JPH01500524A - ヘモグロビン高分子複合体、その調製方法及びその利用分野 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビン高分子複合体、その 調製方法及びその利用分野 本発明は、新しい高分子複合体、その調製方法ならびに、酸素伝導体として、特 に輸血作業の枠内におけるその利用分野に関するものである。

静脈注射の形で、ストロマの無い、血液と等張にさ・れたヘモグロビン水溶液を 注入することが可能であることはわかっている。

ところが、ヘモグロビンが示す欠点の１つは、そのサイズが小さいことを理由と して、それが血液循環路内にとどまらず、循環系の外に拡散するという点にある 。

この欠点を補正するため、つまり、血液の「代用品」又は酸素伝導体である充て ん溶質どしてのその用途の枠内で１６ヘモグロビンの血管内残存性を増大させる ため、いくつかの方法が用いられてきた。

例えば、毒性が無く、非抗原性で血液相容性のある水溶性高分子にヘモグロビン を固定させることが行なわれた。

こうして、水溶性のある重合体の化学的固定により変性されたヘモグロビンの数 多くの例から、有機体内のヘモグロビンの滞留時間を大幅に増大することが可能 であることがわかっている。

使用されたさまざまな重合体のうち、最も一般的なものは、多糖類とくにデキス トラン（フランス特許第２３２８．４７８号）、ヒドロキシエチルでんぷん（フ ランス特許第２３２８．４７８号）、イヌリン（ヨーロッパ特許出願明細書第４ ３．６７５号）そしてポリアルキ１／ンーグリコール、特にポリエチレングリコ ールである。

但し、いずれの場合であれ、こうしてこれらの重合体の直接的固定により変性さ れたヘモグロビンは、輸血での使用に適さない酸素保持特性を有している。

実際、血液代用品は、それが酸素と共に形成する化合物が可逆的、つまり酸素を 固定する能力をもつ（この場合ヘモグロビンは酸素化された形をしている）と同 時に酸素と容易に脱離できる（この場合ヘモグロビンは脱酸素化された形をして いる）かぎりにおいてのみ、生来の赤血球内ヘモグロビンが果たす役割と同等の 役割を果たすことができる、ということを喚起しておきたい。

酸素に対するこの特性は、ヘモグロビンがさらされている大気中に含まれている 酸素の部分圧に応じた、伝導体の質量単位が保留した酸素量の変化に相当する曲 線（バークロフト曲線と呼ばれる）により、特徴づけられる。

天然ヘモグロビンの水溶液（１リツトルあたり１５ルモルの濃度）の場合、この 変化は、２５℃、ｐＨ７，２で表わされた第１図上の基準線によって示されてい る。

この曲線に結びつけられたパラメータの１つは、ヘモグロビン水溶液が化合する ことのできる最大量の５０％に相当する酸素質量を吸収するように、これを付さ なくてはならない酸素の分圧である半飽和圧（Ｐｓｏ）である。ところが、上述 のような変性ヘモグロビン（重合体に複合されたヘモグロビン）の場合、一定の 酸素分圧の下でヘモグロビンに複合させられた酸素の割合を示す第１図の曲線（ 点線）は、天然ヘモグロビンに相当する曲線（実線）との関係において、左方へ の並行移動を受ける。

このことはすなわち、変性ヘモグロビンの圧力Ｐｓ。

が天然ヘモグロビンのものより低いことを意味している。換言するど、変性ヘモ グロビンは、酸素に対しあまりにも強い親和力を示し、このため酸素が洗い出さ れた組織へ急速に復帰されることができないという欠点がもたらされることにな る。

変性ヘモグロビンの酸素保持特性のこの改変は、特に以下の理由で説明のつくも のであるニー　天然ヘモグロビンは、赤血球内部において、デオキシヘモグロビ ンのアロステリック部位のアミンと結合して酸素に対するヘモグロビンの親和力 を低下させる赤血球内天然効果器であるジホスホー２．３−グリセリン酸塩（２ ，３ＤＰＧ）の影響を受けている。

この欠点を補正するための改良は、ジホスホ−２゜３−グリセリン耐塩又はヘキ サリン酸イノシトールのような一時的エフェクタ（又はリガンド、配位子）のあ る状態そして酸素が全く無い状態で、重合体とヘモグロビンの間の結合を行なう ことにより提示された。（フランス特許第８３１４５．４５号）これらのポリリ ン酸塩化された物質は、デオキシヘモグロビンの７０ステリック部位を著しく複 雑にしこのデオキシヘモグロビンを安定化させ、このような形で酸素の搬送プロ セスにとって重要なアミノ部位を保護する。

しかしながらこれらのエフェクタは、ヘモグロビンの重合体複合体の精製の段階 で、又は、血漿の解離条件を理由どして精製によってエフェクタの除去がひき起 こされなかった場合には血漿中で、除去される。

この欠点を補正するため、永久的なエフェクタに助けをめること、例えば、ビリ ドグサル−５′−リン酸塩を固定させること（日本公開特許第５９　１０４３２ ３号）が提案された。

また、ヘモグロビン上への固定の後、酸素に対するその親和力を著しく減少させ る複数のリン酸塩基を伴うリガンドを用いることも提案された。

しかしながら、これらの化合物がもつ欠点の１つは、これらを得るために、ヘモ グロビンに対し複数の作業、いずれの場合であれ２つ以上の作業を用いなくては ならず、そのため減成生成物、とくにメトヘモグロビンの形成が誘発されるとい う点にある。

また、ヨーロッパ特許出願明細書筒１４２　、１２５号において、一方ではリガ ンドと水溶性重合体の間の付加化合物、そして他方ではヘモグロビンから得られ 、ヘモグロビンとりガント重合体の付加化合物の結合がイオン結合であるような 、リガンド−重合体／ヘモグロビンイオン錯体も、提案されている。

これらの錯体は、酸素に対するヘモグロビンの親和力を減少させることができる 。

しかし、ヘモグロビンと、リガンド−重合体の付加化合物の間の純粋にイオンに よる結合は、ヘモグロビンが脱酸素化された形にある場合にのみ堅固なものであ る。すなわち、ヘモグロビンが再度醇素化されると、リガンド−重合体付加化合 物は、ヘモグロビンのリン酸結合部位から放出され、前記付加化合物とヘモグロ ビンの間にはもはや強いイオン相互作用はなくなることになる。

かかるイオン錯体を有機体（生物）内に注入すると、ヘモグロビンに強く特異的 に結合していないリガンド−重合体付加化合物は、特にその分子量が非常に大き いものでない場合に有機体から急速に退出し、ヘモグロビンが血管循環路から出 ると、期待することができる。

本発明の目的は、その血管外の拡散率が制限される（ひいては無くなる）ような サイズをもち、血漿の解離条件に対して保護され、その酸素保持特性が変わらず 遊離ヘモグロビンのものに対し改良され、その調製はヘモグロビンに対する反応 段階の数の制限されたものであるような、ヘモグロビンの高分子複合体を提案す ることにより、これらの欠点を補正することにある。

このような目的は、本発明に基づく新しい高分子複合体により達成される。

本発明の目的の１つは、生理学的に相容性があり、可逆的に酸素を固定させるこ とのできる新しい高分子複合体を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は５Ｍ離ヘモグロビンよりも容易に酸素を復帰させるこ とのできる新しい高分子複合体を提供することにある。

本発明はさらに、工業的規模で容易に合成できる新しい高分子複合体を提案する ことをその目的としている。

また、本発明のもう１つの目的は、ヘモグロビンが最高でも２つの段階、一般に は１段階しか受けないような方法を利用して得られるヘモグロビンの新しい高分 子複合体を提供することにある。

