JPH01501571A - 細胞表面抗原の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ｅ）上記免疫複合体牟ステップ（ロ）でできた場合、上記感作細胞を溶解して 、可溶化免疫複合体を含む水性成分を作る、（社）上記水性成分を、上記免疫複 合体を特異的に結合できる固体サポートと混合し、そのことにより、固／液相混 合物を作る、（ｅ）上記固／液相混合物を、存在する免疫複合体が上記固体サポ ートに結合するのに十分な時間維持し、固相結合複合体を作る、 （０ステツプ（ｅ）でできた結合複合体の存在を検定する、以上、（ａ）〜（０ のステップを含む、細胞試料について、細胞表面抗原の存在を検定する方法。

（２）　（ａ）検出すべき表面抗原をもち、この抗原と免疫反応を起こす、この 抗原に対する抗体を含む免疫複合体を有する細胞の検定のための部分標本を準備 する、 （ロ）上記部分標本の細胞を溶解し、細胞破片及び、免疫複合体が存在するとき は、可溶化した免疫複合体を与える、（Ｃ）上記の可溶化した免疫複合体の存在 を検定する、以上（ａ）〜（Ｃ）のステップを含む細胞表面抗原の存在を検出す る方法。

（３）上記部分標本の細胞が血小板である請求項（２）記載の方法。

（４）上記免疫複合体の上記抗体が自己抗体である請求項（３）記載の方法。

（５）上記自己抗体が、グリコプロティンＩｌｂ／ｌ１ｌａ複合体又は、グリコ プロティンＩｂを指向するものである、請求項（４）記載の方法。

（６）上記血小板が、第１のヒト由来のもので、かつ、上記抗体が第２のヒト由 来のアロ抗体である、請求項（３）記載の方法。

（７）上記免疫複合体の抗体が、主要組織適合性複合体抗原を指向するものであ る、請求項（３）記載の方法。

（８）　主要＆Ｉｌ織適合性複合体抗原がＨＬＡ抗原である、請求項（力記載の 方法。

（９１（＋）ステップ伽）における細胞破片を、存在する可溶化した免疫複合体 から分離する、 （ｉｉ　）上記の分離した免疫複合体を固体サポートに固定し、固相固定化免疫 複合体を作る、 （市）その後、面相固定化免疫複合体として、免疫複合体の存在を検定する、 以上（ｉ）〜（ｉｉ）のステップをさらに含む請求項（２）記載の方法。

（至）（ａ）予期される提供者の血小板を患者由来の血清又は血漿の部分標本と 混合し、水性の液体混合物を作る、〜）上記混合物を、血清又は血漿中に存在す るアロ抗体が、血小板抗原と免疫反応を起こすのに十分な時間、生物学的検定条 件下で維持し、免疫複合体を作る、 （Ｃ１上記混合物の血小板を溶解し、細胞破片及び、上記アロ抗体と、上記血小 板抗原が上記混合物中に存在する場合は、可溶性免疫複合体を作る、 （ｄｌ上記免疫複合体の存在を検定する、以上（ａ）〜ｌｄｌのステップを含む 、提供者と患者との間の血小板適合性を検定する方法。

（１１）　Ｔａ１分類すべき細胞試料の部分標本を、探している実質的に全ての グループの細胞表面抗原に共通した抗原エピトープと反応する抗体と反応させ、 免疫複合体を作る、山）上記試料の細胞を溶解し、細胞破片及び免疫複合体を作 る、（Ｃ１可溶化した免疫複合体を、一群の細胞表面抗原の少なくとも１つの特 異的細胞表面抗原エピトープと免疫反応を起こす指示されたパラトープ分子と反 応させ、第２の免疫複合体を作る、（ｄ）上記第２の免疫複合体の存在を検定す る、以上（ａ）〜（ｄｌのステップを含む一群の細胞表面抗原の存在について、 細胞を分類する方法。

０　上記細胞表面抗原のグループがＨＬＡ抗原である請求項ａυ記載の方法。

（１３（ａｌ血小板試料を溶解し、可溶化した血小板表面抗原−抗体複合体を含 む水性成分を作る、 （ｂｌ上記水性成分を、上記血小板表面抗原−抗体複合体と免疫反応を起こすこ とができる固体サポートと混合することにより、捕獲反応混合物を作る、 （Ｃ１この捕獲反応混合物を、上記固体サポートが存在する上記血小板表面抗原 抗体複合体と免疫反応を起こすのに十分な時間維持し、固相免疫反応産物を作る ことにより維持固体サポートを作る、 Ｔｄｌ上記維持固体サポートを、上記固相免疫反応産物の上記抗原−抗体複合体 と免疫反応を起こすことができる標識化抗体分子と混合することにより、標識反 応混合物を作る、（ｅ）上記標識反応混合物を、上記標識抗体分子が、ステップ （Ｃ）で形成した、上記固相免疫反応産物と免疫反応を起こすのに十分な時間維 持し、標識化固相複合体を作る、（ｆｌステップｌｅｌでできた標識化した固相 複合体の存在を検定し、する、 以上［ａｌ〜（ｆ）のステップを含む、血小板試料中の血小板表面抗原−抗体複 合体を検定する方法。

０４１　（ＩＩ）血小板試料を、血小板表面抗原と免疫反応できる抗体分子と混 合することにより、血小板免疫複合体を作り、血小板拒否反応混合物を作る、 （ｂｌ上記惑作反応混合物を、上記血小板免疫複合体の形成に十分な時間維持し 、抗体感作血小板を作る、ｔｅｌ上記惑作血小板を溶解し、上記免疫複合体がス テップ山）で形成するとき、可溶化感作血小板免疫複合体を含む水性成分を作る 、 Ｔｄ＋ｄｌ水性成分を、上記可溶化血小板免疫複合体と免疫反応を起こす固体サ ポートと混合し、捕獲反応混合物を作る、ｔｅｌ上記捕獲反応混合物を、上記固 体サポートが、存在する上記可溶化血小板免疫複合体と免疫反応するのに十分な 時間維持し、固相免疫反応産物を作ることにより、維持固体サポートを作る、 （ｆｌ上記維持固体サポートを、上記固相免疫反応産物の上記血小板免疫複合体 と免疫反応する標識化抗体分子と混合することにより、標識反応混合物を作る、 （酌上記標識反応混合物を、上記標識抗体分子が、ステップｔｅｌでできた上記 固相免疫反応産物と免疫反応するのに十分な時間維持することにより、標識固相 複合体を作る、［ｈ）ステップｔｇｉでできた、標識化固相複合体の存在を検定 し、これにより、上記血小板試料中の血小板表面抗原の存在を検定する、 以上（ａ）〜（目のステップを含む、血小板表面抗原について血小板試料を検定 する方法。

明　細　書 細胞表面抗原の検出法 里豊 弦歪煎豆団 本発明は血小板のｍｓ適合性型の検出及び個人の抗血小板の免疫状態を特徴づけ るための免疫学的方法に関するものである０本出願は、１９８６年１２月１日登 録された出願通し番号第９３６．１２５号の継続出願である。

