ法は被分析 体への２回のハイブリダイゼーションを伴うため、被分析体への標識プローブの １回のハイブリダイゼーションを伴う非サンドイッチアッセイ法よりも高い特異 性をも約束する。 約１００ヌクレオチド以下の短いオリゴヌクレオチドを核酸プローブアッセイ法 におけるプローブとして使用することも一定の利点を与える。プローブと被分析 体間のハイブリダイゼーションに必要な時間は、プローブが短いほど短縮される 。現在の化学合成および精製技術によれば、配列決定された約１００ヌクレオチ ドまでの一重鎖オリゴヌクレオチドを高純度で、アッセイにおけるルーチン用と して十分な量で十分な速度において製造することができる。これらの製法は、経 費がかかり、生物学的プロセス（たとえばクローニング）を採用しなければなら ない長鎖プローブの製法よりも簡単であり、核酸プローブアッセイ法における感 度および特異性という目的に関してより高い質をもつプローブを与える。 固相結合した”捕獲プローブが約２００塩基よりも短鎖のものであるサンドイッ チアッセイ法についての研究は報告されていない。 固形支持体への一重鎖核酸の固着、アフィニティークロマトグラフィー（核酸と 相補的配列体とのハイブリダイゼーションにより分離が行われる）、および核酸 プローブアッセイ法（サンドイッチアッセイ法を含む）について各種の方法が報 告されている。たとえばラングゾールおよびマルコーム（前掲）；ブーネマンお よびウェス１〜ホフ、メソ、エンザイモ、　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ−）１００ ．４００−４０７（１９８３）　；ブーネマン、ヌクレ、アシッズ、リサ、（Ｎ ｕｃｌ。 、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１０．７１８１−７１９６（１９８２）；ブーネマン ら、ヌクレ、アシッズ、リサ、１０，７ｔ６３−７１８０（１９８２）：クレリ シら、ヌクレ、アシッズ、リサ６，２４７−２５８（１９７９）を参照されたい 、しかし、アミン誘導体およびカルボキシル誘導体にした固形支持体への核酸の 付着、特に核酸プローブ調製物の少なくとも約３０％が末端デオキシリボーズま たはりポーズ部分の水酸基の酸素原子のみによって共有結合している付着につい ては報告されていない。 本発明はサンドイッチアッセイ法、および約１００塩基以下の短鎖オリゴヌクレ オチドをアッセイにおけるプローブとして用いることの双方の利点を実現するこ とを目的とする。 発明の要約 １５〜１００塩基のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション溶液からの核 酸系被分析体の捕獲のために用いる核酸プローブサンドイッチアッセイ法に使用 するのに特に好適な固形支持体が見出された０本発明の固形支持体は、高い割合 の（一般に少なくとも約３０％）結合オリゴヌクレオチド型“捕獲プローブが、 支持体におよびオリゴヌクレオチドの５′末端ヌクレオシドの５′−酸素原子ま たは３′末端ヌクレオシドの３′−酸素原子に共有結合したリンカ−のみを介し て支持体に共有結合しており、このためたとえば非共有性会合または反応性塩基 部分を介しての共有結合など、被分析体捕獲に関する利用率が著しく低下するか または失われさえする様式で支持体に会合した場合と異なり、十分に被分析体の 捕獲に利用されることを特色とする。 本発明の固形支持体は下記のものである。（１）アミノ末端基付きリンカ−によ り誘導体にされたマクロ孔質架橋デキトラン、多孔質ゲイ酸塩ガラス、ポリスチ レン、またはラテックス（リンカ一部分の末端アミン基がホスホルアミデー）　 （ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）基を介してオリゴヌクレオチド型捕獲プロ ーブの末端ヌクレオシドに共有結合しており、ホスホルアミデート基を介してオ リゴヌクレオチド型捕獲プローブの末端ヌクレオシドに共有結合していないアミ ７基は実質的にすべて、オリゴヌクレオチドとの非特異的相互作用がアシル基で ブロックされている）；（２）マクロ孔質架橋デキストランを臭化シアンで活性 化したのち、オリボヌクレオチド型捕獲１０−ブの末端ヌクレオシドへ誘導体形 成されたアミノアルキルホスホルアミデート基のアミノ基と反応させて、架橋デ キストランをプローブで共有結合により誘導体にしたちの；（３）カルボキシル 末端基付き、または活性エステル末端基付きリンカ−で誘導体にされたマクロ孔 質架橋デキストラン、多孔質ケイ酸塩ガラス、ポリスチレンまたはラテックス（ カルボキシル基の部分は結合用ジアミノアルキルまたはジアミノアルキルジスル フィド（たとえばシスタミニル）部分の１個のアミン基に対しアミド結合で結合 しており、その他方のアミノ基はホスホルアミデートに関与しており、このホス ホルアミデートはオリゴヌクレオチド型捕獲プローブの末端ヌクレオシドに直接 に結合している）；ならびに（４）スルフしドリル末端基付きリンカ−により誘 導体にされた架橋デキストラン、多孔質ケイ酸塩ガラス、ラテックスまたはポリ スチレン（スルフヒドリル基の部分は、一端に活性ジスルフィド基（たとえば２ −ピリジルまたは４−ピリジルにより活性化）をもちがつ他端にアミノ基をもつ リンカ−に由来するイオウ原子に対しジスルフィド結合で結合しており、上記ア ミン基はホスホルアミデート基の一部をなし、ホスホルアミデート基はプローブ の末端ヌクレオシドに直接に結合しており、上記ジスルフィド結合はデキストラ ン、ケイ酸塩、ラテックスまたはポリスチレンに対し誘導体形成したスルフヒド リル基とプローブに結合したリンカ−の活性ジスルフィドとのジスルフィド交換 によって生じる）。 本発明による固形支持体を製造するための好ましい支持材は下記のものである。 長鎖アルキルアミン誘導体にされた、およびカルボキシル誘導体にされた制御細 孔ガラス：パース・ケミカル社（米国イリノイ州ロックフォード）によりそれぞ れ製品番号２４８７５および２３７３５において、公称細孔直径５００オングス トロームおよび粒径約１２５〜１７７ミクロンのビーズ状で販売されている；な らびにマクロ孔質架橋デキストラン材料であるセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙ ｌ）Ｓ−５００：ファルマシア社（米国ニューシャーシー州ビスカッタウェイ） により、コードＮｏ、１７−０４７５−０１において、湿潤直径約４０〜約１０ ５ミクロンおよび分子量約２Ｘ１．０’ダルトン以上のデキストランに関する排 除体積（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｖｏ　ｌ　ｕｍｅ）をもつビーズ状で販売されてお り、このセファクリルが後記のように臭化シアンにより、またはアミノ末端基付 き、カルボキシル末端基付き、または活性エステル末端基付きリンカ−により誘 導体にされるべく改質される。 好ましい支持材と好ましい捕獲プローブ（それらの５′末端に結合した適切な結 合用部分をもつべく改質されたプローブである）との反応については後述する。 本発明の新規な、かつ有利なサンドイッチアッセイ法は、種々の方法で行われる サンドイッチアッセイ法における支持体の性能に関連して本発明による固形支持 体がもつ種々の予期されなかった特性が見出されたことに基づく。 先行技術によれば標的核酸系被分析体が結合している固形支持体くたとえばニト ロセルロースフィルター）と非相同（ここでは時に“不活性”と呼ぶ）核酸（た とえば切断されたサケ精子もしくはニシン精子ＤＮＡ、または煮沸したｔＲＮＡ など、検出のための標識付けがなされておらず、標的核酸系被分析体に対し配列 上の相同性をほとんどもたないもの）（これは支持体上の標的核酸に溶液中のプ ローブ核酸をハイブリダイズさせる目的でハイブリダイゼーション条件下に固形 支持体と共にインキュベートされる溶液中に含まれる）とのプレハイブリダイゼ ーションはプローブの非特異的結合を減少させ、これによりバックグラウンド信 号を減少させることが示唆される。たとえばマニアチスら（前掲）を参照された い。先行技術には、オリゴヌクレオチドにより誘導体にされた固形支持体と非相 同核酸とのプレハイブリダイゼーションが相同配列をもつ核酸のハイブリダイゼ ーションに際してオリゴヌクレオチドによる捕獲効率を高めることは示唆されて いない。本発明者らはきわめて意外なことに、本発明による固形支持体と非相同 核酸とのプレハイブリダイゼーションによって、標的を含有する溶液とのハイブ リダイゼーションに際して標的被分析体の捕獲効率がほぼ倍加することを見出し た。 さらに先行技術によれば、短鎖（１００ヌクレオチド以下）オリゴヌクレオチド が存在するハイブリダイゼーション溶液中に硫酸デキストランを含有させても、 オリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドの配列に対し相補的な配列をもつ 核酸との間でハイブリダイゼーションが行われる効率には影響がないことが示唆 される。窓外にもこれと逆に、本発明者らは被分析体が長鎖くすなわち約５００ 塩基以上）である場合、本発明の固形支持体に結合したオリゴヌクレオチドの捕 獲効率はハイブリダイゼーション溶液中に約５〜２０％（、／Ｖ）、奸才しくけ 約９〜１１％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストランを用いることによって著しく改良さ れることを見出した。また本発明者らはプレハイブリダイゼーション溶液中にお けるこの濃度の硫酸デキストランが、非相同ＤＮＡを除いても捕獲効率と高める ことを見出した。しかし著しく短鎖の被分析体（約３０塩基）については硫酸デ キストランは捕獲効率にほとんど効果を与えないことが認められた。さらに本発 明者らは、硫酸デキストランが長鎖被分析体に対する捕獲効率に与える効果は先 行技術において仮定されるような体積排除効果（ｖｏｌｕｍｅ−ｅｘｃｌｕｓｉ ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ）ではないことを見出した。 ポリエチレングリコールが捕獲効率に与える効果は、はるかに小さいからである ０本発明の固形支持体による捕獲効率に対し硫酸デキストランが与えることが見 出された有利な効果についての根拠は明らかではないが、これは電荷に関係があ ると思われる。　また本発明者らは意外にも、被分析体の捕獲、および標識プロ ーブと被分析体とのハイブリダイゼーションが同時に起こるサンドイッチアッセ イ法により得られた結果（すなわち捕獲プローブによってビーズに結合した被分 析体にハイブリダイズした標識プローブからの信号の強度；バックグラウンドに ついて補正されたもの）は、まず被努析体がかなりの程度、溶液中の標識プロー ブとハイブリダイズし、次いで被分析体（全部または一部が標識プローブと複合 体を形成している）の捕獲が行われるサンドイッチアッセイ法の場合と本質的に 等しいことを見出した。捕獲工程が標識プローブとのハイブリダイゼーション工 程の前に行われた場合に得られる結果は、他の２方法の場合より明らかに劣る。 これは、ビーズ結合した被分析体は溶液中の標識プローブにより結合されにくい ためと思われる。 ｉ＆後に、下記の表１に挙げた多数のオリゴヌクレオチドがラトナーら、ネイチ ャー、３１３．２７７−２８４（１９８５）によりめられた配列から、ＨＩＶ− １（エイズの原因物質）についての核酸プローブハイブリダイゼーションアッセ イ法（本発明によるアッセイ法を含む）においてプローブとして用いるのに適切 であることが確認された。