JPH01501439A - 遺伝子修飾され生体内で増殖された真核宿主細胞における誘導発現機構によるタンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子修飾され生体内で増殖された真核宿主細胞における誘導発現機構によるタ ンパク質の生産方法序論 本発明は、遺伝子工学の技術による、さらに詳しくは、遺伝子修飾された適当な 真核宿主細胞において着目遺伝子を誘導発現させることによる、着目タンパク質 の生化学的生産方法に関する。

種々の細胞型における着目遺伝子産物の産生のために、例えば熱衝撃発現要素の 、）な支配下に、遺伝子を誘導発現させることの利用および利点は以前に説明さ れている〔国際出願、ＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５１およびＥＰ　８４８１００ ６６．５　、ＤＲＥＡＮＯら、Ｇｅｎｅ（１９８７）　４９巻、第１〜８頁〕。

真核生物の発現機構に通用されるので、この技術は、能率的、一般的および高誘 導性の特徴のある、本質的な利点を有する。これらの要素は、生物学上および製 薬上重要なタンパク質の大量生産のために、特にそれらのタンパク質が複雑な、 修飾された、不安定な、あるいは潜在的に産生細胞に対し有毒な場合に、非常に 重要である。しかしながら、それらの経済的な効能は、低コストの細胞成長およ びタンパク質の精製に関連して、十分に能力のあるタンパク質の高レベルな産生 を保証できるような宿主／ベクターモデルの利用に太き（依存するであろう０例 えば、宿主細胞機構としての微生物の使用では、そのような機構から期待される べき理想の特性が単一の微生物種において認められないということが実証されて おり、より適切な発現機構およびベクターが必要とされる。

さらに、病気治療上重要なたいていのタンパク質は、分泌されたタンパク質であ り、活性および免疫特性のために、バクテリア内での翻訳後の修飾をしばしば必 要とし、そのような修飾は、翻訳時にはおそらく欠如している。

よって、組換え遺伝子をとりこんでいる遺伝子操作された真核細胞株の発展が、 真核細胞の培養技術がバクテリアのそれに比べて初期の状態にあるにもかかわら ず、最も有望な期待の要素となっている。

しかしながら、組織培養における最近の発展は、化学的に明確な培地を使って、 組織培養法の通用における工業生産への重要な突破口を構成することであるが、 現在、遺伝子操作された遺伝子発現機構を使って形質転換された細胞を増殖およ び大量培養するための改良された培養方法を必要としている。

大量培養に関連する主要な問題点の幾つかは、下記のものである。

一多数の細胞を得ること（特に無菌、材料、限定された人員、場所の点で）。

一生産コスト、特に、人力のためのコスト、および仔牛の胎児血清を含む培地の コストの削ｆｌｉ　（ＦＣＳは、全生産コストの８０％までに相当することがで きる）。

−産業上着目の期待されるタンパク質を、特に分泌タンパク質の場合に、精製す ること、およびそれらを使用された細胞培養の全浮遊培地から単離すること。

発明の概要 このように、適当な宿主細胞によりか（まわれている（ｈａｒｂｏｕｒｅｄ）着 目遺伝子の誘導発現を、工業的なスケールで開発する努力において、本発明者は 、添付された請求項１の中に開示された方法を探り出した。

簡単に言えば、免疫不全の動物に接種された際に腫瘍形成能のある適当な真核宿 主細胞系に、ストレス誘導性プロモーター支配下にある少な（とも１つの着目遺 伝子を含んでいる核酸構成物を移入する。“正常”な細胞を使って、無限の増殖 能力を細胞に与えるために形質転換遺伝子、例えば腫瘍遺伝子、を同時移入する 。そして、上記の着目遺伝子を誘導発現する能力のある形質転換細胞を、免疫不 全の動物に接種する。そのことにより、その細胞は、動物により一時的に増殖さ れ、腫瘍という形で現われる。驚くべきことに、正常な成長条件下では発現され ない転写単位の細胞の中に存在するにもかかわらず、増殖速度は非常に高く　（ １〜２週間内で接種数の約１０’〜１０６倍）、細胞の変質およびストレス下で の着目遺伝子の発現能力の低下もない。この方法は、また、迅速かつ比較的低費 用で、天然タンパク質の工学的なタンパク質変異体の同定および試験量を得るの に特に有用である。

この段階で、温血動物内への腫瘍移植によるある細胞系の増殖は、それ自体、新 しいものではないことに注目するべきである。例えば、ＧＢ−Ａ−２０８３８２ ６（ＨＡＹＡＳＨＩＢＡＲ八）は、インシュリンを生産しているヒトの腫瘍形成 細胞が、スートマウスあるいは免疫抑制された動物（ラット、ハムスター等）お よび鳥類のような温血動物内への移植により、増殖することを明らかにしている 。しかしながら、先行技術に伴う細胞系の種類は、島細胞腫、肺組織ガン、リン パ芽球あるいはハイブリドーマ細胞のような細胞系のみを含んでいる。本発明者 の知る限りでは、熱衝撃要素により支配される遺伝子を組み込んでいる細胞の増 殖に相当するものは、かつて報告されたことがない。さらに、ここに含まれる型 の細胞の生体内における速い増殖は、すなわち、組換えのストレス誘導発現機構 を含み、高い効率で、望ましくない抑制産物の産生のない、かつ十分に熱衝撃誘 導性を保つ増殖は、先行技術と比較して、ごく重要な技術段階を構成する。

手短かに言えば、請求の範囲に記載の方法を支持する実験は、下記の態様を含ん でいる。

重要な産物（ホルモン、酵素、および診断と製剤の適用のために重要な他のタン パク質）の生産をコードする遺伝子は、適当なベクター内の、真核生物由来（ヒ ト、ショウジヨウバエ等）の熱衝撃プロモーター要素の転写および翻訳の支配下 に置いた。所望により、他のプレカーサーもしくは翻訳後の配列およびそれらの 変異体もまた、関連する核酸の中へ挿入した。これら全ては、一般のＤＮＡ組換 え技術により実施された。この大部分は、前の出願（ＰＣＴ／ＥＰ１００４５１ ）中に開示されており、ここにその内容を参照するものである。

次いで、ｈｓｐ７０配列支配下の着目バイブリフト遺伝子および腫瘍形成の形質 転換遺伝子を含む、組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に移入した。腫瘍の宿主細胞 を用いた時は、増殖を促すための付加的な腫瘍遺伝子は、必要でなかった。それ に対して、ＮＩＨ−３７３のような宿主細胞を用いた時は、細胞性もしくはウィ ルス性起源の腫瘍形成の形質転換配列と一緒に同時移入を実行した。次いで、生 体内でさらに増大させ、熱衝撃下に遺伝子の発現を試した後、形質転換された細 胞系を免疫不全の動物、例えばヌードマウスあるいは免疫抑制されたラットに注 射し、腫瘍を約１０９〜１０１０細胞数まで成長させた。

腫瘍を取り出し、細かく切断し、例えばトリプシン分解するなどして細胞を解離 させ、次いで、それによって後にストレスを受けることができるような培地内に 置いた。熱衝撃支配の要素により作動される着目遺伝子は誘起されて、細胞は着 目タンパク質を発現させた。産生物を一般的な方法、例えばアフィニティークロ マトグラフィーで回集した。