本発明の他の目的の１つは、血液の代用品、特に輸血又は器官の血管的持続注入 を必要とする手術において用いられることのできる新しいヘモグロビン高分子複 合体を含む新しい水溶液を提案することにある。

本発明はさらに、Ｍ＃ヘモグロビンに対して、試験官内でのＰｗの増加により暴 露されたその酸素保持特性が生体内で安定した状態にとどまるようなヘモグロビ ン溶液を提供することをその目的とする。

本発明のもう一つの目的は、酸素に対する穏やかな親和力と高い流体力学的体積 を同時に示し、輸血実験の間に血色素尿の抑制によるヘモグロビンの血管内残存 量の増大をひきおこすような新しいヘモグロビン高分子化合物を提案することに ある。

酸素に対して遊離ヘモグロビンのものより低い親和力を示す本発明に従った新し いヘモグロビン高分子複合体は、以下のような特徴をもつニ ー　前記高分子複合体は、以下のもので構成されていること； −可逆的に、脱酸素化された形から酸素化された形に移行しうるヘモグロビン。

Φ　極性ある基、できれば水酸基、カルボキシル基又はアミン基を含み、約１０ ００〜約５０万、できれば約１ｏｏｏ〜約１０万の分子量をもち、非毒性、でき れば非抗原性で、血液相容性があり水溶性をもつ重合体Ｐ。

−前記高分子複合体は、硫酸塩及び／又はリン酸塩及び／又はカルボン酸塩から 成る陰イオン基がもっている負（マイナス）の電荷を１つ以上含み重合体Ｐ上に 固定させられている部位Ｚを有すること。

−重合体Ｐは、以下のものを介してヘモグロビンに結合していること； ・　一方では、重合体が有する部位Ｚのうちの少なくとも１つとヘモグロビンの 間に形成された少なくとも１つのイオン結合を介して、 ・　他方では、重合体とヘモグロビン又は、重合体が有スる部位ＺＯ）１つとヘ モグロビンの間に形成された少なくとも１つの共塙結合を介して、−重合体どヘ モグロビンの間の共有複合数は、高分子複合体が、約７００００〜約１００万、 できれば約７００００〜約５０万の平均分子量を有するようなものであること。

−負の電荷１部位数及び単量体数の間の関係が以下のようなものであること： ・　各部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基を含む場合、重合体 の単量体１０個毎に少なくとも１つの部位がある。

・　部位のうちの少なくとも１つが、硫酸塩及び／又はリン酸塩から成る少なく とも２つの陰イオン基を含んでいる場合、重合体に対し少なくとも１つの部位が ある。

・　各部位がカルボン酸塩からの負の電荷を含んでいる場合、同一の部位Ｚ　Ｊ 二には少なくとも２つのカルボキシル（カルボン酸塩）基が、又単量体５つ毎に １つ以上の部位Ｚがなくてはならない。

−部位のうち少なくとも１つが、カルボン酸塩からの３つ以上の負の電荷を含ん でいる場合、その重合体に対し少なくとも１つの部位がある。

本発明に基づく高分子複合体が水溶性をもち、毒性が無く、できれば非抗原性で 血液相容性をもつものとなるのに必要な条件は、上記高分子複合体の構成に入る 可能性のある重合体Ｐが水溶性をもち、毒性が無く、できれば非抗原性で、血液 相容性のあるものであること、であることがわかった。

さらに、永久エフェクタの役割を果たす陰イオン基の担体である部位Ｚが重合体 鎖上に存在することにより、溶液状態のヘモグロビンの５０％が酸素化される分 圧が増大されることになるが、その原因が、場合によって遊離リガンドが存在す ることにあるとはいえない、ということも確認された。

これらの永久エフェクタは、脱酸素化された形でのヘモグロビン分子の配座のよ り強い安定化と共に、ヘモグロビンを脱酸素化された形から酸素化された形に可 逆的に移行させるのを可能にし、こうして酸素に対するヘモグロビンの親和力の 低減をひきおこすようなものである。

換言すると、これらのエフェクタにより、ヘモグロビンは酸素を可逆的に搬送し 、特に洗い出されている組織内で酸素を容易に塩析することができる。

共有結合は、本発明による高分子複合体に対し、それが、酸素保持機能を果たさ なくてはならない時間すなわち２〜３日の間、血漿媒質中で全く又はほとんど生 物分解できないようにする安定性を与え、こうして、ヘモグロビンの腎臓外及び 血管外への拡散を排除するようなものである。

本発明に従った高分子複合体において、ヘモグロビンは、少なくとも１つの共有 結合により、ただし、特にヘモグロビンの物性を損なう分子間細網化現象がある 場合の重合体とヘモグロビンの間の共有結合の臨界的数を超えて、重合体に結び つけられている。

この共有結合臨界数は、本発明に従った高分子複合体の平均分子量が約１００万 を超えてはならない、という事実に一致する。

負の荷電密度の分布は、ヘモグロビンのアロステリック部位、つまり天然赤血球 内エフェクタ、ジホスホー２，３グリセリン酸塩の部位のアミンとのイオン結合 を形成できるのに充分なものでなくてはならない。

統計的に言って、単量体１０個あたり１つの硫酸塩又はリン酸塩基が必要かつ充 分であることがわかっているが、この比率は１／ｌ　０以上であってもよい。

又１部位のうち少なくとも１つが、リン酸塩及び／又はＴ＆酸塩イオンから成る 少なくとも２つの陰イオン基を含む場合、全ての重合体鎖について単一の部位で 充分であるが、だからといって、その鎖上に複数の部位をもつ可能性が排除され るわけではない。

カルボン酸塩の場合の負の荷電密度に関しては、同一部位上には少なくとも２つ のカルボン酸塩イオンがなくてはならず、単量体５つ毎に、２つのカルボン酸塩 イオンを含む１つの部位が必要である。

少なくとも３つのカルボン酸塩イオンがある場合、その部位の荷電に度は、単量 体頻に対し１つの部位で充分であるようなものであるが、だからといって、その 鎖上に複数の部位をもつ可能性が排除されるわけではない。

血漿媒質内で減成する本発明に従った高分子複合体の構成中に入る重合体は、約 １０００〜約５０万の平均分子量を有する。

本発明に従った高分子複合体の構成に入り有機体内で減成しない重合体は、約１ ００００以下の分子量をもたなくてはならない、これは、この信置りになると、 重合体は腎臓関門を通過しにくくなり、従って有機体の中で蓄積するからである 。

生物分解しないため約１ｏｏｏｏ以下の平均分子量を示さなくてはならないポリ アルキレングリコール、ポリビニルピロリジン、ポリメチルアクリレート又は成 る種の多糖類の場合がそれである。

本発明に従った高分子複合体の構成中に入る重合体は、それができれば非抗原性 であることが望まれる分子量レンジ内で用いられなくてはならない。

従ってデキストランの場合、その分子量は約７万未満でなくてはならない。

本発明の有利な実施態様に従うと、ヘモグロビンの内部Ｃｏ〇−基とＮＨ，＋基 の間の塩橋は、ヘモグロビンが脱酸素化された形にある場合、無傷のままである 。

塩橋というのは、ヘモグロビンが脱酸素化された形にあるとき、ＮＨ３“イオン と陰イオンＣＯＯ−の間に形成される成る種の分子間結合のことである。

本発明に従った高分子複合体における塩橋はできれば無傷であるべきである。と いうのも、これらの塩橋の形成に参加するイオンがその他の結合に組入れられて いる場合、酸素化された形から脱酸素化された形へのヘモグロビンの移行は、き わめて困難かつ不完全な形で起こるからである。