特にこれらのオリゴヌクレオチドは、サザーンハイプ リダイゼーションにおいて本発明によるアッセイに採用されるものに匹敵するス トリンジエンシー条件下でＨＩＶ−１ゲノム（プロウィルスＤＮＡとして感染細 胞のゲノム中へ組込まれるＲＮＡ）またはその断片にはハイブリダイズするが、 ヒト、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）またはｐＢＲ３２２ＤＮＡにはハイブリダイズ しないことが認められた。 表　Ｉ オリゴ８５−２３３：５’　−ｃ＾＾＾＾＾ＣＴＡＴＴＣＴＴ＾八八ＣＣＴＡＣ Ｃ＾＾ＧＣＣＴへへ３’オリゴ８５−２４１：５’　−ＴＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴ Ａに＾八へＣ（：Ｃ＾＾＾＾ＣＣＡＧＣＣ−３’オリゴ８６−３０：　５’　− ＴＡＧにＴＴＴＣＣＣＴＣ：＾＾＾Ｃ八ＴＡへＡＴＡＴＧＣ：Ｔｌ；Ｔ−３’オ リゴ８６−３２：　５’　−ＴＧ（：ＴＣＴにＣＴＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＣＴＡ ＣＴＴＧＴにＴにＣ−３’オリゴ８６−３４：　５’　−ＣＡＣＣＴＡにＧＧＣ Ｔ＾＾ＣＴＡＴ（：ＴにＴＣＣＴ＾＾Ｔ＾＾Ｇに−３’オリゴ８６−３６：　５ ’　−ＴＴＴＣ（：Ｔ＾＾ＣＡＣＴＡＣＣ：Ｃ＾＾＾にＧＴ（１；にＣＴＴＴＡ ＴＣ−３’オリゴ８６−３８：　５’　−ＴＧにＴＣＴＴＣＴＧＧＧにＣＴＴに ＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＣ−３’オリゴ８６−４０：　５’−＾ＣＧＧ＾＾ ＾＾ＴＧＴＣＴ＾＾ＣＡにＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴ＾＾Ｃ−３′オリゴ８６−４２ ７５’−＾＾＾ＴにＧＡＴ＾＾＾ＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴ（：ＣＡＧ＾＾ＴＴＣ −３’オリゴ８６−４４：　５’　−ＴＣＧＡＧＴ＾＾ＣＧＣＣＴＡＴＴＣＴに ＣＴＡＴＧＴＣ（：ＡＣＡＣ−３”オリゴ８６−２７０：５’　−ＣＴＧＴＧＴ ＾＾ＴＧＡＣＴｔｌ；ＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＴＴＧＴ−３’オリゴ８６−２ ７２：５’　−ＴＣＴ＾＾ＴＴＡＣＴＡＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡにＡＣ Ｔ−３’、ｔ　！、ｌ　コ８７−８４：　５”　−ＡＡＴＡＴにＴＴＧＴＴＡＴ ＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡにＣＡＴ−３”オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ のいずれであってもよいが、試験にはＤＮＡを用いた。もちろんＲＮＡであるオ リゴヌクレオチドについては、上記配列のＴはウリジンを表わす。 検出すべき被分析体が感染リンパ球由来のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ、また はＨＩＶ−ＩＲＮＡから逆転写されたＤＮＡである場合には、表■に挙げたオリ ゴ体の配列に相補的な配列をもつオリゴ体もプローブとして適切であろう。 発明の詳細な記述 本発明はその一観点においては、それに結合した１５〜１００塩基の一重鎖オリ ゴヌクレオチドブローブを含み、（Ａ）ケイ素原子において （１）次式の基 （ＣＨ２）ｎ（Ｎ　Ｈ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および−（ＣＨｚ）ｎ（Ｎ　 Ｈ）（Ｐ　Ｏ２）　Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にさ れたケイ素原子は実質的に無く、式中のＣは０〜５であり、ｎは２〜８であり、 Ｒ８はメチルまたはベンジルであり、−〇−（オリゴ）はオリゴヌクレオチド型 プローブであり、（オリゴ）に結合した酸素原子はプローブの５′−ヌクレオシ ドの５′−酸素原子または３′−ヌクレオシドの３′−酸素原子である）；もし くは（２）次式の基 −Ｌ、−ＣＯ２Ｈおよび （ｉ）　Ｌ、＋　（Ｃｏ）（ＮＨ）（ＣＨｚ）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）。 もしくは く式中の−Ｌ＋−は−（ＣＨ２）ｎ（Ｎ　ＨＤＣＯ）（ＣＨ２）ＩＩ−であり、 ここで基−（ＣＨｚ）ｎはケイ素原子に結合しており；ｍ、ｎ、ｐおよびｒは同 一かまたは異なりそれぞれ２〜８である）；もしくは（３）次式の基 ＮＨ（Ｃｏ）ＣＨっ −（ＣＨ２）ｎ（Ｎ　Ｈ）（ＣＯ）（ＣＨ）（ＣＨ２）　Ｓ　Ｓ　（ＣＨｚ）ｐ Ｎ　Ｈ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）および ＮＨ（Ｃｏ）ＣＨ３ ■ （ＣＨｚ）ｎ（Ｎ　Ｈ）（Ｃｏ）（ＣＨ）（ＣＨ２）ＳＨ；により誘導体にされ た多孔質ケイ酸塩ガラス；または（Ｂ）誘導体にされていない水酸基をもつ隣接 炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子に おいて、 （１）次式の基 Ｃ（＝　Ｎ　Ｈ）　Ｎ　Ｈ（ＣＨ２）　ｑ　（Ｎ　Ｈ）　（ＣＯ）　（ＣＨｔ　 ）　ｃ　Ｒ＋（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子 は実質的に無い）、もしくは （２）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）り（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）、もしくは （３）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨｚ）ｑｃｏ、Ｈおよび（ｉ）　Ｒ２ＮＨ（Ｐｏｔ）Ｏ （オリゴ）２もしくは（ｉｉ）　Ｒ２−ＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（Ｐｏ２）Ｏ＜、 ｔリボ）（式中のＣ２Ｑ＋ｐおよびｒは同一かまたは異なり、ｑは２〜１ｏであ り、Ｒ２は −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）Ｑ（Ｃｏ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここ で−〇（＝ＮＨ）基はデキストランの水酸基の酸素原子に結合している〉；もし くは （４）次式の基 Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨｚ）ｎＳＨおよびにより誘導体にされた架橋デキストラ ン系マクロ孔質材料；ならびに （Ｃ）ジビニルベンゼンなどの架橋剤により架橋されていてもよく、かつフェニ ル基において、 （１）次式の基 （ＣＨ２）ＳＣＯ２Ｈおよび （＋　）　Ｒ３ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）、もしくは（ｉｉ）　Ｒ３５Ｓ（Ｃ Ｈｚ）ｎＮＨ（Ｐｏｔ）Ｏ（オリゴ）（式中）Ｌ　ｓは−（ＣＨｚ）ｓ（ＣＯ） （Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）Ｉｊ　Ｃア’）、ココで（ＣＨ２）ｓ基はポリスチレンの フェニル基に結合しており、ｓ。 ｐおよびｎは同一がまたは異なり、Ｓは２〜１ｏである）；もしくは（２）次式 の基 （ＣＨ２）Ｓ（ＣＯ）（Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）ｐ（Ｎ　Ｈ）（ＣＯ）　（ＣＨ２） ｃ　Ｒ。 および −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）ｌ）（Ｎ　Ｈ）（Ｐ　Ｏ２）Ｏ− （オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたフェニル基は無い） ；もしくは （３）次式の基 −（ＣＨｚ）ｓ（Ｃｏ）（ＮＨ）（ＣＨｚ）ｐＳＨ，およびにより誘導体にされ たボリスチ】／ンから選ばれる、固形支持体である。 他の観点においては本発明は （＆）被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ１５〜１００ 塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドである第１１０−ブ（“捕獲プローブ）を含む 固形支持体であって、固形支持体の一部である第１１０−ブの実質的部分がもっ ばら支持体に末端結合しているもの（すなわち支持体に共有結合により、かつ５ ′末端ヌクレオシドの５′−酸素原子または３′末端ヌクレオシドの３′−酸素 原子に結合したリンカ−のみを介して結合しているもの）、および （ｂ）　被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ一重鎖オリ ゴヌクレオチドでありかつ検出のために標コされている第２プローブであって、 ただし第２プローブの配列は第１プローブの配列に対し非相補的であり、第２セ グメントが第１セグメントと重複しないものを用いて試料中の一重鎖核酸系被分 析体を検出する方法であって、（１）上記固形支持体をプレハイブリダイゼーシ ョン条件下で、（ｉ）非相同核酸もしくは＜ｉｉ）約５〜２０％（、／Ｖ）の濃 度の硫酸デキストラン、または（ｉ）および（ｉｉ）の両者からなるプレハイブ リダイゼーション液と共にインキュベートし；（２〉　工程（１）に従ってプレ ハイブリダイズされた固形支持体をハイブリダイゼーション条件下で、約５〜２ ０％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストラン；アッセイされる試料からの核酸（試料中に 存在する場合には被分析体を含む）；およびハイブリダイゼーション液中の被分 析体の量に対し過剰モルの第２１０−ブからなるハイブリダイゼーション液と共 にインキュベートし；（３）工程（２）の後に固形支持体を洗浄して、これから 被分析体に安定にハイブリダイズしていない第２プローブを除去し；そして （４）工程（３）の後に、被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の検出 可能な標識に起因する信号が固形支持体に付随するか否かを測定する ことよりなる方法である。 上記の節に記載した本発明方法における工程く２）の前で、第２プローブを所望 により溶液中でハイブリダイゼーション条件下に被分析試料からの核酸と共にイ ンキュベートしてもよく、これにより試料中に標的被分析体が存在する場合には 標的被分析体の少なくとも一部分はすでにハイブリダイゼーション液中の第２プ ローブにハイブリダイズし、これと固形支持体が工程（２）に従って該工程（２ ）の開始時に結合することを理解すべきである。すなわち標識第２プローブと被 分析体の溶液ハイブリダイゼーションは固形支持体の捕獲１０−ブによる標的の 捕獲の前に行うこともできる。 