この発明の種々の態様における詳細は、以下の記載および従属する請求項に開示 されている。これらの詳細は、下記に要約して列挙する添付図面を参照すること により、さらによく理解されるであろう。

添付図面の簡単な説明（第１〜８図および第１１〜１３図は写真である） 第１図は、細胞系（Ｃ１，６）の注射により形成された皮下（ｓ、ｃ、）腫瘍を もつヌードマウスを示す。

第２図は、ヌードマウスからの０１．６腫瘍細胞の移植により誘発された筋肉内 （ｉ、ａ＋、）腫瘍をもつ５ｅｎｃａｒマウス（Ｓｉｉｉｓｓ由来）を示す。

第３図は、ヌードマウスからのＣ１，６細胞の移植により誘発されたｓ、ｃ、腫 瘍をもつ、シクロスポリン免疫抑制ラットを示す。

第４図は、ヌードマウス内へのＣ１，６１Ｅｌ胞の注射により誘発された、ｓ、 ｃ、腫瘍の組織学的外観を示す。

第５図は、第４図に示されたｓ、ｅ、腫瘍を高倍率で示す。

分裂指数の高い発生率に注目されたい。

第６図は、ヌードマウス内へのＣ１，６細胞の注射により誘発された、ｓ、ｃ、 腫瘍を示す。血管の間隔に注目されたい。

第７図は、ヌードマウス内へのＨＢＮ２細胞の気管内滴注により誘発された、肺 の腫瘍（′ｆａ維筋腫）を示す。

第８図は、肺内の腫瘍を高倍率で示す。

第９図は、プラスミドｐ１７ＨＢＮの構成を図式的に表わしたものである。

第９ａ図は、プラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒ（ＤｒｅａｎｏらＧｅｎｅ、印刷 中）を表わす。それは、ｈｓｐ７０〜ｈＧＨハイブリッド遺伝子、およびＳＶ４ ０の初期プロモーター配列支配下のマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を 含み、ＳＶ４０のターミネータ−配列により終結している。

第９ｂ図は、プラスミドｐＶ６９　（Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ　ら１９８４　、　Ｅ ＭＢＯＪ、、３巻、第３６５〜３７１頁）を表わす。これは、単純庖疹チミジン キナーゼのプロモーターかつターミネータ−支配下にあるネオマイシン耐性遺伝 子、および５．４ｋｂの牛乳頭腫ウィルス亜属のフラグメントを含んでいる。

第９Ｃ図は、７’ｙ　スミＦｐ１７ｈＧＨＮＥＯ（ＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５ １）を表わす。これは、ｈｓｐ７０−ｂＧＨハイプリント遺伝子、およびＳＶ４ ０初期プロモーター配列の支配下にあるネオマイシン耐性遺伝子を含み、ＳＶ４ ０のターミネータ−配列で終結している。

第９ｄ図は、プラスミドｐｂＧＨＢＰＶを表わす、これは、ｐ１７ｈＧ）ｌ由来 の）！ｉｎｄ　ｍ　ＢａｍＨＩ　フラグメントと、ｐＶ６９の旧ｎｄｎ［での消 化およびＢａｍＨＩでの部分消化の結果生ずる７、５ｋｂのフラグメントとの連 結反応の結果生成する。

第９ｅ図は、プラスミドｐ１７Ｋ　ＮＥＯを表わす。これは、ｐＶ６９由来の１ ．８ｋｂのＨｉｎｄ　ｍ　−ＢａｎＨＩ　フラグメント（ＨｉｎｄＩ［Ｉ端は、 ＤＮＡポリメラーゼＩ　（大きなフラグメント）を用いて埋められている〕と、 ｐ１７ｈＧＨＮＥＯのＰｖｕ　ＩＩおよびＢａｍＨＩでの消化の結果生ずる３、 ４ｋｂのフラグメントとの連結反応の結果生成するものである。

第９ｆ図は、プラスミド１）１７）ＩＢＮを表わす。これは、ｐ１７ＫＮＥＯ由 来の旧ｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩ　フラグメントと、ｐｈＧ）Ｉ　ＢＰＶのＨｉ ｎｄ■での消化およびＢａｍＨＩでの部分消化の結果生ずる６、Ｈｂのフラグメ ントとの連結反応の結果生成するものである。

第１０図は、含まれる種々のＤＮＡ配列を明確にするために第９図において用い た記号の記号解である。第９図において図示されたプラスミド内のこのような配 列のおおよその長さく塩基対）は、下記の表１において与えられている。

第１２図は、解離および１リツトルの生物発酵槽内への接種の後、無血清培地内 でインキュベートされているＣ１．６腫瘍細胞を示す。

第１３図は、解離および２リツトルの生物発酵槽内への接種の後、３ｇ＃！のｃ ｙｔｏｄｅｘ　１マイクロキヤリアーの存在下無血清培地内でインキュベートさ れているＣ１．６腫瘍細胞を示す。

表　Ｉ 第９ａ〜９ｆ図における配列および組換え位置の同定。

プ立スま上　配且上工上 ｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒ　Ｄ：０．６；Ｂ：＜０．１；Ｉ：０．７； Ｃ’：０．７（ターミネータ−）二 ０．４（プロモーター） Ｋ：０．７；Ａ：２．３ ｐＶ６９　Ｌ：０．５（プロモーター）：０．３（ターミネータ−） Ｊ　：ｘ、ｏ　；Ｍ：５．４　；Ａ２．２ｐ１７ｂｃ；ＨＮＥＯＤ：０．６；Ｂ ：＜０．１；Ｉ：０．７； Ｃ：０．４（プロモーター）二 ０．７（ターミネータ−）： Ｊ：１．５；Ａ：２．８ ｐｈＧＨＢＰＶ　Ｃ：０．７　（ターミネータ−）；ｐ　１７Ｋ　ＮＥＯＤ　： ０．６　；Ｂ　：　＜０．１　；Ｌ：０．５（プロモーター）： ０．３（ターミネータ−）； Ｊ：１．Ｏ；Ａ：２．８ ｐ　１７ＨＢＮ　Ｄ：０．６；Ｂ：＜０．ＩＩ；０．７Ｃ：０．７（ターミネー タ−）； Ｌ：０．５（プロモーター）： ０．３（ターミネータ−）； Ｊ：１．Ｏ；Ｍ：５．４；Ａ：２．８ ＢＩ：ＢａｍＨＩ ＢＩＩ：ＢｇｌＩＩ ＨＩＩ［：ＨｉｎｄＩＩ［ ＰＩ［：　ＰｖｕＩ［ 発明の詳細な説明 遺伝子組換えＤＮＡ構成物をかくまうために、適当な細胞系を選択しなければな らなかった。熱衝撃支配下にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の高レベルな生産をし ている細胞系（ＮＩＨ３Ｔ３）は、Ｄｒｅａｎｏらによって報告されている（Ｇ ｅｎｅ　（１９８７）　４９巻、第１〜第８頁〕。簡単に言えば、１つの形質転 換された３Ｔ３マウス細胞系のクローン６　（Ｃ１，６）は、４２℃で２時間の 熱衝撃に続く２０時間を越える間、１０’細胞数当り２〜５鱈のｈＧ）Ｉを分泌 することができる。この濃度は、非熱処理の０１．６細胞の培地において測定さ れるｈｃｔＢ、６度の１２００倍である。