「無傷の塩橋」というのは、少なくとも５０％の塩橋が変化せず、塩橋の８０％ 〜９０％ひいてはｌｏ。

％が変化していないことが有利であることを意味している。

塩橋が無傷であるか否かを確認するための基準は、特に以下のようなものである ： ａ）　酸素に対する親和力曲線； 酸素に対する親和力曲線（パークロフト曲線）が、ＭＭヘモグロビンの曲線との 関係において右方へ移動させられた場合、このことは、塩橋が改変されていない ことを暗に意味している。

ｂ）　ヒル係数（ｎ）； このパラメータは、パークロフト曲線のシグモイド速度を表わし、多少の羨こそ あれ協調性のある酸素の固定特性を反映する。ｎの値は、ヘモグロビンのアロス テリック（分子変容）挙動の永続性を評価することを可能にする。天然ヘモグロ ビンの場合、この係数は２．７と３．０の間である。

Ｃ）　ボーア効果； これは、異なるＰＨにおけるヘモグロビンの酸素保持挙動を見極め、さまざまな 操作に統〈混乱を評価できるようにすることから成る。

もう一つの実施態様に従うと、本発明による高分子複合体は、多糖体、とくに、 アルキル基が２〜４個の炭素原子をもつヒドロキシアルキルでんぷん、イヌリン 、デキストラン及びその誘導体、特にアミノデキストラン、ポリビニルアルコー ル、ポリメタクリル酸塩及びその誘導体、ポリペプチド、アルケン基が２〜５個 の炭素原子を含むポリアルケングリコール、とくにポリエチレングリコール及び ポリプロピレングリコールの中から選ばれる。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、２は、０５０３　Ｈから生じている。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、Ｚは、ビリドキサル硫酸塩、エピネフリ ン２′Ｆ＆酸塩、エピネフリン３硫酸塩、ノルエピネフリン２硫酸塩、ノルエピ ネフリン３硫酸塩、フェノールフタレイン２硫酸塩に由来する。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、ＺはＯＰＯ，Ｈ２から生じている。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、Ｚは、ビリドキサルリン酸塩、アデノシ ン３−リン酸塩、ホスホタイロシン、ホスホセリン、イノシトールヘキサリン酸 塩及びその誘導体、ノノシトール３−、４−、５−リン酸塩及びその誘導体から 生じている。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、Ｚは０−ＣＨ（ＣＯＯＨ）　２　、Ｃｏ ｏ）（。

−ＣＨ ＣＨ２ ＣＯＯＨ から生じる。なおｎは、１から４の値である。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、Ｚは、主鎖に約２〜１０個の炭素原子を 含むポリカルボン酸、少なくとも２つのカルボキシル官能基を含むベンゼンカル ボン酸、ジホスホ２．３−グリセリン酸塩、クエン酸、プロパン１，２．３）リ カルポキシル酸塩又はブタン、トリカルボン酸塩から生じている。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、Ｚは、以下の公式のヒドロキシ−２−ホ ルミル−５−ホスホセリンベンズアミド： ＣＨ２０Ｐ０３　Ｈ２ 又は以下の公式のホルミル−４−ホスホセリンベンズアミド： ＨＯ ＣＨ２０ＰＯ３Ｈ２ から生じている。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、部位２には少なくとも３つの、次のよう な官能基があるニー　官能基の１つは、重合体上にＺ基を固定させることを可能 にする官能基である。

−官能基の１つは、ヘモグロビンのアロステリック部位のアミンとイオン結合を 形成することができる硫酸塩、リン酸塩又はカルボン酸塩の官能基である。

−官能基の１つは、ヘモグロビンのＮＨ２基と共有結合を形成することのできる アルデヒド、カルボキシル又はＯＨ官能基である。

Ｚを重合体に結びつける結合の性質は、存在する反応要素及び反応条件によって 異なる。

Ｚを重合体に統合している結合は、エーテル、エステル、アミド又はアミン結合 である。

例を挙げると、エステル結合は、重合体に対するＨ２ＳＯ４又はＨ３ＰＯ４の作 用（固定の後Ｈ２ＳＯ４は一０ＳＯ３Ｈ部位を与え、Ｈ３Ｐ０ａは一０Ｐ０３Ｈ ２を与える）により得られる：エーテル結合は、重合体のＯＨ基に対する塩化コ ／＼り酸の作用又はアクリル酸の基グラフト（ラジカル付加反応）により得られ 、アミド結合は、重合体のＮＨ２基とＺ基のカルボキシル（カルボン酸塩）基の 間の反応により得られる；アミン結合は、重合体のＮＨ２基とＺ基のアルデヒド 基の間の反応とそれに続く還元により得られる。この最後の反応は最初の反応と 同時に行なうこともできる（すなわち、還元アミノ化によって行うことができる 。）。

重合体どヘモグロビンの間の共有結合は、重合体又は部位Ｚ」二にあるカルボキ シル、アルデヒド又は水酸基とヘモグロビンのＮＨ２基の間に形成される。

重合体どヘモグロビンの間の結合は、アミド、イミン、アミン又はカルバミンｍ 塩の結合である。

本発明の１実施態様によると、共有結合は直接、重合体のアルデヒド基、カルボ キシル基又は水酸基とヘモグロビンのＮＨ２基の間に形成される。

本発明のもう一つの実施態様に従うと、共有結合は、重合体上に固定されたＺ基 のアルデヒド、カルボキシル又は水酸各基と、ヘモグロビンのＮＨ２基の間に形 成される。

本発明の特に有利な実施態様に従うと、共有結合は、ヘモグロビンのＮＨ２基と カルボキシル基の間に形成される。

本発明に従ったヘモグロビン高分子複合体は、１０モルのグルコビラノーゼに対 し約５．４モルのＯＳＯ，Ｈ基を含んでいることが望ましい、できれば約４万の 平均分子量のデキストランで重合体が構成されており、ヘモグロビンと重合体の 間の共有結合が、好ましくは１００単位のグルコシドに対し約１８のアルデヒド 基の割合でデキストラン上に予め形成されたアルデヒド基とヘモグロビンのＮＨ ２基の間の結合の結果であるような、高分子複合体である。

本発明に従ったヘモグロビン高分子複合体は、１０単位のグルコピラノーゼに対 し約９．８モルの０３０３Ｈ基を含み、好ましくは、約１００００の平均分子量 をもつデキストランで重合体が構成されており、重合体とヘモグロビンの間の共 有結合は、好ましくは、グルコシド１００単位に対しアルデヒド基約１４の割合 でデキストラン上に予め形成されたアルデヒド基とヘモグロビンのＮＨ２基の間 の結合の結果であるような、高分子複合体である。

本発明に従ったもう一つのヘモグロビン高分子複合体は、重合体が、好ましくは 、グルコピラノー上１０単位に対し約１．７の硫酸塩イオンを含み平均分子量が 約６０００のデキストランから成り、重合体とヘモグロビンの間の共有結合は、 好ましくは、グルコシド１００単位に対し約１８のアルデヒド基の割合でデキス トラン上に予じめ形成されたアルデヒド基とヘモグロビンのＮＨ２基の間の結合 の結果であるような高分子複合体である。

本発明に従ったもう一つのヘモグロビン高分子複合体は、重合体が１０モルのグ ルコピラノーゼに対し約１２モルのＯＰ　Ｏｓ　Ｈ２基を含み好ましくは、約４ ００００の平均分子量をもつデキストランにより構成されており、重合体とヘモ グロビンの間の共有結合が、好ましくは、グルコシド１００単位に対し約１８の アルデヒド基の割合でデキストラン上に予め形成されたアルデヒド基とヘモグロ ビンのＮＨ２基の間の結合の結果であるような、高分子複合体である。

