JPH01501149A - 新規なデオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト及びオリゴヌクレオチドを製造するためのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ」 新規なデオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト及びオリゴヌクレオチドを 製造するためのそれらの使用ｌ１立１１ オリゴヌクレオチドは定められた順序の４種のヌクレオチドの線状配列から成る 短かいポリマーである。ヌクレオチドサブユニットは、１ヌクレオチドの３°− ヒドロキシル部分に結合するホスホジエステル結合により次のヌクレオチドの５ °−ヒドロキシル部分に結合される。オリゴヌクレオチドの例は５’　＞ＡｐＣ ｐＧｐＴｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣ＜３°である０文字Ａ、Ｃ，Ｇ及びＴはデオキシ リボースのｌ゛−位に結合したプリン或はピリミジン塩基の性質を言い、Ａ１ア デニン：０１シトシン；０１グアニン；Ｔ１チミンである。「ｐ」はホスホジエ ステル結合を表わす、オリゴヌクレオチドのセクションの化学構造を１式に示す 。

−ｏ−ｐ＝。

ＤＭＡ鎖の一部の構造 この式はダブリュ、エッチ、フリーマンアンドカンパニー、ルベルトストライヤ ー（Ｌｕｂ＠ｒｔ　５ｔｒｙ＠ｒ　）著テキストブック「バイオヶミス＼リー」 、第１版１９７５．５５８頁から採用した。

合成オリゴヌクレオチドは近代分子生物学及び組換えＤＮＡ研究における強力な 道具である。これらの分子について数多くの用途があり、ａ）遺伝子生成物のタ ンパク質配列に基づく特定の遺伝子の単離用グローブとして、ｂ）新値の遺伝子 のインビトロ突然変異誘発に向けること、ｅ）−重鎖のテンプレートに関するＤ ＮＡ合成用プライマーとして、ｄ）遺伝子の全合成における段階として及びその 他多くを含み、ウィリアムアールパール（Ｗｍ、Ｒ，Ｂ　ａ　ｈ　１　）等、Ｆ ｒｏｇ、　Ｎｎｅｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒ＊ｓ、　Ｍ６１　。

Ｂｌｏｌ、２１．１０１頁、（１９７８）に考察されている。

かかるオリゴヌクレオチドの効率的な化学的合成法の発達に、今迄極めて相当量 の努力が払われてきた。これらの方法が現在Ｋまで発達してきたにつれての簡単 な回顧が、り党ツケット、ジー、シー、　（Ｃｒｏｃｋ＠ｔｔ　、　Ｇ、　Ｃ， ）、アルドリヒミカアクタ１６　（３）　、４７〜５５頁（１９８３）及び「オ リゴヌクレオチドシンセシス：アブラクチカルアプローチ」、英国、オツクスホ ード、ＩＲＬプレス、ゲイト、ヱム、ジエイ、（Ｇａｉｔ、　）ＴＬ　Ｊ、　） 　ＩＩｌ集（１９８４年）わせで用いる、マツテウツチ、エム、ディ、（Ｍａｔ ｔ・ｔ＋ｅｅｌ。

Ｍ、　Ｄ、　）　及びカルナース、エム、エッチ、　（Ｃａｒｏｔｈ＠ｒｓ　。

Ｍ、　ＩＩｌ、　）、ジャーナルオプアメリカンケミカルソサイアテイ１０３． ３１８５頁（１９８１年）；及びビューケージ、ニス、エル、（Ｂ・ｍｕｃａｇ ・、　Ｓ、　Ｌ、・）ゝ及びカルサース、二ム、エッチ、　、Ｔ＠ｔ、　Ｉ、・ ｔｔ、　２２（２０）、１８５８−１８６２頁（１９８１年）。この化学では、 合成すべき配列の３１−ヌクレオシドを、塩基−不安定なり７カーアームを経て 固体支持体に結合させる。次のヌクレオシドを引き続いて前のヌクレオシドに結 合させて固体支持体から離れて伸びる規定の配列の線状ポリマーを生成する。デ オキシリボヌクレオシドホスホルアミダイトの一般構造を２式に示す： ８ｍ　＝ヌクレオシド塩基 ＤＭＴｒ　＝ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル（ジメトキシトリチルとしても知 られている） ２式 及びオリゴヌクレオチド合成の各サイク／Ｉ／において用いられる化学段階を３ 式に示す： ホスファイト−トリエステル法による固相オリゴデオキシリボヌクレオチド合成 土！ （この式は、ＩＲＬプレスゲイト、エム、ジェ仁編、「オリコヌクレオチド合成 ：アブックチヵルアブローチＪい９８４年）、３７頁から採用した） ４０の塩基までの長さのオリゴヌクレオチドをこの方法で日常ペースで作ること ができ及び１０６の塩基程に長い分子が作られた。この化学を採用する機械が今 日市販されている。

その他の化学種を合成オリゴヌクレオチドに共有結合させる方法を凹む理由が多 くある。オリゴヌクレオチドに結合させた螢光染料は、放射性同位体が眉いられ る研究、診断、臨床方法から放射性同位体を排除し、保存寿命及び利用可能性を 向上させることを可能にする。検出のための適当な技術及び計装の発達及び螢光 ａｉ＆オリゴヌクレオチドの使用は、他の現在骨の折れる実験室及び臨床技術の 自動操作を可能にする。ＤＮＡ開裂化学薬品、例えばシュルツ（５ｅｈｔ＋１ｔ ｚ）等、ジャーナルオプアメリカンケミカルソサイアテイ、１０４．６８６１頁 （１９８咋）Ｈハーツパーグ、アール、ビー、　（Ｈｅｒｔｚｂ＊ｒｇ、　Ｒ， Ｐ、　）及びダーバン、ビー、ビー、（Ｄ＠ｒｖａｎ、　Ｐ、　Ｂ、　）、ジャ ーナルオプアメリカンケミカルソサイアテイ、１０４．３１３頁（１９８２年） に開示されているものの結合は、合成制限ｉ！！ｌＥ票であって、それらの％Ｊ ％性がオリゴヌクレオチド配列によって支配されるものを作製することを可能く する。

ＤＮＡの詰導体合成（ｄ＠ｒｉｖａｔｉｚａｔｌｏｎ　）の文献中にいくつかの 報告がある。ビオチン基をクラシルの５位の脂肪族アミノ基に結合させ゛た変性 ヌクレオシドトリホスフェートが開発された、ランガー（Ｌａｎｇ＊ｒ　）等、 Ｆｒｅｅ　。

Ｎａ　ｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅ　１．　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７Ｂ、６６５５−６ ６５７頁（１９８１年）。「ニックトランスレーション」ト呼ハれるプロセスで 、このヌクレオチド誘導体を効率的に二本鎖のＤＮＡＫ加入させる。ヌクレオチ ド誘導体は、−担ＤＮＡ中に入れば、抗ビオチン抗体によって結合されることが でき、次いで螢光或は酵素法により検出用に用いることができる。ビオチン結合 させたヌクレオシドをッンガー等の方法によって中に加入させたＤＮＡを分断し て一層小さい一本鎖及び二本鎖の片にする。これらのバイオケミストリー１９． １７７４〜１７８１頁（１９８０年）はバイサルファイド触媒アミノ基転移反応 による脂肪族アミノ基を導入し及びそれらを次いで螢光標識と反応させることに ついて報告した。ドレーノ（−及びゴールドでは、アミノ基を直接ピリミジン塩 基に結合させる。

そのように位置させたアミノ基は水素結合を阻止し、このため、これらの物質は ハイプリダイゼーシロン等において有用でない。また、この方法ではアミノ基を 所望の位置に選択的に挿入することができない。チュ（Ｃｈｕ）等、　Ｎｗｃｌ ＠ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｍ、　１１　（１Ｂ）、６５　１　Ｂ−６５２９頁（ １９８３年）は、アミンをオリゴヌクレオチド或は核酸の末端５′−ホスフェー トに結合させる方法を報告した。この方法は、数多くの逐次反応及び精製工程を 含み、実施するのに骨が折れ及びスケールアップするのが困細である。この方法 は、また、単一の７ミノ基をオリゴヌクレオチドの５゛−末端に導入することに 制限さ庇る。タケダ及びイケダ、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８ｙｍｐ、 　５ｅｒｉｅｓンのホスホトリエステル誘導体の合成及び使用について報告した 。これらの物質は本明細書において報告するものと、アミノ含有部分が塩基部分 に結合され、オリゴヌクレオチドの糖部分に結合されておらず、かつまた用いる ＤＮＡ合成化学がホスホトリエステルであって・ホスホルアミダイトでなかった 点で、異なる。

本発明は１つ又はそれ以上の自由脂肪族アミノ基を合成オリゴヌクレオチドに導 入する一般的な方法を提供する。コレラの基をオリゴヌクレオチドの任意の所望 の位置に選択的に挿入することができる。それらは種々のアミノ反応性官能価と 容易にかつ特異的に反応され、それＫよって広範囲の化学種を位置！！＃異的方 法で共有結合させることを可能にする。このことを多数の螢光性オリゴヌクレオ チド誘導体を調製することＫよって例示する。

この方式でｌｉ製した物質は、それらをＤＮＡ配列分析におけるプライマーとし て用いることにより、かつまたＤＮＡ二本二本酸生成けるそれらの融解挙動を研 究することによって例示する通りにＤＮＡハイプリダイゼーシ璽ン法において有 効である。

本発明に従かえば、初めにヌクレオシドの糖部分に結合させた保護された脂肪族 アミノ基を含有するヌクレオシド類似体の３′−Ｏ−ホスホルアミダイＦ誘導体 を合成して、脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチドに導入する。このホスホルア ミダイトを次いで固体支持体上に合成されているオリゴヌクレオチドと反応させ る。アミノ保護基が塩基不安定であるならば、固相からのオリゴヌクレオチドの 開裂及び塩基部分及び脂肪族アミノ基の脱保護のプロセスは、アミノ誘導体合成 されたオリゴヌクレオチドを生じる。アミノ保護基が酸不安定ならば、支持体か らオリゴヌクレオチドを開裂させ及び塩基部分を脱保護する前に、無水の或は水 性の酸で処理して除くことができるか或はオリゴヌクレオチドのクロｉトグフフ イー精製を簡単にし及び改良するために開裂及び脱保護する間に、アミノ保護基 を保持し、次いで後に水性酸で処理して取り去ることができ、どちらの場合でも アミノ誘導体合成ヌクレオチドを生じる。

より詳細には、本発明は本明細書中に詳細に述べる通りに保護しておいた脂肪族 アミノ基をヌクレオシドの糖部分に結合させる変性デオキシヌクレオシドホスホ ルアミダイトに関する。代表的なヌクレオシドの化学構造を４式に示す。

ヌクレオシドは、複素環式ピリミジン或はプリン塩基が炭素−窒素結合によって リボース（Ｒ＝Ｒ’＝Ｒ”＝ＯＨ）或はデオキシリボース（Ｒ＝Ｒ’　＝ｏａ； Ｒ”＝ａ）のフラノース（糖）環に結合されていることを１＃徽とする。糖炭素 原子の番号付け（ナンバリング）は弐において示す通りに１１〜５′である；す なわち、塩基は糖のＣ−１′に結合される。脂肪族アミノ基は一般原則として５ つの環炭素の内のいずれに結合させてもよく、また、適当なホスフィンを適当に 保護したアミノヌクレオシドの自由な′５１−ヒト四キシル基と反応させて合成 するそれぞれのホスホルアミダイト誘導体を構成する。

３１１］口り 簡単に言えば、本発明は下記式を有する新規な保護アミノヌクレオシドを含む： ここで、Ｂは通常のヌクレオシドプリン或はピリミジン塩基、例えばアデニン１ グアニン、チミン、シトシン、クラシル或はヒボキサンチン或はそれらめ保護誘 導体、特ＫＤＮＡ化学合成において現在用いられているもの、すなわちＮ・−ベ ンゾイルアデニンｓＮ”　−インプチリルプチルホルムアミジニルアデニン、Ｎ ＠　−（Ｎ−メチル−２−ビロリシンアミジニ／Ｉ／）アデニン、Ｎ＠　−スク シニルアデニン、Ｎ−一７タロイルアデニン、Ｎ’　−ジメチルアセトアミジニ ルアデニン或はＮ３−ジーｎ−フ゛チルホルムアミジニルグアニン；或は一般的 でないプリン或はピリミジン塩基、例えばプリン、インシトシン或はキサンチン （４７−シヒドロー１Ｈ−プリン−２，６−ジオン）或はそれらの保護誘導体１ 或は置換されたプリン或はピリミジン塩基である。このようなｔ１１換基は下記 を含み、これらに限定されないニジアノ、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、ホ ルミル、ヒドロキシ、アルコキシ、了り−ル、アジド、メルカプト、ニトロ、カ ルボキシエステル及びカルボキシアミド。このような塩基は下記を含み１これら に限定されない：６−クロロプリン、６−クロロース−フルオロプリン、ｚ６− ジアミツフリン、２−フルオロ−Ｎ・−ヒドロキシアデニン、２．６−シヒドロ キシアミノプリン、８−ブロモアデニン、２−／ロロアデニン、８−アジドアデ ニン、８−メルカプトアデニン、８−アミノアデニン、６−チオグアニン、２． ６−ジクロロプリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−６−アミノプリン、Ｎ・−ベンジルア デニン、ｔＳ−ジメテルキサンチ／、２−アミノ−へ８−ジヒドロキシプリン、 °６−メト中シブリン、６−メルカプトグリｙ、６−（２−ヒドロキシニブル） アミノプリン、Ｎ・−（２−インペンチル）アデニン、Ｎ’−フル７リルアデニ ン（カイネチン）、５−プロモメチルクテシル、５−ジブロモメチルクラシル、 ５−ヒドロキシメチルウテシル、５−ホルミルクツシル、５−フルオロクツシル 、５−ブロモクツシル、６−メチル−２−チオウラシル、５−ヒト田キシメチル −６−メチルウラシル、５−ヒドロキシウラシル（イソバルビッル酸）、５−メ トキシクチシル、５−メチルシトシン、５−）！Ｊフルオロメチルクラシル、５ −ニトロウラシル、５−アミノウラシル、２−チオシトシン、２−アミノ−４６ −ジヒドロキシプリンジン、４−アミノ−２，６−シヒドロキシビリミジン、２ −アミノ−４−ヒドロキシ−６−メチルピリミジン、或は４−アミノ−６−ヒド ロキシ−２−メルカプトピリミジン、或はそれらの保護誘導体。

Ｂは、また、ヌクレオシド塩基類似体であってもよく、かかる類似体は通常のプ リン或はピＩＪ　ｉジン塩基をそれらの構造（原子の種類及び配ａｔ）が通常の 塩基と同様であるが、通常の塩基の機能特性を追加して保持するか或はいくつか 欠くかのいずれかＫなり得る点で、まねる。

このような塩基類似体は下記を含み、これらに限定されない：イミダゾリン及び その２−１４−１及び／又は５−置換誘導体（置換基は前に規定した通りである ）、インドール及びその２−１３−１４−１５−１６−及び／又は７−［換誘導 体、ベンズイミダゾール及びその２−１４−１５−１６−及び／又は７−置換誘 導体、インダゾール及びその３−１４−１５−１６−及び／又は７−ｍ！置換誘 導体ピラゾール及びその３−１４−及び／又は５−ｍ換誘導体、トリアゾール及 びその４−及び／又は５−に換誘導体、テトラゾール及びそのＳ−Ｗ換誘導体、 ベンゾトリアゾール及びその４−１５−１６−及び／又は７−１１換誘導体、８ −アザアデニン及びそのｗｔ挨誘導体、８−アザグアニン及びその置換誘導体、 ６−アザチミン及びそのＩＩ！換誘導体、６−アザクラシル及びその置換誘導体 、５−アザシトシン及びその置換誘導体、８−アザヒボキサンチン及びそのに抄 誘導体、ピッゾロピリミジン及びそのＩＩ換紡導体、３−デアザクラシル、オロ チンｋｌ＜　２．６−シオキソーｔ　２．＆６−チトラヒドロー４−ピリミジン カルボン酸ン、バルビッル酸、尿酸、エテノアデニン、アログリノール（４−ヒ ドロキシ−ピッゾロ（４４−ｄ）ピリミジン、或はそれらの保診誘導体。

Ｂは、また、塩基と糖のＣ−１’との通常のＣ−Ｎ結合をＣ−Ｃ結合に代えた「 Ｃ−ヌクレオシド」になることができる。このような塩基は下記を含み、これら に限定されない：ウラシル（Ｃ−ヌクレオシドプソイドウリジンにおける）、１ −メチルウラシル、１．３−ジメチルクラシル、５（４）　−カルボメトキシ− ｔＺＳ−トリアゾール、５（４）−カルボキシアミドーｔ２．５−）リアゾール 、５（５）−カルボキシメチルピラゾール、３（５１−カルボメトキシピラゾー ル、５−カルボエトキシ−１−メチルピラゾール、マレイミド（Ｃ−ヌクレオシ ドショウドマイシン（Ｓｈｏｖｄｏｍｙｃ１ｇ＋　）における）、３（４）−カ ルポクスアミド−４（３）−ヒドロキシピラゾール（Ｃ−ヌクレオシドビラゾマ イシンにおける）、或はそれらの保ＩＩ誘導体。

５式において、Ｒ１、Ｒ２％　ＢＳ　、Ｒ４及びＲｓ　Ｃ時には、全体としてＲ ｎと呼ぶ）は下記の通りに規定する：Ｒ＠　＝ＩＩＳＲ４＝ＯＨ％　Ｒ１％Ｒ＊ 及びＲ，はＨ，ＯＲ或はＮＨＲ’のいずれかであり、ここでＲ及びＲ′は適当な 保護基であり；Ｒは通常低級アルキル或はアリールエーテ）’、例：ＩＦ！メｆ ル、ｔ−ブチル、ベンジル、Ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、Ｏ−ニ トロ７エ二ル或はトリフェニルメチル、或は低級アルキル或はアリールエステル 、例えばアセチル、ベンゾイル或はｐ−ニトロベンゾイル、或はアルキルアセタ ール、例えばテトラヒドロピラニル、或はシリルエーテル、例えばトリメチルシ リル或はｔ−ブチル−ジメチルシリル、或はスルホン酸エステル、例えばｐ−） ルエンスルホニル或はメタンスルホニルであり；Ｒ１は任意の通常、標準の窒素 保護基、例えば通常ベプデド合成において用いられているものにューヲーク、ア カデミツクプレス、イー、グロス及びジエイ、マイエンホファー騙集−，［ザペ プテズ：アナラシス、シンセシス、バイオロジーＪ、（１９８１年）、３巻、１ 〜９９頁、アールガイガー（Ｒ，Ｇ＠量ｇ＠ｒ　）及びダプリュ、フーニング（ Ｗ、　Ｋｅｎｉｍｇ　）　）でありｉこれは下記を含み１これらに限定されない ：！２不安定性保護基、例えばホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、Ｎ−ベ ークロロベンジルオキシカルボニル、４−７’ロロベンジルオキシカルボニル、 ２．４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルオキシカルボニル、ｔ −アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロ ピル＋２１オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）フロビル（２）−オキシ カルボニル、トリフェニルメチル、ｐ−ア二シルジフェニルメチル、ジ−ｐ−ア ユシルフェニルメチル、２−ニトロフェニルスルフェニル或はジフェニルホスフ ィニル警塩基不安定性保護基、例えばトリフルオロアセチル−グリシル、４−） ルエンースルホニルエチルーオキシカルボニル、メチルスルホニルエチル−オキ シカルボニル及び２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル；その他、例えばク ロロアセチル、アセトアセチル、２−ニトロベンゾイル、ジチアスクシノイル、 マレオイル、イソニコチニル、２−ブロモエチルオキシカルボエル及び２，２． ２−　）リクロロエチルオキシカルポニル、但し、Ｒ，或はＲ３がＮＨＲ’であ るとき、Ｒ’は前述した基或はトリフルオロアセチル或は９−フルオロエニルメ チルオキシカルボニルの内のいずれかであることを条件とする。