本発明による他の方法は、 （ａ）　被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ１５〜１０ ０塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドである第１１０−ブ（“捕獲プローブ）を含 む固形支持体であって、固形支持体の一部である第１１０−ブの実質的部分がも っばら支持体に末端結合しているもの（すなわち支持体に共有結合により、かつ ５′末端ヌクレオシドの５′−酸素原子または３′末端ヌクレオシドの３′−酸 素原子に結合したリンカ−のみを介して結合しているもの）、および （ｂ）　被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ一重鎖オリ ゴヌクレオチドでありかつ検出のために標識されている第２１０−ブであって、 ただし第２１０−ブの配列は第１１０−ブの配列に対し非相補的であり、第２セ グメントが第１セグメントと重複しないものを用いて試料中の一重鎖核酸系被分 析体を検出する方法であって、（１）　上記固形支持体をプレハイブリダイゼー ション条件下で、（ｉ＞非相同核酸もしくは（ｉｉ）約５〜２０％（ｗ／ｖ）の 濃度の硫酸デキストラン、または（ｉ）および（ｉｉ＞の両者からなるプレハイ ブリダイゼーション液と共にインキュベートし；（２）工程（１）に従ってプレ ハイブリダイズされた固形支持体をハイブリダイゼーション条件下で、約５〜２ ０％（−／ｖ）の硫酸デキストラン；アッセイされる試料からの核酸（試料中に 存在する場合には被分析体を含む）からなる第１ハイブリダイゼーシヨン液と共 にインキュベートし、この第１ハイブリダイゼーシヨン液は実質的に第２プロー ブを含ます；（３）工程（２）の後に、ハイブリダイゼーション条件下で固形支 持体を第２ハイブリダイゼーシヨン液中の被分析体の量に対し過剰モルの第２プ ローブからなる第２ハイブリダイゼーシヨン液と共にインキュベートしく第１プ ローブへのハイブリダイゼーションにより固形支持体に結合した被分析体を含む ）；（４）工程く３）の後に固形支持体を洗浄して、これから被分析体に安定に ハイブリダイズしていない第２プローブを除去し；そして （５）工程（４）の後に、被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の検出 可能な標識に起因する信号が固形支持体に付随するか否かを測定する ことよりなる方法である。 本発明はさらに、試料中の一重鎖核酸系被分析体を検出するための本発明方法を 実施するための試験キットを提供する。このキットは本発明による固形支持体、 固形支持体上に捕獲される被分析体に対する標識プローブ、および標識プローブ からの信号を発生させるのに必要な試薬（必要な場合には）（たとえば、標識が ビオチンである場合には酵素結合アビジン；標識がキレート化ユーロピウムイオ ンである場合には蛍光増強液（ムッソら、国際特許出願公開Ｗ　Ｏ８７７０２７ ０８号明細書参照））からなる。 さらに他の観点においては、本発明は前記衣１に挙げたオリゴヌクレオチド配列 をもつＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの相補体くすなわち上記オリゴヌク レオチドの配列に対し相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド）を提供し、これ らのＤＮＡまたはＲＮＡは所望により検出のために標識されていてもよい。オリ ゴヌクレオチドを検出可能にすべく標識するために当技術分野で知られている多 数の方法をいずれも、本発明のＤＮＡおよびＲＮＡについて採用できる。たとえ ばＤＮＡもしくはＲＮＡを５′−ヌクレオシドの５′炭素原子にあるボスフェー ト基においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２ｐにより：ＤＮＡもし くはＲＮＡの５′末端にあるリンアミデート基にジアミノアルキルリンカ一部分 を通して（チューおよびオルゲル、Ｄ　Ｎ　Ａ　４．３２７−３３１（１９８５ ）の記載による）、もしくは改質ヌクレオチド塩基にリンカ−を通して（たとえ ばドライヤーおよびダーバン、ブロシ、ナショナル、アカデ、サイ、（Ｐｒｏｅ 。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）（Ｕ　Ｓ　Ａ）８２，９６８−９７２（１９ ８５）の記載による）結合したビオチンにより；またはキレート化ユーロピウム イオンによりくムッソら、国際特許出願公開Ｗ　０８７１０２７０８号明細書の 記載による）標識することができる。 捕獲プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは下記の方法により固形支持 材に結合させることができる。（］）各種の非共有型相互作用くたとえば核酸が ニトロセルロースまたはナイロンフィルターなどの月利に結合するもの）、（２ ）支持材」二の、または支持材に共有結合により誘導体形成された基土の反応性 基と、オリゴヌクレオチドのピリミジンまたはプリン塩基部分上の反応性基との 共有結合ならびに（３）支持材上の、または支持材に共有結合により誘導体形成 された基土の反応性基と、オリゴヌクレオチドの一末端ヌクレオシドもしくは他 方に誘導体形成された基（たとえば５′ヌクレオシドの５′−酸素原子または３ ′末端ヌクレオシドの３′−酸素原子を介して）上の反応性基との共有結合、捕 獲プローブは支持体への共有結合の唯一の手段が上記（３）型のものである場合 には、固形支持体に“末端結合”していると言われる。特に捕獲プローブを含む 固形支持体を核酸プローブアッセイ法に用いるためには、高い割合の捕獲プロー ブが末端結合していること、および末端結合プローブと支持材との非共有型相互 作用を最小限に抑えることが有利である。この種の末端結合した捕獲プローブは 標的を捕獲するために最大限に利用されるからである。支持体において捕獲１０ −ブの約１０％以上が末端結合している場合、固形支持体において“実質的割合 ”の捕獲プローブが末端結合している。少なくとも約３０％が末端結合している ことが好ましい。 捕獲プローブが本発明に用いられる固形支持材（たとえばケイ酸塩ガラスピーズ 、架橋デキストラン、ポリスチレン）に、核酸の末端にジスルフィド結合または ホスホルアミデート基を与えるリンカ−によって結合している固形支持体につい ては、末端結合の程度の測定は可能である。ジスルフィド結合は緩和な条件下で 容易に還元されて末端結合しているプローブを放出するが、１個または２個以上 の塩基を介して共有しているプローブは放出しないからであり、またホスホルア ミデート結合は酸不安定性であり、同様に適切な酸性条件下で、末端結合してい るプローブを放出するが、１個または２個以上の塩基を介して共有結合している プローブは放出しないからである。非共有結合は捕獲プローブを支持材と共に、 リンカ−などにより共有結合しない条件下でインキュベートし、支持材により吸 収されたプローブの量を測定するだけで推定できる。これらの共有結合および非 共有結合の測定に際しては、３２ｐ標識された捕獲プローブを用いることが好都 合である。この場合、支持体に付随するプローブおよびそれから除かれたプロー ブの量を容易に測定しうるからである。 特に前記のように、捕獲プローブが各種支持材に各種リンカ−によって結合して いる様式を判定することにより、前記のグループ（Ｂ）（３）による固形支持体 （特定の水酸基酸素原子において、式 ％式％ の基により誘導体にされた架橋デキストラン系マクロ孔質材料）の優れた特性が 見出された。これらの支持体のうちきわめて好ましいデキストラン系材料はセフ ァクリルＳ−５００である。ジスルフィドを含まないリンカ−がより好ましい。 好ましいセファクリルＳ−５００以外のマクロ孔質架橋デキストラン系材料も本 発明による固形支持体に使用できることを認識すべきである。たとえばセファク リルＳ−２００およびセファクリルＳ−１０００（ファルマシア社により販売） も、他のマクロ孔質架橋デキストラン系材料、特にセファクリル類のように、ア リルデキストランをＮ、Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することによ り製造された材料（ファルマシアその他の会社により販売）と同様に使用できる 。 本発明をここにＨＩＶ−１の検出について説明するが、当業者には本発明があら ゆる核酸系被分析体、特にアッセイされる試料中に一重鎖の形で存在するもの（ すなわち相補的配列をもつ連鎖を大幅に上回る一本の連鎖をもつもの）について 適用でき、ＨＩＶ−１に限定されないことが明らかであろう。 さらに本発明による固形支持体は、ここでは主としてそれらを核酸プローブアッ セイに用いることにつき記述したが、アフィニティークロマトグラフィー（“オ リゴｄＴカラム”が長い間使用されているように）に用いて目的核酸を単離する こともできる。 オリゴｄＴカラムはポリＡティル付きＲＮＡの単離に限定されているが、本発明 の支持体と用いると、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであっても、またポリアデニ ル化されていてもいなくても、目的とする特定の核酸を単離することができる。 捕獲プローブがジスルフィド結合をもつリンカ−によって支持材′に結合してい る本発明の支持体は、目的とする核酸をアフィニティークロマトグラフィーによ り得るために有利に用いられる場合がある。これらのジスルフィド型リンカ−を 含む支持体から捕獲プローブ（目的とする核酸にアニールしたもの）を分離する のに必要な条件が緩和であり、実施しゃすいからである。 ここで“活性エステル”とは当技術分野で理解されるように、カルボキシレート 基とＮ−しドロキシスクシンイミド、５−２−ピリジンなどの化合物により形成 されるエステルを表わす。 本発明のアッセイ法が適用される試料は、通常は粗製検体、たとえば血液その他 の体液、植物または動物から得た組織試料、食品試料、微生物培養物などを、当 技術分野で知られている方法により処理して、これから核酸、または少なくとも 核酸系被分析体（すなわち“標的”）を含むと思われる核酸画分を分離すること によって得られるであろう、単離過程で、アッセイを妨害し、特定の酵素の場合 は核酸系被分析体およびオリゴヌクレオチド型プローブを破壊する可能性のある 他の物質（たとえば蛋白質）から核酸が分離されるであろう。 被分析体が存在する場合に、これがアッセイの検出限界以下の濃度で存在すると 思われる場合には、たとえばサイキら、サイエンス２３１．１４３４−１４３６ （１９８５）から採用される方法に従って被分析体の量を増幅する必要があろう 。 プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの条件、ならびに不 安定な状態でハイブリダイズしたプローブまたはハイブリダイズしていないプロ ーブを洗浄除去するための方法は、核酸プローブアッセイの技術分野の専門家に は周知である。 第２プローブは、存在すると思われる被分析体の最大量が経験から分かっている 大部分の場合、ハイブリダイゼーション液中の被分析体の量に対し過剰モル量で 供給することは容易である。この最大量がもし分かっていない場合には、第２プ ローブ濃度が広範に変化した幾つかのアッセイを異なる試料部分につき実施する ことにより、第２プローブが過剰モルであるアッセイに確実に行うことができる 。 被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の標識からの信号が固形支持体に 付随するものであるか否かの判定は、支持体においてその標識に適した測定を行 って支持体からのこの種の信号を検出することによる。８ましくは、被験試料に 由来する被分析体が結合している可能性のある支持体からの信号を、対照支持体 、すなわち被験試料について採用されたと実質的に同じ方法で処理されているが 、それに被分析体は結合していないことが分かつている支持体からの信号と比較 する。被験試料からの信号が対照支持体からの信号よりも規模が大きい場合、ア ッセイが双方の支持体について操作可能であることが分かつている限り、被験試 料支持体からの信号は被験試料中の被分析体に起因することが確認される。もち ろん当技術分野において理解されるように、アッセイされる核酸を含有すること が知られている陽性対照試料をも被験試料および陰性対照試料と平行使用して、 そのアッセイ系が本発明を以下の実施例に若干詳細に説明する。 