本発明に基づくもう一つのヘモグロビン高分子複合体は、重合体が、できれば平 均分子量が約４００００でアミノデキストランにより構成されており、イオン結 合が重合体上に固定されたベンゼンヘキサカルボン酸のカルボキシル（カルボン 酸塩）基を介して実現され、共有結合は、上記イオン結合には関与しないヘキサ カルポン酸のカルボキシル（カルボン酸塩）基とヘモグロビンのＮＨ２基を介し て実現されているような、高分子複合体である。

本発明に従ったもう一つのヘモグロビン高分子複合体は、重合体が、単量体１つ につき平均約１本の２塩基性カルボン酸を含み、好ましくは、約４００００の平 均分子量をもつポリカルボキシルデキストランで構成されており、共有結合は、 ヘモグロビンとのイオン結合に関与しないカルボキシル基とヘモグロビンのＮＨ ２基を介して実現されているような、高分子複合体である。

本発明に従ったヘモグロビン高分子複合体を調製するためには、 −第１段階において、以下の方法で重合体上にＺ基を固定する： ☆　必要に応じて重合体をポリオールに変え次に既知の方法によりＺ基を固定す る方法。又は☆　Ｙをアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル、ハロ ゲン（例えば塩素）のような活性官能基又は活性化可能な官能基として、適切な 試薬を用いて化合物Ｚ−Ｙを使用する方法。又は☆　重合体Ｐに対してＺ基の放 射化学的グラフトを行なう方法。

−次に、第２段階において、約５〜９のｐ）Ｉの水性媒質中で、ヘモグロビンが 変性を受けないような条件下で、ヘモグロビンに対し、Ｚ基を含む重合体Ｐを反 応させ、重合体とヘモグロビンの間にイオン結合と共有結合を同時に形成させる 。

重合体にＺ基を固定させることから成る、本発明に従った高分子複合体の調製の 第一段階は、ポリオールの形での重合体Ｐの硫酸エステル化、リン酸エステル化 又はカルボキシメチル化などの既知の方法で行なわれ得る。重合体Ｐがポリオー ルでない場合、これを予めポリオールに変換する必要がある。

本発明に従った高分子複合体の調製の第１段階はまた、Ｙをアルデヒド、カルボ キシル、アミン、ヒドロキシル又はハロゲンの官能基として、Ｚ−Ｙタイプの化 合物を用いて行なうこともできる。これらのＺ−Ｙ化合物は、従来の化学的技法 を用いて利用可能である；例えば、５又は６カルポン酸、ジホスホロ−２，３グ リセリン酸、ピリドキサルー５′−リン酸塩、を予じめポリアミン化された重合 体上に固定することができる。

この場合、ゲルろ過カラムでの脱塩などにより、Ｚ−Ｙ化合物の全ての痕跡を除 去することが不可欠である。実際、たとえ低い濃度でも本発明の高分子複合体と 出会うと、この複合体の特性に関する結論を狂わせてしまう可能性のある、反応 しなかったＺ−Ｙ化合物の存在は、避けなくてはならない。

同様に、放射化学的グラフトのように重合体に対しポリアニオン鎖を固定できる その他のいかなる方法でも用いることができる。

上述の第２段階は、重合体とヘモグロビンの間の反応段階であり、必要とあらば 場合によって、重合体がヘモグロビンとの反応に付されないうちに重合体の活性 化段階が先に行なわれてもよい。しかし、実際には、この活性化は、重合体とヘ モグロビンの間ノ反応と同時であることができる。

第２段階の間、重合体はヘモグロビンと反応し、一方では重合体の部位２とヘモ グロビンの間のイオン結合、他方では重合体とヘモグロビンの間の共有結合が形 成される。

この第２段階において、 ☆　部位Ｚのカルボキシル官能基、アルデヒド官能基又は木酸官能基が関与して くるか或いは☆　重合体のカルボキシル官能基、アルデヒド官能基又は木酸官能 基が関与してくる。

ヘモグロビンのＮ　Ｈ２２＆と作用するのがカルボキシル基である場合、カルボ キシル基を活性化させるために、水溶性のあるカルボジイミド、特にＮ′−エチ ル−Ｎ−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミドの塩酸１　（ＥＤＣ Ｉ）、Ｎ−←ドロキシサクシンイミドあるいは、エトキシ−２−キノリン−１− カルボン酸エチル（ＥＥＤＱ）のような、従来ペプチド合成に用いられてきた試 薬を利用することができる。

このとき得られる結合は、アミド結合である。

ヘモグロビンのＮＨ２基と作用するのがアルデヒド基である場合、例えば、還元 アミノ化を利用することができる。

アルデヒドの還元アミノ化は、アミンの作用によりイミンを形成させ、Ｎ　ａ　 Ｂ　Ｈａ　、　Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ３、ジメチルアミノポラン又はＨＣＯＯＨ といった還元剤を用いて同時にイミンをアミンに還元することがら成る。

このとき得られる結合は、アミン結合である。

ヘモグロビンのＮＨ２基と作用するのがアルデヒド基である場合、得られる結合 がイミン結合であり、この結合が次に上述のものの１つのような穏やかな還元剤 による還元によってアミンに安定化されなくてはならないような条件の下で作業 を行なうこともできる。

Ｚ基も重合体Ｐもアルデヒドやカルボキシル基を含まず、隣接する炭素上にある ものをいくつか含む水酸基を包含している場合、例えば重合体Ｐの過ヨウ素耐酸 化により、特にＮ　ａ　Ｉ　０４を用いて、この重合体上にアルデヒド基を形成 することができる。

このとき、ヘモグロビンのアミンとこれらのアルデヒド基の間に得られた結合は 、イミン結合であり、これは、例えばＮａＢＨ，を用いて、還元によりアミンに 安定化されなくてはならない。

部位Ｚも重合体Ｐも、アルデヒド基やカルボキシル基を含まない場合、ＯＨ基を 含む重合体は、臭化シアン又はカルボニルジイミダゾールなどの適当な試薬を用 いてヘモグロビンのＮＨ２基に対し作用させることができる。この場合、得られ る結合は、カルバミン酸結合　−〇−Ｃ−ＮＨ−である。

重合体とヘモグロビンの共有結合がイミン結合であるヘモグロビン高分子複合体 は、有機体内で安定していない。そのため、例えばＮａＢＨ４。

ＮａＣＮＢＨ３又はジメチルアミノポランによる還元によってイミン官能基をア ミンで安定化させることが望ましい。

共有結合がイミン結合であるヘモグロビン高分子複合体は、特に試験管内で試薬 として用いることのできる新しい中間化合物である。

共有結合を安定化する必要がある場合、ヘモグロビンは、いずれにせよ、２段階 以上の反応を受けず、その他の場合には、重合体の活性化の有無に関わらず、ヘ モグロビンは唯一の反応段階しか受けない、ヘモグロビンに対する反応段階の数 を制限すること（最高２段階）は、反応効率の他に、ヘモグロビンが変性を受け ないために重要な条件の１つであることから、これはきわめて有利なことである 。

第２段階の間、実際、本発明に従った高分子複合体の形成中ヘモグロビンが、そ の酸素保持特性を少なくとも部分的に保持するため、それを構成するさまざまな 単位の相対的可動性の著しい減少も重大な変性も受けないようにすることが大切 である。