ｌ量 血小板のｍｉｌ適合適合反型個人の抗血小板免疫状態は、抗血小板免疫応答によ る臨床的状態の管理に重要な役割を果たしている。

血小板破壊抗体の生産につながら抗血小板免疫応答は、他の多くの事象のうち、 妊娠、血小板輸血治療及び抗血小板自己免疫障害により発生する。

本発明にとって、血小板輸血治療は特に興味深い、四分の三世紀以上も前から、 血小板輸血治療は、骨髄障害をもつ患者の援助に年々重要性が増してきている。

しかし、この分野での進歩に対する妨害の１つに受容者の多くの人が、ラムダム な提供者からの繰返される輸血に抵抗を示すことがあげられる。血小板拒否反応 は多くの場合、アロ免疫化の結果として誘導される輸血受容者（ドニー）内の抗 血小板抗体によるものであろう。

アロ免疫化は、個人がアロ抗原への接触に応答して抗体を生産するプロセスであ る。アロ抗原とは、典型的にはタンパク質の、同種の各人で別個（対立遺伝子） の形で存在し、従って１つの形のものがそれに以前さらされたことのない同種の 人に移入（輸血又は＆ｌｌｌ１移植により）したとき免疫応答を誘導する抗原で ある。

クラス■のヒト白血球抗原（ＨＬ　Ａ）は、血小板表面上にみられるアロ抗原の １つのグループであり、輸血受容者中での血小板拒否反応を仲介するアロ抗体（ アロ抗原に対する抗体）を誘導することができる。ヤンキー（Ｙａｎｋｅｅ）等 は、単一の提供者由来のＨＬＡ一致血小板の輸血は、輸血受容者内の血小板数を うまく増加させることを最初に示した。すなわち、提供者血小板及び受容者ＨＬ Ａ型の相互一致は、輸血受容者中での血小板拒否反応を減少することが分ってい る。

不幸なことに、ＨＬＡ一致血小板提供者は、アロ免疫化した患者の小数のものに しか用いることができず、部分的に一致した提供者血小板への受容者の応答は、 予知することができない、交差反応基の認識及び血小板上の、あるＨＬＡ抗原（ 例えばＢ１２）の個々の発現の認識は、提供者選抜を考える上で役に立つ、しか し、試行ｌｉ誤に転ることなしに、提供者血小板選抜を行う手段があれば、たい へん役に立つであろう。

以前から言われているように、個人の抗血小板免疫状態の特性化も、自己免疫病 を管理する上で重要である。そのような病気になれば、血小板関連抗原に対する 抗体による破壊的トロンボシトペニア症の１つである、慢性免疫トロンボシトペ ニンク紫斑病（ＩＴＰ）がある（マクミラン（ＭｃＭｉｌｌａｎ）　、二ｓ　− ・イングランド・ジャーナル・オフ・メディシン（Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、） 　、３０４巻、１１３５〜１１４７頁（１９８１年）、及びケルトン（Ｋｅｌ　 ｔｏｎ）等、セミナー・オフ゛・トロンボ・ヘモスタシス（Ｓｅｍｉｎ。

Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、）　％　８巻、８３〜１０４頁（１９８２年 ））。

パン・リューエン（Ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎ）等は（ブランド（Ｂｌｏｏｄ）、 ５９巻、２３〜２６頁（１９８２年））は、自己抗体が何人かのＴＴＦ患者中に 存在するという証拠を最初に提供した。彼等は、４２のＩＴＰ血小板からの抗体 溶出物のうちの、３２が正常な血小板には結合するが、衰弱血小板には結合せず 、また、その他の溶出物は双方に結合したことに注目した。衰弱血小板は、血小 板グリコプロティン（ＣＰ）Ｉｌｂ及びＨａに欠陥をもつので、これらのＩＴＰ 患者はこれらのグリコプロティンの１つに対する抗体を持つのだろうと、彼らは 暗示している。

慢性ＩＴＰｆｉ者中の抗グリコプロティン自己抗体に対する直接的証拠は、種々 の方法を用いた引きつづき研究から提供された。

ウッジ（Ｗｏｏｄ）等は、ＩＴＰ患者由来の自己抗体がモノクローナル抗体を含 むマイクロプレートのウェルに付着させておいたＣＰＩｌｂ／ｌ１ｌａ複合体も しくはＧＰＩｂと結合することを示し、かつ、免疫沈殿法により、これらの観察 を確証した。ウンズ（Ｇｌｏｏｄｓ）等、ブランド（Ｂｌｏｏｄ）、６３−１！ 、３６８〜３７５頁（１９８４年）及びウンズ（Ｗｏｏｄｓ）等、ブランド（Ｂ ｌｏｏｄ）　６４　ｊｌ、１５６〜１６０頁（１９８４年）参照、先の方法を用 い、彼等はパン・リュベン等（上記）の間接的研究で得られたパーセンテージよ りも非常に少ない患者の約ｌＯ％に抗ＧＰＩｌｂ／Ｈａ又は抗血小板自己抗体が あることを印している。

また他の研究者はイムノプロッティング（ンイラン（Ｍａｓｏｎ）等、プリティ ッシュ・ジャーナル・オフ・ヘマトロジーＣＢｒ、Ｊ。

Ｈａｅｍａｔｏｌ、）　５６　＠、５２９〜５３４頁（１９８４年）及びバード スリー（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ）等、ジャーナル・オフ・クリニカル・インベスチ ゲーシッン（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）　７４Ｓ、１７０１〜１７０７頁 （１９８４年））、免疫沈殿法（ウンズ（賀ｏｏｄｓ）等、ブランド（Ｂｌｏｏ ｄ）、６３Ｓ、３６８〜３７５頁（１９８４年）、ウフズ（Ｗｏｏｄｓ）等、ブ ラッド（Ｂｌｏｏｄ）　６４　＠、１５６〜１６０頁（１９８４年）及びテビン （Ｄｅｖｉｎｅ）等、ブランド（Ｂｌｏｏｄ）　６４巻、１２４０〜１２４５　 （１９８４年））、ＩＴＰ血小板へのマウスモノクローナル抗ＧＰＩＩｂ／ｍａ 抗体の結合阻害（バロン（Ｖａｒｏｎ）等、プロシーディング・イン・ナショナ ル・アカデミ−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ ）ＵＳＡ　ｓ　８０＠、６９９２〜６９９５頁（１９８３年）及び交差イムノエ レクトロホレシス（ザトコウスキー（Ｓｚａｔｋｏｗｓｋｉ）等、ブランド（Ｂ ｌｏｏｄ）、６７＠、３１０〜３１５頁（１９８６年））により、慢性ＩＴＰ！ Ａ者中の抗血小板自己抗体を検出した。ヌジェン）　（Ｎｕｇｅｎｔ）等じ血′ 小板活性の理解及び検出のためのモノクローナル抗体の利用に関するＩＮＳＥＲ Ｍシンポジウムの進歩１エルセピア・サイエンス出版（１９８６年）及びアサノ （Ａｓａｎｏ）等（ブランド（Ｂｌｏｏｄ）　６６　＠、１２５４〜１２６０頁 （１９８５年））は、モノクローナル抗血小板抗体を合成するＩＴＰリンパ細胞 由来のヒトのハイブリドーマを作り上げた（ヌジェント（Ｎｕｇｅｎｔ）等、上 記）。