ＴＬＩ　、Ｒｇ及びＲ，の内の精々１つはＮＨＲ’になることができ及びＲ４の みがＯＨになることができる。

本明細書中上述したｒＲＪ保護基は、炭素原子を含有する場合、１〜約２５の炭 素原子を含有することができる。

ケース ＯＲか或はＨのいずれかＫなることができる；この場合の分子を保！！ｉ２’− アミノー２′−デオキシアツビノヌクレオシドと呼ぶ。

２）Ｒ，＝ＮＨＲ’なら、その場合Ｒ１＝：ａ　；　ＲｇはＯＲか或はＨのいず れかＫなることができる；この場合の分子を保１１２′−アミノー２１−デオキ シリボヌクレオシドと呼ぶ。

３）Ｒｉ’＝ＮＨＲ’なら、その場合Ｒ１或はＲ雪のいずれかはＯＲになること ができ、他方はＨであり、或は両方がＨになることができる；Ｒ１がＯＲである なら、その分子を保護５′−アミノアラビノヌクレオシドと呼びＩＲｆｉがＯＲ であるなら、その分子を保１１１ｓｌ−アミノーリボヌクレオクドと呼びｊＢＢ 及びＲ，の両方がＨであるなら、その分子を保Ｗ１５′−アミノー２Ｉ−デオキ シリボヌクレオシドと呼ぶ。

発明は更に下記式を有する新規なホスホルアミダイトここで、Ｂ　ｓ　Ｒ１、Ｒ ２及びＲ１は前に規定した通りであり、 Ｒ・＝低級アルキル、好ましくはメチル或はイソプロピルのような低級アルキル 、或は複素環式、例えばモルホリノ、ピロリジノ或は２．２．４６−チトラメチ ルピロリジハ Ｒｆ＝／？ル、ベーターシアノエテル、ｐ−ニトロフェネチル、Ｏ−／ロロフェ ニル或Ｇ！ｐ−クロロフェニル。

もう一度、本明細書中上述したｒＢＪ基は、炭素原子を含有する場合、１〜約２ ５の炭素を含有することができる。

５弐においてｒＢＪによって表わす部分も、また、６弐によって表わすホスホル アミダイトを合成する前に、ホスホルアミダイトをＤＮＡｍアセンブリー化学に 連合させるために％連光に保証しなければならないことに注意しなければならな い。このような保護は、ゲイト、「オリゴヌクレオチドシンセシス：アプラクチ カルアプローチ」において十分に検討されており、通常、ｒＢＪの環外（・ｘｏ ｅｙｃｌｌｅ　）アミノ基をアシル化或はアミノ化することを含み；かかるアシ ル基はアセデル、ベンゾイル、インブチリル、スクシニル、７タロイル或はアニ ソイルを含み、これらに限定されず畜かかるアミジン基はジメチルホルムアミジ ン、ジ−ｎ−ブチルホルムアミジン或はジメチルアセトアミジンを含み、これら に限定されず；１Ｂ＠を他の反応性基、例えばカルボキシＪ％／１ヒド四キシル 或はメルカプトで置換するならば、これらは同様に適当に保護される。

本発明は別の面では、オリゴヌクレオチドを６式の保護アミノ誘導体合成ヌクレ オシドホスホルアミダイトと反応させる、面相支持体上でオリゴヌクレオチドを 合成することを含む。

加えて、本発明は少なくとも１つのアミノ誘導体合成ヌクレオシドを６式のホス ホルアミダイト前駆体を経て中に加入させた新規なオリゴヌクレオチドを含む。

本発明は、なお更に、上述した新規な脂肪族アミノ誘導体合成された一本釦のオ リゴヌクレオチドを、発色団、螢光剤、タンパク質、酵素、１１！ｌのような放 射性原子或はその他つ「橿原」である検出可能な成分に結合させて成る。

本発明の目的は新規な保護ヌクレオシドを提供することにある。

本発明のなお別の目的は新規なホスホルアミダイトを提供することにある。

本発明の別の重要な面では、前述したホスホルアミダイトと反応させた固体支持 体に結合させた新規なオリゴヌクレオチドを提供することが目的である。

本発明のなお別の目的は、標準の検出手段によって容易に検出し得る新規な標し を付けた（ｔａｇｇ＠ｄ）オリゴヌクレオチドを提供するにある。

本発明のこれらや他の目的及び利点は、下記の一層ていねいかつ詳細な説明から 当業者に明らかになろう。

発明の詳細な説明 下記の引用は、上記５式の化合物の調製において用いるアミノヌクレオシド出発 原料の合成のリストを含む。

Ｉ）５’−アミノ−５１−デオキシチミジン及び５′−アミノ−５′−デオキシ ウリジン及び適当な中間体の合成（ケース３の実施態様）： ｔ　ホルビツツ、ジエイ、ビー、（Ｈ＠ｒｗｉｔｚ、　Ｊ、Ｐ、）、）　ムソ／ 　＊　Ｚ　−ジエイ、　（Ｔｏｍｓｏｎ、　Ａ、　Ｊ、　）、アーバンスキ、ジ エイ、　ｘ　−、（Ｕｒｂａｎｍｋｉ　、　Ｊ、　Ａ、　）及びチュア。

ジエイ、（Ｃｈａ＆、　Ｊ、）ジャーナルオプアメリカンケミカルソサイアテイ ２７．３０４５−５０４８頁（１９ｔＳ２）。

Ｉ［）２’−アミノ−２１−デオキシウリジン及び２１−アミノ−２′−デオキ シシチジン及び適当な中間体の合成（ケース２の実施態様）： ｔ　バーヘイ）”ン、　シｘ−イ、ビー、エッチ、（Ｖ＊ｒｈ＠ｙｄ＊ｎ。

Ｊ、　Ｐ、　Ｉ（、）　、７グナー、ディー、　（Ｖａｇ！Ｉｅｒ、　Ｄ、　） 、及び％７７７）、’）エイ、ジー、　（Ｍｏｆｆａｔｔ、　Ｊ、　Ｇ、　）　 、ジャーナルオプオーガニツクケミストリー３６．２５０−２５４頁（１９７１ 年）。

２イマザワ、エム０．及びエックスタイン、エフ。

（Ｅｅｋｓｔ・ｉ　！Ｌ　Ｔ　Ｆ　、）　、ジャーナルオプオーガニツクケミス トリー、４４．２０３９−２０４１頁（１９７９年）。

五　ニューヨーク、ジョンクイリーアンドサンズ、タウンゼント、エル、ビー、 及びチプスン、アール、ニス。

編集、「エユークリイクアシドケミストリーＪ　（１９７８）、２巻、９７７− ９８９頁、トランス、ビー、エフ（Ｔｏｒｒ＠ｎｃｅ。

Ｐ、Ｆ、）及びウィツトコブ、ビー、（Ｗｌｔｋｏｐ、　Ｂ、　）。

４ササキ、ティ０．ミナモト、ケイ０．スギウ２．ティ。

及びミワ、エム、ジャーナルオプオーガエツクケミストリ−４１，５１５Ｂ−５ １４５頁（１？７５年）。

ＩＩＩ）　２’−アミノ−２′−デオキシアデノシン及び２１−アミノ−２′− デオキシグアノシン及び適当な中間体の合成（ケース２の実施態様）： ｔ　イマザワ、エム、及びエックスタイン、エア０．ジャーナルオプオーガニツ クケミストリー、４４．２０５９−２０４１頁（１９７９年）。

２ホツプス、ジエイ６ビー、　（１’Ｉｏｂｂｓ、　Ｊ、　Ｂ、）及びエックス タイン、エフ０．ジャーナルオプオーガニツクケミストリー、４２．７１４−７ １９頁（１９７６年）。

五うンガナサン、アーＡ／　、　（Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ、　Ｒ，）　ｓテト ラヘドロンレターズ、１５．１２９１−１２９４頁（１９７７年）。

本　メンゲル、アール（Ｍ＠ｎｇ＠ｌ、　Ｒ，）及びライ−ドナー。

エッチ（Ｗｉ＠ｄｍ＠ｒ、　Ｈ，）、Ｃｈ＠ｗ、　Ｂ＠ｒ、　１０９．４Ｓ３− ４４５頁（１９７６年）。

４ウルフ田ム、エム、エル、　（Ｗｏｌｆｒｏｍ、　Ｍ、　Ｌ、　）及びウィン クリ−、エム、ダブリ”　（Ｗｉｎｋｌ＠ｙ　、　Ｍ、　Ｗ、　）　、ジャーナ ルオプオーガニツクケミストリー、３２．１８２３−１８２５買１９６７年）０ ４イケハ２．エム０．ムラヤマ、ティ、及びミキ、エッチ、テトラヘドロンレタ ーズ、４９．４４８５−４４８８頁（１９７６年）。

２　イクハラ、エム、及びムラヤマ、ティ、、Ｃｈｅｗ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、日本２６．２４０−２４４頁（１９７８年）。

ｍＶ）天然のヌクレオシドのいくつかのＣ−ヌクレオシド類似体の合成（全ての ケースに関係する）：ｔ　トラスへ２ス（Ｄｓ　Ｌａｓ　Ｈｓｒｍｓ　）　、エ フ、ジー、（Ｆ、Ｇ、）、タム（Ｔａｎ　）、Ｓ、Ｙ−に、、クライン、　７− 　ｋ　、　Ｚ　ス、　＊ツクス、ジエイ、ジエイ、（Ｆｏｘ、　Ｊ、　Ｊ、　） 　、ジャーナルオプオーガニツクケミストリー、４１．８４−９０頁（１９７６ 年）。

２、）ルムリツツ、ジー、（丁ｒｔ＋ｍｍ１１ｔｚ、　Ｇ、　）　、レプケ。

ディー、ビー、（Ｒ＠ｐｋ・、　Ｄ、　Ｂ、　）、モクアット、ジエイ。

ジー、ジャーナルオプオーガニツクケミ、ストリー、４０．５３５２−３３５６ 頁１９７５年）。

五　チェ、シー、ケー、ライヒマン、　ニー、（Ｒ＠ｉｅｂｍｍｎ。

Ｕ、）、ワタナベ、クー。ニー、及びホックス、ジエイ。

ジエイ、、Ｊ、　Ｈ＠ｔ＠ｒｏｃｙｃｌｉｃ　Ｃｈｅｗ、　１４．１１１９−１ １２１頁（１９７７年）。

４オガワ、ティ、パーネット、ニー、ジー、　（Ｐ＠ｒｍ＠ｔ。

人、Ｇ、）及びへネツシアン、ニス、（Ｈａｎｅｓｍｉａｍ、　Ｓ、　）、テト ラヘドロンレターズ、３７．５５４５−５５４６頁（１９７５年）。

＆「ヌクレオシズ、ヌクレオチズアンドゼアバイオロジカルアプリケーションズ 」、ジエイ・エル・ライドアウト（Ｊ、　Ｌ、　Ｒ１ｄ＠ｏｕｔ　）、ディー、 タフリュ、ヘンリー及びエル、エム、ビーチャム（Ｌ、　Ｍ、　Ｂｅａｅｈａｚ ａ　）ｌ［編集１アカデミツクプレス、二ニーＥ−り（１９８３年）。

■）グリコシレーシラン及びトランスグリコシデージョン反応によるアミノ糖及 びアミノヌクレオシドの合成（全てのケースに関係する）： ｔ　アズマツティ、及びイショノ、ケー、　Ｃｈ＠ｗ、　Ｐｈａｒｍ、。

Ｂｔ＋１１．日本２５．３３４７−！５３５３頁（１９７７年）。

λハシズメ、ティ、及びクワムラ。エッチ、テトラヘドロンレターズ、３５．３ ０９５−３１０２頁（１９６５年）。

五アニスザマン、ニー、ケイ、エム、（Ａｎｉｓｔ＋ｚｚａｍａｎ。

Ａ、　Ｋ、　Ｍ、　）及びクィッスラー、アー１ｋｐ　、　：！−Ａｔ　（Ｗｈ ｉｓｔｌ＊ｒ。

Ｒ，Ｌ、）　、ジャーナルオプオーガエッククミストリー、３７．５１８７−５ １８？頁（１９７２年）。

４　ビシｖ７７、シ＋、？イ、（Ｂｌａｂｏｐ、　Ｃ，Ｔ、　）及びクーパー、 エフ、ビー、　（Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｆ、　Ｐ、　）、カナディアンジャーナルオ プケミスＦリー、４１．２７４３−２７５８頁（１９６５年）。

＆ウンガー、エフ、エム、（Ｕｎｇ＠ｒ、　Ｆ、　Ｍ、　）、クリスチャン、ア ール、及びワルドスタッテン、ビー（Ｗａｌｄｍｔａｔｔ＠ｎ、　Ｐ、　）、テ トラヘドレンレターズ、５０゜４３８３−４！５８４頁（１９７７年）。

６　ウンガー、エフ、工゛ム、、クリスチャン、アール、及びワルドスタッテン 、ビー１．テトラヘト田ンレターズ、７．６０５−６０８頁（１９７９年）。

１　ボベック、エム、（Ｂｏｂ＠に、　Ｍ、）及びマーチン。

ブイ０．テトラヘト四ンレターズ、２２．１９１９−１９２２頁（１９７８年） 。

＆　クルフロム。エム、エル、シャフィザデー、エフ。

（５ｈａｆｉｚａｄ＊ｈ、　Ｆ、　）、アームストロング、アール、ケイ。

及びシエンハン、ティ、エム（Ｓｈ＠ｍ　Ｈｕｎ、　Ｔ、　Ｍ、）、ジャーナル オプアメリカンケミカルソサイアティ、８１．５７１６−５７１９頁（１９５９ 年）。

２　ウルツ冨ム、エム、エル、シャフィザデー、エフ。

及びアームストロング、アール、ケー、、シャーナルオブアメリカンケミカルソ サイアティ、８０，４８８５−４８８８頁（１９５８年）。

１ｃＬ　クル７、ジー、（Ｗｕｌｆｆ、　Ｇ、　）、ローレッジ−、及びクルー ガー、ダブリｎ　、　Ａｎｇｅｒ、　Ｃｈｕｍ、　８２．４５５−４５６頁Ｃ１ ９７０年）。

１ｔ　シュロイダー、エル２アール、（５ｃｈｒｏ＠ｄ＠ｒ、　Ｌ、　Ｒ，）及 びグリーン、ジエイ、ダプリュ、、ジャーナルオプヶミ力ルソサイアティＣ，５ ３０−５３１頁（１９６６年）。

５式の範囲内の好ましい化合物群を下記によって与える。

ノー５１−デオキシチミジンの５ｌ−Ｎ−保護した誘導体：ここで、ｘ−５式に 伴ない発明の詳細な説明において規定した通りの標準の窒素保護基；好ましくは 、Ｘ−）リフェニルーメチル（トリチル）或はｐ−アニシルジフエ二ルメチル（ モノメトキシトリチル、ＭＭＴトモＩ＋”！ｆれる）。

式は、また、化合物（Ｘ−Ｈ）を活性化された適当に保護されたアミノ醸誘導体 と反応させて生成する関連のある化合物群を包含する；コノ場合、ＶはＸ−Ｙ　 −ＮＨ−（ＣＩ（Ｑ）！Ｌ−Ｃ０によって表わされ、ここで、Ｙ−窒素保＆基、 特に本明細書中前ＫＸについて好ましいとしてリストしたもの、トリフルオロア セチル或は９−フル四エニルーメ）ヤシメチルオキシカルボニル；Ｑ−任意の通 常のアミノ酸側鎖；　＊　−１−約１２、通常難＜−６；　！１−１の場合、Ｑ は下記のような部分を含み、これらに限定されない：Ｈ（アミノ酸グリシンから ）、メチル（アミノ酸アラニンカラ）、インプシビル（バリン）、ベンジ＃　（ ７ｘニルアラニン）、ｐ−ヒドロキシベンジル（チロシン）、カルボキシメチル （アスパラギン酸）、カルボキシエチル（グルタミン酸）、４−アミノブチル（ リシン）、イミダゾリル−メチル（ヒスチジン）、インドリルメチル（トリプト ファン）、メルカプトメチル（シスチン）或はヒドプキシメチ／１／（セリン） ＄１１＞１の場合、Ｑは通常Ｈであり；例えばｎ　−２の時、対応するアミノ酸 はベーターアラニンであり；　！ｌ　＝　ｊｓの時、４−アミノ酪酸；ｍ　−５ のとき、６−７ミノへ午サン酸、ＱがＯＲ，ＳＲ。

Ｃｏ、Ｈ或はＮＨ２のような反応性部分を含有するならば、これらもまた標準の 基で適当に保護する（このような基の十分な記述については、ガイガー及びコー ニング、「サヘブチズ：アナラシス、シンセシス、バイオロギー」を参照）。こ の化合物群では、保護されたアミノ基をヌクレオシドの糖環から空間的に取り失 って、その反応性を向上させるか、或はアミノ基に付されるべき「標識」からＤ ＮＡ鎖を空間的に分離する。

式は、また、線状様式で結合された１より多いアミノ酸（ペプチドと呼ぶ）を化 合物（Ｘ−Ｈ）に結合させることによってこの後者の群に関連した化合物群を包 含すル：コノ場合、ＸはＸ　−Ｙ　−（ＮＨ−（ＣＨＱ　ｌ　）！１−　Ｃｏ） ｍによって表わされ、ここで、Ｙ及びｎは本明細書中前に規定した通りであり、 種々のＱｌは本明例書中前にＱについて規定した通りであり、ｌ−１〜ｎｆ）最 大値、ｍｍ１〜約１００；ａｓ−１は前のパングラフにおいて規定した群を表わ す。

５’−０−ｐ−）ルエンスルホニルチミジン、５′−アジド−５′−デオキシチ ミジン及び５１−アミノ−５１−デオキシチミジン出発原料の合成は、 ホルビッツ、ジエ仁ピー宍午ン堅、ジェイ、アーバンスキ、ジエイ、ニー、及び チュア、ジエイ、、ジャーナルオブオーガエツクケミストリー、２７．５０４５ −３０４８頁（１９，６２年）に示されている。

例１ 下記式を有する５’−Ｎ−ｐ−７ニシルジフエニルメチルー５１−７ミノー５１ −デオキシチミジン：５′−アミノ−５′−デオキシチミジン（２，４１１ｓ１ ０ミリモル）を２回無水ピリジン（各回２５−）と共に共蒸発させ（ｃｏ・マリ ｏｒａｔ・）Ｓ次いで無水ピリジン（１００ｄ）中に懸濁させた。トリエチルア ミン（２，１１１４）、Ｎ。