第２の反応段階は、ヘモグロビンを適切に保存できる温度で、充分な時間、でき ればそれ以上になるとメトヘモグロビンが著しく形成される（約５％以上）よう な時間より短い時間、酸素のない状態で、上記のような活性化因子が場合によっ て存在する状態で、約５〜９のｐＨで、緩衝化されている又はされていない水性 媒質内にて、行なわれる。

水性媒質は、ｐＨを望ましい値に安定化させるため、従来用いられている緩衝液 により緩衝化される。

反応時間は、約３０分から２０時間であり、約３℃から３０℃の温度で、約１時 間から８時間であることが望ましい。

反応時間は特に、作業を進める温度によって異なる。

使用されるヘモグロビンは、脱酸素化された形のもので、９％のヘモグロビン溶 液を使用すると有利である。

重合体とヘモグロビンの間のモル濃度比は、さらに、ヘモグロビン分子の大部分 がポリアニオン重合体と共有結合するようなものでなくてはならない。

１例を挙げると、約６．５のＰＨの水性媒質内で溶解した形で、約３〜３０’Ｃ の温度で、平均分子量が約１００００〜４００００のデキストラン重合体とヘモ グロビンの混合物（なお、この混合物中のデキストランとヘモグロビンの間のモ ル濃度比は約０．５〜２である）を反応させることにより、ゲル上の透過などに よるそのクロマトグラフィ検査から遊離ヘモグロビンが全く無くなってしまった ことがわかる、本発明に従った高分子複合体が得られる。

本発明に従った高分子複合体は、メトヘモグロビンの形成が全く又はほとんど無 く（約５％未満）容易に合成され、ヘモグロビンに対する反応の数がわずかしか 無くその変性が避けられる、という利点を有している。

また、本発明に従った高分子複合体は、試験管内実験においてＰＳｏの増加をひ きおこすが生体内試験中腎臓外又は血管外の拡散により容易に除去でき、その効 果が急速に打ち消されるような、結合していない分子量の小さいエフェクタを内 含していない。

本発明の高分子複合体は、酸素に対し中庸な親和力しかもたず、高い波体力学的 体積を有しているため輸面作業中血色素尿の抑制によるヘモグロビンの血管内残 存性を増大するという利点を有する。

本発明に従って調製されたポリアニオン重合体に不可逆的に結合されたヘモグロ ビン複合体は、適当な組成の水溶液中に溶解されたとき、特に輸血又は器官の持 続注入を必要とする手術において、血液の代用品の役割を果たすことができる。

従って、本発明は同様に、上述の複合体を内含する水溶液、とくに、例えばタイ ロード氏液（その組成は、ＮａＣＱ８ｇ／ｌ：ＫＣＱｏ、２ｇ／ｌ：ＣａＣ文２ ０．２ｇ／文、ＭｇＣ文２０−Ｌｇ／文：Ｎ　ａＨ２ＰＯａ　０　、０５　ｇ／ 文；　ＮａＨＣＯ３１ｇ／Ｕ　；　Ｄ　、　クルコース１　ｇ／ｕ）に対する長 時間の透析及び、ヘモグロビンについて約７％の濃度を得るに到るまでの限外ろ 過によるａＩｌｉｉにより血液の等張液となった溶液をも、その目的としている 。

本発明に従って得られたヘモグロビン高分子複合体の調合物は、潜在的酸素伝導 体として検査された。そして、それらが実際に酸素を不可逆的に固定できること 、とくに、以下に解説されている第５図上に示され以下の例１、例３及び例５に 記されている生成物の酸素親和力曲線が図示しているように、＊離ヘモグロビン よりも容易に酸素を修復させることができることが実証された。実際、これらの 調合物の特徴は、同一条件（ＮａＣＪＩ　０．０５Ｍ、ＰＨ７，２５℃）におｌ 、％テ天然ヘモグロビンについて約４８０Ｐａである半飽和（Ｐｓｏ）圧力がき わめて高いこと（９００〜５０００Ｐａ）にある。

このように、これらの化合物は１局所貧血を起こした組織に対して大量の酸素を 供給するために用いられうる。同様に、これらの化合物は、佐薬（賦形剤）の有 無に関わらず、血液の等張液にされた水溶液の形で、輸血に用いられ患者に投与 することもできる。かかる化合物は、また、凍結保護剤を加えた又は加えない状 態で真空凍結乾燥法を施すか又は微粒子化させ。

使用前に可解することもできる。

本発明は、制限的な意味をもたずに以下に与えられている例を用いれば、より良 く理解されるであろう。

性」：ヘモグロビンとＷＬ酸デキストラン（デキストラン分子量：４００００） の共有結合体の合成：Ｃ，Ｒ，ＲｒＣＫＥＴＴＳ、生化学ジャーナル、１９５２ 年。

５１．１２９内に示されているように、その平均分りｐｐｓａ　Ｉａ　、スエー デン）から、Ｔ＆興を８％含むデキストラン硫酸ナトリウム（１０モルのグルコ ピラノーゼに対して約５，４モルの硫酸塩イオン）を調製する。

このデキストラン硫酸塩の活性化は、　Ｅ、　ＤＥＩ、［、ＡＣＨＥＲＩＥ他著 、生化学、生物理学Ａｃｔδ、１９８３年。

７４９．１０６に示されているように、過ヨウ素酸酸化により行なわれる。使用 されるＮ　ａ　Ｉ　Ｏ４の量は。

デキストラン・ジアルデヒドのｒｉＭ　堪が１００ｆ１位のグルコビラノーゼに 対し約１８のアルデヒド基を含んでいるようなものである。

この化合物を、水に対して長時間透析し１次に凍結乾燥し、真空下で低温に保持 する。

このデキストラン参ジアルデヒドの硫１１１１ｉ１０ｇを２０％のＮａ０文溶液 １０〇−中に溶かし、この溶液と、グローブボックス内で鋭敏素化し真空下に置 き１次に窒素の！１４気を行ない、この作業を三度くり返す、同じ方法で脱酸素 化された９％のヘモグロビン溶液を１２０４加え、鋭敏素化された０、ＩＮのナ トリウムの付加により、得られた混合物のｐ）ｌを７．５に調整する。

撹拌することなく溶液を２０℃に維持し、６時間反応を続ける。

それから、ｉｏ’Ｎ　ＮａＯＨ５−中に、２００ｍｇのＮａＢＨ４でその場で調 合された溶液３．５ｄを加える。１時間この反応を続け１次に、過剰な還元剤を 分解するためのｐＨを７にまで低下させる。

ＴＳ　Ｋ、ＳＷ３０００　Ｂｅｃｋｗａｎタイプのカラムを用いたゲルろ適法で 得られたクロマトグラムを検討すると、（排除ゾーン３０００００ダルトン）、 結合していないヘモグロビンはきわめて少ないことがわかる。溶離体積に対応す る光学密度の変化が示されている第２図を参照することができる。これによると 、結合していないヘモグロビンに相当するピークの振幅はきわめて小ざい。

本発明によるこの結合体の酸素に対する親和力曲四は、第５図に示されており１ 点線を用いて酸素に対するＭ＃ヘモグロビンの親和力曲呻が表されている。

Ｐｓｏは８５０Ｐａ（２５℃、ＮａＣ，ｌ　０．０５Ｍ、ｐｉ（７）である。

メトヘモグロビンの割合は５％である。この比率は、　ＥＶＥＬＹＮ　Ｋ、　Ａ 及びＨＡＬＬＯＹ、　Ｉｌ、　Ｔ共著ｃ７）Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｓ、、１９３８年、１２６，６５５内に示されているようにして測定され た。