慢性ＩＴＰ中の抗グリコプロティン自己抗体を示すのに用いた検定法のうち、マ イクロプレートウェル法（ウンズ□１ｏａｄｓ）等、ブランド（Ｂｌｏｏｄ）、 ６３Ｓ、３６８〜３７５頁（１９８４年）及びウンズ（Ｗｏｏｄｓ）等、ブラン ド（Ｂｌｏｏｄ）　６４Ｓ、　１５６〜１６０頁（１９８４年））は、臨床的利 用に最も容易に適用できる。しかし、パン・リューエン（Ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅ ｎ）等のパーセンテージ（約７６％）と比較すると、陽性の率が低い（約１０％ ）ことは、抗体反応前の血小板の可溶化がエピトープの一部を変化させているこ とを示している。この理由で、抗グリコプロティン自己抗体のための検定法（免 疫ビーズ法）として、抗体への結合の際、血小板表面抗原がより安定に維持され うろことを利用した可溶化の前に血小板を反応させる方法をデザインした。この 検定法は、血小板関連及び血漿の自己抗体の両方を測定できる。

第１Ｊｂ（社）１！ 本発明は、（ａｌ細胞を、その細胞表面抗原と免疫反応を起こす抗体と混合し、 細胞感作反応混合物を作る、偽）上記細胞感作反応混合物を、その抗原及び抗体 を含む免疫複（Ｃ）上記感作細胞を分解し、上記免疫複合体がステップ伽）で形 成されているとき、可溶化した免疫複合体を含む水溶性成分を提供する、 ［ｄｌ上記水溶性成分を上記免疫複合体を特異的に結合しうる固体サポートと混 合し、固／液相混合物を作る、（ｅ）上記固／液相混合物を、存在する免疫複合 体が上記固体サポートに結合するのに十分な時間維持し、固相結合複合体を形成 させる、 そして（ｆ）ステップ（８１で形成した結合複合体の存在を検定する、以上のス テップを含む方法で、細胞表面抗原の存在を細胞試料について検定する方法を提 供する。

また、本発明は、（ａ）検定すべき表面抗原をもち、その抗原と免疫反応を起こ す抗体を含む免疫複合体を存する細胞の検定すべき部分標本を準備する、 −）上記部分標本の細胞を溶解し細胞破片及び上記免疫複合体がその部分標本中 に存在する時は、可溶化した免疫複合体を作る、（Ｃ１上記可溶化免疫複合体の 存在を検定する、以上＋８）〜（Ｃ１のステップを含む、細胞表面抗原の存在を 検出する方法を提供する。

他のｓ様において、本発明は、 Ｔａ）　患者由来の血清又は血漿の部分標本を予期される提供者の血小板を混合 し、水性液体混合物を作る、山）上記混合物を、生物学的検定条件下、その血清 又は血漿中に存在するアロ抗体が血小板と免疫反応を起こすのに十分な時間維持 し、免疫複合体を作る、 （Ｃ）　上記混合物の血小板を溶解し、細胞破片及び、上記アロ抗体と、上記血 小板抗原が、上記混合物中に存在する場合は、可溶化免疫複合体を作る、 ［ｄｌ　上記免疫複合体の存在を検定する、以上＋ａｌ〜（ｄｌのステップを含 む、提供者及び患者の間の血小板適合性を検定する方法を考案している。

また本発明は、 ｉＭｌ　ｔｉＢ胞試料の部分標本を請求められている細胞表面抗原の実質的に全 ての群に共通した抗原エピトープと反応する抗体と反応させて、免疫複合体を作 る、 （ｂｌ　上記試料の細胞を溶解し、細胞破片及び可溶化免疫複合体を提供する、 ｔｅｌ　その可溶化免疫複合体を、細胞表面抗原群の、少なくとも１つの特異的 細胞表面抗原エピトープと免疫反応を起こす、指示されるバラトープ分子と反応 させ、第２の免疫複合体を作る、＋ｄｌ　上記第２免疫複合体の存在を検定する 、以上、上記（ａｌ〜（ｄｌのステップを含む、ある群の細胞表面抗原の存在で 、細胞を分類する方法を考案している。

叉貝重立員呈脱里 １、定義 種々の文法型で用いられている“抗体”という語は、一群のイムノグロブリン分 子そして、または、イムノグロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわ ち抗体結合部位あるいはバラトープを含む分子を意味する集合的名詞として使わ れている。

“抗体結合部位”とは、特異的に抗原を結合する、Ｈ及びＬ鎖の可変及び超可変 領域を含む抗体分子の構造部分である。

種々の文法型で用いられている“抗体分子”という語句は、本来のイムノグロブ リン分子及びイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分の両方を指している 。

代表的抗体分子には、本来のイムノグロブリン分子、実質的に本来のイムノグロ ブリン分子及び当分野ではＦ　ａｂｂ　Ｆ　ａｂ　’、）’（ａｂ’）を及びＦ 　（Ｖｌとして知られているこれら領域を含む、パラトープを含有するイムノグ ロブリン分子の一部分がある。

抗体のＦａｂ、及びＦ（ａｂ’）を領域は、従来法により、実質的に本来のイム ノグロブリン分子に各々パパイン及びペプシンによるタンパク分解反応を行うこ とにより調製する０例えば、米国特許第４．３４２．５６６号、テオフィロホラ ス及びディクソンのものを参照せよ、Ｆａｂ’抗体領域も、よく知られており、 Ｆ（ａｂ　’）ｔｅｌ域を原料とし、２本のＨＩＪｊをつなぐジスルフィド結合 を、メルカプトエタノール等で還元し、ついで、生じたタンパク質のメルカプタ ンを、ヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化することにより調製される 。

本来の抗体分子を含む抗体が好ましく、ここでも例示的に用いられている。

種々の文法型で用いられる“モノクローナル抗体”という語句は、決まった（既 知の）抗原特異性をもつ、ある種の一群の抗体分子を意味する。モノクローナル 抗体は、特別の抗原と免疫反応しうる唯一種の抗体結合部位を含んでおり、従っ て、一般的に、ある抗原に対し単一の結合親和性を示す、それゆえ、モノ、クロ ーナル抗体は、各々、異なる抗原に免疫特異性をもつ２つの抗体結合部位を有す る二特異的抗体分子も含む。

ここで用いられているように、“生物学的検定条件２という語句は、本発明に有 用な、抗体のような分子が、約５から約９のｐＨ範囲、蒸留水から約１モル濃度 までのイオン強度及び約４℃から約４５℃までの温度範囲で、抗原のような別の 有用な分子に結合するときに用いられるような条件に対し、使用される。