加えて、これらの細胞は、誘導サイクルを繰り返すのに利用可能であり、それ故 本発明における使用のために好都合であった。

我々は、以下に３種の遺伝子操作されたマウスの細胞系：り０−７６　（Ｃ１， ６）　、ＨＢＮ２およびりｏ　−７１８（Ｃ１，１Ｂ）　（７）移植結果を報告 する。これら３つの細胞系は、ヒトのｈｓｐ７０−ｈＧＨハイブリッド遺伝子を 発現し、また以下の付加遺伝子；　Ｃ１，６には、ヒトの）Ｉａｒｖｅｙ　ｃ− ｒａｓ遺伝子（Ｔａｂｉｎら１９８２　、　Ｎａｔｕｒｅ。

３００巻、第１４３−１４９頁）　、ＨＢＮ２には、牛乳頭腫つィ７１／ス（Ｂ ＰＶ）亜属のフラグメントおよびネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性株の選 択に用いられる）　、Ｃ１，１８には、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｃ１，１８は 対照として使われる）、を含む。明らかに、他の着目遺伝子もまた、同様なりＮ Ａ構成において、ｈｓｐ７０プロモーター配列の支配下に位置させ、同様に発現 させることができる。そのような着目遺伝子は、例えば、ウィルス性タンパク質 、ホルモン、酵素、血液タンパク質およびその他を含む。

熱衝撃制御の配列に関しては、他の熱衝撃制御要素を本発明に例示した特定の実 験において記載する配列に置き換えて使用できるということは明白である。我々 の出ＩＩ　（ＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５１）の中で開示した如き、ヌクレオチ ドの欠失、突然変異および挿入により得られる遺伝子操作された変異体もまた通 している。

ヌードマウス内への最初の２つの細胞系の移植は、注射動物において腫瘍を誘発 させた。タンパク質加水分解による解離もしくはコラーゲンでの処理の後、腫瘍 細胞は熱誘導後に親細胞と同量のｈＧｌ（を産生ずることができた。この方法論 を使って、我々は腫瘍当り約１０１０個の腫瘍細胞を得ることができた。最終的 に我々は、動物中の腫瘍から回収されたこれらの細胞を、１リフドルないし２リ ツトルの生物反応槽内のｃｙｔｏｄｅｘマイクロキャリアー上において、および 、これに加えて、化学的に明確な培地、無血清培地（ＳＦＭ）あるいは無血清か つ無タンパク質培地（ＳＰＦＭ）　（ＣＨＥＳＳＥＢＥＵＦおよびＰＡＤＩＥＵ 、　。

ＰＣＴ／８４／９０１３６３，６．ＰＲ−Ａ−８３１０４８４３参照）内で、容 易に培養できることを見出した。加熱を繰り返すと制御されたｈＧＨの産生が再 度得られた。

１、クローン６ ＢＡＬＢ　ＮＩＢ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ機構から提供された）は、ヒトの熱衝 撃タンパク質７０　（ｈｓｐ）プロモーターにより作動するヒト成長ホルモン（ ｈＧ）ｌ）遺伝子をもっているプラスミドＩ）１７ｈＧＨｄｈｆｒ−、第９ａ図 参照（プラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒはＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５１に発表 されている）と、ヒトのｃ−ｒａｓ腫瘍遺伝子をもっているプラスミドとにより 同時移入された。２週間後、病巣を単離し、培養し、次いで、ｈＧＨ生産の分析 を行なった。

クローン６は、４２℃で２時間の単一熱処理に続いて１５時間内に、１０’細胞 数当り３■のｈＧ）Ｉを分泌することがわかった。

１．１　ヌードマウスへの１゜ ヌードマウスに注射され自発的に形質転換された３Ｔ３細胞は、腫瘍形成を引き 起こすことが可能である（ＲｕｂｉｎおよびＡｒｎ５ｔｅｉｎ　１９８２＋　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、３００巻、第１４３〜１４９頁；　Ｒｕｂｉｎ１９８４ ＋　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、＋７２巻、第３７５〜３８１頁） 。

−に上１１　ど目色権 無血清培地０．１−中の１０’−個の細胞をヌードマウスの背側の部位に皮下注 射した。最初の腫瘍が接種後３週間で明らかに目に見えるようになり（第１図） 、腫瘍が直径２０ｍｍ　（重量約３ｇ）に達した時、それを切開した。この第一 世代の腫瘍（Ｇｌ／ｎで表わされる）の一部を培地中で切２）刻み、一部を後の 熱衝撃のための単層培地に接種するため再懸濁させ、そしてその他の部分を別の ヌードマウスに皮下注射した（Ｇ２／ｎを形成させるため）。最後に、腫瘍の残 りの部分を組織学的実験のためにホルムアルデヒドで固定した。これらの腫瘍細 胞は、プラスチック製皿上に付着する大きな力を持っていた。

実際、完全培地内に接種後３０分で細胞の大部分が付着し、線維芽細胞の外観を 示した。−夜後、細胞は皿を覆い、死細胞はごくわずかしか観察されなかった（ 第１１図）、培地内で腫瘍細胞（Ｇｌ／ｎ由来）を熱処理後、それらは１０’細 胞数当り２．５〜５Ｊ！ｇのｈＧＨを分泌することがわかった。これは、最初の Ｃ１，６細胞と同じ範囲内の生産であった。加えて、腫瘍切片（０，５〜Ｉｇ） は、熱処理後に浮遊培地内で２０〜１００　ｎのｈＧＨを分泌することがわかっ た。８回に及びマウス内へ注入された腫瘍（Ｇ８／ｎ）からの細胞についても、 同様な実験を実施した。表■（実験の部分を参照）は、Ｃ１，６を使って、ヌー ドマウスで２４世代の間、および５ｅｎｃａｒマウスで８世代の間、熱制御生産 が一定速度に維持されることを示している。下記に記載の別のクローンＨＢＮ２ を使っても、ヌードマウスにおける最初の２世代からの細胞で同様な結果が観察 された。ヌードマウス内への連続した皮下注入の後、腫瘍の発病までの時間は、 ３０ｍｍの腫瘍形成のためのわずか２週間に減少した。これに比較して、腫瘍細 胞が別のヌードマウス由来の時は、細胞培養から由来する腫瘍を得るのに４週間 を必要とした。皮下１１瘍の組織学的外観（第４図〜第６図）は、ヌードマウス 内に注入している間、同様（高い有糸分裂指数をもつ線維肉腫）であった。Ｃ１ ，６を使ってヌードマウス内で形成される直径３０ｍｍに及ぶ腫瘍において、主 要な腫瘍の壊死は観察されなかつた。さらに、腫瘍の末梢は、毛細血管により十 分に浸っていた（第６図）。

１、１．２　ン゛、 組織培養由来のＣ１，６細胞（１０’　ＩＥＩ胞数）をヌードマウス内の腹腔内 にもまた注射した。注射後３週間、腹部の腫大が観察された時、マウスを犠牲に した。剖死時、著しい腹水をもった腫瘍が認められ、また、腹腔のリンパ節およ び腎臓周辺並びに肝臓において腫瘍の転移が観察された。顕微鏡上、この腫瘍は 、Ｃ１，６細胞の皮下注射で得られた腫瘍と同様であった。