Ｎ−ジメチルア之ノビリジン（（ＬａＯ２：アルドリッチケミカルカンパニー） 及びｐ−アニシルークロνジフェニルメタン（４６８１１，１＆２ミリモル；ア ルドリッチケミカルカンパニー）を加えた。反応混合物を水分及び光から保護し 及び黄色−オレンジ溶液を室温で一晩攪拌した。反応を次いで水中で冷却し及び 冷飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００１ｊ）を加えて過剰のトリチル化（ｔｒ ｉｔｙｌａｔｉｎｇ　）　剤を分解した。５０分した後に、混合物を１リツトル の分液漏斗に移し及びエチルアセテート（２０ａｍ分）で２回抽出した。−緒に したエチルアセテート層を水（１００１ｊ分）で２回及び飽和塩化ナトリウム水 溶液（１００ｍ）で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ｆ過し、減圧 下で回転蒸発乾固させた。

ガム状のオレンジ−黄色生成物を次いで無水トルエン（１００＊分）と共に２回 共蒸発させて残留ピリジンを除いた。残分を最少量のエチルアセテートに溶解し 及びヘキサン中に充填した中性アルミナ（活性グレードＶ。

１５重量％：ホエルムファーマ（Ｗｏ＠１ｍ　Ｐｈａｒｍａ　ＧｍｂＨアンドカ ンパニー）のカラム（１００３Ｘ＆Ｏｃｍ）に加えた。カラムを初めにエチルア セテート：ヘキサン（１：１マ／マ）で、鮮黄色物質が全てカラムから溶出され るまで溶出し、次いで純エチルアセテートで溶出した。

生成物を含有する留分をプールし及び回転蒸発乾固させた。無色に近いガム状残 分を歩容量のエチルアセテートに溶解し及び室温のヘキサン（４００ｄ）中に沈 殿させた。生成物をｒ過し及び真空デシケータ内で乾燥して結晶化されない白色 粉末４５３＃ｌＬ８ミリモル、８８％）となった。精製した生成物をシリカゲル ＬＱ６ＤＦプレー）（ピアースケミカルカンパニー）上でアセトニトリル；水（ ９：１マ／マ）で展開させるＴＬＣ分析は、短波ＵＶ検出により１つのスボツ） Ｒｆα８７を示し、これ番１プレーＦに過塩素酸：エタノール溶液（３：２マ／ マ）を吹付けた後にｐ−アエシルジフェニルメチルカチオンに特有のオレンジ− 黄色となった。生成物の構造を更にベルシュウチリウム置換した（　ｐ＠ｒｄ鎗 ａｔ・ｒａｔ・ｄ）ジメチルスルホキシド（メルクアイソトープス）で”ＨＮＭ Ｒ分光分析法によって確認した。

同様に、下記の化合物を調製する： １）５′−アミノ−２’、５’−ジデオキシ−Ｎ＠−ベンゾイル−アデノシンか らｓ’−Ｎ−ｐ−７ニシルジフエニルメチルー５１−アミノ−２１，５１−ジデ オキシ−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン。

２）５１−アミノ−２’、５’−ジデオキシ−Ｎ”−イソブチリルグアノシンか ら５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５′−アミノ−２１，ｓｌ−ジデ オキシ−Ｖ−インブチリルグアノシン０ ３）５１−アミノ−２１，５１−ジデオキシ−Ｎ４−ペンシイｙシスチジンから ５’−Ｎ−Ｐ−アユシルジフェニルメチル−５１−フミノー２１．５′−ジデオ キシ−Ｎ４−ベンゾイルシチジン。

リ　５′−アミノ−２’、　５’−ジデオキシクリジンｄ−ら５’−Ｎ−ｐ−ア 二シ〃ジフェニルメチルー５１−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシウリジン。

５）５１−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシイノシンから５ｌ−Ｎ−ｐ−７ニシ ルジ７エエルメチルー５１−アミノ２１゜５Ｉ−ジデオキシイノシン０ ６）５１−アミノ−２１−テ）ラヒドロピラニルーｓｌ　＋デオキシウリジンか ら５’−Ｎ−（ｐ−アニシルジフェニルメチ／Ｉ／）　−５＋−アミノ−２１− テトラヒト四ビ２ニルー５１−デオキシウリジン。

７）５′−アミノ−２１−テトラヒト豐ピラニルー５１−デオキシイノシンから ｓ’−Ｎ−（ｐ−アニシルジフェニルメチル）、−５ｌ−アミノ−２′−テトラ ヒドロピラニル−５′−デオキシイノシン。

８）５′−アミノ−２１−テトラヒドロピラニル−Ｎ”　−ベンゾイル−５′− デオキシアデノシンから５’−Ｎ−（ｐ−アニシルジフェニルメチル）−ｓｌ− アミノ−２１−テシラヒドフビラニルーＮ＠−ベンゾイル−５′−デオキシアデ ノシン。

９）５′−アミノ−２′−テトラヒドロピラニル−Ｎ’　−ベンゾイル−５１− デオキシシトシンから５’−Ｎ−（ｐ−アニシルジフェニルメチル）　−ｓｌ− アミノ−２１−テトラヒドロピラニル−Ｎ４−ベンゾイル−５１−デオキシシト シン。

１ｏ）　５’−アミノ−２１−テトラヒドロピラニル−Ｎ”　−イソブチリル− ５′−デオキシグアノシンからｓ　＋　−Ｎ−（Ｐ−７ニシルジフエニルメチル ）−ｓｌ−ア、　、　−２１−テ）ラヒドロビラニルーＨ１−インブチリル−５ ′−デオキシグアノシン。

１１）５’−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシ−Ｎｔ−ベンゾイルアゾｌシンか ら５’−Ｎ−トリフェニルメチル−５１−アミノ−２１，５１−ジデオキシ−Ｎ ｔ−ベンゾイルアデノシン。

１２）５’−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシ−Ｎ鵞−イソブチリルグアノシン から５’−Ｎ−）ジフェニルメチル−５′−アミノ−２’、５’−ジデオキシ− Ｎ１−インブチリルグアノシン０ １！Ｓ）　５’−アミノ−２１，５１−ジデオキシ−Ｎ６−ベンゾイルシチジン から５’−Ｎ−）リフェニルメチルーｓ＋−アミノ−２′、５′−ジデオキシ− Ｎ４−ベンゾイルシチジン０ １す５′−アミノ−２１，５１−ジデオキシウリジンから５’−Ｎ−）ジフェニ ルメチル−５１−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシウリジン。

１ｓ）　５’−アミノ−ｚｌ、　ｓｌ−ジデオキシイノシンから５’−Ｎ−トリ フェニルメチル−５１−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシイノシン０ １６）　５’−アミノ−２１−テトラヒドロピッニルーｓｌ　−デオキシウリジ ンから５’−Ｎ−）リフ二二ルメチルーー５１−アミノ−２１−テトラヒト田ピ ラニルー５′−デオキシウリジン。

１７）５’−アミノ−２１−テトラヒドロピラニル−５ｌ−デオキシチミジンか ら５’−Ｎ−トリフェニルメチル−５′−アミノ−２１−ナト２ヒト四ピラニル ー５′−デオキシイノシン。

１８）５’−アミノ−２１−テトラヒドロピッニル−Ｎ１−ベンゾイル−５′− デオキシアデノシンから５’−Ｎ−トリフェニルメチル−５′−アミノ−２′− テトラヒドロピッエル−Ｎ−−ベンシイ＃−５’−デオキシアデノシン。

１９）５’−アミノ−２１−テトラヒドロピラニル−Ｎ４−ベンゾイル−５′− デオキシシトシンから５’−Ｎ−）ジフェニルメチＡｌ−５’−アミノ−２１− テトラヒドロビラニルーＮ４−ベンゾイル−５１−デオキシシトシン。

２０）５’−アミノ−２１−テトラヒドロピラニル−Ｎｔ　−インブチリル−５ １−デオキシグアノシンから５’−Ｎ−トリフェニルメチル−５′−アミノ−２ １−テトラヒドロピッニル−Ｎｔ−イソブチリル−５１−デオキシグアノシンＯ ン： ５′−７ミノー５１−デオキシチミジン（ｔ２１１ｉ１５０ミリモル）及びＮ− ベンジルオキシカルボニル−６−アミノヘキサン酸ｐ−ニトマフェニルエステル （２１２，９、＆５”すそル：下記の注を参照）を無水ＤＭＦ（２５ｄ）に溶解 し及び３日室濃で攪拌した。次いで、溶液を減圧下で回転蒸発乾固させて黄色固 体を生じ、これを乾燥エチルエーテルを何回か変えて粗粉砕した。白色粉末状生 成物を、次いでｒ過し、ジエチルエーテルでよく洗浄し、真空デシケータ−中で 乾燥して２．５１１！（４７１リモル、９５≦）となった。

注：Ｎ−ベンゾイルオキシカルぎ品ルー６−アミツヘキｆ　：ｙ　１９　ｐ−二 ）胃フェニルエステルは、エチルアセテート溶液中のＮ−ベンジルオキシカルボ ニル−６−アミノへキサン＠（シグマケミカルカンパニー）、ｐ−ニドマフエノ ール（アルドリッチケミカルカンパニー）及びＮ。

Ｎｌ−ジシクＵへキシルカルボジイミド（アルドリッチケミカルカンパニー）か ら様態技法によって合成した。

同様に、下記の化合物を１１Ｍする： １）５１−アミノ−２１，５１−ジデオキシ−Ｎ１−ベンゾイル−アデノシンか ら５’−Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−６−７ミノヘキサノイル）−ｓ ｌ−７ミノー２１−５１−ジデオキシ−Ｎ６−ベンゾイルアゾｌシン。

２）５′−アミノ−２１，５１−ジデオキシ−Ｈｌ−イソブチリルグアノシンか ら５’−Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）　＋ 　５１−７ミノ＋　２１　、　ｓ　ｌ−ジデオキシ−Ｎ３−イソブチリルグアノ シン０ ３）５１−アミノ−２１，ｓｌ−ジデオキシ−Ｎ４−ベンゾイルシチジンから５ ’−Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）−５１− アミノ−２１，５１−シデオキシーＮ４−ベンゾイルシチジン。

４）５Ｉ−アミノ−ｚｌ、ｓｌ−ジデオキシウリジンから５’−Ｎ−（Ｎ−ベン ジルオキシカルボニル−６−アミノヘキサノイル）　＋　ｓ　ｌ−アミノ−２１ ，ｓｌ−ジデオキシウリジン。

ｓ）ｓ’−アミノ−２’、５’−ジデオキシイノシンから５’−Ｎ−（Ｎ−ベン ジルオキシカルボエル−６−７ミノヘキサノイル）、−５ｌ−アミノ−２１，５ １−ジデオキシイノシン。

６）５′−アミノ−２１−テトラヒト田ピラニルー５１−デオキシイノシンから ｓ’−Ｎ−（Ｎ−ペンジルオキシカルボニＡ／−６−７ミノヘキサノイル）−ｓ ｌ−７ミノー２１−テ）ジヒドロビラニル−５′−デオキシイノシン０ ７）５′−７ミノー２１−テトラヒドロピッエル−Ｎ！　−イソブチリル−５′ −デオキシグアノシンから５’−Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−６−ア ミノヘキサノイｙｖ）−５’−アミノ−２′−テＦラヒドロビラニル−一一イン プチリル−５１−デオキシグアノシン。

８）５′−７ミノーｚｌ、ｓｌ−ジデオキシクリジンから５ｌ−Ｎ−（Ｎ−ベン ジルオキシカルボエル−６−アミノヘキサノイＡ／）　−ｓ　ｌ−アミノ−ｚｌ 、ｓｌ−ジデオキシウリ組成において説明した化合物の３’−０−ホスホルアミ ダイ）： ここで、Ｘ−前のセクション（物質番号１の組成）において規定した通りであり 、 Ｒｏ−低級アルキル、好ましくはメチル或はイソプロピルのような低級アルキル 、或は非芳香族窒素含有接素環、例えばモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ或 は２．２．４６−チトラメチルビベリジノ、 Ｒ７−メチル、ベーターシアノエチル、ｐ−ニトリフエネチル、０−クロロフェ ニル或はｐ−クロロフェニル。

例 ＪＬ：下記のホスホルアミダイト化合物を合成するの夷に用いたホスフィン出発 原料を文献の手順に従がって調製した： １）マクブリッジ、エル、ジエイ（Ｍｅ　Ｂｒｉｄｇ・）及びカルザース、エム 、エッチ９．テトラヘトブンレタース、２４．２４５−２４８頁（１９８３年） 。

２）シンハ、エヌ、ディ、（５ｉｔｉｈａ、　Ｎ、　Ｄ、　）、ビアーナト、ジ エイ、（Ｂｉ＠ｒｎａｔ、　Ｊ、）、マクマナス、ジエイ。

（Ｍｅ　Ｍａｎｕｉ　、　Ｊ、　）及びコスタ−、エッチ、　（Ｋｏｓｔｅｒ、 　Ｈ，）＋Ｎｕｔ１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＠１．、１２．４５３９−４５５７頁（ １９８４下記式を有する５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５′−アミ ノ−５１−デオキシチミジン−３′−〇−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジイ ンプレビルアミノホスホルアミダイト： キシチミジン（ｃＬ７８５１！、ｔｓｔリモル）を、Ｎ、　Ｎ−ジイソプマビル エチルアミン（ｔｓｄ）を含有スルトした。クロロ−Ｎ、Ｎ−ジーイソプロビル アミノーペーターシアノエ）キシホスフィン（（Ｌ７０ｄ、五０ミリモル）を注 射器から溶液に約１分かけて滴下し及び反応を室温で攪拌した。エチルアセテ− ）ニトリエチルアミン（？　９　＝１マ／マ）中で展開させたシリカゲル６０　 Ｆ　−２５４プレー）上のＴＬＣは、反応が３０分後に完結したことを示した０ 次いで、無水メタノール（（Ｌｌｌｌｊ）を加えて過剰のホスフィチル化（ｐｈ ｏすｈ口ｙｌａｔ１ｎｇ　）剤を分解し、反応を更に数分攪拌した。反応混合物 を、次いで１エチルアセテート（ＳＯＶ、あらかじめ１０％（ｖ／マ）の冷炭酸 ナトリウム祷液５０Ｉｌｔで洗浄した）による分液漏斗に移し、１０≦（Ｗ／マ ）の冷炭酸すＦリウム水溶液（８〇−分）で２回及び飽和冷塩化ナトリウム水溶 液（８〇−分）で２回洗浄した。有機溶液（、次いで、無水硼酸ナトリウムで乾 燥し、ｒ過し、減圧下で回転蒸発させて透明な７オームになった。７オームをド ライエチルアセテ−）（１０−１５１１ｊ）に溶解し、この溶液を一７８℃（ド ライアイス／アセトン浴）のへキサン（２００ｄ）に滴下した。沈降した生成物 をｆ過し、−７８℃のヘキサンでよく洗浄し、真空デシケータ−内で乾燥して白 色粉末状固体ＣＬ９３２Ｊｌ（ｔ３１ｔリ−Ｔ−Ａ／、８７％）を生じた。生成 物の構造を更にベルジュクテリクム置換したアセトニトリル中の”ＨＮＭＲ分光 分析法によって確認した。ベルジエクテリクム置換したアセトニトリルにおけｐ ｐｍにおける２つの一重線（シングレット）（ベルジュウテリクム置換したアセ トニトリル中のリン酸に対して）及び微量のみ（〈５％）の他のリン含有不純物 を示した。シリカゲルＬＱ６ＤＦプレート上の上配溶ｆＩ＆系におけるＴＬＣは 、ジアステレオマー生成物により、短波Ｕ”ｌ／検出下で２つの密接に移動する スボツ）、Ｒｆα８７及びｃＬ９２を示した。これらのスゴットは、過塩素戯： エタノール溶液（５２マ／マ）に暴露した際に、ｐ−７ニシルジフエニルメチル カチオンに特有の黄−オレンジ色となつた。

り田ローＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−、ベーターシアノエトキシホスフィン の代りにクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィンを用いて上 記の例を繰り返した場合に、５’−Ｎ−ｐ−アニシルジ７工二ルメチルー５′− アミノ−５′−デオキシチミジン−３′−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピル アミノホスホルアミダイＦを得た。

同様に下記の化合物を調製する： １）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５’−アミノ−５１−デオキシ チミジン−３′−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイ ト。

２）５’−Ｎ−、−アニシルジフェニルメチル？子９佇１５デオキシチミジン− ｓ’−ｏ−メチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

３）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５１−アミノ−５′−デオキシ チミジン−３′−〇−メチルモルホリノホスホルアミダイト。

４）　５　’−Ｎ　−ｐ−７ニシｆｉｙ’）ｙｘ９”’５　’−７ミ／　−５′ −デオキシチミジン−３′−〇−ベーターシアノエチルモルホリノホスホルアミ ダイト。

５）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５１−アミノ−５′−デオキシ チミジン−ｓ’−ｏ−ｐ−ニトロ７エネチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホル アミダイトっ ６）５’−Ｎ−ｐ−アニシルジフエニ４も−１−アミノ−５１−デオキシチミジ ン−３１−〇−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダ イト。

７）５’−Ｎ−ｐ−アニシルジフェニルメチルーｓ　Ｉ　−アミノ−２１、ｓ　 ｌ−ジデオキシウリジン−３’−０−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジイソプ ロピルアミノホスホルアミダイト。

８）５’−Ｎ−ｐ−アニシルジフェニルメチルーｓ　ｌ　−アミノ−２＋　、　 ｓ　＋−ジデオキシイノシシ−３−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ ホスホルアミダイト。

９）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５１−アミノ−Ｎ・−ベンゾイ ル−２＋　、　ｓ　＋−ジデオキシアデノシン−ｓ’−ｏ−メチル−Ｎ、Ｎ−ジ メチルアミノホスホルアミダイト。

１０）５’−Ｎ−、−アユシルジフェニルメチル５′−アミノ−Ｎ４−ペンシイ ／Ｉ／−２１１５１−ジデオキシシトシン−３１−〇−メチルモルホリノホスホ ルアミダイト。

１１）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル５′−アミノ−Ｎ１−インブチ リル−２’、５’−ジデオキシグアノシン−３１−〇−ベーターシアノエチルモ ルホリノホスホルアミダイト。

１２）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル５′−アミノ−２１−テトラヒ ドロピラニ１ＬＩ−ｓ　ｌ−デオキシウリジン−ｓ　’−０−ｐ−二トロ７エネ チルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１３）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル５１−アミノ−２′−テトラヒ ドロピラニル−５１−デオキシイノシン−３′−０−ベーターシアノエチル−Ｎ 、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１４）５’−Ｎ−ｐ−アニシルジフエエルメチル５′−アミノ−２１−テトラヒ ドロピレニル−Ｎ６−ペンゾイ１ｖ−ｓ’−デオキシアデノシン−３′−〇−ベ ーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

１５）５’−Ｎ−ｐ−アユシルジフェニルメチル５１−アミノ−２′−テトラヒ ドロピレニル−Ｎ４−ベンゾイル−５ｌ−デオキシシトシン−３′−０−メチル −Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