実施例Ｉ プローブの調製および精製 短鎖オリゴヌクレオチド（溶液からの被分析体の捕獲に関与する成分を含む）を 用いるサンドイッチアッセイにおいては、感度および特異性、従って信頼性のた めに、プローブが高純度でありかつ均一な配列をもつことが重要である。十分な 品質をもつオリゴヌクレオチドを得るために当業者にとっては多数の合成法およ び精製法があるが、本発明者らは下記の方法を受容しうろことを認めた。すなわ ちオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｃｌｅ　Ｂ　 ｉｏｓｙｓｔｅｍ）３８０Ａ型自動合成装置を用いて、シアノエチルホスホルア ミデート化学により合成される０合成は１Ｍモルの規模で９分間の短い結合サイ クルを用いて行われる。各結合サイクル独自の収率は比色ア・ンセイ法を用いる トリチル検出により測定して９８％である。この方法によって３０ヌクレオチド のＤＮＡプローブが３時間で合成され、次いで塩基保護基の除去およびトリチル 化オリゴヌクレオチドの精製にさらに１８時間を要する。精製プロトコール終了 時に得られるオリゴヌクレオチドの量は合成１回当たりオリゴヌクレオチド４０ ０〜６００μ２である。 特異的標的核酸である被分析体を確実に検出するためには純粋な全長プローブが 必須であるため、本発明者らはオリゴヌクレオチド精製のプロトコールを開発す ることに特別な注意を払った。トリチル化オリゴヌクレオチドの精製はＣ−１８ 逆相半調製用クロマトグラフイー（１０Ｘ　２５０＋＊＋＊のカラム）により行 う、Ｃ−１８クロマトグラフイーの前に脱トリチル化されたオリゴヌクレオチド を単離する試みは、オリゴヌクレオチドの疎水性がより低いためより効率の低い 精製手段であることが証明された。４０分間にわたって０．１Ｍ　）ジチルアン モニウムアセテート中１５〜３５％のアセトニトリルの濃度勾配を用いて、トリ チル化された全長オリゴヌクレオチドを溶離した。このオリゴヌクレオチドを次 いで水中の８０％酢酸により１時間脱トリチル化した。脱トリチル化ののちＧ− ５０セフアデツクスクロマトグラフイーを行った。単離されたオリゴヌクレオチ ドをさらにＲＰＣ−５カラム上でのＨＰＬＣにより判定した＜４．６Ｘ２５０ｍ ｍのカラム；溶剤Ａ。 ２−Ｍトリス、ｐＨ１２、溶剤８．２＋ｍＭ）リス、２００諭Ｍ過塩素酸塩、ｐ Ｈ１２，濃度勾配置０％Ｂから５０％Ｂまで、４０分間）、この最後の工程は少 量のオリゴヌクレオチドについては付加的な精製工程にもなる。 比較的長鎖のオリゴヌクレオチド（〉５０ヌクレオチド）については、全長オリ ゴヌクレオチドの単離は１２〜２０％のゲルを用いる調製用ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により行われる（マニアチスら（前掲）に記述されるプロトコール に従う）。 前記の方法（５０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに関するもの）を採用 して、表ＩにＤＮＡとして挙げられるオリゴヌクレオチドを調製した。 実施例■ プローブのリン酸化 オリゴヌクレオチド型プローブを３′−ヌクレオシドの３′−炭素原子（“３′ 末端”）または５′−ヌクレオシドの５′−炭素原子（“５′末端”）において 標準法によってリン酸化する。 ３′末端におけるリン酸化についてはバネットおよびコラナ、ジェイ、バイオロ 、ケミ、（Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、ｃｈｅｍ、）２４９．５２１３−５２２１を参照 されたい。 オリゴヌクレオチドはそれらの５′末端においてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ を用いて標準プロトコールに従ってルーチンにリン酸化されたくマニアチスら（ 前掲）を参照されたい）。 ３２ｐ標識プローブを調製するためには、適宜な位１に３２ｐ含有ホスフエート を含む基質をリン酸化に用いる。 実施例■ プローブの標識付けおよび検出 検出のためのプローブ標識付けは放射性または非放射性標識により行うことがで きる。 放射性標識付けを採用する場合、実施例Ｈに記載した３２ｐ標識付けが好ましい が、他の同位体、たとえば１２８工または”Ｃを用いた既知の方法に従う標識付 けも採用できる。 被分析体（固形支持体に結合した捕獲プローブと複合体を形成）と複合体を形成 した放射性標識プローブを検出するためにはシンチレーション計数法が採用され る。 多数の非放射性標識付けおよび付随する検出のプロ１〜コールが知られている。 標識オリゴヌクレオチド型プローブとこのプローブの配列に相補的な配列をもつ 被分析体セグメントとの間の塩基対合に対する妨害が最小であるこれら標識付は 技術はいずれも本発明に採用できる。たとえばビオチンに結合し、かつホスホル アミデート結合によりオリゴヌクレオチドの５′末端のホスフェートに結合した ジアミン系リンカ−を介するビオチンによる標識付けを採用しうる（チューおよ びオーゲル、ＤＮＡ、４巻、３２７−３３１（１９８５）に従う）、ビオチンの 代わりにＥＤＴＡキレート化蛍光Ｅｕ”を用いる同様な標識付けも採用し、うる （ムッソら、国際特許出願公開Ｗ　Ｏ８７１０２７０８号明細書に記ｔＩ’、） 。 ヌクレオシド塩基に結合したビオチン（ドライヤーおよびダーバン（前掲）によ り報告されたもの）による標識付けも採用できる。 実施例■ 多孔質ケイ酸塩ガラスの誘導体形成 （Ａ＞“長鎖アルキルアミン”誘導体型の制御細孔ガラスはパース・ケミカル社 （米国イリノイ州ロックフォート）から購入された。製品Ｎｏ、２４８７５．こ の多孔質ゲイ酸塩ガラスは式（ＣＨｚ）ａＮ　Ｈ２の基で誘導体にされたケイ素 原子を含む。 （Ｂ）　カルボキシル誘導体型の制御細孔ガラスはパース・ケミカル社（米国イ リノイ州ロック７オード）から購入された。製品Ｎ　ｏ　、２３７３５　、この 多孔質ケイ酸塩ガラスは式−（ＣＨ２＞３８Ｈ（Ｃ○）（ＣＨ２）２Ｃ○２Ｈの 基で誘導体にされたケイ素原子を含む。　（Ｃ）　チオール誘導体型の制御細孔 ガラスもパース・ケミカル社（米国イリノイ州ロックフォード）から購入された 。製品Ｎ　ｏ、２３７４８．この多孔質ケイ酸塩ガラスは次式の基で誘導体にさ れたケイ素原子を含む。 （Ｄ）　スクシンイミドエステル誘導体型の多孔質ケイ酸塩ガラスは前記のカル ボキシル誘導体型ガラスを用いて調製される。 カルボキシル誘導体型ガラスをアセトンで３回、次いで乾燥アセトン（４人の分 子篩上に置くことにより乾＠）で３回洗浄することにより乾燥させる。これらの ビーズを次いで焼結ガラスろうとにより濾過し、真空中で１０時間乾燥させる。 乾燥Ｎ、Ｎ”−ジメチルホルムアミド（“ＤＭＦ”）　］、５　ｚ　１中の乾燥 ビーズ５００＋ｙにジシクロへキシルカルボジイミド５００１９およびＮ−ヒド ロキシスクシンイミド３００３＋１７を添加する。混合物を１６時間攪拌し、乾 燥ＤＭＦ＜３回、各２０ａ＋１）および塩化メチレン（２回、各２０ｚ１）で洗 浄して、過剰の試薬およびジシクロヘキシル尿素を除去する。得られた支持体を 次いで真空中で３時開乾燥させる。 実施例Ｖ マクロ多孔質架橋デキストラン系支持体の誘導体形成（Ａ）　セファクリルＳ− ５００はファルマシア社（米国ニューシャーシー州ビスカッタウェイ）からコー ドＮ　ｏ　、１．７−０４７５−　ＯＸで購入された。 （Ｂ）　セファクリルＳ−５００をブーネマンら（前掲）の方法に従って臭化シ アン活性化した。製造業者により供給された湿潤材料１００ｇを大過剰の蒸留水 および焼結ガラスフィルターを用いて洗浄した。オーバーヘッドかい形攪拌機お よびｐＨ［極を備えた１０００１Ｎのビーカーに湿潤ケーキを移した。水冷しな 水５００Ｒ１を添加し、混合物を激しく攪拌し、その間木片を時々添加すること により１０℃以下に保った。固体臭化シアン４０ｇを添加し、ｐＨを反復監視し 、５　Ｍ−ＮａＯＨの添加により約２０分間、１０．５〜１１．５に維持した０ 次いでビーズ材料を５容量の氷冷水ののち１容量の氷冷した１０ｍＭリン酸カリ ウム（ｐＨ８，０）で速やかに洗浄した。 当業者に理解されるように、ＣＮＢｒ活性化には隣接炭素原子上に水酸基を必要 とする。 （Ｃ）　カルボキシル誘導体型の材料は下記により調製された。 １０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）２００ｚｉ中の新たに調製した２０９のＣＮ Ｂｒ活性化セファクリルＳ−５００の懸濁液に６−アミノカプロン酸１６ｇを４ 回に分けて３０分毎に添加し、得られた混合物をかい形攪拌機で２０分間攪拌し た。（あるいは６−アミノカプロン酸の代わりにヘキシレンジアミンを用いて、 そのアミン誘導体型支持体を得ることができる）。 得られた誘導体型セファクリルを焼結ガラスろうとにより枦通し、１０＋ｍＭリ ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）　；　Ｉ　Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８ ，０）；Ｉ　Ｍ−ＫＣｌ、０．１Ｍ−ＮａＯＨ５最後に水で徹底的に洗浄した０ 次いで湿潤ゲータを０．１Ｍ　−Ｍ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ６，０）に懸濁し、４℃に 保存した。 （Ｄ）　スクシンイミド誘導体型のマクロ孔質架橋デキストラン材料は下記によ りカルボキシル誘導体型の材料から調製された。０．１Ｍ　−ＭＥ　Ｓ［衝液（ ｐＨ６）に懸濁したカルボキシル誘導体型セファクリル５−ｓｏｏを焼結ガラス ろうとに移し、順次氷、７０：３０．５０：５０次イテ３０ニア０（’）　Ｈ２ ０／　７　セ）　７　テ洗浄したのち、アセトンで３回、次いで４オングストロ ームの分子篩で乾燥させたアセトンで３回洗浄した。−過したのちセファクリル を高真空下に（０，０１）ル）１０時間乾燥させた０次いで乾燥したカルボキシ ル誘導体型材料を実施例ＩＶ（Ｄ）にカルボキシル誘導体型の多孔質ガラスにつ き記載したと同様に処理して、スクシンイミドエステル誘導体型セファクリルを 得た。 （Ｅ）　チオール誘導体型セファクリルＳ−５００は下記により調製される。　 １０＋ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８，０）中の新たに調製した１５２のＣＮＢｒ 活性化セファクリルＳ−５００の懸濁液にシスタミンジ塩酸塩５ｇを添加し、混 合物をかい形攪拌機で２０時間攪拌する。得られた誘導体型セファクリルをＶ（ Ｃ）の場合と同様に濾過し、洗浄する。使用前に誘導体型材料のリンカ−である シスタミンのジスルフィド結合は、この材料を１１００ｅａジチオトレイ１〜− ル（ＤＴＴ）、５０ｒａＭ　−ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ７，７＞に２５℃にお いて１時間懸濁し、次いでこの材料を脱泡した０、２Ｍ　−ＨＥ　ＰＥ　Ｓ　（ ｐＨ７，７）、０．１Ｍ　−Ｋ（Ｊで十分に洗浄し、最後に０．２Ｍ・ＨＥ　Ｐ 　Ｅ　Ｓ　（ｐＨ７，７＞で再び洗浄することにより解裂される。 実施例■ ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン系支持体の誘導体形成（Ａ）　１％架橋ジビ ニルベンゼン−ポリスチレンクロルメチル樹脂（１，１ｍＭｅ！／１？、２００ −４００メツシュ）は、ニー・ニス・バイオケミカル社（米国オハイオ州クリー ブランド）から購入された。 １２％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ（メツシュサイズ２００〜４０ ０）はポリサイエンス（ペンシルベニア州ワリントン）から購入された。 （Ｂ）１２％架橋ジビニルベンゼン−ポリスチレンビーズを下記によりカルボキ シル誘導体にした。 上記ビーズ１０ｇを１．２−ジクロルエタン１５０ｚｌに添加し、混合物を還流 した。ニトロベンゼン１０１Ｒ中の塩化アルミニウム２０ミリモルおよびグルタ ル酸モノメチルエステルクロリド１０ミリモルの濾過混合物を５分間にわたって 添加し、反応混合物をさらに４時間還流した。樹脂を焼結ガラスろうとで濾過し 、ジオキサン：４Ｎ　−Ｈ（Ｊ（３：１）、ジオキサン；水（３：１）、ジオキ サン、エタノール、アセトン、最後にメタノールで洗浄し、次いでデシケータ− 内で真空下に乾燥させた。三日フラスコ中のＫＯＨ２ｙにエチレングリコール１ ００ｙ／を添加し、混合物を１００℃に加熱した。ＫＯＨが十分に溶解したのち 、乾燥した誘導体型樹脂５ｇをヒドラジン水化物３ｙｔ（ｌと共に添加した。混 合物を還流させ、３時間還流したのち還流温度が１９８℃に達するまで液体の一 部を留去した０次いでフラスコを密栓し、１２時間還流を続けた６次いで樹脂を 前記（グルタル酸モノメチルエステルクロリドによる誘導体形成後）と同様に洗 浄した。 （Ｃ）１２％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズを下記によりアミン誘導 体にした。カルボキシル誘導体型ビーズ５ｇにジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　 Ｆ　＞５０ｚｌ中のジシクロへキシルカルボジイミド１ｆＩおよびＮ−ヒドロキ シスクシンイミド１．２５９を添加した。３０分間攪拌したのち、１，８−ジア ミノオクタン７ｆＩを添加し、混合物をさらに３時間攪拌した０次いで樹脂を濾 過したのち、順次メタノール、水、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ　２、最後にアセト ンで洗浄した。 （Ｄ）　１％ジビニルベンゼン架橋したクロルメチル誘導体型ポリスチレン樹脂 を下記によりアミノ誘導体にした。ＤＭＦ８０１１１中の１％架橋したクロルメ チル誘導体型樹脂（ニー・ニス・バイオケミカル社により供給）　１０．にＮ− ｔ−ブチルオキシカルボニル−６−アミノカブロンＭ２．６１？およびフッ化カ リウム１．２８２を添加し、混合物を８０℃で１６時間攪拌した。次いで樹脂を 濾過し、順次ＣＨ２Ｃｌｘ、メタノールおよびアセトンで洗浄したのち、高真空 （０，０１）ル）を３時間施した。ＣＨ２（Ｊ２中の３０％トリフルオル酢酸を 用いてアミノ基の脱保護を行い、アミン誘導体型の支持体を得た。アミノ酸のピ クリン酸滴定によって０．１７ミリモル／９（樹脂〉の置換水準が示された。 実施例■ オリゴヌクレオチドの５′−アミノアルキル、５′−カルボキシルアルキル、お よび ５′−シスタミニルホスホルアミデート誘導体（Ａ）　５’−アミノアルキルホ スホルアミデート誘導体アミノアルキル誘導体は一般に１〜２０μＭの濃度で１ 〜１０ナノモルの規模において調製された。以下のプロトコールはチューら、ヌ クレ、アシッズ、リサ、（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＞１１．６５１３− ６５２９（１９８３）のものであり、修飾されたオリゴヌクレオチドはエタノー ル沈澱法により単離された（コレットおよびカワシマ、ヌクレ、アシッズ、リサ 、（Ｎｕｃｌ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、Ｈ３，１５２９−１５４１（１９８５）に 従う。 すなわちオリゴヌクレオチドのアミノ−へキシル付加物を調製するために、シリ コナイズしたエッペンドルフ試験管内でオリゴヌクレオチド（５′末端において リン酸化されたもの）４ナノモルを、０．３肩βの０　、２４　Ｍ・１．６−ジ アミツヘキサン、０．１Ｍ・Ｎ−メチルイミダゾールおよび０．１Ｍ・１−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノブロビル）カルボジイミド（“ＣＤＩ”）（ｐＨ ６，０）中に入れ、２０時間反応させた。得られたＤＮＡを３回エタノール沈殿 させて過剰のジアミンを除去し、次いで０．１Ｍ　−ＭＯＰＳ　（ｐＨ７，５） に入れた。オリゴヌクレオチドが反応中に試験管の側面に非特異的に結合するの を防ぐために、オリゴヌクレオチドを反応させる際には常に試験管をシラナイズ 液で前処理するのが必須であることが認められた。 同じ方法により、ただし１，６−ジアミツヘキサンの代わりに１．２−ジアミノ エタンまたは１．８−ジアミノオクタンを用いると、６−アミノヘキシル付加物 の代わりにそれぞれ２−アミノエチルまたは８−アミノオクチル付加物が得られ る。 （Ｂ）　５′−カルボキシアルキルホスホルアミデート誘導体表組の誘導体をグ リシンまたはアミノカプロン酸により調製するために、下記の方法を採用した。 シラナイズしたエッペンドルフ試験管内で５′−リン酸化オリゴヌクレオチド４ ナノモルを、０．３ｘｌの０．１Ｍイミダゾール、０．１Ｍ−ＣＤ　Ｉ　（ｐＨ ６，０）中に２５℃で入れ、ホスホルイミダゾリドを９０分間かけて生成させた ０次いでオリゴヌクレオチドをエタノール沈澱させたのち０．１Ｍグリシンまた は０．１Ｍアミノカプロン酸の溶液（ｐＨ８，０）０．３ｘＲに再溶解し、５０ ℃に３時間加熱した。次いで得られた付加物をエタノール沈澱法により単離し、 最後に０．０５Ｍ　−Ｍ　ＯＰＳ（ｐＨ７，５）に入れた。 （Ｃ）　５’−シスタミニルホスホルアミデート誘導体シラナイズしたエッペン ドルフ試験管内で５′−リン酸オリゴヌクレオチド１ナノモルに０．３ｄの０． １Ｍイミダゾールおよび０．１５Ｍ　−ＣＤ　Ｉ　（ｐ）４６．００）を添加し 、得られた溶液を２３℃で１．５時間インキュベートした。５′イミダゾリド誘 導体をエタノール沈澱法により単離し、次いで０．２５Ｍシスタミン（ｐ　Ｈ７ ，７）０．３１１に入れ、そこで反応を５０℃において３時間進行させた０次い でシスタミニルホスホルアミデート誘導体を３回エタノール沈澱させて過剰のシ スタミンを除去した０次いでＤＮＡベレットを０．０５Ｍ　−Ｍ　ＯＰ　Ｓ　（ ｐＨ７，５＞４ｍ入ｉ７’、：　。 （Ｄ）　３’誘導体 ５′末端においてリン酸化されたものの代わりに３′末端においてリン酸化され たオリゴヌクレオチドを用いて実施例■（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の場合と同 じ方法に従って、５′誘導体型のものの代わりに３′誘導体型ホスホルアミデー ト付加物を得る。 実施例■ オリゴヌクレオチドによるアミノ誘導体型多孔質ケイ酸塩ガラスの誘導体形成 表題の誘導体形成に用いられる標準反応は下記のものである。 長鎖アルキルアミン誘導体型の制御細孔ガラス（バース・ケミカル社、製品Ｎ　 ｏ、２４８７５）　（アミノ基２０〜３０マイクロモル／ｇ＜ガラス）を含む） Ｌｏｇをシラナイズされた工・ンベンドルフ試験管内で０．１１＋６の０．１Ｍ 　−Ｎ−メチルイミダゾール、０．１Ｍ　−ＣＤ　Ｉおよび５ｘｉｏ−’〜２０ Ｘ１０−’Ｍ・５′−リン酸化オリゴヌクレオチドと混和する。攪拌しながら２ ４時間反応を続け、次１１でビーズをＮ　ａｏ　Ｈ（ｐＨ１２）で１分間洗浄し て、非特異的に結合したＤＮＡを除去する。最後に、誘導体にされたビーズをＴ Ｅ緩衝液（１０綿トリス、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）中に保存する。 使用前にビーズを１００μ！の５０ＴａＭ酢酸−またはプロピオン酸−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル、０．２Ｍ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，７）と混和し 、１５分間反応させ、次いで０．２Ｍ　−ＨＥ　ＰＥ　Ｓ　（ｐＨ７，７）で３ 回洗浄し、最後にＴＥ緩衝液中に保存することにより、ビーズの未反応アミノ基 をプロ・ツクする。この処理はビーズの遊離アミン基を実質的にすノくてプロ・ ツクするのる二十分である。 アミン誘導体型多孔質ケイ酸塩ガラスピーズへのオリゴヌクレオチドの結合収率 は、３２Ｐ標識５′−リン酸化オリゴヌクレオチド２５ピコモルとビーズ５０す を０．５５ｚｌの０．１Ｍ・メチルイミダゾール、Ｏ，ｔＭ　−ＣＤ　Ｉ　（ｐ Ｈ６，ｏｏ）中で攪拌下に２４時間反応させ、次いでＮ　ａｏ　Ｈ（ｐＨ１２＞ で１分間洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除去することによって測定された 。非特異的（すなわち非共有）結合は反応をＣＤＩの不在下に行うことにより測 定された。次いでビーズからのチェレンコフ計数をベックマンＬ　Ｓ　７８００ 液体シンチレーションシステム（ベックマン・インスツルメンツ社）により測定 した。“結合収率”はビーズに結合した２５ピコモルの両分である。結合収率は オリゴヌクレオチドの長さの間数であることが認められた。一般にアミン誘導体 型多孔質ガラスピーズに対し１７−ｍｅｒについては７５〜８０％の収率が得ら れ；２５−　ｖｅｒについては４０〜４５％の収率が得られた。非特異的結合度 は４〜６％であった。ホスホルアミデート結合の酸加水分解により支持体から本 質的に完全にオリゴヌクレオチドが離脱した。これはこの節に記載した方法によ って非特異的に結合していないオリゴヌクレオチドはすべて末端結合しているこ とを示す。 実施例■ ５′−アミノアルキルホスホルアミデート誘導体型オリゴヌクレオチドによる臭 化シアン活性化マクロ孔質架橋デキストラン系支持体の誘導体形成新たに調製し たＣＮＢｒ活性化セファクリル５−ｓｏｏビーズ５００１？（湿潤）を０．５ｚ ｌの０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ，，０，５Ｍ−Ｎａ（１！（ｐＨ８，３）、および０ ．０２５ｚｆの５′−６−アミンへキシルホスホルアミデート誘導体型オリゴヌ クレオチド（約５ｘｌＯ−’Ｍ）と０．０５Ｍ・Ｍ　ＯＰ　Ｓ　（＋）Ｈ７，５ ）中で混和する。反応を２０時時間待させる。 次いで試験管を遠心分離し、上層液を除去したのち、０．１Ｍ・トリス（ｐＨｓ 、ｏｏ）と１時間混和して、臭化シアン誘導体形成から残された未反応部位を不 活化する０次いでビーズをＮ　ａ　ＯＨ（ｐＨ１２）で４回洗浄し、最後にＴＥ ［衝液中に保存する。この場合、セファクリルの水酸基の酸素原子とオリゴヌク レオチドの５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を連結するリンカ−は次式の構 造をもつ。 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）−６−アミノエチルホスホルア ミデート誘導体にされる代わりに２−アミノエチルホスホルアミデート誘導体に されたオリゴヌクレオチドを用いて同じ処理を行うことにより、デキストランの 酸素原子とオリゴヌクレオチドの５′−ヌクレオシドの５′酸素原子とのリンカ −が次式の構造をもつ固形支持体が得られる。 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＰＯ□）一実施例Ｘ ５′−アミノアルキルホスホルアミデート誘導体型オリゴヌクレオチドによるカ ルボキシル誘導体型固形支持材の誘導体形成前記カルボキシル誘導体型の多孔質 ゲイ酸塩ガラス、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、およびマクロ孔質架橋デ キストラン系の支持体につき下記の１０トコールを適用した。 カルボキシル誘導体型の支持体５０〜７５ａｙ　（セファクリルの場合は湿潤重 量）に、２５〜３０ピコモルの５′−アミノアルキルホスホルアミデート−また は５′−シスタミニルボスボルアミデート誘導体型のオリゴヌクレオチドと、０ ．