ここで用いられているように“複合体°という言葉は、特異的な結合試薬−リガ ント反応の産物を意味する０代表的複合体とは抗原−抗体反応で形成される免疫 反応産物である。

“特異的結合試薬”とは、選択的に別の分子又はリガンドに結合しうる分子であ る０代表的な特異的結合試薬にはパラトープ分子、補体タンパク質又はその断片 、Ｓ、オーレウス（ａｕｒｅｕｓ）タンパク質入、及びそれに類するものがある 。特異的結合試薬は、そのリガンドが複合体の１部として存在する時、そのリガ ンドに結合することが望ましい。

■　検定法 本発明は細胞表面抗原の存在を検定する方法を巾広く考案している。この方法に 従がい、検定細胞、典型的には血液細胞を、細胞表面上に存在する抗原と免疫反 応を起こす抗体と混合する。できた混合物は、第１の免疫反応混合物であり、そ れが“抗体感作”細胞を作るところから、典型的には、細胞感作反応混合物と呼 ばれる。

本発明の方法によりその存在が検定されうる臨床的に有用であるマーカーとして 知られる細胞表面抗原は、主要＆ｌ繊織適合複合体（ＭＭＣ）抗原、特に、ヒト 白血球抗原（ＨＬＡ）のような組織適合性を決定できるものを含んでいる。また 有用な細胞表面抗原は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含むタンパク質と結合する膜 会合レセプターを含むグリコプロティン（ＣＰ）を含んでいる。そのようなグリ コプロティンにはＧＰ　１　ｂ％ＧＰＩＩ　ｂ、ＧＰＩ［ｌａ及びＧＰＩ［ｂ／ ＧＰＩＩ［ａ複合体のような、これらタンパク質を含む細胞表面複合体等が含ま れる。

細胞表面上の抗原と免疫反応を起こす抗体はよく知られており、ＭＤ州、ロック ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシラン（ＡＴＣＣ）から入手で きるものもある。

細胞感作反応混合物を、抗体及び細胞表面抗原を含む免疫複合体が細胞表面上に 形成するのに十分な時間維持する。よく知られているように、免疫複合体形成に 要する時間は温度や、反応物の濃度等を含む多くの因子に依存する。典型的には 、この時間は、この検定を行う前に、従来法により一連の反応条件で予め測定し ておく、生物学的検定条件下、通常この維持時間は３０分から約２時間というよ うな、分から時間のオーダーである。

免疫複合体の形成に十分な時間、この細胞感作反応を維持すると抗体感作細胞が でき、これらは、一般的に、洗浄と遠心により、未反応の抗体から分離される。

もし、これらの細胞が、検定する細胞表面抗原を持つならば、この感作細胞は、 細胞表面に会合した免疫複合体をもつであろう。

形成した、細胞表面免疫複合体の存在を検定するため、その感作細胞を溶解し、 可溶化した細胞表面タンパク質を含む水性成分を作る。Ｗ解は、感作細胞を、細 胞表面タンパク質を可溶化しうる界面活性剤と水又はバフファーを含む水性バ、 フッと混合することにより行う、細胞表面タンパク質を可溶化できる界面活性剤 には、ＰＡ州、フィラデルフィア、ロムアンド・ハス（Ｒｏｈｍ　＆＋１ａｓｓ ）社の登録商標トリトンＸ−１００の存在下、使用しうる・ポリオキシエチレン （９）オクチル・フェニル・エーテルのような洗剤が含まれる。

細胞及び界面活性剤の混合により生じた溶解反応混合物を、その界面活性剤が、 生じた細胞表面免疫複合体を含む、その細胞の表面タンパク質を溶解（！ｉｌ胞 膜から解離）するのに十分な時間維持する。可溶化に要する時間は予め測定して おき、通常、約１５分から約２時間のような、分から時間の範囲である。

細胞表面タンパク質の可溶化を検出する方法はよく知られており、検定すべき細 胞表面に会合したことが分っているタンパク質の出現について、その溶解反応混 合物の水層をモニターする免疫学的方法の使用を含んでいる０例えば、グリコプ ロティンｎｂ及びｍａが、全ての正常な血小板の表面に会合していることが分り 、血小板を検定する際の表面タンパク質可溶化の免疫学的マーカー通常、溶解反 応混合物の維持後形成した水性可溶化タンパク質成分は、可溶化タンパク質と同 時に、細胞破片を含んでいる。好ましいＢ様においては、その可溶化タンパク質 を、典型的には遠心により、細胞破片と分離する。

形成された可溶化した表面免疫複合体の存在を検出するため、その水性可溶化タ ンパク質成分の一部を、その免疫複合体と特異的に結合する固体サポートと混合 し、固／液相（捕獲反応）混合物を作る。

可溶化表面免疫複合体と特異的に結合する固体サポートは一般的に、固体マトリ ックスに固定（機能的に結合）した特異的結合試薬からなる。固相固定特異的結 合試薬は、可溶化した表面免疫複合体と免疫反応を起こすことができる抗体分子 であることが望ましい０表面免疫複合体の抗原又は抗体のいずれかと免疫反応を 起こしうる抗体を用いることができることに注意すべきである。

有用な固体マトリックスは、当分野ではよく知られているものである。その材質 は不溶性であり、それには、Ｎ、Ｊ、州ピスカタウエイのファルマシア社から登 録商標セファデフクスとして市販されている網状デキストラン；アガロース；ポ リ塩化ビニル、ポリスチレン、網状ポリアクリルアミド、ニトロセルロース；ナ イロン網でできたシート、ヒモ又はヘラ状のもの、又は、ポリスチレン、ポリカ ーボネート又はポリ塩化ビニルでできたチューブ、プレート又はマイクロプレー トのウェルなどが含まれる。

固体サポートの一部として存在するとき、特異的結合試薬は、当分野でよく知ら れている共有結合のような別の固定化法も使いうるが、典型的には、水性媒体か らの吸着により、固体マトリックスに固定化されている。

固／液相混合物を、存在する可溶化表面免疫複合体が、その固体サポートに結合 するのに十分な時間維持し、固相結合複合体を形成させる。維持した固体サポー トは、さらに、典型的には洗浄により、未結合のタンパク質から分離させること が望ましい。

維持した固体サポートに対し、固相結合複合体の有無を検定することは、細胞試 料中の、目的とする表面抗原の有無を検出する手段を提供する。このような検定 は、一般的に、その維持した固体サポートを、固相複合体の免疫複合体部分と特 異的に結合することができる、標識化した特異的結合試薬と混合することにより 、標識化反応混合物を作ることにより行なわれる０表面免疫複合体自身が固体サ ポートに結合している場合、その表面免疫複合体の抗原又は抗体のいずれかと、 その標識化特異的結合試薬が結合することができることが望ましい。