１６）５’−Ｎ−Ｐ−アユシルジフェニルメチル５′−アミノ−２１−テトラヒ ドロピレニル−ＨＲ−イソブチリ／Ｉ／−５’−デオキシグアノシン−３１−〇 −メチルーＮ。

Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

内の好ましい化合物群である５′−〇−保護された２１−アミノ−２１−デオキ シウリジン及び５′−〇−保護された２’−Ｎ−アミノアシ／Ｉ／−２１−アミ ノ−２１−デオキシウリジンの２“−Ｎ−保護された誘導体：ここで、凡＝トリ ７エ二と１３ツ７１リチル）、ｐ−アニシ〃ジフェニルメチル（モノメトキシト リチ＃、ＭＭＴ）、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチ／Ｉ／（ジメトキシトリチル 、ＤＭＴ）９−フェニルキサンテニル（ビキシル）、ジーＯ−アニシルー１−ナ フチルメチル、ｐ−アニシルー１−す７チルフ工ニルメチル等ｇ Ｘ＝Ｓ式に伴なう発明の詳細な説明において規定した通りの標準の窒素保護基ｊ 好ましくは、Ｘ＝）リフルオロアセチ＃（Ｔｆａ）、９−フルオレニルメチルオ キシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、）リフェニルメチル（トリチＡ／）或はｐ−アニ シルジフェニルメチル（また−モノメトキシトリチル、ＭＭＴとも呼ばれる）。

式は、また、化合物（Ｘ＝Ｕ）を活性化された適当に保護されたアミノ酸誘導体 と反応させて生成する関連のある化合物群を包含する１この場合、ＸはＸ＝Ｙ− Ｎｌｌｌ−（ＧＨＱ）。−ＣＯによって表わされ、ここで、Ｙ＝本明細書中前に Ｘについて規定した通りの標準の窒素保護基、特に本明細書中前にＸについて好 ましいとしてリストしたもの＋Ｑ＝任意の通常のアミノ酸側鎖１ｎ＝１〜約１２ 、通常ｎ＜−＝６＋ｎ＝１の場合、Ｑは下記のような部分を含み、これらに６定 されない：Ｈ（アミノ酸グリシンから）、メチル（アミノ酸アラニンから）、イ ソプロピル（バリン）、ベンジル（フェニルアラニン）、ｐ−ヒトルキシベンジ ／Ｉ／（チフシン）、力〃ボキシメチル（アスパラギン酸）、カルボキシエチ／ Ｉ／（グルタミン！ｔ）、４−アミノブチル（リシン）、イミダゾリル−メチル （ヒスチジン）、インドリルメチ／Ｉ／（トリプトファン）、メルカプトメチル （シスチン）或はヒトレキジメチル（セリン）＋ｎ）１の場合、Ｑは通常■であ り１例えばｎ＝２の時、対応するアミノ酎ベーターアラニンでありｌｎ＝３の時 、４−アミノ酪酸１ｎ＝５のとき、６−アミノヘキサン酸。ＱがＯＲ，ＳＥ：％ Ｃｏ、ｕ或はＮＵ、のような反応性部分を含有するならば、これらもまた標準の 基で適当に保護する（このような基の十分な記述については、ガイガー及びフー ニング、「ザヘブチズ：アナラシス、シンセシス、バイオロギーｊを参ｆ＠）。

この化合物群では、保護されたアミノ基をヌクレオシドの精魂から空間的に取り 失って、その反応性を向上させるか、戒はアミノ基に付されるべき「標＆！ｌｊ からＤＭＡ鎖を空間的に分離する。

式は、また、線状様式で結合された１より多いアミノ酸（ペプチドと呼ぶ）を化 合物（Ｘ−Ｈ）に結合させることによってこの後者の群に関連した化合物群を包 含する蓼この場合、ＸＦ′１Ｘ＝Ｙ−（ＮＨ−（ＣＨＱｉ）ｎ−Ｃｏ）、、によ って表わされ、ここで、Ｙ及びｎは本明細書中前に規定した通りであり、種々の Ｑｉは本明細書中前にＱについて規定した通りであり、ｉ＝１〜ｍの最大値、ｒ ｎ　＝　１〜約１００１００ｌは前のパラグラフにおいて規定した群を表わす。

一デオキシウリジン、２　’−Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキシ−デオキシウリジン及 び２′−トリフルオ四アセトアミドー２１−デオキシウリジンの合成は下記に示 されてしする： バーヘイドン、ジエ仁ビー、エッチ０．ウェイシナ−。

デ仁　（Ｗａｇ＠ｎ＠ｒ、　Ｄ）及びモファット、ジエイ、ジー、。

ジャーナルオプオーガニツクケミストリー、３６．２５〇−２５４頁（１９７１ 年）。

シャーマツアール、ニー、（８ｂａｒｍａ、　Ｒ，人、）、ボペク。

エム、　（Ｅｏｂｅｋ、Ｍ、）及びブロック、ニー、　（Ｂｌｏｅｈ、人、）。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈａｍ、　１　Ｂ、９５５−９５７頁（１９７５年）。

イマザワ、エム、及びエックスタイン、エフ、ジャーナルオプオーガニツクケミ ストリー、４４．２０３９−２０４１頁（１９７９年）。

般的に上記文献に見られる手順に従力２つた：１）２′−アジド−２１−デオキ シウリジンをシリカゲルの代りにメタノ−／Ｉ／ニア七トン（１：１マ／マ）中 の中性アルミナのカラムで精製した寥 ２）２′−アミノ−２１−デオキシウリジンは、トリフェニルホスフィン及びア ンモニアを使用する代りに、炭素上にパラジウム５％を付着した触媒の存在にお し１て２′−アジド−２′−デオキシウリジンを水素で還元して得たｌ ３）２′−７ミノー２１−デオキシウリジンのＮ−）リフルオロアセチル化はｐ −二トロフェニルトリフルオロアセテートを用いた後に、Ｓ−エチルチオールト リフルオロアセテートを使用する代りに、クロロホルム−メタ／−Ａ／（６：　 １ｖ／ｖ）中のシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって行なった。

例４ 下記式を有する５１−０−ジ−ルーアエシルフェニルメチル−２’−Ｎ−）リフ ルオロアセチル−２′−アミノ−２１−デオキシウリジン： ２　’−Ｎ−）リフルオロアセチル−２′−アミノ−２′−デオキシウリジン（ １２５９，１８ミリモル）を無水ピリジン（ｓ　ａＩＬｌ）に溶解し、ジーｐ− アニシルフェニルメチルク田リドＣ１４２９，４，２ミリモル寥アメリカンバイ オニュークリアーコーポレーション）を加えた。

オレンジ溶液を、次いで、くらがりで室温において一晩攪拌した。水（１ｏｄ） を加え、混合物を更に１時間攪拌した。溶媒を４０°Ｃで回転蒸発させて除いて 樹脂状生成物とし、これをトルエン（１００１Ｌｔ分）で２回＃蒸発させたつフ オーム状生成物を水（５０ｄ）とエチルアセテート（１００ｍ）との間に分配さ せ、層を分離し、有機層を水（５０ｄ）及び飽和塩化ナトリウム水溶液（５０１ Ｌｔ）で抽出した。エチルアセテート溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過 し、蒸発させて黄色フオームになった。このフオームを歩容量のエチルアセテー トニトリエチルアミン（’　９　：　ｉ　ｖ／ｖ）に溶解し及び同じ溶媒中に注 入したシリカゲルのカラム（３αＸ　２５　ｃｎｒ　）にかけた。カラムをエチ ルアセテート：トリエチルアミン（９：　１　ｖ／ｖ）で溶出し？生成物を含有 する留分をプールし及び蒸発させて透明なガラス状固体になった。生成物を最少 容量のエチルアセテート（約１０ｍ１）に溶解し及び室温のヘキサン（１００ｄ ）に沈殿させた。ゼラチン状の沈殿を濾過し及び真空デシケータ−内で乾燥して 結晶化されない白色粉末２．０６ｇ（５，５ミリモル、８６％）トなった。クロ ロホルム：エタノール（９：　１　ｖ／ｖ）で展開させたシリカゲル６０Ｆ−２ ５４プレート上の精製した生成物のＴＬＣ分析は短波ＵＶ検出により１つのスポ ット、Ｒｆ　α６Ωを示し、これはプレートに過塩素酸：エタノール溶液（Ｓ　 ：　２　ｖ／ｖ）を吹付けた後に、ジ−ｎ−アユシルフェニルメチルカチオン特 有の鮮オレンジ色となった。生成物の構造を更にベルシュウチリウム置換したジ メチルスルホキシド中のＩＨＮＭＲ分光分析法によって確認した。シュウチリウ ム置換したクロロホルム（アルドリッチケミカルカンパニー）中の７ツ＠（１ｑ Ｆ）ＮＭＲ分光分析法は、単一のトリ２ルオロア七チル基について予期される通 りに４０５　ｐｐｍに１つの一重線を示シタ（シュウテリム置換したクロロホル ム中のトリフルオロ酢酸に対して）。

同様に、下記の化合物を調製する： １）Ｓ’−Ｑ−ジ−ｐ−７ニシルフエ二ルメチルー２′−Ｎ−トリフルオロア七 チルー２１−アミノ−２′−デオキシイノシン。

２）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−）リフルオロアセ チル−２１−アミノ−Ｎ−−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン。

３）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロアセ チＡｌ−２’−アミノ−Ｎ４−ベンゾイル−２１−デオキシシトシン。

４）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロア七 チルー２′−アミノ−Ｎ寞　−イソブチリル−２１−デオキシグアノシン。

５）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチｈ−２’−Ｎ−（ｑ−フルオレニ ル−メチルオキシカルボニル）−２’−アミノル２１−デオキシイノシン。

６）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（９−フルオレニ ル−メチルオキシカルボニル）−２′−アミノ−Ｎ−−ベンシイｙ−２’−デオ キシアデノシン。

７）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（９−フルオレニ ルメチルオキシカルボニル％り−２１−アミノ−Ｎ４−ペンシイ、Ａ／−２’− デオキシシトシン。

ｓ）ｓ’−ｏ−ジ−ルーアエシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（９−フルオレニ ルメチルオキシカルボニル）−２１−アミノ−Ｎ３−インブチリル−２′−デオ キシグアノシン０ ９）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（９−７７メオレ ニルーメチルオキシカルボニル）−２′−アミノ−２′−デオキシウリジン。

例５ 下記式を有する５１−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ／Ｉ、　−２ｌ−５− （Ｎ−）リフルオロアセチルグリシ、　）　−２１−アミノ−２′−デオキシウ リジン：２ｌ−Ｎ−グリシル−２１−７ミノー２１−デオキシウリジン（ｔ２９ 、ｔｏミリモル）及びｐ−ニトロフェニル）　ＩＪ　フルオ豐アセテート（１２ ｇ、５．１ミリモル暮アルドリッチケミカルカンパニー）を無水ＤＭＦ（２０ｔ ｊ）Ｋ溶解し、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を次いで５０℃で回転 蒸発乾固させ、ガム状の黄色残分をエチルアセテート：メタノ−Ｉ％／（９５： ５マ／マ）中のシリカゲル６０のカラム（ｚ５ｃｎＩ×１０インチ（２５ｃｌｌ Ｉ））でフラッシュクロマトグラフィーにかけた（スチル、ダプリュ、シー、　 （ｓｔｉｔｘ、ｗ、　ｃ、　）　、カーン、エム、（Ｋａｈｎ。

Ｍ、）及びミトラ、ニー、（Ｍｌｔｒａ、ム、）ジャーナルオブオーガニツクケ ミストリー、４３．２９２５−２９２５頁（１９７８年）を参照）。生成物を含 有する留分を蒸発乾固させて白色７オームｃｔｓ９、五７ミリモル、９３％）と なり、これを結晶化させずに直接次の工程で使用した。

上記の物質（ｔＳり、エフミリモル）をドライピリジン（！！ロー分）で２回蒸 発させ、残分をドライピリジン（５ｏｄ）に溶解した。Ｎ、Ｎ−ジメチル−ラミ ノビリジン（２５ａｆ、Ｑ、１９ミリモル）、トリエチルアミン（α８ｍ！７． ５．２ミリモル）及びジーｐ−アニシル７工二ルメチルクロリド（１５４ｇ、４ ．４”リモル）を加え、オレンジ混合物を室温で一晩攪拌した。次いで−１炭酸 ナトリウム水溶液（５％Ｗ／マ、５ｏＩＬｔ）を加え、混合物をもう１５分攪拌 したつ混合物をエチルアセテート（１００１分）で２回抽出し、−緒にしたエチ ルアセテート層を１度飽和塩化ナトリウム水溶１ｖ（５０４）で洗浄し、無水硫 酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。

トルエン（１００Ｒ１分）と２回共蒸発させた後に、フオーム状黄色生成物を、 クロ田ホルム：メタノール：トリエチルアミン（８９：　１０　：　１　ｖ／ｖ ）を溶離剤として用いてシリカゲルのカラム（３ｃｍＸ　２５　ＣＭ）のクロマ トグラフィーによって精製した。生成物を含有する習分をプールし及び蒸発乾固 させて透明なガラス状固体になったっこの物質を最少のエチルアセテート（約１ ０１Ｌｔ）に溶解し及び室温のヘキサン（３００′ｍｌ）に沈殿させた。生成物 を一過し及び真空デシケータ−内で乾燥して粉末状白色固体となり、これはベン ゼン／ヘキサンから結晶化することができた。ジクロロメタン：メタノール（９ ２：８　ｖ／ｖ　）中で展開させたシリカゲル６０ア−２５４プレート上の精製 した生成物のＴＬＣ分析は短波ＵＶ検出により１つのスポット、Ｒｆα３３を示 し、これはプレートに過塩素酸：エタノール溶液（３：２ｖ／マ）を吹付けた後 に、ジ−ｎ−７ニシルフエニルメチルカチオン特有の鮮オレンジ色となった。生 成物の構造を更にべ〃シュウチリウム置換したジメチルスルホキシド中のＩ　Ｈ ＮＭＲ分光分析法によって確認した。シュウチリウム置換したクロロホルム中の ”Ｆ　ＮＭＲ分光分析法は、単一のトリフルオ四ア七チル基について予期される 通りに５．９８ｐｐｍに１つの一重線を示した（シュウチリウム置換したクロロ ホルム中のトリフルオロ酢酸に対して）、）同様に、下記の化合物を調製する： １）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフルオ ロ−アセチルグリシル）　−２１−アミノ−Ｎ２−インブチリル−２′−デオキ シグアノシン。

２）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフルオ ローア七チルグリシル）　−２１−アミノ−２′−デオキシイノシン。

り５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフルオロ −アセチルグリシル）−２’−７ミノーＮ６−ペンゾイルー２′−デオキシアデ ノシン。

４）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−）リフルオ ローア七チルグリシル）　−２１−アミノ−Ｒ４−ベンゾイル−２１−デオキシ トノシン。

ｓ）ｓ’−ｏ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−９−フルオ レニルメチルオキシカルボニル−グリシ／ｌ／）−２′−アミノ−Ｒ８−インブ チリル−２１−デオキシグアノシン。

６）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−９−フルオ レニルメチルオキシカルボニル−グリシル）　−２１−アミノ−２′−デオキシ ウリジン。

７）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチＡ／−２’−Ｎ　−（Ｎ−９−フ ルオレニルメチルオキシカルボニル−グリシル）　−２１−アミノ−２′−デオ キシイノシン。

８）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−９−フルオ レニルメチルオキシカＡ／〆ニルーグリシル）−２１−アミノ−Ｎ・−ベンゾイ ル−２′−デオキシアデノシン。

９）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチＡ／−２’−Ｎ−（Ｎ−９−フル オレニルメチルオキシカルボニル−グリシル）−２′−アミノ−Ｒ４−ベンシイ 、１％／−２′−デオキシシトシン。

物質番号４の組成： 下記の一般式を有する、物質番号３の組成において説明した化合物の３′　−〇 −ホスホルアミダイト：■ ここで、Ｒ＝前のセクション（物質番号５の組成）において規定した通りである ； Ｘ＝前のセクション（物質番号３の組成）において規定した通りである： Ｒ０＝低級アル中ル、好ましくはメチル或はイソプロピルのような低級アルキル 、或は非芳香族窒素含有複素環、例えばモルホリノ、ピペリジノ、ピロリジノ戒 はλλへ６−チトラメチルピペリジノ。

Ｒｖ＝メチル、ベーターシアノエチル、ｐ−ニトロ７エネチル、ｏ−１’ロロフ ェニｙｔ、ハｐ　−／ロロフェニル。

例 このセクションで説明する手順は、「物質番号２の組成」なる表題のセクション で説明したのと本質的に同じである。下記のホスホルアミダイト化合物を合成す るのに用いたホスフィ／出発原料は、そのセクションで挙げこ文献参考資料に従 かつ″′ｒ：調製した。

例６ 下記式を有する５′　−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’　−Ｎ−） リフルオロアセチル−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン−３′　−〇−メ チルーＮ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト：５′−０−ジ−ｐ−アユシルフ ェニルメチル−２１−Ｎ　−）　ＩＪフルオロアセチル−２′−アミノ−２′− デオキシウリジン（α９５Ｊｉｌ、１．５ミリモル）を、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピ ルエチルアミン（１，ｓｖｔ、ｓ、ｏミリモル）を含有するドライジクロロメタ ｙ（１ｏ−１五酸化リン、次いで水素化カルシウムから蒸留して乾燥した）に溶 解した。溶液な乾炊アルゴン雰囲気下室温で攪拌し及びクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイン グロビルアミノメトキシホスフィン（Ｏｌ　５ｄ、　２．４ミリモ／Ｌ／）を注 射器から約１分かけて滴下した。エチルアセテート：トリエチルアきン（９９： 　１ｖ／ｖ）において展開させたシリカゲル６０Ｆ−２５４プレート上のＴＬＣ は、反応が３０分後に完結したことを示した。次いで、無水メタノール（α１− ）を加えて過剰のホスフィチル化剤を分解し、反応を更に数分攪拌した。反応混 合物を、次いで、エチルアセテ−）（５０ｒｊ、あらかじめ１０チ（ｗ／ｖ）の 冷炭酸ナトリウム水溶液５（１ｇｌｔで洗浄した）による分液漏斗に移し、１０ チ（Ｗ／ｖ）の冷炭酸す）ＩＪウム水触触液８〇−分）で２回及び飽和冷塩化ナ トリウム水溶液（８〇−分）で２回洗浄した。有ａ溶液を、次いで、無水硫酸ナ トリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で回転蒸発させて透明なフオームに々つだ。

７オームをドライエチルアセテート（１ｏ−１ｓ−）に浴解し、この溶液を一７ ８℃（ドライアイス−アセトン浴）のへキサン（２０ｏ−）に滴下した。沈降し た生成物を濾過し、−７８℃のヘキサンでよく洗浄し、真空デシケータ−内で乾 燥して白色粉末状固体１．０４　ｆ／　（１，５ミリモル、８７％）を生じた。