７５ｚ１の０．１５Ｍ　−ＣＤＩ、０．１Ｍ・ＭＥＳ（ｐＨ６）中において添 加し、混合物を回転ミキサーにより１時間（セファクリルの場合）または１６時 間（ガラスおよびポリスチレンの場合）Ｍ和に攪拌する。（セファクリルとの反 応速度がより大きいことはこの材料の著しい利点である。）反応後に支持体をＮ 　ａｏ　Ｈ（ｐＨ１２）で４回洗浄し、最後に、オリゴヌクレオチド誘導体型の 材料をＴＥＭ衝液中に保存する。 これらのカルボキシル誘導体型支持体についての結合収率は、上記の例に示した ように３２ｐ標識オリゴヌクレオチドを使用し、ビーズのチェレンコフ計数を測 定することによりめられた。 非特異的結合はＣＤＩの不在下で結合反応を行ったのち支持体における放射能を 測定することにより評価された。オリゴヌクレオチドに結合したリンカ−の末端 アミノ基を介したものではなく塩基のアミノ基を介した結合は、リン酸化された くただし他の点では誘導体にされていない）オリゴヌクレオチドを支持材と反応 させることにより評価された。末端結合度はホスホルアミデート結合をＨＣｌ（ ｐＨ２＞中で３７℃において４時間加水分解したのち支持体をＮａＯＨ（ｐＨ１ ，２＞で洗浄することによりめられた。これにより支持体上の残留放射能が末端 結合が推定値を与える。５′−シスグミニルホスホルアミデート誘導体型オリゴ ヌクレオチドを含む支持体については、末端結合度はジスルフィド結合をＤＴＴ で解裂させることにより測定された。すなわちオリゴヌクレオチド誘導体にされ た支持体５０１９を２３℃で０．２ｚｌ（７）０．１Ｍ　−ＤＴＴ　、０．１Ｍ 　・ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、オよＬ’１ｍＭ・ＥＤＴＡ（ｐＨ７，７）と共に１時 間インキュベートした０次いで支持体をＮ　ａｏ　Ｔ４　（ｐＨ１２）で洗浄し て、離脱したオリゴヌクレオチドを除去した。一般に、シスタミニル誘導体型オ リゴヌクレオチドについての末端結合の測定結果はアミノアルキル誘導体型オリ ゴヌクレオチドについてのものと一致した。 シスグミニル誘導体型オリゴヌクレオチドを脱離するために用いられる条件が緩 和であることは、本発明の固形支持体を核酸の単離に適用するにつき、注目すべ きである。 本発明のきわめて好ましい固形支持体は５’−（６−アミノへキシルホスホルア ミデート）誘導体型オリゴヌクレオチドで誘導体にされたカルボキシル誘導体型 セファクリルＳ−５００である。 この例の方法を採用すると、カルボキシル誘導体型セファクリル５−ｓｏｏのａ ｇ＜湿潤重量）当たり約１．２ピコモルのオリゴヌクレオチドが誘導体形成され る。約半量のオリゴヌクレオチドがもっばら末端結合しており（オリゴヌクレオ チドに結合した６−アミノへキシルホスホルアミデートの６−アミン基とセファ クリルに結合したカルボキシルとの間のアミド結合の形成のみによって共有結合 ）、わずか約０．５％が支持体に非共有結合により結合しており、約半量はオリ ゴヌクレオチドの塩基（たとえばシトシン）のアミン基を介して共有結合してい ると考えられる（支持体のカルボキシル基と６−アミノへキシルホスホルアミデ ートのアミノ基との間のアミドの形成を伴うと思われる）。 支持材のカルボキシル基がそれらのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとし て活性化されている場合、末端結合の水準はより高く、ヌクレオシド塩基を介し た結合は低下する。一般的な固定化法によれば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド 活性化したセファクリル系支持体１０１ｇ（乾燥）を、５′−アミノアルキルホ スホルアミデート−または５′−シスタミニルホスホルアミデートー誘導体型の オリゴヌクレオチド２０〜２５ピコモルを含有する０、２Ｍ　−ＨＥ　Ｐ　Ｅ　 Ｓ　（ｐＨ７，７）０．７ｍｌに懸濁し、混合物を回転ミキサーで１時間攪拌す る０次いで支持体をＮａＯＨ（ｐｉ−（ｔ２．０）で４回洗浄し、次いでＴＥ中 に保存する。（水和すると乾燥材料１０１ｆＩから５０１１９の湿潤支持体が得 られる。）これらの条件下で固定化すると、５０〜５５％の結合効率および８０ ％以上のオリゴヌクレオチド末端結合が得られた。しかし結果はＮ−ヒドロキシ スクシンイミド活性化された支持材については変動する傾向があった。これはス クシンイミドエステル部分が加水分解を受けやすいことによると思われる。従っ てスクシンイミドエステル活性化された支持体の調製に際して水分を厳密に除く こと、および真空乾燥したものをＮ２下に４℃で保存することが、この支持体に ついて良好な結果を保証するために有用である。 実施例］ ＨＩＶ−１ゲノムの検出 この例は本発明のオリゴヌクレオチド誘導体形成した固形支持体を核酸系被分析 体、特にヒトにおける後天性免疫不全症候群の原因物質であるＨＩＶ−１ウイル スのゲノムの検出に使用する方法につき説明する。 本発明による固形支持体く”ビーズ）はカルボキシル誘導体型セファクリルＳ− ５００および５’−（６−アミノヘキシル）ホスホルアミデート誘導体型オリゴ ヌクレオチド８５−２４１（捕獲プローブ）を用いて調製された。デキストラン の酸素原子とオリゴヌクレオチドの５′−チミジンの酸素原子との間のリンカ− は次式の構造をもつ。 −Ｃ（＝　Ｎ　Ｈ）Ｎ　Ｈ（ＣＨｚ）ｓ（ＣＯ）（Ｎ　Ｈ）（ＣＨ２）ＩＮ　Ｈ （Ｐ　Ｏ２）−オリゴヌクレオチド８５−２３３を第２の標識プローブとして用 いるためにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２ｐ含有ホスフエートによ り５′−リン酸化した。 以下の方法は８５−２４１および８５−２３３以外の、ＨＩＶ−１ゲノムの重複 ないし各セグメントの配列に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド対を用いて 行うことができる点を留意すべきである。たとえば表１に挙げたオリゴヌクレオ チド対をいずれも使用できる。さらにビーズの調製に用いられる他の固形支持体 を用いて、また第２１０−ブ上に検出のための非放射性標識を用いて行うことも できる。 ＨＩＶ−１について検査すべき者から得た血液１０ｚ＆のリンパ球画分からの総 核酸をいずれかの標準法により分離する。ヒトＤＮＡｌ０μバ約１０８のゲノム の相当）の試料を、ＨＩ　Ｖ−１ゲノムにつき検査すべき核酸試料と平行して陰 性対照としてアツセハイプリダイゼーション液（Ｈ３；５Ｘ　５ＳＰＥ（０，７ ５Ｍ　ＮａＣ１，５０μＭ　ＮａＨ２ＰＯ，、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ） 、１０％硫酸デキストラン、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ）を使用前に３７℃に置いて昇温させる。 ２０ｘＳＳＣを希釈して２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（０，３Ｍ　・ＮａＣ１，３０−Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）となし、その後の使用のために３７℃に置く 。 ビーズの原液をＴＥｇ衝液に再懸濁し、この懇濁液２５０μ！を取出してビーズ ５０３＋１？　（湿潤重量）を得る０次いでこの２５０μｌをエッペンドルフ試 験管に入れ、ビーズを遠心分離して（５秒間）、ビーズ５０ｍｇのベレットとな す、各アッセイは５０ｚｇのビーズを用いて行わなければならない。 次いで下記に従ってプレハイブリダイゼーションを行う。ビーズが保存されてい た緩衝液を５〜１０秒間の遠心骨Ｎ後に除去する。予熱されたＨ　Ｓ　（３７℃ ）２５０μ！をビーズに添加し、ビーズを再懸濁する。このプレハイブリダイゼ ーション混合物を３７℃に１５〜６０秒間置く。 次いでサンドイッチハイブリダイゼーションを行う。 溶液ハイブリダイゼーション工程： ビーズをプレハイブリダイズする間に、標識オリゴヌクレオチド（第２１０−ブ ）を試料（または対照）核酸のアリコートに添加する。このハイブリダイゼーシ ョン液の容量は５０μｌを越えてはならず、ＴＥ緩ｉ液中で行うことができる。 プローブ量と標的量の比率は約５：１（モル対モル）とずべきである。 この標識プローブー標的−ハイブリダイゼーション液（５０μりを６５℃に移し 、５分間置く。 標識プローブ−標的液す４２℃に移す０次いでＨ３を添加して最終ハイブリダイ ゼーション液２５０μ！となし、４２℃で３０〜６０分間ハイブリダイゼーショ ンを続行させる。 捕獲工程： ビーズを捕獲に用いる直前に、ビーズをプレハイブリダイゼーション温度から取 出し、ビーズを試験管底に遠心分離し、ブレハイブリダイゼーション液を除去す る０次いでビーズを３７℃に置き、ハイブリダイゼーション液（標的および標識 プローブ）２５０μｌをビーズに移す、ビーズをハイブリダイゼーション液に再 懸濁させ、５分毎に振とうする。３７℃に６０分間保持する。 洗浄： ビーズがハイブリダイゼーション複合体を捕獲している闇に、シンチレーション バイアルおよびピペットを用意する。 ６０分間の捕獲ののち、ビーズを遠心分離しく５〜１０秒間）、ハイブリダイゼ ーション液を除去する。 予熱く３７℃）した２ＸＳＳＣ１ｍｌをビーズに添加し、試験管を振とうし、５ 〜１０秒間遠心分離する。洗液を除去し、さらに２回洗浄を繰返す。 ｉ＆後の洗液を除去したのち、シンチレーション計数計（たとえばベックマンＬ 　Ｓ　７８００）を用いて各試料につきビーズを計数する。 ビーズから標識プローブの溶ｗＬ： 同位体標識プローブをビーズから回収するために、ビーズを水１００〜１０００ μ！に再懸濁し、１００℃に５分間加熱する。 この懸濁液を使い捨てカラム（クイックーセブ−Ｑ　ｕｉｃｋ−３ｅｐ）に移し 、溶出液を採取する。 この溶液はビーズに付随する標識の８０％を含むと思われる。 この標識を凍結乾燥により濃縮することができる。 使用したヒトＤＮＡ陰性対照を含む固形支持体より得られるバックグラウンドカ ウントを、被分析体を含有すると思われる試料核酸を含む固形支持体より生じる カウントから差引くことによって、試料核酸を含む固形支持体からの信号（被分 析体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド上の標識に起因する）が測定され る。 前記のように、硫酸デキストラン（濃度５〜２０％、好ましくは約１０％）を少 なくとも捕獲ハイブリダイゼーションに用いると、本発明の固形支持体を核酸系 被分析体の検出に使用する際のＳＮ比が著しく高められるこを見出した。これは 被分析体とシテのＨＩＶ−１ゲノムを検出するためにこの例で用いたビーズにつ いて当てはまる。 さらにこの例に示したように、硫酸デキストラン（濃度５〜２０％、好ましくは 約１０％）をプレハイブリダイゼーション液中に用いると、本発明の固形支持体 を核酸系被分析体の検出に使用する際のＳＮ比を高めるのに有利であることも認 められた。 これより好ましさの程度は低いがこの例の上記方法の変法においては、非相同（ 本明細書においては“不活性”ともいう）核酸、たとえば音波処理したサケ精子 ＤＮＡをプレハイブリダイゼーション液に約１１１ｇ７ｍ１の濃度で含有させる ことができる。 本発明を各種の例につき説明したが、詳細に例示された対象の種々の変更および 拡張が当業者に自明であろう、この種の変更および拡張も、ここに開示され、請 求範囲に示された本発明の精神および範囲に包含される。 本発明の種々の観点も以下の請求の範囲に開示される。 国際調査報告 ＰＣＴ／Ｕ３８７１０１９６６ Ａ＝ａＣｈＯｅｒ＋ｅ　！＋Ｏｒｏｒ：ｌ　？Ｃτ／ＺＳＡ１０１９６６　Ｐａ ｒ：　Ｖ工。