標識化反応混合物を、その標識化特異的結合試薬が存在する固相免疫複合体と反 応（特異的結合）を起こし、標識化した固相産物を形成するのに十分な時間維持 する。

それから未結合の標識化特異的結合試薬を、固体サポートから分離するのが一般 的である。

それから、生成した、標識化固相産物の有無を、よく知られている、使用した１ ｍのタイプによる従来の検定操作で測定する。

Ｉ激化固相産物の存在は、細胞試料中の、目的とする表面抗原の存在を示してい る。

ここで用いているように、“可溶化免疫複合体１という語句は抗体及び細胞表面 抗原エピトープとの反応と、それに続く、細胞破片及び可溶化免疫複合体を形成 する溶解によって生じる、存在の有無を調べる細胞表面抗原エピトープに結合し た抗体によって出きる複合体を意味する。この免疫複合体は、グリコプロティン ｍｂ／ｍａ複合体又はグリコプロティンＩｂのような血小板抗原に対する自己抗 体を含む、免疫トロンボシトペニフク紫斑病の患者由来の血小板試料であるよう な、患者（提供者）由来の分析用の細胞試料中に存在する。また、この免疫複合 体は、予期される提供者の別の血小板と、患者のアロ抗体との免疫反応によって も生ずる。さらに、この免疫複合体は、細胞表面に存在するＨＬＡクラス！又は クラス■抗原エピトープのような主要組織適合性複合体（ＭＢＣ）抗原エピトー プに対する抗体の免疫反応によっても生ずる。

細胞表面抗原の存在を検定する別の方法は、検定すべき細胞の部分標本を準備す るステップを含んでいる。そのような部分標本の細胞で、その表面抗原を持つも のは請求めている抗原と免疫反応を起こす抗体を含む免疫複合体を有することを 検出される。ここで再び、もしも存在するならばこの免疫複合体は、患者（提供 者）から得られる試料中に存在するが、又は、その細胞試料を得た後に生成され たかである０部分標本の細胞を溶解して細胞破片とし、かつ、その部分標本中に 免疫複合体がある場合は、可溶化免疫複合体を形成する。その後、可溶化免疫複 合体の有無を検定する。

好ましい態様においては、溶解／可溶化ステップでできた細胞破片を、遠心等の 従来法により可溶化した免疫複合体から分離する。それから、その分離した免疫 複合体を面相サポートに固定化し、固相固定化免疫複合体を作る。その固定化は 、物理的吸着、受理番号ＨＢ４３　ＭＤ州コロツクビルアメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクシラン（ＡＴＣＣ）から入手できる、モノクローナル・マウス 抗ヒト抗体のような、免疫複合体の抗体に結合する固相に結合した抗体を用いた 免疫反応は又は、固相サポート上にコートしたＳ、オウレウス（ａｕｒｅｕｓ） プロティンＡとの結合によって行なわれる。その後、この免疫複合体は、固相固 定免疫複合体として検定される。

１つの態様においては、試料の細胞は血小板である。このようなり様の場合、こ の免疫複合体の抗体は、試料提供者（患者）由来の自己抗体でもよいし、かつこ れらの自己抗体は、グリコプロティン■ｂ／Ｗｌａ複合体又は、グリコプロティ ンＩｂを指向するものでもよい、別のＢ様においては、血小板又は別の細胞が第 １０人（提供者）由来のものであり、免疫複合体の抗体は、第２の人（受容者） 由来のアロ抗体であるような予期される提供者の血小板又は他の細胞と、免疫複 合体の抗体を与える患者（受容者）の血清又は血漿の交差による場合もある。ま た免疫複合体の抗体は、ＭＭＣの抗原又はＨＬＡ抗原のごとき組織拒否関連抗原 のような一部の細胞表面抗原を指向することもある０個々のＨＬＡ特異的抗原エ ピトープを指向するもの同様、実質的に全てのＨＬＡ抗Ａ抗原上在するエピトー プを指向する抗体は、ＭＤ州ベセスダの、ナショナル・インスチュート・オブ・ ヘルス（Ｎ　１１（）の抗血清バンクからと同様に、ＡＴＣＣからも入手できる 。

従って、提供者及び患者（受容者）との間の血小板又は他の細胞適合性を検定す る方法も提供されることになる。この方法において、提供者の血小板又は他の細 胞抗原に対するアロ抗体を持つと思われる患者からの血清又は血漿の部分標本を 、提供者の血小板又は他の細胞と混ぜ水性の液体混合物を作る。このようにして できた混合物を、その血清又は血漿中に存在するアロ抗体が血小板又は他の細胞 抗原と免疫反応を起こし、免疫複合体を作るのに十分な、予め決めた時間、生物 学的検定条件に維持する。この混合物の血小板又は他の細胞を溶解し、細胞破片 及び、その混合物中に、アロ抗体及び血小板又は他の細胞性抗原が存在する場合 には、その可溶性免疫複合体を作る、それから、免疫複合体の有無を検定する。

もし、免疫複合体がみつからない場合は、提供者及び受容者は互いに適合性があ る。

また本発明は、ＨＬＡＬＡ抗原うな種々の表面抗原の有無により、細胞を分類す る方法を提供している。ここで、分類すべき細胞試料の部分標本を、ＨＬＡＬＡ 抗バックボーンと反応するモノクローナル抗体のような、検定すべき実質的にす べての群の細胞表面抗原に共通した抗原エピトープと反応する抗体と反応させ免 疫複合体を作る。それから、この細胞を溶解し、細胞破片及び可溶化免疫複合体 とする。その後、可溶化免疫複合体を指示パラトープ分子と反応させる；すなわ ち、ＨＬＡ特異的抗原エピトープのような抗原群のうちの少なくとも１つと免疫 反応を起こし、第２の免疫複合体を作る抗体全体又は、そのパラトープを含む抗 体の一部と反応させる。それから、その第２の免疫複合体の有無を検定する。Ｉ （ＬＡ抗原を検定する場合は、第１の抗体及び指示パラトープ分子はＡＴＣＣ及 びＮ１）（から入手できる。

ＨＬＡ分類を行う場合のような、細胞表面抗原の完全なプロフィールが必要なと きは、可溶化免疫複合体を、多くの部分標本に分割すると便利である。それから 個々にその部分標本を、一群の指示パラトープ分子と反応させ、各分子から第２ の免疫複合体が生ずるかどうか検定する。

本発明のこの検定法は、特異的に可溶化免疫複合体を結合しうる固体サポートを 利用している。一般的に、有用な固体サポートは、固体マドＩＪックスに固定（ 機能的に結合）した特異的結合試薬を含んでいる。

特異的結合試薬は標識又は指示手段を結合しており、標識化免疫反応産物を作る のに利用される。

“指示手段”及び“標ｗ１”という語句は、検出可能な信号を生じることができ 抗体に結合した形で、又は、それとは別に用いられる単一の原子及び分子を含ん で用いられている。