１．２　５ｅｎｃａｒマウス　への 遺伝的な免疫欠損ではない、マウスの５ｅｎｃａｒ変種（実験の部分において説 明されるような５ｗ１ｓｓ由来の変種）は、遺伝子操作された形質転換細胞に対 する宿主として、前述したヌードマウスへの注入の後に正常マウス内でこれらの 細胞が成長できるかどうかの試験として用いる。細胞培養から直接に５ｅｎｃａ ｒマウス内で腫瘍を形成させる試みは、不成功であった。

しかしながら、ヌードマウス内の第一世代の腫瘍（Ｇｌ／ｎ）を５ｅｎｃａｒマ ウスに皮下（ｓ、ｃ、）もしくは腹腔内（ｉ、ｐ、）注射した後で得られるＣ１ ．６細胞は、５ｅｎｃａｒマウス内で各々、ｓ、ｃ、およびｉ、ｐ、腫瘍を形成 した（Ｇｌ／ｓ／ｓｃおよびＧｌ／ｓ／ｉｐと称される、第２図）、この実験を ヌードマウス内の第二世代の腫瘍ＣＧ２ノｎ）を使って５ｅｎｃａｒマウス内に ｓ、ｃ、注射して繰り返すと、また５ｅｎｃａｒマウス内でｓ、ｃ、腫瘍を形成 した。　５ｅｎｃａｒから５ｅｎｃａｒへのＣ１，６１１瘍の直接の注入もまた 成功した。５ｅｎｃａｒマウス内のｉ、ｐ、腫ｇｉ１（Ｇｌ／ｓ／ｉｐ）が、ｓ 、ｃ、、　ｉ、ｐ、および箔内（ｉ、ｍ、）経路により、いくつかの他の５ｅｎ ｃａｒマウスに移植されて、Ｇ２／ｓ腫瘍を形成したからである。　ｉ、ｍ、お よびｓ、ｃ、腫瘍を観察し続けると、５ｅｎｃａｒから５ｅｎｃａｒへの移植は 、継続可能である。

５ｅｎｃａｒマウス内の腫瘍の組織学的構造は、ヌードマウス内に誘発されるそ れと同様であった。

１．３”−）への 遺伝子操作され、形質転換された細胞の種間の異種移植片が腫瘍を形成できるか どうか確かめる為に、ヌードマウス内の成長した腫瘍（Ｇ４／ｎ）を３匹の白変 種ラットに皮下移植（約７５ｍ５”切片）した、１匹は、免疫制御のためシクロ スポリンを投与され（実験の部を参照）、他の２匹は、その薬物を投与されなか った。移植後２週間で、腫瘍は２匹の正常ラットにおいて退化していた。一方、 シクロスポリン免疫抑制達していた（第３図）、剖死時、この腫瘍１よ、約２値 の生存している腫瘍細胞の層に囲まれた大きな壊死領域力１ら成ることが認めら れた（総合して約４０ｇ）。その組織学的外観番よ、再び前にマウス内に誘発さ れた腫瘍に等しし）、線維肉腫の構造であった。この腫瘍細胞からのｈＧ）Ｉの 熱誘導生産番よ、ヌードマウスからのそれに等しかった。免疫抑制動物器よ、遺 伝子操作された細胞を成長するために興味ある宿主である。ラットに加えて、他 の溢血動物もまた用いることができる。

２、　クローンＨＢＮ２ ＩＢＮ２もまた、プラスミドｐ１７）ＩＢＮを取り込んでｔ）るＮＴ）ｌ−３７ ３細胞系由来のクローンである。このプラスミドの構成ｔ′！第９ａ〜９ｂ図に 示されるように、３つの翻訳単位、すなわち、（１）ヒトのｈｓｐプロモーター によって作動されるｈＧ）Ｉ　：Ｊｊｌ（立子、（２）単純庖疹ウィルスチミジ ンキナーゼのプロモーター支配下のネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性によ る細胞選択に使用される）、（３）マウスの線維芽細胞内で、プラスミドの安定 した形能でのマルチコピーを維持する要因となる配列を有する、牛乳頭腫ウィル ス亜属のフラグメント（Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉら１９８４　、　ＥＭＢＯＪ、、　 ３巻、第３６５〜３７１頁）、を含んでむ）る。

２．１　ヌードマウスへの 培養（無血清培地０．１　ａｆ中の１０６個の細胞を使用）からのＨＢＮ２細胞 の移植は、２様式で実施した。１つの場合にお（１ては、細胞をヌードマウスの 内証に皮下注射した。１ケ月後成長が認められ、この第一世代の腫瘍（ＨＢＮ２ ／Ｇｌ／ｎ）を取り出し、ハサミで切り刻み、次いで、腫瘍細胞を第二世代の腫 瘍（ＨＢＮ２／Ｇ２／ｎ）形成のためスートマウスの背部に注射した。

第２の場合においては、無血清培地０．５ｄ中の１０ｈ個のＨＢＮ２細胞をヌー ドマウスの肺中の気管内に注入した。２ケ月後動物を副列させた時に、乳頭突起 部を侵している巨大な乳頭腫（直径１０ｍ）が認められた。その腫瘍（ＨＢＮ２ ／Ｇｌ／ｉｔ）は、顕微鏡上肉腫であると査定された（第７図および第８図）。

また、クローンＨＢＮ２由来の腫瘍から単離された細胞は安定であり、熱誘導下 高い効率で、培地内に希望とするタンパク質を提供した（表■参照）。

３、　クローン１８（Ｍ） ＮＩＨ−３７３細胞に、プラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒを、ＳＶ４０の初期プ ロモーター支配下にあるネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドと共に同時 移入した（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ　１９８２゜Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ 、Ｇｅｎ、１巻、第３２７〜３４１頁）。２週間後、６４１８耐性（浮遊培地１ −当り２００　ｎ＞のクローンを単離し、増大させた。クローン１８は、熱処理 後、１０’細胞数当り約１．５４のｈＧＨを分泌することを見出した。上記に記 載した様に２匹のヌードマウスの内証に皮下注射した。３ケ月後、腫瘍は注射部 位において成長しなかった。これは移植が不成功であることを示している。

４、　ベト１皿上で　した学　′Ｐｉにおしる腫瘍１［（Ｃ１，＆）を連続した トリプシン処理により解離させた。各トリブシ分解の段階からの一部を３種の培 地において、ベトリ皿上に接種した。

一５％仔牛脂児血清および５％新生仔牛血清の加わったＷｉｌｌｉａｎ＋ｓ’Ｅ 溶液から成る、血清補足培地（ＳＳＭ）　（第１１図参照）。

−４ｇ／ｌの牛血清アルブミンおよび７．６μｍｏ　ｌ　／　Ｉ！の６種遊離脂 肪ａ　（ＦＦＡ）の混合物の加わったＷｉｌ　ｌ　１ａＩＩｌｓ’　Ｅ培地から 成る、無血清培地。これら６種のＦＦＡは、必要なアセチルＣｏＡを提供してタ レブス回路機能を確実にするために不可欠であり、血清脂質の欠損下において要 求されるものである。