生成物の構造にぺ〃シュウチリウム置換したアセトニトリル中の’ＨＮＭＲ分光 分析法によって確認した。ベルシュウチリウム置換したアセトニトリｙにおける ”ＰＮＭＲ分光分析法は、ジアステレオツーホスホルアミダイト生成物について 予期される通りの１５１１１及び１５ＣＬ４５ｐｐｍにおける２つの一重Ｍ（ベ ルシュウチリウム置換したアセトニトリル中のリン酸に対して）及び極めて微量 のみ（＜１％）の他のリン含有不純物を示した。シュウチリウム置換したクロロ ホルムにおゆるＩ”Ｆ　ＮＭＲ分光分析法も、また、隣接するキラルリンのわず かな影響により、α４２及びα５８ｐｐｍＫｍいて２つの一重線を示した（シュ ウチリウム置換したクロロホルム中のトリフルオロ酢酸に対して）、シリカゲル ＬＱ６ＤＦプレートの上記溶媒系におけるＴＬＣは、短波ＵＶ検出下で１つだけ のスボツ）、Ｒｆα９６を示した。このスポットは、過塩素酸：エタノール溶液 （３：　２　ｖ　／　ｖ　）に暴露したＩＩＫ、ジ−ｐ−アユシルフェニル−メ チルカチオンに特有の鮮オレンジ色となった。

同様に、下記の化合物を調製する： １）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−）リフルオロアセ チル−２１−アミノ−２′−デオキシウリジン−３１−０−ベーターシアノエチ ル−Ｎ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスホルアミダイト。

２）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロアセ チル−２１−アミノ−２′−デオキシウリジン−５’−０−メチル−Ｎ、Ｎ−ジ メチルアミノホスホルアミダイト。

ｓ）ｓ’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニ〃メチル−２１−Ｎ−トリフルオロアセ チル−２′−アミノ−２′−デオキシウリジン−５１−０−メチル−モルホリノ ホスホルアミダイト。

４）５’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２１−Ｎ　−）　Ｉ７　フル オロアセテルー２１−アミノ−２１−デオキシウリジン−３１−〇−ベーターシ アノエチルーモルホリノホスホルアミダイト。

５）Ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２＋　−Ｎ−）リフルオロア セチル−２１−アミノ−２′−デオキシウリジン−３’−０−ｐ−ニトロフェネ チル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

６）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’−Ｎ−）Ｉ７フルオロア セチルー２′−アミノ−２１−デオキシウリジン−ｓ’−ｏ−ベーターシアノエ チル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

７）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロアセ チル−２′−アミノ−２１−デオキシツノシン−３１−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジ イソプロピルアミノホスホルアミダイト。

ａ）ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ）％／−２′−Ｎ−）リフルオロ アセチル−２′−アミノ−Ｎ＠−ヘｙシイ）ｖ　−２’−デオキシアデノシンー ３１−〇−メチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

９）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロアセ チル−２′−アミノ−Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシシトシン−ｓ’−０− メチルーモルホリホスホ〃アミダイト。

１０）５’−０−ジーｐ−アニシルフェニルメテル−２１−Ｎ−トリフルオロア セチＡ／−２’−アミノーＮ″−インブチリルー２１−デオキシグアノシン−５ １−〇−ベーターシアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。

１１）５′−Ｏ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−）ＩＪフルオロ アセチル−２′−アミノ−２１−デオキシイノシン−３′−Ｏ−ベータシアノエ テル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１２）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ／Ｌ／−２’Ｎ−（−９−フル オレニ〃メチルーオキシカルボニル）−２′−アミノ−２′−デオキシウリジン −５′−０−ベーターシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルア ミダイト。

１３）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニルーメチルーオキシカルボニル）−２１−アミノ−２′−デオキシクリジン− ３′−メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

１４）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ／ｌ／−２’Ｎ−（−９−フル オレニル−メチ〃−オキシカルボニル）−２′−アミノ−２′−デオキシウリジ ン−３′−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１ｓ）５’−０−ジーｐ−アニシ／ｌ／フェニ〃メチル−２’Ｎ−（−９−フル オレニル−メチル−オキシカルボニル）−２′−アミノ−２′−デオキシウリジ ン−３′−〇−メチルーモルホリノホスホルアミダイト。

１６）５’−０−ジーｐ−アニシ〃フェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニル−メチル−オキシカルボニル）−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン− ３′−Ｏ−ベール−シアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。

１７）　５　’　−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１Ｎ−（−ｑ−フ ルオレニル−メチル−オキシカルボニル）−２１−アミノ−２１−デオキシウリ ジン−３“−〇−ｐ−二トロ７エネチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミ ダイト。

１ａ）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニル−メチル−オキシカルボニル）−２′−アミノ−２′−デオキシクリジン− ３１−〇−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト 。

１９）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニル−メチル−オキシカルボニル）−２１−アミノ−２′−デオキシイノシン− ３′−〇−メチノＪ−１〜．Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

２０）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニル−メチル−オキシカルボニル）−２１−アミノ−Ｎ６−ペンゾイルー２１− デオキシアデノシン−５’−０−メチ、Ｆ／−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホル アミダイト。

２１）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニル−メチル−オキシカルボニル）−２１−アミノ−Ｎ４−ベンゾイル−２１− デオキシシトシン−３′−〇−メチルーモルホリノホスホルアミダイト。

２２）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’Ｎ−（−９−フルオレ ニル−メチル−オキシカルボニル）−２′−アミノ−Ｎｔ　−インブチリル−２ １−デオキシグアノシン−５′−０−ベーターシアノエチル−モルホリノホスホ ルアミダイト。

２３）５’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２’Ｎ−（−９−７〃オレ ニｙ−メチ〃−オキシカルボニル）−２′−アミノ−２′−デオキシイノシン− ３１−〇−ベーターシアノエチルーＮ　、　？Ｊ−ジメチルアミノホスホル下記 式を有する５゛−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−）リ フルオロアセチルグＩＪ　Ｘ／ル）−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン− ３′−０−メチル−Ｎ　＊　Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト： ５′−〇−ジーｐ−アニシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−トリフルオロア セチル−グリシル）　−２’−７ミノー２１−デオキシウリジン（１，０７１！ 、１．５ミリモル）を、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１，３ｇＩｔ。

５、．０ミリモル）を含有するドライジクロロメタン（１〇−１五酸化リン、次 いて水素化カルシウム力・ら蒸留して乾燥した）に溶解した。溶液を乾燥アルゴ ン雰囲気下室源で攪拌し及びクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホ スフィン（ｌ１４５ｄ、２．４ミリモル）を注射器から約１分かけて滴下した。

エチルアセテート：トリエチルアミン（９９：１ｖ／ｖ）において展開させたシ リカゲル６ｏｐ−２ｓ４プレート上のＴＬＣζ家、反応が３０分後に完結したこ とを示した。無水メタノール（［ｌＬ１＋ｄ）を加えて過剰のホスフィチル化剤 を分解し、反応を更）Ｃ数分攪拌した。反応混合物を、次いで、エチルアセテ− ）（ｓｏｉ、あらかじめ１０チ（ｗ／ｖ）の冷戻１ｚナトリウム水溶ｇ、５０ｍ ｇで洗浄した）による分液漏斗に移し、１０　％　（ｗ　／マ）の冷炭酸ナトリ ウム水溶液（８〇−分）で２回及び飽和冷塩化ナトリウム水溶液（８〇−分）で ２回洗浄した。有機溶液を無水Ｆ！ｆ、酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下 で回転蒸発させて透明なフオームに乏っだ。フオームをドライエチルアセテ−） （１０−１５艷）に溶解し、この溶液を一７８℃（ドライアイス−アセトン浴） のヘキサン（２０ｏａｇ）に滴下した。沈降した生成物を濾過し、−７８℃のヘ キサンでよく洗浄し、真空デシケータ−内で乾燥して白色粉末状固体１．２５１ ７　（１，４ミリモル、９３％）を生じた。生成物の構造をベルシュウチリウム 置換したアセトニトリル中の’ＨＮＭＲ分光分析法によって確認した。ベルシュ ウチリウム置換したアセトニトリルにおけるＡｌｐＮＭＲ分光分析法は、ジアス テレオマーホスホルアミダイト生成物について予期される通りの１５１．２５及 び１４＆９６ｐｐｍにおける２つの一重級（ベルシュウチリウム置換したアセト ニトリル中のリン酸に対して）及び極めて微量のみ（＜２９りの他のリン含有不 純物を示した。シュウチリウム置換したクロロホルムにおける”ＦＮＭＲ公党分 析法はα６６　ｐｐｍにおける１つの−Ｍ線を示した（ジュクテリウム置換した トリフルオロ酢ａＫ対して）。シリカグ＃ＬＱ６ＤＦプレート上の上記溶媒系に おけるＴＬＣは、短波ＵＶ検出下で１つのみのスポット、Ｒｆα９１を示した。

このスポットは、過塩素酸：エタノール溶液（５：　２　ｖ　／　ｖ　）に暴露 した際に、ジ−ｐ−アユシルフェニルメチルカチオンに特有の鮮オレンジ色とな った。

同様に、下記の化合物を調製する： １）ｓ’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２　′＋＋Ｎ−（Ｎ−）リフ ルオロアセチル−グリシル）−２’−アミノ−２′−デオキシウリジン−３１− ０−ベーターシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト 。

２）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−）リフルオ ロアセテルーグリシル）　−２＋　＋＋アミノー２′−デオキシクリジン−６１ −〇−メチルーＮ。

Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

３）５’−０−ジーｐ−アニシル７工二ルメチル−２′−Ｎ−（Ｎ−）リフルオ ロアセチル−グリシル）−２′−アミノー２１−デオキシクリジン−３１−０− メチル−モルホリノホスホルアミダイト。

４）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−）リフルオ ロアセチル−グリシル）　−２′＋＋アミノー２′−デオキ７ウリジ７−５’− ０−ベーターシアノエチル−モルホリノホスホルアミダイト。

ｓ）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ　−（Ｎ　−）　Ｉ Ｊフルオロアセチル−グリシル）−２°−デオキシクリジン−３’−０−ｐ−二 トロ７エネｆｆ１−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

６）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−）す７）ｖ オロアセチルーグリシル）−２’−アミノ−２゛−デオキシウリジン−３１−Ｏ −ベータシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

７）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフルオ ロアセチル−グリシル）　−２１−アミノ−２１−デオキシイノシン−３１−〇 −メチｙ−Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

ａ）ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフルオ ロアセチル−グリシ／Ｉ／）−２’−アミノ−Ｎ６−ペンゾイルー２１−デオキ シアデノシン−３’−０−メチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト 。

？）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−）リフルオ ロアセチル−グリシル）−２１−アミノ−Ｎ４−ぺ／シイルー２１−デオキシシ トシン＝ｓ’−０−エチルモルホリノホスホルアミダイト。

Ｎ−（Ｎ−）リフルオロアセチル−グリシル）−２１−アミノ−２１−デオキシ イノシン−３１−〇−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホル アミダイト。

１１）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２＋　−Ｎ−（Ｎ−トリフ ／Ｉ／オロアセチルーグリシル）　−２＋　−アミノ−Ｎ＠−ベンシイ＃　−２ ’−デオキシアデノシンー５”−０−ｐ−ニトロフェネチル−Ｎ。Ｎ−ジメチル アミノホスホルアミダイト。

１２）５’−０−ジーｐ−アニシｙフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフル オロアセチル−グリシル）−２１−アミノ−１Ｉ４−ヘンシイルー２１−デオキ シシトシン−ｓ’−０−ベーターシアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。

１３）５’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２′−Ｎ−（Ｎ−９−フル オレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル）−２′−アミノ−２１−デオキ シクリジｙ−３１−Ｏ−ベーターシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホ ルアミダイト。

１４）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−９−フル オレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル）　−２１−アミノ−２′−デオ キシイノシノー３’−０−ベーターシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホス ホルアミダイト。

１ｓ）ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチＡ−２’　−Ｎ−（Ｎ−９−フ ルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシ／／）−２’−アミノ−Ｎ＠−ベ ンゾイル−２１−デオキシアデノシン−３１−０−ｐ−ニトロフエネテμｍＮ、 Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１６）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２Ｔ　−Ｎ−（Ｎ−９−フ ルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル）−２′−アミノ−Ｎ４−ベン ゾイル−２１−デオキシシトシン−３Ｉ−ｏ−ベーターシアノエチル−モルホリ ノホスホルアミダイト。

発明の用途 １）５１−７ミノ末端を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成。

保護５１−アミノ−ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いて５′−アミン末端 を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成するのに含まれる段階を例８ の式に示し及び下記のテキストにおいて説明する。

標準のホスホルアミダイ）ＤＮＡ合成技法（英国、オツクスホード、ＩＲＬプレ ス、ゲイト、エム、ジエイ、。

「オリゴヌクレオチドシンセシス：アプラクチカルアプローチＪ（１９８４）、 ５５−８２頁、アトキンソンテイ、　（Ａｔｋｌｎａｏｎ　Ｔ、　）及びスミス 、エム及びその中に引用されている参考文献を参照）を用いて、保護５°　−ア ミノ−ヌクレオシド−３′　−０−ホスホルアミダイト、好ましくはＢｎ＝チミ ン、Ｘ　−Ｍ　Ｍ　Ｔ　、　Ｒ＊　＝イソプロピル、Ｒ７＝メチ、Ｉ′Ｉ／戊は ベーターシアノエチル、最も好マシくはベーターシアノエチルであるものを、固 体支持体に結合された成長オリゴ−デオキシリボヌクレオチドの５′　−ヒドロ キシルにカップリングさせる。簡単に言えば、この手順は無水のアセトニトリル 溶液中の保護５′−アミノーヌクレオシド３１−０−ホスホルアミダイトを支持 体に粘合したオリゴヌクレオチドと、不活性雰巳気下１Ｈ−テトラゾールの存在 において反応させ、支持体上の生成物から過＝」の反応体を洗い去り、次いで、 項基住テトラヒドロフラン不溶液中のヨウ素溶液でホスファイト生成物を酸化し て所望のホスフェートにすることから成る。支持体に結合したオリゴヌクレオチ ドに対し、１０〜２０倍Ａｉｒのホスホルアミダイト及び５０〜１００倍過剰の テトラゾールを用いるのが普通であり；保該５°　−アミノホスホルアミダイト を用いて合成する場合、２０倍過刺のホスホルアミダイト及び１００倍過剰のテ トラゾールが好ましい。こｎらの条件下で、ｈｉ　ｋｉ　Ｔ−保護された（例３ ）ホスホルアミダイトは常習的に９０−より良好な収率で、通常９５チより良好 な収率でカップリングする。カンプリングは６分のカップリング反応時間及び３ 分の欧化反応時間を用いて手動により行なうか、或は随伴するブレプログミド合 成サイクルを用いてアプライドバイオシステムメモデル３８０Ａ自動操作ＤＮＡ 合成装置（或はホスホルアミダイト化学に適応させるように設計された同様の器 械）により行なうことができる。

５１−アミノオリゴヌクレオチドは、次いで、濃水酸化アンモニウム溶液で室温 において少なくとも４時間処理して支持体からＤＮＡを開裂させた後に、ＤＮＡ 塩基を同じ溶液中５５℃において１２〜１６時間脱保獲することによって得る。

Ｒ，＝メチルである時、ＤＮＡを支持体から開裂させる前に、ジオキ？ｙ中のト リエチルアンモニウムチオ７エンオキシドで室温において１時間処理することも 必要とする。

Ｘ　＝　ＭＭ　Ｔである時、水散化アンモニウムにおける開裂及び脱保護処理は 、塩基不安定、数年安定のＭＭＴアミノ保護基に影響を与えない。これより、所 望の生成物はＭ　Ｍ　Ｔ部分を５１−アミノ基上に保護する。このＭＭＴ基は所 望の生成物ＤＮＡに増大した疎水性を付与し、Ｃ１８カラムによるＲＰ　ＨＰＬ Ｃ間の保持時間を著しく増大させることになる。不純物混入破損ＤＮＡシーケン スは所望のオリゴヌクレオチドよりずっと早くカラムから溶出し、次いで後者が 清浄な、よく分離された様式で溶出する。ＭＭＴ保５基を、次いで、酢Ｗｌ／水 （８０：２０ｖ／マ）溶液で室温において２０〜３０分間温和な酸処理して除き 、極めてＰＩ製された遊離アミノオリゴヌクレオチドを生ずることができる。

例８ ５’−Ｎ−ｐ−７ニシルジフエニルメチルー５１−アミノ＋＋　ｓ　＋−デオキ シチミジン−ｓ’−０−メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダ イトを用いた３　’＞ＨＯ−ＣｐＡｐＴｐＧＰＣＰＴＰＧｌ）Ｔ−ｈ’Ｈ＊　＜ ｓの合成オリゴデオキシリボヌクレオチド ３　’＞ＨＯ−ＣｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＧ−ＯＨ＜５　”ｒ：、［９のホスホ ＃アミダイ）ＤＮＡ合成技法にニーヨーク。プレナムプレス、セトロク、ニー、 及びホランダー、ジエイ、ケイ。

鰻集「ジエネチツクエンジニアリングＪ（１９８２年）。

ａ＠、１−７７頁、カルザース、エム、エッチ６．ビューケージ、ニス、エル（ Ｂｅａｕｃａｇｅ　＋　Ｓ、　Ｌ、　）　＋　＜ツカー瞥シ＋、、！７カピツチ 、ダブリｚ　、　（Ｅｆｃａｖｉｔｃｂｖ　Ｗ、　）　。

フィッシャー、イー、ｚ７．、ガルビワジー−（Ｇａｌｌｕｐｉ　。

Ｇ、）、ゴールドマン、アール０．ドハーゼス瞥エフ・（ｄｅ　Ｈａｓｅｔｈ＋ 　Ｆ、　）　＊　マーチン、エフ０．マチラッチ。

エム９．スタビンスキー、ワイ、　（５ｔａｂｉｎａｋ７．　Ｙ−）　）を用い て、手動でアミノプマビルシリカ支持体（結合５１−０−ジメトキシトリチル− Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシシチジン約４マイクロキルを含有する）上に 合成した。５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン、５１−０−ジメトキシトリ チル−Ｎ＠　−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシン　ｓ　ｌ　−Ｑ−ジメト キシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシシトシン及ヒｓ　＋　−０− ジメトキシトリチル−Ｎ！　−インブチリル−２′−デオキシグアノシンの３１ −〇−メチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトを公表された 手順（マクブリッジ、エル、ジエイ、及びカルサース、エム。

エッチ１．テトラヘドロンレターＸ、２４，２４５−２４８頁（１９８３年）） に従がって合成した。合成の各サイクルの後にジメトキシトリチルカチオンの収 率を分光分析法分析して、ヘプタイマーについて総括収率８＆８％、段階収率９ ７．７チを示した。支持体をＭＭＴ−保護されたホスホルアミダイトで処理した 。担体結合されたオリゴデオキシリボヌクレオチドに対して２０倍：Ａ剰のホス ホルアミダイト及び１００倍過剰の１Ｈ−テトラゾールを用い、カンプリング反 応時間を６分及び酸化反応時間を３分にした。