医工：ヘモグロビンとデキストラン硫ｍ塩の共有複合体の合成、゛ （デキストランの分子量＝ｌＯＯＯＯ）り　本発明に従った上記結合体のｙ４Ｖ ：グルコシド１００単位に対し１４のアルデヒド基と１２％の硫ｆｔ（つまりグ ルコピラノーゼｌＯ単位に対し９．８の硫酸塩イオン）を含み１分子量１０００ ０のデキストランから１例１に記載の方法に従って調製されたデ午ストランージ アルデヒド硫酸ナトリウムとデオキシヘモグロビンの反応を実施する。

酸素が全く無い状態で２５℃で７時間、デキストランジアルデヒド硫酸ｔＪｉｌ ｏｇと９％のデオキシヘモグロビン溶液１２０−（例１に記されている反応に対 する条件と同じ条件）を反２させる。ヘモグロビンは全て重合体に結合され、結 合体（７）　Ｐ　ｓｏは、１０６０Ｐａ　（２５℃、ＮａＣＭＯ，０５Ｍ、ｐＨ ７）である。

２）　デキストラン硫酸塩とヘモグロビンの混合物と、１）において調製された デキストランｆｔ酸塩とヘモグロビンの本発明に従った共有結合体の比較。

立体排除クロマトグラフィにより、デキストラン硫酸塩（非常に優れたヘモグロ ビンの高分子エフェクタであり、従ってデオキシヘモグロビンと非常に強く結合 する）と酸素化されたヘモグロビンの混合物が、クロマトグラフィのカラムの出 口において、それぞれ遊離ヘモグロビンとＭＭデキストラン硫酸塩に相当する２ つの別々のピークに導くことが確認された。

第６図には、デキストラン硫酸塩とヘモグロビンの混合物の注入の結果書られる 、溶離体積（横座標）に対応する屈折率（縦座標）の変化が表わされている。得 られた曲線は、実線で表わされ、これには、Ｍ＃ヘモグロビンに相当する第１の もの（約６０．ｔの溶離体積）と遊離デキストラン硫酸塩に相当する第２のもの （約９０−の溶離体積）の２つのピークがある。

Ｓ６図には又、点線にて、その合成が上記ｌ）に示されている本発明に従ったデ キストランｆｔ酸塩とヘモグロビンの共有結合体の注入に相当する曲線が、示さ れている。

この曲線には、それぞれＭ離ヘモグロビンのもの及び遊離デキストラン硫酸塩の ものよりも大きい分子量に相当する単一の溶離ピークしか含まれていない（その 相応する横座標は、排除容量である）。

これら２木の曲線を得ることができるような分離は、以下の条件下Ｔ５５ｃｍの Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　Ａ　ｃ　Ａ　５４ＩＢＦのカラム（排除ゾーン９００００） で行なわれた：緩衝液トリス０．０５Ｍ：ＮａＣ文０．１５Ｍ。

ｐ）１７　、２　、流量３０−７時）。

こうして、次のような状況が得られるようヘモグロビン上に重合体−リガントを 不可逆的に固定することが必要であるという結論が得られる： ａ）　重合体のエフェクタ基は、ヘモグロビンがその酸素を遊離させると直ちに このヘモグロビンに対するモジュレータとしての自らの役割が果たせるように、 ヘモグロビンの近くにつねにとどまっている。

ｂ）　重合体とヘモグロビンは互いに対し結合した状態にとどまりながら、導管 回路内に保持されうる。

また、こうして共有結合の形で固定されたヘモグロビンの０２に対する親和力が Ｍ離ヘモグロビンのものに比べ増加していないことも認められ、さらに成る種の 場合においては−特に、エフェクタ重合体として、デキストランのポリカルボン 酸塩（デキストランベンゼンへキサカルボン酸塩、ポリアクリル酸塩デキストラ ン）を用いる場合−重合体との結合後のヘモグロビンのＰｓｏは、共宥結合前の 同じ重合体が存在する状態での遊離ヘモグロビンのＰｓｏよりも大きいものであ りうるということがわかった。

従ってこのことから、重合体が共有結合の形ですなわち不可逆的にヘモグロビン 分子上に固定される本発明に従った複合体は、固定化された後のヘモグロビンが より優れた機能的活性を呈するようなものであるということができる。これは、 化学反応の間、ヘモグロビンは、脱酸素化された形をしており、この形において 、成る種の化学的官能基は隠され、こうして結合により影響を受けなくてすむよ うになるからである。

医】：デキストラン硫酸塩とヘモグロビンの共有結合体の合成（デキストランの 分子量＝６０００）グルコシド１００単位に対し１８のアルデヒド基と３％の硫 黄（つまりグルコピラノーゼｌＯ単位に対し１．７の硫酸塩イオン）を含む分子 量６０００のデキストランから例１に記載の方法に従って調製されたデキストラ ン・ジアルデヒド硫酸ナトリウムとデオキシヘモグロビンを反応させる。６時間 、２５℃で、酸素が全く無い状態でデキストランφジアルデヒド硫酸塩１０ｇと ９％のデオキシヘモグロビン溶液１２０．Ｊを反応させる（例１に記載の反応と 同じ条件）。全てのヘモグロビンは重合体に結合され、複合体のＰｓＯは６０２ Ｐａ　（２５℃、ＮａＣｌ　０．０５Ｍ、ｐＨ７）である。

１：ヘモグロビン共有結合体とデキストランリン酸塩の合成。

（デキストランの分子量＝４０，０００）Ｇ、　ＤＡＵＬ他著Ｉｎｄｕｓｔｒｉ ａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ（インダストリ アル・アンド争エンジニアリング・ケミストリー）、１９５４年、４６．１０４ ２内に示されているように分子量４００００のデキストランから、１２％のリン を含むデキストランリン酸ナトリウム（すなわち、１０モルのグルコピラノーゼ に対して約１２モルのリン酸イオンを含む）を調製する。

グルコシド１００単位に対し約１８のアルデヒド基を形成するよう、例１に記さ れているように、過ヨウ素酸酸化によってこのデキストランリン酸塩の活性化を 実現する。

例１に記されているものと全く同じ割合及び条件で、このデキストランジアルデ ヒド・リン耐塩をデオキシヘモグロビンと反応させる。６時間の反応、そしてそ れに統〈例１に記されているようなＮａＢＨ，による還元の後、全てのヘモグロ ビンが結合される。この結合体の酸素に対する親和力曲線は、第５図に示されて いる。

複合体（７）　Ｐ　ｓｏは、１２４０Ｐａ　（２５℃、ＮａＣｊｌ。

０　、０５Ｍ、　ｐｌ（７）である、メトヘモグロビンの比率は、約４％である 。

［：デキストランポリカルポン酸塩とヘモグロビンの共有結合体への合成（デキ ストランの分子量＝４００００）。

工え二重】１工 Ｐ、　）ＩｔｌＢＥＲＴ他著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ 、Ｓ、Ａ。

１９７８年、７５．３１４３に従って、エピクロルヒドリンで活性化されたデキ ストランに対するアンモニアの作用により、乾燥生成物ｔｇにつき５ＸｌＯ’モ ルのＮＨ，を含む（グルコビラノー上１００モルに対しＮＨ２８モル）アミノデ キストランを調製する。

このアミノデキストラン１ｇは水２０−内に溶かされ、Ｏ，ｌＮ　ＨＣｊｌでＰ Ｈは６，５にＡｇ１節される０次に１．７ｇのベンゼンヘキサカルボン酸を加え 、その後１ｇのＮ′−エチル−Ｎ−（３−ジメチル−７ミノプロビル）カルボジ イミド（ＥＤＣＩ）を加える・ｐＨを６．５に戻し１反応を３日間、２０℃で続 ける・０・５Ｍの酢酸ナトリウム溶液に対する透析の後、この混合物は、デキス トランのＭ検されていないアミン官能基を固定するため無水酢耐で処理される。