−５０ｒＮｌ／ｊ！のデキストランおよび７．ＥｌｊｍｏＣ＃！の６種ＦＦＡを 含んでいるＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地から成る、無血清かつ無タンパク質培地（ ＳＰＦＭ）。培養後、細胞を通常のようにストレスにさらした。結果は表Ｈにお いて概略されている（実験の部参照）。

ＳＦＭおよびＳＰＦＭの使用に関連する利点は、（１）最適な成長および細胞機 能のための基礎的な合成培地の容易な選択、 （２）仔牛脂児血清の使用を削除することによるコストの低減、 （３）血清の多くの既知および未知の成分を削除した明確な培地の使用、 （４）既知量の有効因子および阻害因子を使った補足、（５）特にｈＧＨのよう な分泌されたタンパク質のための抽出過程の簡略化、 （６）血清の外来的影響の排除、 （７）選択培地の容易な配合および使用、（８）アルブミンに結合した多くの汚 染物質の排除、（９）二倍体細胞系の表現型の発現に関する基礎的研究の継続、 （１０）正常のもしくは組換えの真核細胞が、人間の投薬用の治療的あるいは生 物学的に活性な分子の生産のために培養される時ＷＨＯおよびＦＤＡの要求を満 足させるような新規基礎培地の応用研究における技術革新。これらの利点は、Ｃ ＨＥＳＥＢＥｔｌＦおよびＰＡＤＩＥＵらにより教示されている（ＷＯ８４１０ ３７１０）　、ベトリ皿上に再接種後、Ｃ１，６細胞は、ＳＦＭおよびＳＰＦＭ においてＳＳＭと正確に等しい性質、即ち、非常に速い固定化、線維芽の形態の 回復および完全コロニー化、を有した。腫瘍細胞は、いかなる汚染細胞が認めら れることな（、親株のＣ１，６ｍ胞に等しかった。それ故、本方法に従って増大 された細胞を培養するために、ＳＦＭおよび５ｐｐｎ培地を使用することは、技 術的かつ経済的に有利である。

５、　のＣ１，６ ５，１マイクロキャ１アー　る 各トリプシン分解後の約３・１０９個ずつの細胞を、３〜５ｎ／１２のｃｙｔｏ ｄｅｘマイクロキャリアーと共に各々に３つの異なる培地の１つ２５０ｉを含ん でいる３つの生物発酵槽に接種した。接種後１２時間で、マイクロキャリアーは 腫瘍細胞で十分に覆われた。トリパン青呈色は、いずれの培地においても死細胞 は３％より少ない存在であることを示した（第１３図）。

２３日よりも長い間、この期間のあいだに数回の４２℃での４時間処理を施して 、細胞を生物光槽内で保存することが可能であった。　ＲＩＡ（ラジオイムノア ンセイ）法を使って、ｈＧＨの産生に注目した０表■（実験の部を参照）は、細 胞が各熱処理後にｈＧＨを分泌したことを示している。　ＳＳＭにおける産生は 、ＳＦＨにおけるよりも重要であり（第１２図参照”）　、ＳＰＦＭにおけるよ りもさらに重要であった。

ＳＳＨの生物発酵槽において、約３■のｈＧＨが培地に分泌されたことに注目す ることは興味深い。これらの細胞は、１■より少ない完全な腫瘍から由来してい ること、および熱処理は毎日適用できることに注目すべきである。

５．２　マイクロキャ１アーのない　：を解離された細胞は、条件がより好まし くないが、マイクロキャリアー〇ない生物発酵槽内でも生存維持され得る。例え ば、細胞は接種後５日でもまだ生存していることが確認された。

実験の詳細 １、１７ＨＢＮを　る　゛ プラスミドｐＢＰＶ　ｈＧＨ：　ｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒ　（Ｄｒｅａｎｏら、同 一文献）をＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、次いでＢｇｌＩ［で部分的に消化した。ヒ トのｈｓｐ７０プロモーター、ｈＧＨ遺伝子およびＳＶ４０終結シグナルを含む １．４　ｋｂフラグメントを低融解アガロース（Ｓｆｇｍａ＋■型）から抽出し た。プラスミドＶ　６９　（Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ　ら、同一文献）を旧ｎｄＩ［ Ｉで消化し、次いでＢａａ＋ＨＩで部分消化して、プラスミドベクター配列と５ ．４ｋｂの牛乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）亜属フラグメントとを含む、？、６ｋｂ のフラグメントを単離し、上記フラグメントと連結させた。

プラスミドｐ１１Ｋ　ＮＥＯ；ｐＶ６９をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、大きいフラ グメントをＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＢａｌ１Ｉ）Ｉ　Ｉで消化した 。単純庖疹チミジンキナーゼ転写シグナル（プロモーターおよびターミネータ− ）支配下のネオマイシン耐性遺伝子を含む、得られた１、８ｋｂのフラグメント を精製した。次いで、そのフラグメントを、ヒトのｈｓｐ７０プロモーターおよ びｐＢＲ３２２由来の配列を含む、ｐ１７ｈＧＨＮＥＯからのＰｖｕ　ｎ　−Ｂ ａｎ＋旧精製フラグメントに連結させた。

プラスミドｐ１７）ＩＢＮ　；　ｐ１７Ｋ　ＮＥＯを旧ｎｄＩ［ＩおよびＢａｍ ＨＩでの消化により線状にした。ｈｓｐ７０プロモーターおよびネオマイシン耐 性の転写単位を含むこのフラグメントと、ｈＧ）ｌ遺伝子、ＳＶ４０終結シグナ ルおよびＢＰＶ亜属のフラグメントを含む、ｐＢＰＶ　ｈＧＨからの６．８　ｋ ｂフラグメント（ＨｉｎｄＩ［［での完全消化およびＢａｍＨＩでの部分消化か ら得られる）とを連結させた。

得られたプラスミドｐ１７ＨＢＮは、３つの完全な“転写単位”を含有している 。

−ＳＶ４０ターミネータ−をもつ、ヒトのｈｓｐ７０−ｈＧＨハイブリッド遺伝 子 −ＴＫ転写シグナル配列をもつ、ネオマイシン耐性遺伝子−ＢＰＶ亜属のフラグ メント ２、　二　′６るのに　いる　。

２．１’　Ｉ　る゛ 細胞に、ＣａＣ１，法（Ｇｒａｈａａ＋およびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、１９７３ ．Ｖｉｒｏｌ。

５２巻、第４５６〜４６７頁）を用いて、ｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒ（Ｄｒｅａｎｏ ら１９８６）とｐＥＪ（Ｔａｂｉｎら１９８２．Ｎａｔｕｒｅ、　３００巻、第 １４３〜１４９頁）とを同時移入させた。２週間後、病巣形成能のあるクローン を単離し、培養した。各クローンの１０−個の細胞を２０ｃｄの皿中に接種し、 ２４時間培養後、４２℃で２時間熱処理し、次いで３７℃で１５時間インキュベ ートした。クローン６は、これらの熱衝撃の条件下、１０’細胞数当り３ｎのｈ ＧＨを産生じた。