指示手段は、抗体又は検出を変性することなくこれらに化学的に結合し、有用な 免疫螢光性トレーサーである螢光団（色素）を作る螢光標識試薬でもよい。適当 な螢光ｍｔａ試薬には、フルオレセイン・イソシアネート（Ｆ　Ｉ　Ｃ）　、フ ルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミノ−１−ナ フタレンスルホニル・クロライド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチローダミンイソ チオシアネー）　（ＴＲＩＴＣ）　、リサミン、ローダミン８２００スルホニル クロライド（ＲＢ２００ＳＣ）及びこれに類する螢光色素がある。免疫螢光分析 技術の説明は、ここに参考として組込まれている、マルカロニス（Ｍａｒｃｈａ ｌｏｎｉｓ）等の“免疫螢光分析”１８９〜２３１　（上述）に与えられている 。

好ましい態様においては、その指示手段に、ホースラデイツシエバーオキシダー ゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、又はこれに類する＃素が使われている 。基本的な指示グループがＢＲＰ又はグルコースオキシダーゼのような酵素の場 合、複合体（免疫反応産物）が形成したことを可視化するのに別の試薬が必要で ある。このようなＨＲＰに対する付加的試薬には過酸化水素及びジアミノベンジ ジンのような酸化色素前駆体がある。グルコースオキシダーゼに対する付加的試 薬は、２．２′−アジノージ−（３−ニチルーベンズチアジンン−Ｇ−スルホン 酸”）（ＡＢＴＳ）である。

放射活性元素も有用な標識試薬であり、ここでも例示的に用いている。

代表的放射性標識試薬は、ガンマ線を発生する放射性元素であ４ｍ　”’Ｉ、Ｉ Ｒｓ■、Ｉ！−■、＋３■１、菖０Ｉ及び”Ｃｒ（７）ような、それ自身ガンマ 線を発する元素は、ガンマ線発生放射性元素指示グループを形成している。特に ｌｆｆ１Ｊが好ましい、他の有用な指示グループには、それ自身陽電子を発生す るＩ’Ｃ％　”Ｆ％　”Ｏ及び”Ｎのような元素がある０発生した陽電子は、動 物体中に存在する電子と衝突してガンマ線を発生する　Ｉｌｌインジウムのよう なベータ線発生源も有用である。

タンパク質性特異的結合試薬の標識は、当分野ではよく知られていることである ０例えば、ハイブリドーマによって産生された抗体は、組織培養培地中の成分と して与えられるアイソトープ含有アミノ酸の代謝的取込みにより標識することが できる０例えばガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等のメソンズ・イン・エンザイモロジ ー（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　７３１’、３〜４６頁（１９８１年）を 参照せよ、活性化した官能基を介してのタンパク質の結合技術は特に有用である ０例えば、オーラミアス（＾ｕｒａｍｅａｓ）等、スカンジナビアン・ジャーナ ル・オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、Ｉ關ｕｎｏｌ、　）、８巻、付録 、７；７〜２３頁（１９７８年）及び参考として、ここに組入れである米国特許 第４．４９３．７９５号を参照せよ。酵素をタンパク質に結合する方法は、米国 特許第３．７９１．９３２号及び第３．８３９．１５３号にみられる。加えて、 部位特異的結合反応は、その標識が実質的に、第２レセプターとアホＢ−１００ の免疫反応を妨害しないように行うことを可能にする。例えばロッドウェル（Ｒ ｏｄ　ｗｅｌｌ）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏ　ｔｅｃｈ、）、３巻、８８ ９〜８９４頁（１９８５年）参照。

例 次に掲げる例は、本発明の説明のためのものであり、これの制限を意図するもの ではない。

１、自己免疫をもつ人の抗血小板免疫状態の特徴Ａ、研究患者 慢性ＩＴＰ患者４４名由来の、１９８２年１月１日から１９８６年７月１日まで に得られた血漿又は血小板試料、２０個のコントロール検体及び２０個の血小板 減少症コントロール（急性非リンパ性白血病３患者；急性リンパ芽球白血病２患 者；抗ＨＬＡ抗体をもつ骨髄移植患者３患者；無形成貧血２患者；非オシキン・ リンパ！１３患者（うち１人はクリオグロブリンを有する）；硬変、１患者；ミ エロフリファラティブ病３患者；及び化学療法中のがん腫３患者）。ＩＴＰを有 する患者は、正常数もしくは多い巨核球を有し、かつ他の型の免疫性血小板減少 症の存在証拠をもたない血小板減少症患者である。

Ｂ、抗グリコプロティン自己抗体の検定イムノビーズ及びマイクロタイターによ る両横定法の特異性は使用したモノクローナル抗グリコプロティン抗体により測 定する。

次に掲げるマウスのモノクローナル抗体を用いた；抗ＧＰＩＩｂ／ｍａ抗体−２ Ａ９．３Ｆ５．２Ｇ１２　（Ｖ、　Ｌ、ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）博士から提供して いただいた）−２Ａ９はＧＰＩＩｂに特異的であり、また他のものは、複合体特 異的である；抗ＧＰ　Ｉ　ｂ−Ｐ　３（スクリップス・クリニックのザベリオ・ ルゲリ　（Ｚａｖｅｒｉ。

Ｒｕｇｇｅｒ　ｉ）及びセオドールージンマーマン（Ｔｈｅｏｄｒｅ　Ｚｉｍｍ ｅｒｍａｎ）博士からいただいた）、及び抗ヒ）ＩｇＧ（ＭＤ州、ロックビル・ アメリカン・タイプカルチャー・コレクション、ＡＴＣＣＨＢ−４３）。モノク ローナル抗体を、クロラミンＴ法を用い、５００μＣｉの１２５１抗体（５０Ｍ ｇ）で標識した。両検定における全インキュベーションは室温で行った。界面活 性剤抽出物中では、ＧＰＩＩｂ及びＧＰＩＩ［ａは複合体を作り、かつ、ＧＰＩ ｂは、血小板グリコプロティン■及びＶと複合体を作ることが知られている。

従って、これら２つの検定で測定されたように、抗ＧＰ］ｌｂ／ｎ［ａ自己抗体 は、ＧＰＩＩｂ又はＧＰｎｌａのいずれかの上にあるエピトープに対するもので あり、また抗ＧＰＩｂは、ＧＰＩｂ％ＧＰＶ又はＧＰＩＸに特異的である。しか し、本報告の目的のため、ＧＰ］ｌｂ／ｎｌａ複合体又はＧＰＩｂ複合体のタン パク質に対する自己抗体に関する抗ＧＰＩＩｂ／Ｉ［［ａ抗体又は抗Ｉｂについ ての結果を報告する。

Ｃ，イムノビーズ検定法 本検定法は、血小板関連自己抗体又は血漿自己抗体のいずれかを測定するのに用 いることができる。

（ｊ）イムノビーズの調製 抗ＩｇＧコート化イムノビーズ、ポリスチレンビーズ（ＰＡ州クワ−リントン１ １ａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、ポリサイエンス社、ポリセプ）を食塩水中、ビーズ／ 抗体の重量比２０００　：　１（例えば食塩水Ｑｒａｌ中、５０ｐｇ（Ｄ抗Ｉｇ Ｇに対し、ビーズ１００ｍｇ）　テロ　０分間、マウスのモノクローナル抗ヒト ＩｇＧ　（ＡＴＣＣＨＢ−４３）心機（インターナシラナル・クリニカルセント リフユージ、モデル６５１３３Ｍ）の最高スピードで１０秒間遠心する。リン酸 緩衝食塩水（ｐＨ７，４）　（７）０．０５％トウイー７２０溶液（ＰＢＳ−Ｔ ｗｅｅｒ＋）　１０　ｍｌで一度洗浄した後、非特異的結合部位は、ＰＢＳ−Ｔ ｕｅｅｎ中２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中でそのビーズを６０分間イン キュベートすることによりブロックし、その後Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｔｗｅｅｎで４回洗 浄する。