このとき、溶液はｐＨ７，２０，２Ｍのリン癩緩衝液を用いテＵＩｔｒｏｇｅｌ 　ＡＣＡ　２０２（ＩＢＦ−７ランス）カラムを用いた脱塩により１分子量の小 さい汚染物質を除き、精製される。

水に対する長時間の透析の後、ポリアニオン重合体を含む溶液を凍結乾燥する。

化合物は、真空下で低温にて保存する。

このデキストランポリカルボン酸塩０．５ｇを０．０５ＭのＮａＣ見水溶水溶液 ２５に溶かす。

０．１ＮのナトリウムでＰＨを６．５にもっていき１例１で記されているように 溶液を脱酸素化する。その後、同じ条件で脱酸素化された１０％のヘモグロビン 溶液１５−を加える。窒素掃気下でグローブボックス内に保持された混合物に対 し１次に６（１＋ｇのＥＤＣＩを加え、１０時間２０°Ｃで反応を続ける。　Ｕ ｌｔｒａｇｅｌＡＣＡ　３４　（ＩＢＦ−フランス）カラム上で得られたクロマ トグラムにはもはや！離ヘモグロビンが無いことを確かめる。

ここで、溶離体積に応じての光学に度の変化を示した第３図を参照することがで きる。この図によると。

結合されていないヘモグロビンに相当するピークの振幅は小さいものであること がわかる。複合体のＰｗは１３６０Ｐａ（２５℃、ＮａＣＪｌ　Ｏ，０５Ｍ、ｐ Ｈ７）である。

凱ｊ：ヘモグロビンとデキストラン・ポリカルボン酸塩の共有結合体の合成 （デキストランの分子量＝４００００）乳ｌ立工丑： 多＠類釦に沿って、その上で水性媒質内でアクリル酷のオリゴブー化が開始され る基を作り出すことにより、ポリアクリル醋オリゴマー鎖を含むデキストランの ポリカルボン酸塩を調製する。このデキストランのポリカルボン酸ナトリウムは 、水に対する長時間の透析により浄化され１次に凍結乾燥される。

平均グルコシド１単位あたり１つの２塩基性カルボン醇の環を含むこのデキスト ランのポリカルボン酸ナトリウムＩｇと、例５で記されているものと全く同じ条 件下でデオキシヘモグロビンと反応させる。

この反応は、４時間後に停止され、混合物は。

旧ｔｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ　３４　（ＩＢＦ−７ランス）カラム上でクロマトグラ フィにかけ、こうして１ｉ離ヘモグロビンが無くなってしまったことを確認する ことができる。ここで、溶離体積に対応する光学密度の変化を示した第４図を参 照することができる。この図によると、結合されていないヘモグロビンに相当す るピークの振幅は小さい。

この複合体の酸素に対する親和力曲線は、第５図に示されティる。Ｐ−は５５０ ０Ｐａ　（２５℃。

ＮａＣＪｌ　０．０５Ｍ、ｐＨ７）である。

に　嘩　″ 諸々の例において記されている異なるポリアニオン重合体を、以下の条件下で５ ＷＩＳＳ産マウスに注入した二重合体は、２．５ｇ／ｆＬ〜５ｇ／ｌの濃度で精 製水中に溶かされ、　ＰＨは７．４にＸＪ！４節される０次に各々の溶液０．５ ｄを５匹のマウスにｆｌｌ１Ｍ下に注入する。その後この５匹のマウスの挙動を ７日間にわたり観察する。これらの試験により、急性毒性の兆候は全くみられな かった。