２、２−工Ｕ叱１沢 細胞に、り１７ｈＧＨｄｈｆｒとｐＳＶ２　ＮＥＯとを同時移入した（Ｓｏｕ　 ｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、、１９８２　Ｊ、！１ｏ１．Ａｐｐ１．Ｇｅｎｅｔ 、１．第３２７〜３４１頁）。

あるいは、カルシウム法を用いてり１７ＨＢＮを移入した。２００■のＧ４１８ 　（ＧＩＢＣＯ）を含む完全浮遊培地において２週間培養の後、結果としてのク ローンの可視化は２週間後に観察された。それらを単離し、さらに前述のように 分析した。Ｃ１，１８及び）ＩＢＮ２は、１０６細胞数当り、各々１．４４およ び０．７　ｔｒｇのｈＧＨを誘導的に分泌することがわかった。

Ｉ　ｆ　ｆａ−Ｃｒｅｄｏ　（Ｌ’　Ａｒｂｒｅｓ　ｌｅ、　Ｆｒａｎｃｅ）か らの年令４〜６週間のヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスは、フィルターで覆われたＭ ａｃｒｏｌｏｎカゴの中で飼育され、空気濾過室に設置された。それらは、滅菌 済の食物および一般水道水を任意に与えられた。

遺伝子操作された１０６個ずつの細胞をトリプシン分解し、無血清のＤｕｌｂｅ ｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地で２回洗浄し、箔内（Ｌｍ、）、腹腔内（ｉ、ｐ、） および皮下（ｓ、ｃ、）注射用に約０．１−１並びに気管内への滴注用に０．５ −の同培地に懸濁した。

３．２　ヌードマウス）゛ヌードマウス　し　は５ｅｎｃａｒマウヌこゴ目Ｆ１ ヌードマウス内のｓ、ｃ、移植されたクローン６細胞は、ｓ、ｃ。

腫瘍を発達させた。腫瘍が直径２０ｍ５に達した時点（接種後約４週間）で、マ ウスを犠牲にし、腫瘍（約３ｇ）を切り取り、無血清培地内で切り刻んだ。次い で、切断された腫瘍の一部（１／１０）を、ヌードマウスあるいは５ｅｎｃａｒ マウス内に再注射した。

Ｂａｔｔｌ　１ｅ−Ｇｅｎｅｖａは、マウスのＳｅｎｃａｒ変種、いわゆる皮膚 の発ガン物質感受性のために選別されたスイスマウス由来の白変種マウスをつ（ り出した（Ｓｅｎｃａｒは、“発ガン物質感受性”からきている）、ヌードマウ スに比べて、このマウスの変種は、遺伝的に免疫欠損ではない。

３．３−一　への ヌードマウス内で発達させた（第四世代）　Ｃ１，６腫瘍の約７５ｍ”の切片を 、Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ白変種ラット（ＩＦＦＡ−ＣＲＥＤＯ。

Ｆｒａｎｃｅ）に皮下移植した。移植は、３匹のラットにおいて実施された。そ のうち２匹は正常のラット、１匹は１０日間毎日、６０■八ｇのシクロスポリン （Ｓａｎｄｏｚ、　Ｂｅｎｎｅｔらｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、＊４５巻、第４ ９６３〜４９６９頁）のｓ、ｃ、注射により、化学的に免疫抑制されたラットで ある。

１」−」旧１２ 腫瘍を再移植のために取り出した時、その一部を固定化溶液（１０％ホルマリン 緩衝液）の中に置き、次いで処理し、切片を顕微鏡観察のために、Ｍ、ＧＡＢＥ （１９６Ｂ）、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｈｉｓｔｏ−１ｏｇｉｑｕｅｓ　Ｅｄ、 Ｍａｓｓｏｎ　ｅｔ　Ｃｉｅ　Ｐａｒｉｓ記載の方法で、ヘマリンーフロキシン ーサフランにより染色した。

玉−１１マウス１°　へ　せ枦　な 皿 ４．１３　の立士の量旦 この項において用いる３種の培地の組成は、以下のようである。

一５％仔牛脂児血清（ＦＣＳ）および５％新生仔牛血清（共にＢｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒから入手）の加わったＷｉｌｌｉａａ＋ｓ’Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）から成る 、血清補足培地（ＳＳＭ　）　。

−４ｇ／ｌの生血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ　（Ｓｉｇａ＋ａ）（ １０％ＦＣＳに等しい）および７．６μｍｏ　１２　／　１の６種の長鎖遊離脂 肪酸（ＦＦＡ）混合物を添加した同培地から成る、無血清培地（ＳＦＭ）、　Ｆ ＦＡのモル比は、ラットの血漿のそれに近似した（ｅｉｓ−リルイン酸の増加を 除いて）、すなわちバルミチン酸３１．０％、ｃｉｓ−パルミトレイン酸２．８ ％、ステアリン酸１１．６％、ｃｉｓ−オレイン酸１３．４％、ｃｉｓ−リノー ル酸３５．６％、ｅｉｓ−リルインＭ　５．６　％　（Ｓｉｇｍａ）である。

−５０■／ｊ！の２−１０’ダルトンのデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を 含む同培地から成る、無血清かつ無タンパク質培地（ＳＰＦＭ）　。

デキストランは、７．６μｔａｏｌ／Ｉｔの６種のＦＦＡを可溶化する４　ｇ／ 　ｌ　ＢＳＡと同じ効果をもつ。各培地は、抗生物質として５０ｎＮのゲンタマ イシン（ｇｅｎｔａｌｉｎｅ、　Ｕｎｉｌａｂｏ）を含む。

４．２　マウス１′　への　の マウスを犠牲にし、皮膚を切断して腫瘍を容易に摘出した。

ハサミで細かく刻んだ後、マグネチックヌターラーを備えた５０ｒｒ１１のトリ プシン分解容器に腫瘍切片を移した。これに、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｃｏ＋ｅｐａｎｙ　、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　、　ＭＤ 　、　ＵＳＡから入手した、１：２５０　（同重量の２５０倍のカゼインを分解 するトリプシンに等しい）をトリプシン洗浄培地により３倍に希釈した溶液を同 容量加えた。それを１０分間１１００ｒｐ　、　３７℃で撹拌し、次いで細胞の 懸濁液を氷上で冷却した“Ｈａｍ　ＦＩＯ培地”（細胞容量に対して２倍容の培 地）にデカンテーションし、３０ｇで遠心分離した。平行して、容器内において トリプシン分解の操作を補足した。それに続くトリプシンでの分解は、解離が完 全になるまで、通常１０〜１３回くり返した。各遠心の段階の後、細胞を約４． ３−の培地内に懸濁させた。その１／１０を２０ａａのペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ ）上に、９／１０を１リツトルの光物発酵槽（Ｔｅｃｈｎｅ、　Ｃａｍｂｒｉｄ ｇｅ、　Ｕ、　Ｋ、）に移した。数回のトリプシン分解の段階後は、もはやトリ プシン溶液を希釈しなかった。別の方法において、コラ−ゲナーゼ溶液（Ｂｏｅ ｈｒｉ−ｎｇｅｒ、０．５５ｇ／　１　）を使って、同等の解離が得られた。