洗浄し及び乾燥した後に、支持体をジオキサン中のトリエチルアンモニウムチオ フェノキクドで１時間処理し、よく洗浄し、乾燥し、しつかりキャップをしたコ ニカル遠心管中湯水酸化アンモニウムで室温において４時間処理した。次いで、 上溌液を支持体からデカントし、濃水酸化アンモニウムの別のアリコートを加え 、溶液をしつかりシールした管（ゴム隔壁）内で５５℃において１６時間加熱し た。ＤＮＡ宮有溶液を、次いで、１．５　ｄエツベンドルフ（Ｅｐｐｅｎａｏｒ ｆ　）管にアリコートし、凍結乾燥し、生成したベレットを水に溶解した。オリ ゴヌクレオチド溶液のアリコートを、次いで、２つのアルテックス（Ａｌｔｅｚ ）　１１ｏＡポンプ、デュアルチャンバーグラジェントミキサー、レオダイン（ Ｒｈｅｏｄｙｎｅ　）インジェクター、クレイトス（Ｋｒａｔｏｓ　）　７５７ ＵＶ−ＶＩ　Ｓデテクター、アクシオム（Ａｘｘｉｏｍ　）　７１０コントロー ２−から成るＲＰＨＰＬＣシステムでクロマトグラフィーにかけた。Ｖｙｄａｅ 　Ｃ１ｓカラム（５ミクｏｙ、２５ｃｍ）を使用した。

ＭＭＴ保護された５′−アミノ−５′−デオキシチミジンホスホルアミダイトか ら誇導したアミノオリゴヌクレオチドを、初めに、２０チ緩衝液Ｂ／８０チ緩衝 液人の６０チ緩衝液Ｂ／４０チ緩衝液人への線状勾配を４０分にわたって用いて （Ｍ衝液Ａ及びＢは前で説明した通りである）、ジメトキシトリチル化付加体と してクロマトグラフィーにかけた。これらの条件下で、生成物が５９分に溶出し た（流量１ｇＩｔＺ分）。ＭＭＴ生成物のｖ４製運転を打力い、生成物を捕集し 及び凍結乾燥し、ベレットを酢酸／水（８０：２０ｖ／マ）で室温において２０ 分間処理した。凍結乾燥し及び水に再溶解した後に、アリコートをＦｍｏｅ９導 オリゴヌクレオクチドの場合と同じ染件を用いてクロマトグラフィーにかけた。

生成物が１７．５分に溶出した。精製したアミノオリゴヌクレオチドはＤＮＡｔ ｔ象徴するＵＶスペクトル（２６０ｎｍにおける主ピーク）を有していた。

下記の化合物を同様の方式で用いて対応する５“−アミノオリゴヌクレオチドを 作ることができる：１）５’−Ｎ−ｐ−アニシｙジフェニルメチルー５′−アミ ノ−５′−デオキシチミジン−３′−〇−メチルーＮ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

２）５’−Ｎ−Ｐ−アユシルジフェニルメチル−５′−アミノ−５１−デオキシ チミジン−３′−〇−メチルーＮ。

Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

３）　５　’　−Ｎ　−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５′−アミノ−５１− デオキシチミジン−ｓ”−ｏ−メチルモルホリノホスホルアミダイト。

４）５’−Ｎ−Ｐ−アユシルジフェニルメチル−５’−フミノー５１−デオキシ チミジン−３１−０−ベーターシアノエチルモルホリノホスホルアミダイト。

５）　５　’　−Ｎ　−ｐ−アニシルジフェニルメチＡ／−５’−アミノ−５′ −デオキシチミジン−ｓ’−０−ｐ−二トロ７エネチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミ ノホスホルアミダイト。

６）　５　’　−’Ｎ　−ｐ−アユシルジフェニルメチル−５ａ−アミノ−５１ −デオキシチミジン−Ｓ　＋　＋＋　Ｏ−ベータシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチ ルアミノホスホルアミダイト。

２）５゛−末端に螢光部分を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの水溶液 における合成。

オリゴヌクレオチドの５°　−末端上に核的な脂肪族アミノ基が存在することは 、アミノＤＮＡと種々の電子性試薬、とりわけアミン反応性螢光染料誘導体との それ以上の反応を可能にさせる。このような染料誘導体を１下記を含み、これら に限定されない：フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン イソチオシアネート、ニオシンインチオシアネート、エリスロシンイソチオシア ネート、ローダミンＸインチオファネート、’）　ｔ　ｉ　７　（ｌｉｓｓａｍ ｌｎｅ　）ローダミンＢスルホニルクロリド、テキサスレッド、ルシ７アーイエ ロー、アクリジン−９−イソチオシアネート、ピレンスルホニルクロリド°・７ −ジエチルアミノー４−メチルクマリフ＄−）、４−フルオロ−及び４−クロロ −７−ニドロベンズー２−オキサ−１．５−ジアゾール及びそれらの誘導体、例 工ばスクシンイミジル１２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（７−ニドロベンズー２−オキ サ−１．３−ジアゾール−４−イル））アミノドデカノエート。生成した染料− オリゴヌクレオチド接合物（　ｃｏｎｊｃｇａｔｅ　）を、次いで、種々の診断 或は検出用に使用することができる。

染料分子をアミノオリゴヌクレオチドに結合させるのに用いる基本的な手順は、 アミノＤＮＡ及び染料をｐＨ９にｆｆ１％した水性（戒は水性／有機性）溶液中 で結合させ、室温において数時間静置させ、次いで生成物を２段階で絹製するこ とである。過剰の未反応染料を染料−ＤＮＡ接合物から除き及び未反応のＤＮＡ をゲル濾過によって除く。凍結乾燥した後に、ＲＰ　ＨＰＬＣを用いて純染料− ＤＮＡ接合物を得る。

例９ フルオレセイン−５−イソチオシアネートと３’＞ＨＯ−ＣｐＡＰＴＰＧＰＣＰ ＴｐＧＰＴ−ＮＨＩ　＜５　’　との結合５１−アミノオリゴヌクレオチドを例 ８に記載する通例９についての反応スキーム を３３分で溶出した（　２　６　０　ｎｍにおけるＵＶ検出、りにして合成した 。′８製したアミノオリゴヌクレオチド２　４　０　ｎｍにおける螢光励起、５ ２５ｎｍパンドパスフ例えは無水ピリジン中２ｏ＊（ｖ／ｖ）の第三アミン或は 無水ピリジン中α５　Ｍの１゜８−ジアザビシクロ〔ｓ４０〕ウンデカ−７−二 ン（ＤＢＵ）下、室温においてオリゴヌクレオチドホスフェートトリエステルか らベーター　シフ／、！？ル基ヲ取り去ってホス７エートジエステルとすること ができるので、必要である。厳密に無水状態が観測されるならば、このような処 理はＤＮＡに他の影響を与えたり、支持体から認め得る量を開裂したりしない。

自由アミノ基を有するトリエステル含有オリゴヌクレオチドは、染料との迅速な 反応を行なうのに必要とする塩基性の条件下で不安定であり及び分解して今まで のところ未識別の（ｕｎｅｈａｒａｅｔｅｒｉｇｅｄ　）　Ｄ　Ｎ　Ａ様になり 、もはや実施し得るアミン末端をもた力くなるので、ジエステルの生成は臨界性 である。ジエステル形への転化はこの分解を阻止する。

また、数年安定な保護基、例えばｐ−アニシルジフェニルメチ／ｌ／（ＭＭＴ） を５′−アミノ−５１−デオキシチミジンホスホルアミダイト上に用いてオリゴ ヌクレオチドに５１−アミン末端を導入することが必要である。これは、ＭＭＴ 基が、前述したＤＮＡの環基性分解を防止することを必要とする、ホスフェート 保護基を除くのに必要とする塩基性条件に安定であり、次いで、ＤＮＡが支持体 に結合されたままである温和な酸性条件を用いて取り去り、とうして染料と反応 するための遊離アミノオリゴヌクレオチドとすることができるので、必要とする 。

アミノオリゴヌクレオチドへの染料結合は、無水のＮ。

Ｎ−ジメチルホルムアミダイト／第三アミン、好ましくはＮ、Ｎ−ジイソプロピ ルエチルアミン（９ｏ：１゜ｖ　／　ｖ　）　＊はトリエチルアミン（８０：　 ２０　ｖ　／　ｖ　）中過剰の染料（１０〜１００倍）を濃溶液で用いて行なう 。

１２〜２４時間の後に、過剰の染料を洗い去り、染料−ＤＮＡ接合物を支持体か ら開裂し、及び例８に記載した標準の条件下で濃水酸化アンモニウムを用いて塩 基保護基を取り去る。生成物を次−でＲＰ　ＨＰＬＣによって精固体支持体上で のエオシン−５−インチオシアネート及び−ｒ　＃　？　スｖ　ｙ　Ｙ　トｓ　 ’＞ＨＯ−ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ−ｈ％　＜５　’との結合 つ オリゴデオキシリボヌクレオチド Ｓ’＞ＨＯ−ＴｐＴＰＴＰＴＰＴｐＴ−ＯＨ＜５’　を、ベーターシアノエチル 保護ホスホルアミダイト（アメリカンバイオニュークリアコーポレーションから 得るか或は例３に記載した通りにして合成した）を用いて例８に記載する通りに して１マイクロモルスケールで制御された細孔ガラス支持体上に合成した。各サ イクルの後のジメトキシトリチルカチオンの収率の分析は、ヘキサマーについて 総括収率８９．６チ、段階収率９７．８ヂを示した。５’　−Ｎ−ｐ−アユシル ジフェニルメチル−５′−アミノ−ｓ　ｌ　＋デオキシチミジンー３′−０−ベ ーターシアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトの最終 付加を例８に記載する通りにして行なった。

ＤＮＡ約ｃＬ５ｕモルを含有する、完全に保護され、支持体結合されたアミノオ リゴヌクレオチド（支持体的２０Ｔｑ）のアリコートを、次いで、無水ピリジン （５００μり中Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（アルドリッチケミカルカンパ ニー）の５チ（、／マ）溶液と無水ピリジン（ｓｏｎμｊ）中ｐ−アニシルジ７ 工二ルメチルクロリドの１０　’ｉｒ　（ｗ／マ）溶液との混合物で室温におい て１時間処理した。これは、全ての末端アミノ基を保護することを確実にするた めに行なったもので、染料結合をオリゴヌクレオチド合成のすぐ後で行なうこと ができるならば、おそらく不必要である。支持体を、次に、ドライピリジンでよ く洗浄し、無水ピリジン中１５ＭＤＢＵで室温において２時間処理した。支持体 を再びピリジンで、次いでジエチルエーテルでよく洗浄し及び風乾した。対照と 同じように通常の通りにして、アルコート（約４岬）を採取して開裂し、脱保ｉ し、ＲＰ　ＨＰＬＣを行なった。

ドライ支持体結合ＭＭＴ保護アミノオリゴヌクレオチドを酢酸／水（８０：２０ マ／Ｙ）で室温において２０分間脱トリチル化（ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｅ　）　 した。支持体を、次いで、水及びメタノールで洗浄し及びトリエチルアミンな無 水ピリジンに溶解したもの（２０：８０マ／マ）で２０分間処理してアセテート 塩から遊離アミンを発生させた。それをピリジン及びエーテルで洗浄し、空気及 び真空乾燥した。対照と同じように通常の通りにしてアリコート（４呼）を採取 し、開腹し、脱保詮し、ＲＰＨＰＬＣを行なった。

染料結合反応を１．５−二ツペンドルフ管内で行なった。

染料はオレゴン、ジャンクションシティ、モレキュラーブロープズインコーボレ ーテツドから得た。約１１０モルの支持体結合アミノオリゴヌクレオチド（４− ５岬）を、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１０チ（マ／Ｖ）を含有する無 水ＤＭＦ（ｓｏμ））中のエオシン−５−インチオシアネート（五５岬、５０倍 過剰）か或はテキサスレッド（１４岬、３８倍過ｙｊ）のいずれかで処理した。

反応を暗がりで呈協において１２〜１６時間進行させた。反応混合物を、次いで 、小さいガラスークリツテド漏斗に移し、ＤＭＦ、メタノール及びエーテルでよ く洗浄し、風乾した。この時点で、エオシン結合支持体はピンク色で、テキサス レッド結合支持体は紫色であった。両方の支持体は長波ＵＶ先光下強い螢光を発 した。

各染料−ＤＮＡ接合物を例８に記載した通りにして（濃水酸化アンモニウム中室 温において４時間）支持体から開裂させ及び塩基脱保護条件（濃水酸化アンモニ ウム中５５℃において１２時間）Ｋ暴露させた。ポリーＴオリゴヌクレオチドに ついては不必要であるが、この後者の処理を行なって染料部分及び染料−ＤＮＡ 結合に対する処理の効果を試験した。螢光性の強いオレンジ（エオシン）及びビ ンクー赤色（テキサスレッド）染料−ＤＮｋｍ液を、次いで、凍結乾燥し、水に 溶解し及び各螢光性オリゴヌクレオチドな、１０分にわたる１０％緩衝液Ｂ／９ ０チ緩衝液Ａの３０チ酸衝液Ｂ／７０チ緩衝液人への、次いで１０分にわたる３ 〇−緩衝液Ｂ／７０チ緩伽液人の６０チ繊衝液Ｂ／４０チ峻ｉ＆′ｉ液人への碕 状勾配（ｍｙ；ｐ人及びＢは例８に記載した通りである）を用いたＲＰ　ＨＰＬ ＣによってＮ製した。

２つの染料−オリゴヌクレオチド接合体のＨＰＬＣ分析は、エオシン−５−イン チオシアネートの場合、出発アミノオリゴヌクレオチドの消失から判断して、反 応は約８０チの完結まで進行していたが、一方テキサスレッド、スルホニルクロ リドの場合、反応は約２０〜５Ｏｔｓの完結にまで進行していたＫすぎないこと を示した。各クロマドグ２ムにおいて、非誘導体合成のアミノオリゴヌクレオチ ドを表わすピークを１６分に観測した。所望のエオシン−ＤＮＡｆ＝合物はカラ ムから２５分に溶出し、テキサスレッド−ＤＮＡ接合物は２９．５分に溶出した 。

例５に記載した溶液法を用いて別々に合成した出発アミノオリゴヌクレオチド及 び各螢光性オリゴヌクレオチドの対照ＨＰＬＣ分析は、上記の割り振り（アサイ ンメント）を確認した。加えて、テキサスレッド−オリゴヌクレオチドは脱保護 条件によってそこなわれずに出現したが、エオシン−オリゴヌクレオチドは少量 の分解を受けたようであった。しかし、両方の場合において、固相法を用いた染 料−ＤＮＡ接合物の総括収率は溶液法を用いた場合と同じ程に良好であるか或は それより一層良好であり、仕上は及び精製はずっと簡単であった。各々の精製し た染料−ＤＮＡ接合体のＵＶ可視スペクトルは予想される通りに２つの主ピーク を示した；エオシン−オリゴヌクレオチドの場合、２ｄ２ｎｍにおけるピーク（ ＤＮＡ吸光度）及び５２４　ｎｍにおけるピーク（染料吸光度）；及びテキサス レッド−オリゴヌクレオチドの場合、２６２　ｎｍにおゆるピーク（ＤＮＡ吸光 度）及び５９６　ｎｍにおけるピーク（染料ａ光度）。

同様の接合物は、フルオレセイ／インチオシアネート、テトラメチルローダミン インチオシアネート、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンインチオシア ネート、四−ダミンＸインチオシアネート、リサミンローダミンＢスルホニルク ロリド、ピレンスルホニルクロリド、７−ジエチルアミノ−４−メチル−クマリ ンイソチオシアネート、４−フルオロ−７−ニドロベンズー２−オキサ−１，３ −ジアゾ−々、−一クロロー７−二トロベンズー２−オキサ−１，３−ジアゾー ル、アクリジン−９−インチオシアネート、ルシファーイエローを用いて得るこ とができる。

４）１つ又はそれ以上のインターナル脂肪族アミノ基を含有するオリゴデオキシ リボヌクレオチドの合成。

「物質書号４の組成」力る表題のセクションにおいて記載したトリフ／Ｉ／オロ アセチル保！（Ｔｒａ−保護）２１−アミノ−２１−デオキシウリジン−３１− 〇−ホスホルアミダイトを用いてＤＮＡオリゴマー中の内部位置に１つ又はそれ 以上の自由アミノ基を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成すること ができる。これは、これらの化合物におけるアミノ基の位置（すなわち、糖環の ２′−炭素原子上）がＤＮＡ鎖の５’、５’−ホスホジエステル主鎖の形成にお いて含まれないので、可能である。それ故に、例８に記載した標準のホスホルア ミダイ）ＤＮＡ合成技法を用いてこれらの化合物を、固体支持体に結合させた成 長オリゴデオキシリボヌクレオチドの５′−ヒドロキシルにカップリングさせる ことができる。保護５Ｉ−アミノ−５°−デオキシチミジン化合物であって、そ れらの使用は５′−末端上のアミノ基の存在により成長ＤＮＡ鎖を停止させるも のと異なり、’ｆｆ＊保獲２′−アミノー２゛−デオキシウリジン化合物の５° −ヒドロキシｙ上に存在するｓ　ｌ　−ｏ−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチ〃基 を合成の次のサイクルで除いて、通常の手順によって合成オリゴヌクレオチドを 更に伸長させるのを可能にすることができる。Ｔｆａ保８２’−アミノ−２′− デオキシウリジンユニットは鎖の任意の位置に挿入することができ、生成したオ リゴマーは任意の所望数の反応性アミノ基を含有することができる。

これらの化合物は、例８に概略した化学を用いて成長ＤＮＡ鎖にカップリングす ること一層できるが、２＋位に水素と異なる基鱒：存在することは、通常のデオ キシリボヌクレオチドホスホルアミダイトを用ｂ″′Ｃ′Ｃ観測のと同様のカッ プリング効犀を達成するのに一層長いカップリング時間を用いることを必要とす る。もう一度、支持体結合オリゴヌクレオチドに対して１０〜２０倍過剰のホス ホルアミダイト及び５０〜１００倍過剰のｔＨ−テトラゾ−〃を必要とし、この 場合、過剰が大きｂ根強く好ましい。これらの童を使用したカップリング時間は 。

通常のホスホ／Ｉ／７ミダイトカツプリングについて６分を用いるのに対して、 １〜１．５時間にするのが普通である。

Ｔｆａ保＠　２　）−アミノ−２１−デオキシウリジンホスホルアミダイトはこ の一層長いカップリング時間の間にある程度の分解を受けるようであるので、１ つの伸長カップリングに２或は３短かいカンプリング（各々２０〜３０分）が好 ましい。これらの条件下で、Ｔｆａ保護２′−アミノ−２＋−デオキシクリジン −３１−〇−ホスホルアミダイト（例６及び７）は、常習的に８０チより良好な 収鹿で、通常８５％より良好な収率でカップリングする１つ又はそれ以上のイン ターナルアミノ基を含有するオリゴヌクレオチド生成物を、次いで、例８に略述 する欅準の開裂及び脱保詳条件を用いて得る。Ｔｆａ基は塩基不安定であるので 、濃水醪化アンモニウム処理する間に容易に除去されて、所望数の自由アミノ基 を含有するオリゴヌクレオチド生成物を生じる。生成物ＤＮＡは、凍結乾燥した 後に、上述した通りにＲＰ　ＨＰＬＣか或はゲル電気泳動のいずれかによって精 製することができる。その上、粗製生成物ＤＮＡは５′−〇−ジーｐ−アニシル フェニルメチル基な含有して得ることができ、こうして５’−Ｎ−ｐ−アニシル ジフェニルーメチル基について記載したのと同様の方法でＲＰ　ＨＰＬＣ精製を 簡単にすることができる。