（ｉｉ　）血小板調製 ＥＤＴＡ凝集化血液からの血小板を患者、又は、正常な提供者から入手し、０． ０５Ｍの等張りエン酸バンファで６回洗浄する。

抗体感作血小板を調製するため、洗浄した正常な血小板（０，１■ｌ中１０１個 ）を、ＰＧＥＩ　（１μｇ／　ｍｊり及びセオフィリン（１μＭ）を含む患者又 は正常血＠１．０ｍｌと、室温で６０分間インキュベートし、その後、Ｐ　Ｇ　 Ｅ　＋及びセオフィリンを含む０．０５Ｍクエン酸バフファで４回洗浄する。患 者血小板（１０１個）又は抗体感作血小板を、ロイペプチン（１００μｇ／ｍｊ ）を含む９００μｌのクエン酸バンファに再懸濁し、その後１０％のトリトンＸ −１００を１００μｌ加えることにより可溶化する。

コントロール試料も同様に取扱う。

（ｈｌ）検定 各試料からの可溶化した血小板を、１２０００Ｘｇで５分間遠心する。予備実験 で、このステップが、誤った高い値を示すのを妨ぐ意味で、特に、抗ＣＰＩｂ自 己抗体の研究の際に必要であることが示された。この上清を１００ｍｇの抗Ｉｇ Ｇコート化イムノビーズと６０分間インキュベートし、ＩｇＧと結合抗原を付着 させた。　ｐ　１３　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、特異的抗原の存在は、 そのビーズを、抗ＧＰＩＩｂ／ｎｌａ　（非競合部位２Ａ９．３Ｆ５及び２Ｇ１ ２に特異的な３つのモノクローナル抗体のカクテル）又は、抗ＧＰ１ｂ（Ｐ３） に特異的な約４００．０００ｃｐｍのＩｔＳＩモノクローナル抗体を含む１．０ ＊ｊのＰ　Ｂ　５−Ｔ１１ｅｅｎと室温で６０分間インキュベートし、それから Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで何回か洗うことにより示した。データは、三つのコン トロール試料の平均ｃｐ■に対する患者試料の結合ｃｐｓ１比で表現した。コン トロール血漿で感作した血小板及びコントロール血小板の複製試料の平均変化率 の結果は抗ＣＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ：各々９．１±８．１（３１検体）及び１Ｏ８ １±７．５（１４検体）、抗ＧＰＩｂ、各々７．９±７．６（２４検体）及び６ ．８±７．０（１７検体）であった、結合比１．３以上の患者試料又は陽性と考 えた（コントロールよりも標準偏差で２以上大きいもの）、予備実験で陽性の活 性は、過剰量の血小板を含む血漿の吸着により除去することができることが示さ れた。加えて、４℃で４日間までの試料の保存は、血小板あるいは血漿のコント ロール値に影響を与えなかった。

Ｄ、マイクロタイターウェル検定法 詳細は、以前に報告されている（ウンズ（Ｗｏｏｄｓ）等、ブランド（Ｂｌｏｏ ｄ）　６３巻、３６８〜３７５頁（１９８４年）及びウッズ０１ｏｏｄｓ）等、 ブランド（Ｂｌｏｏｄ）、６４巻、１５６〜１６０頁−ｌ）を含むＰＢＳ中の洗 浄済血小板（１０”／ｍＡ）又はＣＭＥ白血病（１０’／ｍＪ）を、１％トリト ンＸ−１００中、４℃、３０分間で可溶化し、その後趨遠心する（１００．００ ０Ｘｇ、６０分間）、その分解物を一１７０℃で保存する。マイクロタイターウ ェルを、１００μｊ！の抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ　（２Ａ９又は３Ｆ５）又は抗 ＧＰＩｂ　（Ｐ３）（５μｇ／■ｌ）を用い、５℃、−晩でコートする。２００ μｚのＰ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎで６回洗浄した後、残存する結合部位を２００μ ｆの２％Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｐ　Ｂ　Ｓ−Ｔｗｅｅｎ溶液を用い、５０分間でブロック する＊　Ｐ　Ｂ　５−Ｔｅｉｅｅｎで６回洗った後、１０倍希釈した１００μｌ の血小板溶解物又は抗原ネガティブＣ２Ｍ溶解物を加え、５０分間インキュベー トする。この操作は、特異的血小板抗原を、ウェルに結合したモノクローナル抗 体に付着させる。６回洗浄後、患者又はコントロールの血漿を適当に希釈したも の（血漿のスクリーニングの場合は１０倍、もし陽性なら、より高い希釈率を用 いて）を加え、５０分間インキュベートする。６回洗浄後、１００μｌの放射性 標識したマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ（約１００．　ＯＯ０ｃｐｓ　）を 加え、５０分間インキュベートした後、６回洗浄し、各ウェルの放射活性を測定 する。複製コントロール血漿の変化率は抗ＧＰＩＩｂ／ｍａについては−５，０ ±７．７、抗ＧＰＩｂについては−１，９±６．４であった（ウフズ０１ｏｏｄ ｓ）等、ブランド（Ｂｌｏｏｄ）、６３巻、３６８−３７５頁（１９８４年）、 及びウッズ（Ｗｏｏｄｓ）等、ブランド（Ｂｆｏｏｄ）、６４巻、１５４〜１６ ０頁（１９８４年））、増加率が１％以上の試料を陽性とした（〉２標準偏差） 。

Ｅ、結果 （ｉ）慢性ＩＴＰ患者 結果は、評価のため２つのグループに分けられた。１（１１牌切除前の患者−何 人かの患者のうち、手術後にいくつかの実験が行なわれたものであったが、牌切 除手術前に最初の研究試料を入手した。（２）牌切除後の患者−この患者は、手 術後に研究された。

（ｉｉ）牌切除手術前の研究（表１） ６５名の患者を研究した；１６名は除去すべき肺臓を有していたが８名は完全に 寛解傾向に入っており、６名は牌切除手術がうまくいかず、２名は追跡調査され ていない状態であった。２６患者のうちの７名について、イムノビーズ検定法を 用い、血小板関連の自己抗体を測定した。このうち、６名（８５，７％）が、４ ．９〜３０．１（コントロール値＜　１．３　”）の範囲の比をもつ陽性とでた ；５名は抗Ｃ；ＰＩｌｂ／Ｉ［ｌａ自己抗体を、又、１名は抗ＧＰＩｂ自己抗体 を持っていた。