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ１５〜１ ００塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドである第１プローブを含む固形支持体であ って、固形支持体の一部である第１プローブの実質的部分がもっぱら支持体に末 端結合しているもの、および （ｂ）被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な配列をもつ一重鎖オリゴ ヌクレオチドでありかつ検出のために標識されている第２プローブであって、た だし第２プローブの配列は第１プローブの配列に対し非相補的であり、第２セグ メントが第１セグメントと重複しないものを用いて試料中の一重鎖核酸系按分所 体を検出する方法であって、（１）上記固形支持体をプレハイブリダイゼーショ ン条件下で、（ｉ）非相同核酸もしくは（ｉｉ）約５〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度 の硫酸デキストラン、または（ｉ）および（ｉｉ）の両者からなるプレハイブリ ダイゼーション液と共にインキュベートし；（２）工程（１）に従ってプレハイ ブリダイズされた固形支持体をハイブリダイゼーション条件下で、約５〜２０％ （ｗ／ｖ）の硫酸デキストラン；アッセイされる試料からの核酸（試料中に存在 する場合には被分析体を含む）；およびハイブリダイゼーション液中の被分析体 の量に対し過剰モルの第２プローブからなるハイブリダイゼーション液と共にイ ンキュベートし；（３）工程（２）の後に固形支持体を洗浄して、これから被分 析体に安定にハイブリダイズしていない第２プローブを除去し；そして （４）工程（３）の後に、被分析体にハイブリダイズした第２プローブ上の検出 可能な標識に起因する信号が固形支持体に付随するか否かを測定する ことよりなる方法。 ２．第１プローブがそれに結合している固形支持体が（Ａ）ケイ素原子において （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたケ イ素原子は実質的に無く、式中のＣは０〜５であり、ｎは２〜８であり、Ｒ１は メチルまたはベンジルであり、−Ｏ−（オリゴ）はオリゴヌクレオチド型プロー ブであり、（オリゴ）に結合した酸素原子はプローブの５′−ヌクレオシドの５ ′−酸素原子または３′−ヌクレオシドの３′−酸素原子である）；もしくは（ ２）次式の基 −Ｌ１−ＣＯ２Ｈおよび （ｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）， もしくは （ｉｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２ ）−Ｏ（オリゴ）（式中の−Ｌ１−は−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２ ）ｍ−であり、ここで基−（ＣＨ２）ｎはケイ素原子に結合しており；ｍ，ｎ， ｐおよびｒは同一かまたは異なりそれぞれ２〜８である）；もしくは（３）次式 の基 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼； により誘導体にされた多孔質ケイ酸塩ガラス；または（Ｂ）誘導体にされていな い水酸基をもつ隣接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある 水酸基の酸素原子において、 （１）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２） Ｏ−（オリゴ） （アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子は実質的にな い）、もしくは （２）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）、もしくは （３）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈおよび（ｉ）Ｌ２−Ｎ，Ｈ（ＰＯ２） Ｏ−（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ２−ＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２）Ｏ− （オリゴ）（式中のｃ，ｑ，ｐおよびｒは同一かまたは異なり、ｑは２〜１０で あり、Ｌ２は −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここ で−Ｃ（＝ＮＨ）基はデキストランの水酸基の酸素原子に結合している）；もし くは （４）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＨおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ Ｓ（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）により誘導体にされた架橋デキスト ラン系マクロ孔質材料；ならびに （Ｃ）ジビニルベンゼンなどの架橋剤により架橋されていてもよく、かつフェニ ル基において （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈおよび （ｉ）Ｌ２−ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ３−ＳＳ（Ｃ Ｈ２）ｎＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（式中のＬ３は−（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ） （ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここで（ＣＨ２）ｓ基はポリスチレンのフェニ ル基に結合しており、ｓ，ｐおよびｎは同一かまたは異なり、ｓは２〜１０であ る）；もしくは（２）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ １および −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたフェニル基は無い）；もしく は （３）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＨ，および−（ＣＨ２）ｓ（Ｃ Ｏ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）ｎＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）によ り誘導体にされたポリスチレン から選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．第１プローブは５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形支持体に 結合し、第１プローブがそれに結合している固形支持体は （Ａ）直径約１００〜２００ミクロンおよび細孔直径約４００〜６００オングス トロームのビーズ状であり、ケイ素原子において次式の基 −（ＣＨ２）ａ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−（ＣＨ２）ａ（Ｎ Ｈ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた ケイ素原子は実質的に無く、式中のａは３または６であり、ｂは０．１または２ である）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキスト ランをＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することにより調製され、 湿潤直径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１０ ６〜約１０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ隣 接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子 において次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−Ｃ（ ＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリ ゴ）または−（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により 誘電体にされ、アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子 は実質的に無いマクロ孔質材料から選ばれる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．第１プローブは５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形支持体に 結合し、第１プローブがそれに結合している固形支持体は （Ａ）直径約１００〜約２００ミクロンおよび細孔直径約４００〜６００オング ストロームのビーズ状であり、ケイ素原子において次式の基 −（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈおよび−（ＣＨ２）３ＮＨ（ ＣＯ）（ＣＨ２）２（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキストランを Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することにより調製され、湿潤直 径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１０６〜約 １０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ隣接炭素 原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子におい て次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２） ５（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により誘導体に されたマクロ孔質材料；ならびに（Ｃ）約６０〜５００メッシュの粒度であり、 ポリスチレンのフェニル基において次式の基 −（ＣＨ２）４ＣＯ２Ｈおよび −（ＣＨ２）４（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた０〜約１６％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ から選ばれる、請求の範囲第２項に記載の方法。 ５．第１プローブおよび第２プローブが２５〜５０塩基を有し、第２プローブが 放射性標識されている、請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。 ６．第２プローブ上の放射性標識が５′−ヌクレオシドの５′−炭素原子に結合 したホスフェート基の３２Ｐである、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．プレハイプリダイゼーション液およびハイブリダイゼーション液が双方とも 約８〜約１２％（ｗ／ｖ）硫酸デキストランを含む、請求の範囲第６項に記載の 方法。 ８．請求の範囲第１項に記載の工程（２）の前に、アッセイされる試料からの核 酸をハイブリダイゼーション条件下に、ハイブリダイゼーション液中の被分析体 の温度に対し過剰モルの第２プローブからなる第１ハイブリダイゼーション液中 で、存在する被分析体の実質的部分が第２プローブにハイブリダイズするまでイ ンキュベートし、次いで第１ハイブリダイゼーション液を請求の範囲第１項に記 載の工程（１）に従ってプレハイブリダイズされ、第２ハイブリダイゼーション 液に浸漬された固形支持体と混和することにより請求の範囲第１項に記載の工程 （２）を開始することよりなる、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．被分析体が第１プローブおよび第２プローブに対し相補的な配列をもつセグ メントを含むＨＩＶ−１ウィルスのゲノムまたはその断片である、請求の範囲第 ５項ないし第８項のいずれかに記載の方法。 １０．それに結合した１５〜１００塩基の一重鎖オリゴヌクレオチドプローブを 含み、 （Ａ）ケイ素原子において （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたケ イ素原子は実質的に無く、式中のＣは０〜５であり、ｎは２〜８であり、Ｒ１は メチルまたはベンジルであり、−〇−（オリゴ）はオリゴヌクレオチド型プロー ブであり、（オリゴ）に結合した酸素原子はプローブの５′−ヌクレオシドの５ ′−酸素原子または３′−ヌクレオシドの３′−酸素原子である）；もしくは（ ２）次式の基 −Ｌ１−ＣＯ２Ｈおよび （ｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）， もしくは （ｉｉ）−Ｌ１−（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２ ）Ｏ−（オリゴ）（式中の−Ｌｌ−は−（ＣＨ２）ｎ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２ ）ｍ−であり、ここで基−（ＣＨ２）ｎはケイ素原子に結合しており；ｍ，ｎ， ｐおよびｒは同一かまたは異なりそれぞれ２〜８である）；もしくは（３）次式 の基 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼； により誘導体にされた多孔質ケイ酸塩ガラス；または（Ｂ）誘導体にされていな い水酸基をもつ隣接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある 水酸基の酸素原子において、 （１）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ１および −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２） Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原 子は実質的に無い）、もしくは （２）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）、もしくは （３）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈおよび（ｉ）Ｌ２−ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ −（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ２−ＳＳ（ＣＨ２）ｒＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（ オリゴ）（式中のｃ，ｑ，ｐおよびｒは同一かまたは異なり、ｑは２〜１０であ り、Ｌ２は −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｑ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここ で−Ｃ（＝ＮＨ）基はデキストランの水酸基の酸素原子に信合している）；もし くは （４）次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＨおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ Ｓ（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ）により誘導体にされた架橋デキスト ラン系マクロ孔質材料；ならびに （Ｃ）ジビニルベンゼンなどの架橋剤により架橋されていてもよく、かつフェニ ル基において、 （１）次式の基 −（ＣＨ２）ｓＣＯ２Ｈおよび （ｉ）Ｌ３−ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ），もしくは（ｉｉ）Ｌ３−ＳＳ（Ｃ Ｈ２）ｎＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（式中のＬ３は−（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ） （ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ−であり、ここで（ＣＨ２）ｓ基はポリスチレンのフェニ ル基に結合しており、ｓ，ｐおよびｎは同一かまたは異なり、ｓは２〜１０であ る）；もしくは（２）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｃＲ １および −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐ（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされたフェニル基は無い）；もしく は （３）次式の基 −（ＣＨ２）ｓ（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＨ，および−（ＣＨ２）ｓ（Ｃ Ｏ）（ＮＨ）（ＣＨ２）ｐＳＳ（ＣＨ２）んＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により 誘導体にされたポリスチレン から選ばれる、固形支持体。 １１．オリゴヌクレオチドが５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形 支持体に結合し、支持体が（Ａ）直径約１００〜２００ミクロンおよび細孔直径 約４００〜６００オングストロームのビーズ状であり、ケイ素原子において次式 の基 −（ＣＨ２）ａ（ＮＨ）（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−（ＣＨ２）ａ（Ｎ Ｈ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた ケイ素原子は実質的に無く、式中のａは３または６であり、ｂは０，１または２ である）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキスト ランをＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド▽で架橋することにより調製され 、湿潤直径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１ ０６〜約１０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ 隣接炭素原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原 子において次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｂＣＨ３および−Ｃ（ ＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）ｐＮＨ（ＰＯ２）Ｏ（オリゴ ）（アミノ基を末端にもつ基により誘導体にされた水酸基の酸素原子は実質的に 無い）または次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ）により誘導体に されたマクロ孔質材料 から選ばれる、請求の範囲第１０項に記載の固形支持体。 １２．オリゴヌクレオチドが５′−ヌクレオシドの５′−酸素原子を介して固形 支持体に結合し、固形支持体はが（Ａ）直径約１００〜２００ミクロンおよび細 孔直径約４００〜６００オングストロームのビーズ状であり、ケイ素原子におい て次式の基 −（ＣＨ２）３ＮＨ（ＣＯ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈおよび−（ＣＨ２）３ＮＨ（ ＣＯ）（ＣＨ２）２（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた制御細孔ガラス；ならびに（Ｂ）アリルデキストランを Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドで架橋することにより調製され、湿潤直 径約３０〜約１２０ミクロンおよびデキストランに関する排除体積約１０６〜約 １０８ダルトンのビーズ状であり、誘導体にされていない水酸基をもつ隣接炭素 原子少なくとも１個を有する糖部分の炭素原子上にある水酸基の酸素原子におい て次式の基 −Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｈおよび−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２） ５（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６ＮＨ（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ） により誘導体にされたマクロ孔質材料；ならびに（Ｃ）約６０〜５００メッシュ の粒度であり、ポリスチレンのフェニル基において次式の基 −（ＣＨ２）４ＣＯ２Ｈおよび −（ＣＨ２）４（ＣＯ）（ＮＨ）（ＣＨ２）６（ＮＨ）（ＰＯ２）Ｏ−（オリゴ ）により誘導体にされた０〜約１６％ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンビーズ から選ばれる、請求の範囲第１０項に記載の固形支持体。 １３．オリゴヌクレオチドが２５〜５０塩基を有する、請求の範囲第１１項また は第１２項に記載の固形支持体。 １４．オリゴヌクレオチドがＨＩＶ−１のゲノムのセグメントの配列に対し相補 的な配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡである、請求の範囲第１３項に記載の固形 支持体。 １５．（Ａ）請求の範囲第１２項ないし第１６項のいずれかに記載の固形支持体 であって、（オリゴ）が被分析体の第１セグメントの配列に対し相補的な配列を 有するもの、および（Ｂ）被分析体の第２セグメントの配列に対し相補的な前列 を有する一重鎖オリゴヌクレオチドでありかつ検出のために標識されている第２ プローブからなり、ただし第２プローブの配列は第１プローブの配列に対し非相 補的であり、かつ第２セグメントは第１セグメントと重複しないものである、核 酸プローブサンドイッチアッセイ法において一重鎖核酸系被分析体を検出するた めのキット。 １６．【配列があります】および 上記のものに対し相補的な配列よりなる群から選ばれる配列を有し、ただしＲＮ Ａの場合には上記配列中のＴはウリジンを表わす、ＲＮＡまたはＤＮＡ。