５゛−Ｏ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２°−Ｎ−トリフルオロアセチル −２１−アミノ−２′−デオキシウリジン−３′−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジイソ プロピルアミノホスホルアミダイトを用いた Ｓ　’＞ＨＯ−ＣｐＡｐＴｐＧｐＣｐＵ（２’−昌）　ｐＧｐＴ−ＯＲ（５＋及 び５′−〇−ジーｐ−アニシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−）リフルオル アセチルグリシＡ／）　−２’−アミノー２１−デオキシウリジン−３１−〇− メチル−Ｎ、Ｎ−ＮＨ，迅ＮＣ凡Ｃ０ＮＦ（ オリゴデオキシリボヌクレオチド ３’＞ＨＯ−ＣＰＡｐＴｐＧｐＣ−ＯＨ＜５’　を例８　に記載したＡりにして 手動でアミラブルピルシリカ支持体上に合成した。次いで、支持体を２つの等し い部分に分けた。一方の部分子ｔ　ｓ　’　−ｏ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメ チル−２’−Ｎ−）リフルオ四アセチルー２１−アミノ−２１−デオキシウリジ ン（ＤＭＴ−ＴｆｍＮＨｄＵ）ホスホルアミダイトとのカップリングに用い及び 他方を５１−〇−ジーｐ−アニシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−）リフル オロアセチル−グリシル）　＋　２１−アきノー２１−デオキシウリジｙ（ＤＭ Ｔ−ＴｆａＧｌｙＮＨｄＵ）ホスホルアミダイトとのカップリングに用いた。各 々の場合において、各々３０分の２つの逐次カップリングを酸化反応の前に行な い、支持体をカップリングの間に無水のアセトニトリルでよく洗浄した。各々の カップリングにおいて、２０倍過剰のホスホルアミダイト及び１００倍過剰の１ Ｈ−テトラゾールを用いた。これらの条件下で、ＤＭＴ−ＴｆａＮＨｄＵホスホ ルアミダイト及びＤＭＴ−ＴｆａＧｌ）’ＮＨｄＵホスホルアミダイトは共に収 率８３〜８５チ（このサイクルの後にジメチオキシトリチルカチオンの収車で判 断して）でカップリングした。３分の酸化反応及び３分のキャッピング反応の後 に、最後の２つのヌクレオチドホスホルアミダイトをアミノウリジン含有オリゴ ヌクレオチドにカップリングさせた。各々の場合において、これら２つのカップ リングの内の初めは９８チより良好な収率で進行し、ＲＰ　ＨＰＬＣｆｉ製を簡 単にするために、最終のジ−ｐ−アユシルフェニルメチル基を各オリゴヌクレオ チドの５′　−末端上に保持した。

滉浄し及び乾燥した後に、支持体結合オリゴヌクレオチドの各アリコートを例８ に記載した枦準の開裂及び脱保Ｃ染件下で処理し、凍結乾燥し、水中に溶解した 。各溶液のアリコートに１次いで、例８に記載した系を用いてＲＰＨＰＬＣ分析 を行なった。４０分にわたる２０チ緩脅液Ｂ／８０チ緩贅液Ａの６０チ緩衝液Ｂ ／４０チｖ蓼液Ａへの線状勾配（緩薮液Ａ及びＢは例８に記載した通りである） を用いて各トリチル化付加体を精製した。

これらの条件下で（流ゑ１−７分）、Ｕ（２’−ＮＨり含有オリゴヌクレオチド 及びＵ　（２’　−ＮＨＣＯＣＨ＊　ＮＨｔ　）含有オリゴヌクレオチドは共に ３９分で溶出した。各オリゴヌクレオチドについて予備精製を行ない、生成物を 捕集し及び凍結乾燥し、ペレットを酢酸／水（８０：２ｏｖ／ｖ）で室温におい て３０分間処理して５′−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル基を除いた。凍結乾 燥し及び水に再溶解した後に、各溶液のアリコートを、３０分にわたる１０チ緩 衝液Ｂ／９０チ援衝液Ａの５０チ覆衝液Ｂ／７０　％緩衝液入への線状勾配を用 いてクロマトグラフィーにかけた。これらの条件下（流量１−７分）で、Ｕ　（ ２’　−ＮＨｔ　）含有オクタマーは清浄に１８分で溶出しく　２６０　ｎｍに おゆろＵＶ検出）、他方Ｕ（２’−ＮＨＣＯＣＨｔＮＨｔ　）含有オクタマーは わずかに清浄性に劣つ′ｃ１９分で溶出した。この後者のクロマトグラムでは１ ８分に溶出するピークが見られなかった。このことは、グリシン部分はあるとし てもほとんど合成する間の化学処理によってＤ　Ｎ　ｆｉ−から加水分解されな かったことを示す。両方の精製した２′−アミノオリゴヌクレオチドはＤＮＡを 象徴するＵＶスペクトル（２６０ｎｍにおける主ピーク）を有していた。

下記の化合物を同様の方式で用いて対応する２１アミノオリゴヌクレオチドを調 製することができる：１）ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ／１／−２ ’−Ｎ−トリフルオロアセチル−２′−アミノ−２１−デオキシウリジン−３１ −〇−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイ ト。

２）ｓ’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２′−Ｎ−）リフルオロアセ チル−２′−アミノ−２１−デオキシイノシン−ｓ　ｌ　−ｏ−メチｈ−Ｎ、Ｎ −ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

３）ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロアセ チル−２′−アミノ−２’−Ｎ”　−ベンシイ／Ｉ／−２’−デオキシアデノシ ンーｓ’−ｏ−メチ／ｌ／　−Ｎ　、　Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミ ダイト。

４）５菅−Ｏ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ）ｖ　−２’　−Ｎ−）リフルオ ロアセチル−２′−アミノ−２’−Ｎ’−ベンシイ）ｗ　−２’−デオキシシト シンー３′−ｏ−メチｙ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルア２ダイト・ ｓ）ｓ’−０−ジーｐ−アニシ／Ｉ／フェニルメチ／Ｉ／　−２’　−Ｎ−トリ フルオロアセチル−２′−アミノ−２’−Ｎ”　−インブチリ／、／　−２’− デオキシグアノシンー３′−〇−メチル−Ｎ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスホ ルアミダイト。

６）５’−Ｑ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（９−フルオレニ ルメチルオキシカルボニル）−２１−アミノ−２′−デオキシウリジン−３１− 〇−メチ７、／−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

７）５’−Ｑ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチ）ｖ−２’　−Ｎ−（Ｎ−）リフ ルオロアセチル−グリシ／ｌ／）−２’−アミノ−２′−デオキシウリジン−３ ′−〇−ベーターシアノエチルーＮ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスホルアミダ イト。

ｓ）ｓ’−ｏ−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２′−Ｎ−（Ｎ−）リフルオ ロアセチル−グリシル）　−２＋　＋＋アミノー２°−デオキシウリジン−５１ −〇−メチ）ｖ　−１ｉＪ　。

Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

？）５’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチＡｔ　−２’　−Ｎ　−（Ｎ　− ）　リフルオロアセチル−グリシル）−２’−アミノ−２′−デオキシウリジン −３１−〇−メチルーモルホリノホスホＡ・アミダイト。

１ｏ）ｓ’−ｏ−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−）リフル オロアセチル−グリシル）−２′−アミノ−２′−デオキシウリジン−５′−〇 −ベーターシアノエチルーモルホリノホスホルアミダイト。

１１）ｓ’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２ｌ−Ｎ−（Ｎ−１−リフ ルオロアセチル−グリシル）　−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン−３′ −〇−ｐ−ニトロフェネチルーＮ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１２）ｓ’−ｏ−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２′−Ｎ−（Ｎ−）リフル オロアセチル−グリクル）　−２１＋＋アミノー２′−デオイシウリジン−５′ −〇−ベーターシアノエチｙ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。

１ｓ）ｓ’−０−ジ−ｐ−７ニシルフエニルメチルー２’−Ｎ−（Ｎ−）リフル オロアセチル−グリシ＃）−２’　−アミノ−２′−デオキシイノシン−３１− Ｏ−メチル−Ｎ。

Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。

１４）ｓ’−０−ジ−ルーア−クルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−）リフル オロアセチ７＋／−グリシル）　−２１−アミノ−Ｎｏ−ベンゾイル−２１−デ オキシアデノシン−３’−０−メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホル アミダイト。

１５）５″−〇−ジーｐ−アニシルフェニルメチル−２’−Ｎ−（Ｎ−トリフル レオロアでチル−グリシル）　−２＋　−アミノ−Ｎ４−ペンシイ／Ｌ／　−２ ’−デオキシシトシンー３′−〇−メチル−Ｎ　＋　Ｎ−ジイソプロピルアミノ ホスホルアミダイト。

１６）ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−）リフル オロアセチル−グリシｙ）−２’　−アミノ−Ｎ！　−イソブチリル−２１−デ オキシグアノシン−３′−０−メチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホル アミダイト。

１７）Ｓ’−０−ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル−２＋　−Ｎ−（Ｎ−９−フ ルオレニル−メチルオキシカルボニル−グリシル）　−２１−アミノ−２１−デ オキシウリジン−３′−〇−メチルーＮ、Ｎ−ジインプロピルアミノホスホルア ミダイト。

５）インターナル２“位に１つ又はそれ以上の螢光性部分を含有するオリゴデオ キシリボヌクレオチドの水溶液における合成。

セクション２で説明した通りに、オリゴヌクレオチドに脂肪族アミノ基が存在す ることは、ＤＮＡと種々の試薬とのそれ以上の反応を可能にする。螢光染料の場 合、１つより多い染料分子をオリゴヌクレオチドに結合させることによって、高 められた検出感度な達成すごことができ、これよりオリゴマー当りの螢光量を増 大させることができる。任意の所望数のアミノ基を２′−アミノ−２１−デオキ シウリジンホスホルアミダイトを経てオリゴヌクレオチドに加入させ得ることを 利用してこの増大を達成することができる。

螢光染料を２′−アミノオリゴヌクレオチドに結合させる基本的な手順は、例９ に記載したのと同じである。

例１２ フルオレセイン−５−インチオシアネートと、３’　＞ＨＯ−ＣｐＡｐＴｐＧｐ ＣｐＵ（２’　−ＭＨｚ　）　ｐＧｐＴ−ＯＨ＜５　’及び５　’＞ＨＯ−Ｃｐ ＡｐＴｐＧｐＣｐＵ（２’　−ＮＨＣＯＣＨ＊ＮＨｔ　）ｐＧｐＴ−ＯＨ＜５’ との結合 Ｈ Ｈ Ｎ）１ ２１−アミノオリゴヌクレオチドを例１１に記載する通りにして合成した。ｎ災 したアミノオリゴヌクレオチドの各々（水中６００−１０００μｍ’／、！溶液 の７５μｌ　）ｔｌ、ｓ−のエツベンドルフＷ内テ水（１０５μ／）及び１Ｍの 重炭醒ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝水溶ｉ、ｐＨ９（５０μりで希釈した。

フルオレセイン−５−インチオシアネー）（ＦＩＴＣ）をＤＭＦに溶解した溶液 （２ｏＩＩｖ／ｇｄ、　２０　μｔ　）を加え、黄色溶液をよく混合し及び暗が りで室温において一晩静置させた（約１２−１６時間）。次いで、各々の反応混 合物を、１〇−の使い捨て可能なプラスチックピペット内の水に充填したセファ デックスＧ−２５の分離カラム（１ｏ−）に加え、カラムを水で溶出した。各々 の場合において、カラムの空隙容積により溶出した早く移動する黄色バンド（長 波ＵＶ下で螢光性）を捕集した。粗製染料−ＤＮＡ接合物を次いで凍結乾燥し、 水に溶解し、例９に記載した系を用いてＲＰ　ＨＰＬＣを打力った。３０分にわ たる１０チ緩衝液Ｂ／９０チ欣衝液Ａの３０チ緩衝液Ｂ／７０チ緩衝液Ａへの線 状勾配を用い（緩衝液Ａ及びＢは例８に記載した通りである）及び流量１−７分 であった。

Ｕ（２’−ＮＨ−ＦＩＴＣ”）含有オリゴヌクレオチドの場合、２つの主ピーク を観狗した。出発２゛−アミノオリゴヌクレオチドは予想される通りに１８分に 溶出し、他方、螢光生成物染料−オリゴヌクレオチド接合物は２６分に溶出した （　２６０　ｎｍにおけるＵＶ検出、２４０　ｎｍにおける蚤光励起、５２５　 ｎｍバンドパスフィルターを用いた検出）。螢光生成物はサンプル中に存在する アミノ含有Ｄ　Ｎ　Ａの全量の約５０−の割合になった。

Ｕ（２’−ＮＨＣＯＣＨ＊ＮＨ−ＦＩＴＣ）含有オリゴヌクレオチドの場合、３ つの主ピークを１ｓ、１１した。出発２１−７ミノオリゴヌクレオチドは予想さ れる通りに２０分に溶出した。また、２α５分における詰２の主ピークが出５＠ ２′−アミノオリゴヌクレオチドのクロマトグラムにおける汚染物として観測さ れた。螢光生成物染料−オリゴヌクレオチド接合物が２８分に溶出した。しかし 、この場合、螢光生成物はサンプル中のアミノ含有ＤＮＡの全量の少なくとも９ ０チの割合になった。相当に高い結合度は２“−アミノ基上にグリシン成分が存 在することに起因し得る。驚くべきことではないが、枠環から反応性アミノ基を 移し去り、こうして染料が接近する立体障害を減することが、得られる染料−Ｄ ＮＡ接合安の量を増大させる。よって、スペーサーの長さを調節し、こうしてＫ ｔＲからの距離を調節することによってアミ７基の反応性の度合を制すすること が可能である。

両方の精製螢光性ｔリボヌクレオチドは２６０　ｎｍにＵＶ吸光度最大（ＤＮＡ ）Ｃ＃有）及び４９６　ｎｍに可視吸光度最大（フルオレセインに特有）を有し ていた。

上記は、また、テキサスレッド、テトラメチルローダミフィンチオシアネート、 エオシンイソチオシアネート、エリス四シンインチオシアネート、ローダミンＸ インチオシアネート、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ルシファーイ エロー、アクリジン−９−イソチオシ７ネ−）、ピレンスルホニルクロリド、７ −シエチルアミノー４−メチルクマリンインチオシアネー）、Ｊ−フルオロ−７ −ニドロペンズー２−オΦサー１．ｓ−シフ１−ル、４−クロロ−７−ニドロベ ンズー２−オキサ−１゜３−ジアゾールを用いて行なうことができろ。

発明を十分に説明したが、発明は単に添付した請求の範囲の適法な範囲によって のみ制限されるつもりである。

ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１４２２ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｆｏｒｒｎ　ｐｃ’ｒ／工ＳＡ／２１０　Ｐａｒ ｔ工。