解離が完了した時、浮遊培地（ＳＳＭ　、　ＳＦＭあるいはＳＰＦ？ｌ。

ｑｓｐ２５０ｍ／）およびｃｙｔｏｄｅｘマイクロキャリアー（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ。

Ｆｒａｎｃｅ　、　Ｆ７８３４０　、３〜５　ｇ／　ｌ　）を添加した。培地は 、５％ＣＯ□／空気混合物を約１０分間バブリングすることによりＣＯｔ処理さ れている。

最終的に、細胞を３７℃で一夜インキユベートする。培地を交換し、次いで生物 発酵槽を３〜４時間４２℃の温浴下に置き、続いて３７℃で２０時間インキュベ ートする。培地を除去し、表■に記載のような熱処理の有無の前に、新しい培地 で置換する。

表■：ヌードマウスもしくは５ｅｎｃａｒマウスに注入後Ｃ１，６細胞によって 産生されるｈＧＨの定量。腫瘍をマウスから回収し、はさみで細かく刻み、次い でトリプシン処理した。解離された細胞は、１０％の仔牛脂児血清を補足したＤ ｕｌｂｅｃｃｏ改良のＥａｇｌｅ培地５ｒｎ１中の１０”細胞数で、２０ｃｓＡ のペトリ皿（Ｆａｌｃｏｒ＋）内に接種された。翌日、細胞を４２℃で１〜２時 間熱処理し、もしくは処理しなかった（対照）。３７℃で２０時間後、試料培地 中に分泌されたｈＧＨを、Ｃａｍｂｉｒｄｇｅ　Ｉｎｃ、ｔＭａｓｓ、　Ｌｌ、 Ｓ、Ａ、からのｈＧＨＲＩＡキントを使って定量した。細胞の同定コード中の数 字は、腫瘍の世代順序を示している（　１．１．１項参照）。

マウス種　細胞　熱衝撃　対照 （ｈＧＨｘ／２０　ｉ／１０’ｃｅｌｌｓ）ヌード　Ｃｌ−６２〜５　０．０１ ０１　／　ｎ　２〜５　−−−−−−−−Ｇ２／ｎ　１．３　０．１５ ０７／ｎ　６　０．０３ ０８／ｎ　２．５　０．０３ Ｇ９／ｎ　２．２　０．０３ Ｇｌｌ／　ｎ　１．４　０．０２ ０１３／　ｎ　Ｏ，７０，０１ ０１４／　ｎ　１．　ＯＯ，０１ Ｇ１６／ｎ　１．７　０ ０１８／　ｎ　！、　９　０．０４ Ｇ２０／ｎ　２．９　０ Ｇ２２／　ｎ　１．２　０．０００２ Ｇ２４／　ｎ　０．７　０．０００５ Ｓｅｎｃａｒ　Ｇ　２　／　ｓ　１．１　０．０１０２／ｓ　１０　０．０８ Ｇ５／ｓ　＞１．３　０．０４ Ｇ？／ｓ　４．５　０．０１ ０８／ｓ　７．８　０．０２ 表■：生物発酵槽内に保存された、形質転換されたＮＩＢ　３Ｔ３細胞における ｈｃｕの分泌、各生物発酵槽に、３〜５ｇ／２のｃｙｔｏｄｅｘマイクロキャリ アーを含む前述の３種の各培地２５０ｄの容量中の２．２・１０９個の腫瘍細胞 を接種した。接種後数日（表■の第一段を参照）で、細胞を４２℃で３〜４時間 熱処理し、次いでその後３７℃で２０時間保ち、最終的に新鮮な培地に入れた。

培地のＣＯ□濃度は、培地中に５％ＣＯ□−空気混合物をバブリングすることに より維持された。接種後１２時間でマイクロキャリアーが腫瘍細胞で覆われるこ とがわかった。

トリパン青呈色は、使用したいずれの培地においても、死細胞が３％より少ない 存在であることを示した。

実験２において、各生物発酵槽に、２　ｇ／　ｇのｃｙｔｏｄｅｘ　ミクロキャ リアーを含んでいる上記の培地１０〇−容量中の５０・１０＆個の腫瘍細胞を接 種した。細胞を４３℃で２時間熱処理し、３７℃で２４時間さらに維持し、最終 的に新しい培地に入れた。浮遊培地をＲＩＡ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅ ｕｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎにより提供）もしくはＥＩＡによりｈＧＨの存在に ついて分析した。

これらの細胞を、下記で補足された、Ｗｉｌｌｉａｎ＋ｓ’Ｅ培地（実験１）あ るいはＷｉｌｌｉａｎ＋ｓ’Ｅ／ＨＡＭ　Ｆ−１０（５０：５０．　ｖ／ｖ）　 （実験２）内に維持した。

一５５Ｍ　；　５％仔牛脂児血清および５％新生仔牛血清、−３ＦＭ　；　４ｇ ／Ａの生血清アルブミンおよび７．６　ｕｍｏｌｌＨ２の６種のＦＦＡ　（遊離 脂肪酸）、 一５ＰＦＭ　；　５０＋ｎｇ／／のデキストランおよび１．６ｔｔｍｏｌｌ／ｌ の６種のＦＦＡ　。

実験　１ 接種後の　ＳＳ？Ｉ　ＳＦ？ｌｌ　ＳＰＦＭ熱処理日数　ｍｇｌｌ　ｇ／１０’ ｃ　ｍｇ＃　ｍｇ／１０’ｃ　ｍｇ／ｉｔ　、ｑ／１０’ｃ１　０．３５　０． ０４　０．４４　０．０５　０．７０　０．０８２　０．３５　０．０４　０． ２６　０．０３　０．２６　０．０３３　１．１　０．１３　０．５３　０．０ ６　０．５３　０．０６７　２．３　０．２６　１．９　０．２２　０．７９　 ０．０９９　２．９　０．３３　１．７　０．１９　０．１８　０．０２１１　 ２．１　０，２４　１．９　０．２２　０，７９　０．０９１３　４．２　Ｑ、 ４８　０．３５　０．０４　・−・−・実験　２ １　０．２５　０．５　０．３５　０．７　０．２５　０．５５　２．９５　５ ．９　０．４５　０．９　０．３０　０．６７　０．４０　０．８　０．６　１ ．２　２．２５　４．５１２　０．２５　０．５　１．２　２．４　３．６５　 ７．３５、他の実験系列において、Ｂ型肝炎ウィルス表面の抗原（ＨＢｓＡＧ　 ）をコードするＤＮＡ　フラグメントを、ヒトの７０ｋｂの熱衝撃タンパク質プ ロモーターの支配下に位置させた。得られたプラスミド構成物（ネオマイシン耐 性の選択遺伝子を含むｐ１７Ｍｓ　ｎｅｏ　）を、ヒト起源の安定した羊膜細胞 系（Ｗｉｓｈ）を確立するための移植実験において用いると、ＨＢｓＡｇ遺伝子 は、熱制′４Ｂ様式において発現した。集合、グリコジル化、分泌並びに主要お よび中間のＳタンパク質の両生成のような翻訳後修飾は、正常に機能に現われた 。加えて、熱誘導の種々のプロトコール下にＨＢｓＡｇの生産が可能であること がわかった。ヌードマウスへの接種後、腫瘍の発達は接種の部位で観察された。