Ｄ、０゜ ０．０゜ ＦＩＧ、３ Ｄ、０゜ ＦＩＧ、４ ＨｂＯ。

ＦＩＧ、６ 国際調査報告 １＋’ｍｖｍ＊ｍｌＡｍｌｊｍｍ、ＰＣＴ／ＦＲ８７１００２６２Ａｌｓ’！９ ミ＝ＸτＯＴ：ミ：ＥＩｒＥ：Ｉコ〉ゴＡτＩＣＮＡＬＳＥ二ＡＲＣ：ミＲＥ？ ＣＲＴＯＮＦＲ；Ａ−２５５１６６０１５１０３／８５　Ｎｏｎｅ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．遊離ヘモグロビンの親和力に比べて低い、酸素に対する親和力を呈し、それ が血漿中で酸素保持（平衡）機能を果たさなくてはならない時間中、生物分解を 全く又はほとんど起こさないヘモグロビンの水溶性高分子複合体であって、 前記高分子複合体が以下のもので構成されていること： ・可逆的に、脱酸素化された形から酸素化された形に移行しうるヘモグロビン ・極性のある基、好ましくは水酸基、カルボキシル基又はアミン基を含み、約１ ０００〜約５０万、好ましくは約１０００〜約１０万の分子量を有し、非毒性、 できれば非抗原性で、血液相容性があり、水溶性の重合体Ｐ、 −前記高分子複合体が、硫酸塩、及び／又はリン酸塩及び／又はカルボン酸塩の 基がもっているマイナスの電荷を１つ以上含み重合体Ｐ上に固定されている部位 Ｚを有すること、 −重合体Ｐが、以下のものを介してヘモグロビンに結びつけられていること： ・一方では、重合体が有する部位Ｚのうちの少なくとも１つとヘモグロビンの間 に形成された少なくとも１つのイオン結合を介して、 ・他方では、重合体とヘモグロビン又は、重合体が有する部位Ｚのうちの少なく とも１つとヘモグロビンの間に形成された少なくとも１つの共有結合を介して、 −重合体とヘモグロビンの間の共有結合数は、高分子複合体が、約７００００〜 約１００万、特に、約７００００〜約５０万の平均分子量を有するようなもので あること、 −マイナスの電荷、部位数及び単量体数の間の関係が以下のようなものであるこ と； ・各部位が硫酸塩又はリン酸塩から成る唯一の陰イオン基を含む場合、重合体の 単量体１０個毎に少なくとも１つの部位がある、 ・部位のうち少なくとも１つが、硫酸塩及び／又はリン酸塩から成る少なくとも ２つの陰イオン基を含んでいる場合、重合体に対し少なくとも１つの部位がある 、 ・各部位がカルボン酸塩からの負の電荷を含んでいる場合、同一の部位Ｚ上には 少なくとも２つのカルボキシル（カルボン酸塩）基が、又、単量体５つ毎に１つ 以上の部位Ｚがなくてはならない、 ・部位のうち少なくとも１つが、カルボン酸塩からの３つ以上の負の電荷を含ん でいる場合、その重合体に対し少なくとも１つの部位がある、ことを特徴とする ヘモグロビン高分子複合体。
2. ２．前記ヘモグロビンの内部ＣＯＯ−基とＮＨ３＋の間の塩橋は、ヘモグロビン が脱酸素化された形にあるとき、無傷のままであることを特徴とする請求の範囲 第１項記載の高分子複合体。
3. ３．前記重合体Ｐが多糖類、特にそのアルキル基が２〜４個の炭素原子を含むヒ ドロキシアルキルでんぶん、イヌリン、デキストラン及びその誘導体、特にアミ ノデキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメタクリ ル酸塩及びその誘導体、ポリペプチド、アルケン基が２個乃至５個の炭素原子を 含んでいるポリアルケングリコール、特にポリエチレングリコール及びポリプロ ピレングリコールの中から選ばれていることを特徴とする請求の範囲第１項に記 載の高分子複合体。
4. ４．前記重合体Ｐの平均分子量が、それがデキストランとその誘導体から成る場 合７万以下であり、それがポリアルケングリコール、ポリビニルピロリドン又は ポリメチルアクリル酸塩の中から選ばれている場合には１万以下であることを特 徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
5. ５．前記部位Ｚが、エステル、エーテル、アミド又はアミン官能基を介して重合 体に結合していることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
6. ６．前記部位Ｚが、ｎを１から４までの変数として、ＯＳＯ３Ｈ，ＯＰＯ３Ｈ２ ， Ｏ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２， −Ｏ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＯＯＨ，▲数式、化学式、表等があります ▼ からくるか又は、硫酸ピリドキサル、リン酸ピリドキサル、アデノシン三リン酸 、ホスホチロシン、ホスホセリン、イノシトールヘキサリン酸とその誘導体、主 連鎖上に２個乃至１０個の炭素原子を含むポリカルボン酸、カルボン官能基を３ つ以上含むベンゼンカルボン酸、２，３ジホスホグリセリン酸塩から生じている ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
7. ７．前記ヘモグロビンが、一方ではアルデヒド基、カルボキシル基又はＯＨ基、 そして他方ではヘモグロビンのＮＨ２基の間に形成された結合を介して、共有結 合の形で重合体に結びつけられていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載 の高分子複合体。
8. ８．前記重合体とヘモグロビンの間の共有結合が、重合体がもっているＯＨ基、 アルデヒド基又はカルボキシル基とヘモグロビンのＮＨ２基の間で直接形成され ているか、又は、重合体上に固定された部位Ｚからくるアルデヒド基、カルボキ シル基又は水酸基及びヘモグロビンのＮＨ２基から形成されていることを特徴と する請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
9. ９．前記部位Ｚには、以下のような官能基が３つ以上含まれていることを特徴と する請求の範囲第１項に記載の高分子複合体： −官能基のうちの１つは、重合体に部位Ｚを固定させることを可能にする官能基 である；−官能基のうちの１つは，ヘモグロビンのアロステリック部位のアミン とイオン結合を打ちたてることのできる硫酸塩、リン酸塩又はカルボン酸塩の官 能基である； −官能基うちの１つは、ヘモグロビンのＮＨ２基と共有結合を形成することので きるアルデヒド、カルボキシル又はＯＨ官能基である。
10. １０．前記重合体が、好ましくは、グリコピラノーゼ１０モルに対し約５．４モ ルのＯＳＯ３Ｈ基を含み、好ましくは、平均分子量が約４００００のデキストラ ンで構成されており、ヘモグロビンと重合体の間の共有結合は、できればグルコ シド１００単位に対し約１８のアルデヒド基の割合でデキストラン上に予め形成 されたアルデヒド基と、ヘモグロビンのＮＨ２基の間の結合の結果として得られ ていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
11. １１．前記重合体が、グルコピラノーゼ１０単位に対し約９．８モルのＯＳＯ３ Ｈ基を含み、好ましくは、約１００００の平均分子量をもつデキストランで構成 されており、重合体とヘモグロビンの間の共有結合は、できればグルコシド１０ ０単位に対し約１４のアルデヒド基の割合でデキストラン上に予め形成されたア ルデヒド基とヘモグロビンのＮＨ２基の間の結合の結果として得られることを特 徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
12. １２．前記重合体が、グルコピラノーゼ１０単位に対して約１．７のＯＳＯ３Ｈ 基硫酸塩イオンを含みできれば約６０００の平均分子量をもつデキストランで構 成されており、重合体とヘモグロビンの間の共有結合は、好ましくは、１００単 位に対して約１８のアルデヒド基の割合でデキストラン上の予め形成されたアル デヒド基の間の結合の結果として得られたものであることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の高分子複合体。
13. １３．前記重合体が、グルコピラノーゼ１０モルに対し約１２モルのＯＰＯ３Ｈ ２基を含み、好ましくは、約４００００の平均分子量をもつデキストランで構成 されており、重合体とヘモグロビンの間の共有結合は、好ましくは、グルコシド １００単位に対して約１８のアルデヒド基の割合でデキストラン上の予め形成さ れたアルデヒド基とヘモグロビンのＮＨ２基の間の結合の結果として得られてい ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
14. １４．前記重合体が、好ましくは、平均分子量約４万のアミノデキストランで構 成されており、イオン結合は、重合体上に定着させられたベンゼンヘキサカルボ ン酸のカルボキシル（カルボン酸塩）基を介して実現され、共有結合は、上記イ オン複合には関与しないヘキサカルボン酸のその他のカルボキシル基及びヘモグ ロビンのＮＨ２基を介して実現されていることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の高分子複合体。
15. １５．前記重合体が、一単量体につき１本程度の２塩基カルボン酸の鎖を含み、 好ましくは、約４００００の平均分子量をもつポリカルボキシルデキストランで 構成されており、共有結合は、ヘモグロビンとのイオン結合に関与していないカ ルボキシル基及びヘモグロビンのＮＨ２基を介して実現されていることを特徴と する請求の範囲第１項に記載の高分子複合体。
16. １６．以下のことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の高分子複合体の調製方 法： −第１段階において、重合体上に部位Ｚを以下の方法により固定させること： ・必要に応じて重合体Ｐをポリオールに変え次に例えば硫酸エステル化、リン酸 エステル化又はカルボキシメチル化により部位Ｚを固定させる方法、或いは、 ・Ｙをアルデヒド、カルボキシル、アミン、ヒドロキシル又はハロゲンのような 活性官能基又は活性化可能な官能基として、Ｚ−Ｙ化合物を用いる方法、或いは ・重合体Ｐ上に部位Ｚを放射化学的にグラフトする方法； −次に、第２段階において、上述のようにして得られた重合体を、ヘモグロビン が変性を受けないような条件下で、約５〜９のｐＨの水性媒質中で、脱酸素化さ れたヘモグロビンと反応させ、重合体とヘモグロビンの間にイオン結合と共有結 合を同時に形成させること； −場合によっては、上記の反応によりイミン官能基が導き出される場合、これら の官能基は、例えば、ＮａＢＨ４ＮａＣＮＢＨ３、ジメチルアミノボラン又はＨ ＣＯＯＨを用いた還元により、アミン官能基で安定化させられる。
17. １７．前記第１段階の終了時点で、部位Ｚをもつ重合体は、ヘモグロビンとの反 応に付される前に活性化されることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方 法。
18. １８．前記活性化は、例えば過ヨウ素酸酸化によってＯＨ官能基をアルデヒド基 に変えることから成ることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．前記部位Ｚを有する重合体の活性化及びそのヘモグロビンとの反応は実際 上同時であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の方法。
20. ２０．前記部位Ｚをもつ重合体が −重合体Ｐも部位Ｚもアルデヒド基をもたず水酸官能基を含んでいる場合、臭化 シアン又はカルボニルジイミダゾールを用いて活性化されること；又は −重合体Ｐ又はＺ基がカルボキシル基を有する場合、ペプチド合成で用いられる 試薬を用いて活性化されること、 を特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。
21. ２１．前記、最高約５％のメトヘモグロビンを導き出す時間より短い時間、でき れば１０時間以内の間、ヘモグロビンの適正な保存を可能にする温度、例えば３ ℃から３０℃までの温度で重合体とヘモグロビンの間の反応が行なわれることを 特徴とする請求の範囲第２０項に記載の調製方法。