工ＰＣ（４）：　’１９／１６７；１９／１７３；　２１１００；２１１０２； ２１１０４１＋ｍｎｖｍｎａ−＾ｓｏ番ｃｓｗＰＮｏ、ｐ（＋〒ｚａＳ＋＋７１ ０１４２２ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１４２２ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｆｏｒｍ　ｐｃｒ７ＩｓＡ／２１ｏ　Ｐａｒｔ　 ＶＬＰＣＴ／ＩｊＳ８７１０１４２２ Ｔｉ＋ａ＠　Ｌｉｍ１ｔ　ｆｏｒ　Ｆｉｌｉｎａ　ａ　Ｐｒｏｔｅｓセ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記式を有する新規な保護アミノヌクレオシドホスホルアミダイト： ▲数式、化学式、表等があります▼、 ここで、Ｂはヌクレオシド塩基、ヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護され た誘導体から成る群すり選択し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は以下に規定 する通りである：Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＨ、ＯＲ或はＮ ＨＲ１のいずれかであり、但し、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の内の精々１つはＮＨＲ６ になつてもよく及びＲ３のみがＯＨになることがてきることを条件とし、ここで 、Ｂは一価の有機基であり、Ｒ１はトリフルオロアセチルグリシル、４−トルエ ン−スルホニルエチル−オキシカルボニル、メチルスルホニルエチル−オキシカ ルボニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル；クロロアセチル、アセト −アセチル、２−ニトロベンゾイル、ジチアスクシノイル、マレオイル、イソニ コチニル、２−プロモエチルオキシ−カルボニル及び２．２．２−トリクロロエ チルオキシカルボニルから成る群すり選ぶ酸不安定性或は塩基不安定在保護基で ある窒素保護基であり、但し、Ｒ１或はＲ１がＮＨＲ１である時、Ｒ１は前記の 基、或はトリフルオロアセチル或は９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル の内のいずれかであることを条件とし；Ｒ６は低級アルキル或は複素環式であり ；Ｒ７は低級アルキル、シアノ低級アルキル、ハロ低級アルキル或にニトロフエ ニル低級アルキルである。 ２．下記の一般式を有する新規な保護５′−アミノヌクレオシドホスホルアミダ イト： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護さ れた誘導体から成る群より選択し；Ｘ１はｐ−アニシルジフェニルメチル、トリ フェニルメチル及び下記式を有する保護されたアミノアシル；Ｙ−ＮＨ−（ＣＨ Ｒ）ｎ−ＣＯ （式中、Ｙはトリフルオロアセチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル 、ｐ−アニシルジフエニルメチル及びトリフエニルメチルから成る群より選択し ；ｎ＝１の時、Ｒはアミノ酸側領域は水素であり；ｎが２〜１００の整数である 時、Ｒは水素である）から選択し；Ｒ１は低級アルキル（ｍ＝２の場合）及び複 素環式（ｍ＝１の場合）から成る群すり選択し；Ｒ１はメチル、ベーターシアノ エチル、ｐ−ニトロフエネチル、ｏ−クロロフエニル或はｐ−クロロフエニルか ら成る群すり選択する。 ３．Ｘ１、がｐ−アニシルジフエニルメチルである請求の範囲第２項記載の化合 物。 ４．Ｘ１がトリフエニルメチルである請求の範囲第２項記載の化合物。 ５．Ｘ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請求の範囲第２項記載の化 合物。 ６．Ｂがチミンである請求の範囲第２項記載の化合物。 ７．Ｂがウラシルである請求の範囲第２項記載の化合物。 ８．Ｒ２がメチルである請求の範囲第２項記載の化合物。 ９．Ｒ２がベーターシアノエチルである請求の範囲第２項記載の化合物。 １０．Ｒ１がメチルである請求の範囲第２項記載の化合物。 １１．Ｒ１がイソプロピルである請求の範囲第２項記載の化合物。 １２．Ｒ１がモルホリノである請求の範囲第２項記載の化合物。 １３．Ｂがチミンであり及びＸｌがｐ−アニシルジフエニルメチルである請求の 範囲第２項記載の化合物。 １４．Ｂがチミンであり及びＸ１がトリフエニルメチルである請求の範囲第２項 記載の化合物。 １５．Ｂがチミンであり及びＸ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請 求の範囲第２項記載の化合物。 １６．Ｂがウラシルであり及びＸがトリフルオロアセチルである請求の範囲第２ 項記載の化合物。 １７．Ｂがウラシルであり及びＸｌが９−フルオレニルメチルオキシカルボニル である請求の範囲第２項記載の化合物。 １８．Ｂがウラシルであり及びＸ１がｐ−アニシルジフエニルメチルである請求 の範囲第２項記載の化合物。 １９．Ｂがウラシルであり及びＸ１がトリフエニルメチルである請求の範囲第２ 項記載の化合物。 ２０．Ｂがウラシルであり及びＸ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである 請求の範囲第２１項記載の化合物。 ２１．下記式を有する５１−Ｎ−ｐ−アニシルジフエニルメチル−５１−アミノ −５１−デオキシチミジン−３１−Ｏ−ペータ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソ プロピルアミノホスホルアミダイト： ▲数式、化学式、表等があります▼ ２２．５１−Ｎ−ｐ−アニシルジフエニルメチル−５１−アミノ−５１−デオキ シチミジン−３１−Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダ イト。 ２３．５１−Ｎ−ｐ−アニシルジフエニルメチル−５１−アミノ−５１−デオキ シチミジン−３１−Ｏ−ベーターシアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノホスホ ルアミダイト。 ２４．５１−Ｎ−ｐ−アニシルジフエニルメチル−５１−アミノ−５１−デオキ シチミジン−３１−Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノホスホルアミダイト。 ２５．５１−Ｎ−ｐ−トリフエニルメチル−５１−アミノ−５１−デオキシチミ ジン−３１−Ｏ−ベータ−シアノニチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホ ルアミダイト。 ２６．下記の一般式を有する新規な保護２１−アミノ−ヌクレオシドホスホルア ミダイト： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護さ れた誘導体から成る群より選び；Ｘ１はトリフルォロアセチル、９−フルオレニ ルメチルオキシカルボニル、ｐ−アニシルジフエニルメチル、トリフエニルメチ ル及び下記式を有する保護されたアミノアシル： Ｙ−ＮＨ−（ＣＨＲ）ｎ−ＣＯ （式中、Ｙはトリフルオロアセチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル 、Ｐ−アニシルジフエニルメチル及びトリフエニルメチルから成る群すり選択し ；Ｒは、ｎ＝１の時、アミノ酸側鎖或は水素であり；ｎが２〜１００の整数であ る時、Ｒは水素である）から選択し；Ｒ１は低級アルキル（ｍ＝２の場合）及び 複素環式（ｍ＝１の場合）から成る群すり選択し；Ｒ２はメチル、ベータ−シア ノエチル、ｐ−ニトロフエネチル、ｐ−クロロフエニル或はｐ−クロロフエニル から成る群すり選択し；Ｘ２ほトリフエニルメチル、ｐ−アニシルジフエニルメ チル、ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル及び９−フエニルキサンテニルから選ぶ ヒドロキシル保護基である。 ２７．Ｘ１がトリフルオロアセチルである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ２８．Ｘ１が９−フルオレニルメチルオキシカルボニルである請求の範囲第２６ 項記載の化合物。 ２９．Ｘ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請求の範囲第２６項記載 の化合物。 ３０．Ｂがウラシルである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３１．Ｒ２がメチルである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３２．Ｒ１がイソプロピルである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３３．Ｒ１がモルホリノである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３４．Ｒ２がメチルである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３５．Ｒ２がベータ−シフノエチルである請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３６．Ｂがウラシルであり及びＸ１がトリフルオロアセチルである請求の範囲第 ２６項記載の化合物。 ３７．Ｂがウラシルであり及びＸ１がフルォレニルメチルオキシカルボキシルで ある請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３８．Ｂがウラシルであり及びＸ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである 請求の範囲第２６項記載の化合物。 ３９．下記式を有する５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ− トリフルオロアセチル−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン−３１−Ｏ−メ チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルフミノホスホルアミダイト：▲数式、化学式、表 等があります▼ ４０．下記式を有する５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ− （Ｎ−トリフルオロ−アセチルグリシル）−２１−アミノ−２１−デオキシクリ ジン−３１−Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソノロビルアミノホスホルアミダイト： ▲数式、化学式、表等があります▼ ４１．５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロア セチル−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン−３１−Ｏ−ベータ−シアノエ チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。 ４２．５１−ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフル オロ−アセチルグリシル）−２１−アミノ−２１−テオキシウリジン−３１−Ｏ −ベータ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。 ４３．下記の一般式を有する新規な保護２１−アミノヌクレオシドホスホルアミ ダイト： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護さ れた誘導体から成る群すり選択し；Ｘ１はトリフルオロアセチル、９−フルオレ ニルメチルオキシカルボニル、ｐ−アニシルジフエニルメチル、トリフエニルメ チル及び下記式を有する保護されたアミノアシル： Ｙ−ＮＨ−（ＣＨＲ）ｎ−ＣＯ （式中、Ｙはトリフルオロアセチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル 、ｐ−アニシルジフエニルメチル及びトリフエニルメチルから成る群すり選択し ；Ｒは、ｎ＝１の時、アミノ酸側鎖或は水素であり；ｎが２〜１００の整数であ る時、Ｒに水素である）から選択し；Ｒ１は低級アルキル（ｍ＝２の場合）及び 複素環式（ｍ＝１の場合）から成る群より選択し；Ｒ２はメチル、ベータ−シア ノエチル、ｐ−ニトロフエネチル、０−クロロフェニル或はｐ−クロロフェニル から成る群より選択し；Ｘ２はトリフエニルメチル、ｐ−アニシルジフエニルメ チル、ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル及び９−フエニルキサンテニルから選ぶ ヒドロキシル保護基である。 ４４．Ｘ１がトリフルオロアセチルである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ４５．Ｘ１が９−フルオレニルメチルオキシカルボニルである請求の範囲第４３ 項記載の化合物。 ４６．Ｘ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請求の範囲第４３項記載 の化合物。 ４７．Ｂがウラシルである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ４８．Ｈ１がメチルである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ４９．Ｒ１がイソプロピルである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ５０．Ｒ１がモルホリノである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ５１．Ｒ２がメチルである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ５２．Ｒ２がベータ−シアノエチルである請求の範囲第４３項記載の化合物。 ５３．Ｂがウラシルであり及びＸ１がトリフルオロアセチルである請求の範囲第 ４３項記載の化合物。 ５４．Ｂがウラシルであり及びＸｌがフルオレニルメチルオキシカルボキシルで ある請求の範囲第４３項記載の化合物。 ５５．Ｂがウラシルであり及びＸ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである 請求の範囲第４３項記載の化合物。 ５６．５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロア セチル−２１−アミノ−２１−デオキシ−アラ−ウリジン−３１−Ｏ−メチル− Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。 ５７．５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフル オロ−アセチルグリシル）−２１−アミノ−２１−デオキシ−アラ−ウリジン− ３１−０−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。 ５８．５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ−トリフルオロア セチル−２１−アミノ−２１−デオキシ−アラ−ウリジン−３１−Ｏ−ベーダ− シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト。 ５９．５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ−（Ｎ−トリフル オロ−アセチルグリシル）−２１−アミノ−２１−デオキシ−アラーウリジン− ３１−０−ベータ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソノロピルアミノホスホルアミ ダイト。 ６０．下記式を有する５１−Ｎ−ｐ−アニシルジフエニルメチル−５１−アミノ −５１−テオキシチミジン：▲数式、化学式、表等があります▼ ６１．下記式を有する５１−Ｎ−（Ｎ−ベンジルオキケカルボニル−６−アミノ ヘキサノイル）−５１−アミノ−５１−デオキシチミジン： ▲数式、化学式、表等があります▼ ６２．下記式を有する５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ− トリフルオロアセチル−２１−アミノ−２１−アミノ−２１−デオキシウリジン ： ▲数式、化学式、表等があります▼ ６３．下記式を有する５１−Ｏ−ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ− （Ｎ−トリフルオロ−アセチルグリシル）−２１−アミノ−２１−デオキシウリ ジン：▲数式、化学式、表等があります▼ ６４．下記式を有する５１−Ｏ−ジ−Ｐ−フニシルフエニルメチル−２１−Ｎ− トリフルオロ−アセチル−２１−アミノ−２１−テオキシ−アラ−ウリジン：▲ 数式、化学式、表等があります▼ ６５．下記式を有する５１−Ｏ−ジ−Ｐ−アニシルフエニルメチル−２１−Ｎ− （Ｎ−トリフルオロ−アセチルグリシル）−２１−アミノ−２１−デオキシ−ア ラ−ウリジン： ▲数式、化学式、表等があります▼ ６６．下記式を有するホスホルアミダイト化合物：▲数式、化学式、表等があり ます▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基、ヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護され た誘導体から成る群より選択し；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は以下に規定 する通りである：Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝ＯＨ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はＨ、ＯＲ或はＮ ＨＢ１のいずれかであり、但し、Ｒ１、Ｅ２及びＲ３の内の精々１つはＮＨＢ１ になつてもよく及びＲ５のみがＯＨになることができることを条件とし、ここで 、Ｒは一価の有機基であり、Ｒ１はトリフルオロアセチルグリシル、４−トルエ ン−スルホニルエチル−オキシカルボニル、メチルスルホニルエチル−オキシカ ルボニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル；クロロアセチル、アセト −アセチル、２−ニトロ−ベンノイル、ジチアスクシノイル、マレオイル、イソ ニコチニル、２−ブロモエチルオキシカルボニル及び２，２，２−トリクロロエ チルオキシカルボニルから成る群より選ぶ酸不安定性或は塩基不安定性保護基で ある窒素保護基であり、但し、Ｒ１或はＲ２がＮＨＢ１である時、Ｒ１は前記の 基、或はトリフルオロアセチル或は９−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル の内のいずれかであることを条件とし；Ｒ６は低級フルキル或は複素環式であり ；Ｒ７は低級アルキル、シアノ低級アルキル、ハロ低級アルキル或はニトロフエ ニル低級アルキルである を固相オリゴヌクレオチド合成の最後のカツプリング段階において固体支持休に 結合されたオリゴヌクレオチドと反応させることを台む５１−アミノオリゴヌク レオチドの改良された合成方法。 ６７．下記の一般式を有するホスホルアミダイト化合物：▲数式、化学式、表等 があります▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護さ れた誘導体から成る群より選択し；Ｘｌはｐ−アニシルジフエニルメチル、トリ フエニルメチル及び下記式を有する保護されたアミノアシル：Ｙ−ＮＨ−（ＣＨ Ｒ）ｎ−ＣＯ （式中、Ｙはトリフルオロアセチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル 、ｐ−アニシルジフエニルメチル及びトリフエニルメチルから成る群より選択し ；ｎ＝１の時、Ｒはアミノ酸側鎖或は水素であり；ｎが２〜１００の整数である 時、Ｒは水素である）から選択し；Ｒ１は低級アルキル（ｍ＝２の場合）及び複 素環式（ｍ＝１の場合）から成る群より選択し；Ｒ２はメチル、ベーターシアノ エチル、ｐ−ニトロフエネチル、０−クロロフエニル或はｐ−クロロフエニルか ら成る群すり選択する を固相オリゴヌクレオチド合成の最後のカツプリング段階にかいて固体支持体に 結合されたオリゴヌクレオチドと反応させることを含む５１−アミノオリゴヌク レオチドの改良された合成方法。 ６８．ｘ１がＰ−アニシルジフエニルメチルである請求の範囲第６７項記載の改 良方法。 ６９．Ｘｌがトリフエニルメチルである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７０．ＸｌがＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請求の範囲第６７項記載 の改良方法。 ７１．Ｂがチミンである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７２．Ｂがウラシルでわる請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７３．Ｒ２がメチルである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７４．Ｒ２がベーターシアノエチルである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７５．Ｒ１がメチルである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７６．Ｒ１がイソプロピルである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７７．Ｒ１がモルホリノである請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ７８．Ｂがチミンであり及びＸ１がｐ−アニシルジフエニルメチルである請求の 範囲第６７項記載の改良方法。 ７９．Ｂがチミンであり及びＸ１がトリフエニルメチルである請求の範囲第６７ 項記載の改良方法。 ８０．Ｂがチミンであり及びＸ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請 求の範囲第６７項記載の改良方法。 ８１．Ｂがウラシルであり及びＸがトリフルオロアセチルである請求範囲第６７ 項記載の改良方法。 ８２．Ｂがウラシルであり及びＸ１が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル である請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ８３．Ｂがウラシルであり及びＸ１がｐ−アニシルジフエニルメチルである請求 の範囲第６７項記載の改良方法。 ８４．Ｂがウラシルであり及びＸ１がトリフエニルメチルてある請求の範囲第６ ７項記載の改良方法。 ８５．Ｂがウラシルであり及びＸ１がＮ−トリフルオロアセチルグリシルである 請求の範囲第６７項記載の改良方法。 ８６．下記の一般式を有するホスホルアミダイト化合物：▲数式、化学式、表等 があります▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護さ れた誘導体から成る群より選び；Ｘｌはトリフルオロアセチル、９−フルオレニ ルメチルオキシカルボニル、Ｐ−アニシルジフエニルメチル、トリフエニルメチ ル及び下記式を有する保護されたアミノアシル： Ｙ−ＮＨ−（ＣＨＲ）ｎ−ＣＯ （式中、Ｙはトリフルオロアセチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル 、ｐ−アニシルジフエニルメチル及びトリフエニルメチルから成る群より選択し ；Ｒは、ｎ＝１の時、アミノ酸側鎖或は水素であり；ｎが２〜１００の整数であ る時、Ｒは水素である）から選択し；Ｒ１は低級アルキル（ｍ＝２の場合）及び 複素環式（ｍ＝１の場合）から成る群より選択し；Ｒ２はメチル、ベーターシア ノエチル、ｐ−ニトロフエネチル、ｏ−クロロフエニル或はｐ−クロロフエニル から成る群すり選択し；Ｘ２にトリフエニルメチル、ｐ−アニシルジフエニルメ チル、ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル及び９−フェニルキサンテニルから選ぶ ヒドロキシル保護基である を固相オリゴヌクレオチド合成の１つ又はそれ以上のカツプリング段階において 固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドと反応させることを含む２１−アミ ノオリゴヌクレオチドの改良された合成方法。 ８７．Ｘ１がトリフルオロアセチルでおる請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ８８．Ｘ１が９−フルオレニルメチルオキシカルボニルである請求の範囲第８６ 項記載の改良方法。 ８９．ＸｌがＮ−トリフルオロアセチルグリシルである請求の範囲第８６項記載 の改良方法。 ９０．Ｂがウラシルである請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９１．Ｒ１がメチルである請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９２．Ｒ１がイソプロピルである請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９３．Ｒ１がモルホリノである請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９４．Ｒ２がメチルである請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９５．Ｒ２がベーターシアノエチルである請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９６．Ｂがウラシルであり及びＸｌがトリフルオロアセチルである請求の範囲第 ８６項記載の改良方法。 ９７．Ｂがウラシルであり及びＸｌがフルオレニルメチルオキシカルボキシルで ある請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９８．Ｂがウラシルであり及びＸｌがＮ−トリフルオロアセチルグリシルである 請求の範囲第８６項記載の改良方法。 ９９．下記の一般式を有するホスホルアミダイト化合物：▲数式、化学式、表等 があります▼ ここで、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシド塩基類似体或はそれらの保護さ れた誘導体から成る群より選択し；Ｘ１はトリフルオロアセチル、９−フルオレ ニルメチルオキシカルボニル、ｐ−アニシルジフエニルメチル、トリフェニルメ チル及び下記式を有する保護されたアミノアシル： Ｙ−ＮＨ−（ＣＨＲ）ｎ−ＣＯ（式中、Ｙはトリフルオロアセチル、９−フルオ レニルメチルオキシカルボニル、ｐ−アニシルジフエニルメチル及びトリフエニ ルメチルから成る群より選択し；Ｒは、ｎ＝１の時、アミノ酸側鎖或は水素であ り；ｎが２〜１００の整数である時、Ｒは水素である）から選択し；Ｒ１は低級 アルキル（ｍ＝２の場合）及び複素環式（ｍ＝１の場合）から成る群より選択し ；Ｒ２はメチル、ベーターシアノエチル、ｐ−ニトロフエネチル、ｏ−クロロフ エニル或はｐ−クロロフエニルから成る群すり選択し；Ｘ２はトリフエニルメチ ル、ｐ−アニシルジフエニルメチル、ジ−ｐ−アニシルフエニルメチル及び９− フエニルキサンテニルから選ぶヒドロキシル保護基である を固相オリゴヌクレオチド合成の１つ又はそれ以上の段階において固体支持体に 結合されたオリゴヌクレオチドと反応させることを含む２１−アミノオリゴヌク レオチドの改良された合成方法。 １００．Ｘ１がトリフルオロアセチルである請求の範囲第９９項記載の改良方法 。 １０１．Ｘ１が９−フルオレニルメチルオキシカルボニルてある請求の範囲第９ ９項記載の改良方法。 １０２．Ｘ１がＮ−トリフルオロアセナルグリシルである請求の範囲第９９項記 載の改良方法。 １０３．Ｒ１がメチルである請求の範囲第９９項記載の改良方法。 １０４．Ｒ１がイソプロピルである請求の範囲第９９項記載の改良方法。 １０５．Ｒ１がモルホリノである請求の範囲第９９項記載の改良方法。 １０６．Ｒ２がメチルである請求の範囲第９９項記載の改良方法。 １０７．Ｒ２がベーターシアノエチルである請求の範囲第９９項記載の改良方法 。 ｌ０８．Ｘｌがフルオレニルメチルオキシカルボキシルである請求の範囲第９９ 項記載の改良方法。 １０９．請求の範囲第６６〜９９項記載の生成物。 １１０．オリゴヌクレオチドを実質的に支持体から開裂させる請求の範囲第６６ 〜１０８項記載の方法。 １１１．Ｘ１成分が酸不安定性であり、Ｒ２成分がベーターシアノエチルであり 、ホスホルアミダイトをオリゴヌクレオチド合成の最後のカツプリング段階にお いて固体支持体に結合させたオリゴヌクレオチドに結合させた後に、ベーターシ アノエチル保護基を取り去り、酸不安定性保護基を取り去り、自由アミノ基と検 出可能な成分とを反応させ、次いで誘導体合成したオリゴヌクレオチドを支持体 から開裂させる請求の範囲第６６項記載の方法。 １１２．検出可能な成分に結合させた請求の範囲第６６〜１０８項記載の方法に よつて作られる生成物。 １１３．検出可能な成分が螢光性である請求の範囲第１１２項記載の生成物。 １１４．検出可能な部分が吸収性或は着色している請求の範囲第１１２項記載の 生成物。 １１５．検出可能な部分がタンパク質である請求の範囲第１１２項記載の生成物 。 １１６．検出可能な部分が酵素である請求の範囲第１１２項記載の生成物。 １１７．検出可能な部分が放射性１１２５を含有する請求の範囲第１１２項記載 の生成物。 １１８．検出可能な部分をテキサスレツト、テトラメチルロ−ダミンイソチオシ アネート、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、ロ ーダミンＸイソナオッアネート、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ピ レンスルホニルクロリド、７−ジエチルアミノ−４−メチルクマリンイソチオシ アネート、４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１３−ジアゾール、 ４−クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１３−ジアゾール、アタリジン− ９−イソチオシアネート、ルシフアーイエロー、から成る群より選択する請求の 範囲第１１２項記載の組成物。