腫瘍細胞は、切り取られた腫瘍からコラ−ゲナーゼあるいはトリプシン処理の方 法により分散され、次いでペトリ皿上に接種されて、熱誘導の後、起源の細胞系 の細胞と同量のＨＢｓＡｇを分泌した。

腫瘍細胞による抗原の産生に関する結果は、下記の表■において提供される。

表■：腫瘍としてヌードマウス内に注入する前後のＷＢ４細胞によるＨＢｓＡｇ の分泌、親細胞（約１０６個）をヌードマウスの背部に接種した。３週間後、マ ウスは腫瘍を増大させた。

マウスを犠牲にし、腫瘍をハサミで紺かく切断し、腫瘍の次世代を形成させるた めにヌードマウスに接種した。もしくは、続いて腫瘍細胞を解離させるためにト リプシンで処理し、ペトリ皿に接種した。細胞を２５ｃＪ皿当り１０６細胞数の 密度で４３℃で２時間熱処理した（ＨＳ）あるいはしない（対照）後、３７℃で 一晩インキユベートした。ＨＢｓＡｇは、Ａｂｂｏｔから入手したＥＬＩＳＡキ フトを使って測定された。

世代　ＷＢ４ ｎｇ　）ｌＢｓＡｇ／１０’ｃｅｌｌｓ対照　）Ｉｓ 親細胞　０　８０ Ｇ　１　０　１００ Ｇ２　未測定　未測定 Ｇ３　０　５０ プラスミドｐ１７Ｍｓ　ｎｅｏの構成に関する完全な詳細は、ＤＲＥＡＮＯら、 Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９Ｂ？）　＋　８　＠　、第４３−５９頁 の中に公表されている。

ＦＩＧ、　９σ　ＦＩＧ、　ｅｂ　ＦＩＧ、　９σ配列記号に対すも呈漫見 （（５２０５５雫’Ｑ　５Ｖ４０ｆロモーターおよびターミネータ−配列βゝ０ ２５く　ヒトのｈｓｐ　７０遺伝子配列９２２２２８８　ヒトの成長ホルモン遺 伝子配列６１２５２５１ミ　ネオマイシン耐性遺伝子配列（ＮＥＯ）シ２５２６ ５２５（ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子配列（ｄｈｆ　ｒ　）≦２５０００５ ５礎　単純庖疹ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子配列ＦＩＧ、１０ 国際調査報告 ＋ｍｖ負ｍ＊’ｅ’ＡＩ＞’を番Ｉｎｓ＋＋６．ＰＣ？／ＥＰ８７１００５９９ 国際調査報告 ＥＰε７００５９９ ＳＡ　１８９５１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．組換え遺伝子の誘導発現単位／宿主細胞機構による着目タンパク質の生化学 的生産方法てあり、（１）真核生物起源の適当な細胞系を選択する過程、（２） 以下の要素を含む組換えＤＨＡを使って形質転換することによりこれらの細胞を 遺伝子修飾する過程、（ａ）真核生物起源のストレス誘導性転写プロモーターの 支配下にある、着目タンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）細胞質性のあるいは ウィルス性起源の、腫瘍遺伝子もしくは腫瘍形成の形質転換遺伝子、 （３）形質転換された細胞を、接種に応じて腫瘍成長させることのできる、選択 された実験用の温血動物内に接種する過程、 （４）腫瘍が１０１０細胞数もしくはそれより多く観察されるまで動物内で腫瘍 を成長させる過程、 （５）上記腫瘍を取り出し、それの解離をもたらし、解離された細胞を管内の培 地に注入し、着目遺伝子の発現を誘導するためのストレスを受けさせる過程、お よび（６）発現されたタンパク質を単離する過程、を含む方法。 ２．選択される細胞系（１）が腫瘍細胞であり、要素（ｂ）が省略される、請求 項１記載の方法。 ３．転写プロモーター（ｂ）が、ヒトの７０ｋｄの熱衝撃（ｈｓｐ７０）プロモ ーターフラグメントである、請求項１記載の方法。 ４．腫瘍遺伝子もしくは腫瘍形成の形質転換遺伝子が、（ｉ）ヒトのｃ−ｒａｓ 腫瘍遺伝子（ｉｉ）牛乳頭腫ウィルス亜属のフラグメントから選ばれる、請求項 ３記載の方法。 ５．着目遺伝子（ａ）が、ヒト生長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子もしくはＢ型肝炎 ウィルス表面の抗原の遺伝子である、請求項３記載の方法。 ６．上記（２）の組換え遺伝子が、（ｉ）ｈｓｐ７０プロモーター支配下のｈＧ Ｈ遺伝子を有するプラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒ、（ｉｉ）ｈｓｐ７０プロモ ーター支配下のｈＧＨ遺伝子、単純庖疹ウィルスチミジンキナーゼプロモーター 支配下のネオマイシン耐性遺伝子および牛乳頭腫ウィルス（クローンＨＢＮ２） の形質転換遺伝子を有するプラスミドｐ１７ＨＢＮから選ばれる、請求項３記載 の方法。 ７．過程（２）における上記形質転換が、プラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒとヒ トのｃ−ｒａｓ腫瘍遺伝子を有するプラスミドｐＥＪとの同時移入によりもたら される、請求項３記載の方法。 ８．過程（２）における上記形質転換が、プラスミドｐ１７ｈＧＨｄｈｆｒと、 初期ＳＶ４０プロモーター支配下のネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド ｐＳＶ２ＮＥＯとの同時移入によりもたらされる、請求項２記載の方法。 ９．選択される細胞系が、ＮＩＨ−３Ｔ３である、請求項１記載の方法。 １０．選択される動物の中に、ヌードマウスおよび化学的に免疫抑制された動物 を含む、請求項３記載の方法。 １１．過程（４）の後に、さらに中間の（４ｂ）腫瘍を取り出し一部をＳＥＮＣ ＡＲマウスのような免疫性動物内に接種する過程を含む、請求項３記載の方法。 １２．過程（５）において、（ｉ）血清補足培地（ＳＳＭ）、（ｉｉ）無血清培 地（ＳＦＭ）、および（ｉｉｉ）無血清かつ無タンパク質培地（ＳＰＦＭ）から 選ばれる培地における培養を含む、請求項３記載の方法。 １３．組織学的に分散されたマイクロキャリアー（ＣＹＴＯＤＥＸ）もしくは、 陥凹繊維培養システムの存在下、発酵槽内で実施することを含む、請求項１２記 載の方法。 １４．着目タンパク質の単離が、アフィニティークロマトグラフィー、透析、イ オン交換およびゲルクロマトグラフィーから選ばれる技術によりもたらされる、 請求項１３記載の方法。 １５．上記（２）における組換えＤＮＡが、ｈｓｐ７０プロモーターにより作動 されるＨＢｓＡｇ遺伝子を有するプラスミドｐ１７ＭＳＮｅｏである、請求項３ 記載の方法。 １６．宿主細胞系が、ＮＩＨ−３Ｔ３およびＷＩＳＨ（ＡＴｃｃ−ＣＣＬ２５） から選ばれる、請求項３記載の方法。