表１ 抗血小板グリコプロティン自己抗体 （牌切除手術前の慢性ＩＴＰ患者） 抗ＣＰＩｌｂ／Ｉ［［ａ　抗ＧＰＩｂ これらの患者のうちの３名（１４，１８及び２３番の患者）の血小板関連自己抗 体も、牌切除手術後研究した（表２）。完全な寛解傾向を得た患者において（患 者２３番）、牌切除手術前に存在した抗ＧＰＩｌｂ／ＩＩ［ａ自己抗体は、手術 後もはや示されなくなかった。他の２人の場合、牌切除後も自己抗体を維持し、 また、両人とも、手術後、血小板数の一時的増加があったが（１人は１３５．０ ００／ａｓ”、ｂう１人！！３１３．０００／ａｓ”）　、両人も手術後数週間 以内に、激しい血小板減少症におちいった（２０．０００以下）。表２は、牌切 除手術前後の血小板関連ｉｇＧ（ＰＡＩｇＧ）及び血小板関連抗ＧＰＩＩｂ／ｌ １ｒａ値を比較しである。完全な寛解傾向を得た患者２３番及び部分的にしか応 答しなかった患者１４番において、両側定値は、一致して変化している。

しかし、血小板数が手術後簡単に正常値に戻ったが、後に再発した（血小板数１ ４．　ＯＯＯ／　ａｍ”）　患者１８１（Ｄ場合、ＰＡＩｇＧ値は、血小板数と 協調して、正常値となったが、血小板関連抗ＧＰＩＩｂ／ｎＩａ値は、上昇した ままであった。

全ての患者を両横定法を用い、血漿自己抗体について研究してみた；１６名７２ ６名（６１，５％）は、少なくとも１つの検定法において陽性とでた。１１名は 循還する抗ＧＰＩ［ｂ／Ｉ［Ｉａを有しており、３名は抗ＧＰＩｂ自己抗体を有 していることがイムノビーズ検定法で分った；その比は１．４から５．５の範囲 であった。イムノビーズ法で陽性の患者のうち、たった１人（２４番）は、マイ クロタイター法でも陽性であった。イムノビーズ法で陰性の２人の患者（５番と ２１番）は、マイクロタイター法で陽性であった；このうちの１人（患者５番） は、マイクロタイター法で、ＧＰＩＩｂ／ｎ［ａ及びＧＰＩｂの両方に対する抗 体を有していた。

表２ 抗ＣＰＩＩｂ／ＩＩ［ａ自己抗体及び血小板関連ＩｇＧへの牌切除手術の影響 １４　−２Ｓ　Ｐ　４０．０００　２Ｂ、８　Ｂ、９０００　Ｐ　９６．０００ 　２１．２　５．８４７＋　５　−　１３５．０００　２５．４　６．５９５＋ 　５２　−　１０９．０００　３１．１　１９．５００１８　−１１１　−　５ １．０００　１７，１４００　Ｐ　１１８．０００　１６．１　４．４００＋　 ５　−　１０３．０００　１３．７　４．３９４＋　８　−　３１３．０００　 １１．３　２．６１１２３　−　Ｉ　Ｐ　１０６．０００　１６．２　５．１５ ２＋２８　−　４６５．０００　１．０　９８５抗ＧＰＩＩｂ／ｎ１ａ−イムノ ビーズ法で測定した、血小板グリコプロティンＩ［ｂ／１１［ａ複合体に対する 血小板関連自己抗体；ＰＡＩｇＧ−血小板関連１ｇＧ：Ｐ−高投与量のプレドニ ソーン；＊−牌切除手段前（−）、後（＋）の日数：日“０”、は手術の日。

＜１ｉｉ）　ＷＩＡ切除手段後の研究（表３）このグループの全ての患者は、牌 切除手段後、正常な血小板数を維持できなくなった。このグループの１８名のう ちの４名についてイムノビーズ法を用い血小板関連自己抗体を測定した。３名は 陽性で、１名はＧＰＩ［ｂ／Ｉ［［ａに対する自己抗体をもち、他２名はＧＰＩ ｂに対する自己抗体を有していた。

１８名のうちの１０名（５５％）で、イムノビーズ法を用い血漿自己抗体を示す ことかできた；７名のものは抗ＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａで、３名のものは抗ＧＰＩ ｂであった。イムノビーズ法で陽性の１０名のうちの７名は、マイクロタイター 法で示されたものと同じ特異性をもつ自己抗体を有していた。２人の患者（９番 と１２番）は、マイクロタイター法では陽性であったが、イムノビーズ法では陰 性であった。１人の患者（４番）は、両抗原に対する自己抗体を有していた。

（ｉｖ）血小板減少症コントロール 非免疫血小板減少症の患者由来の血小板（８名の患者）及び血漿（２０名の患者 ）を、両横定法で研究した。イムノビーズ及びマイクロタイター法画法を用いた 全ての場合において陰性の結果が得られた（データ示さず）。

表３ 抗血小板グリコプロティン自己抗体 （牌切除手術後の慢性ＩＴＰ患者） ２７　１０００　−−　−−　−−　Ｎｅｇ　−−３，３°Ｐｏｓ　（６４００ ）２８　３０００　−−　−−　２．２　Ｎｅｇ　−−（）Ｎｅｇ２９　３００ ０　６９１１　−−　１．ＯＮｅｇ　−−１，ＯＮｅｇ３０　３０００　５９８ ００　−−　１．３Ｐｏｓ（４０）　−−２，６Ｐｏｓ（８０）３１　６０００ 　−−　７．０”９．４Ｐｏｓ（６４０）　−−１，２Ｎｅｇ３２　６０００　 −−　−−　０．９　Ｎｅｇ　−−０，９Ｎｅｇ３３　７０００　５３０００　 −−　５．２Ｐｏｓ（３２０）　−−０，９Ｎｅｇ３４　７０００　−−　−− 　１．２　Ｎｅｇ　１７．２　２、Ｑ　Ｐｏｓ　（２０）３５　９０００　−− 　−−　０．６　Ｎｅｇ　１．０　０．９Ｐｏｓ’（４０）３６　９０００　− −　−−　１．ＯＮｅｇ　−−１，Ｉ　Ｎｅｇ３７　１３０００　−−　−−　 ２．５　Ｎｅｇ　−−０，９Ｎｅｇ３８　１４０００　−−　０．６　０．７　 Ｎｅｇ　５．７　１．３Ｐｏｓ（８０）３９　２１０００　４２３９６　−−　 ３．８Ｎｅｇ　−０，８Ｎｅｇ４０　２４０００　６３２６　−−　０．９　Ｎ ｅｇ　−−１，Ｉ　Ｎｅｇ４１　３４０００　−−　−−　０．６　Ｎｅｇ　− １，ＯＮｅｇ４２　４００００　５６５０　−−　２．６　Ｎｅｇ　−−１，Ｉ 　Ｎｅｇ４３　４２０００　１９０２４　−−　１．ＯＮｅｇ　−−０，９Ｎｅ ｇ４４　１１７０００　１１７９５−２、Ｉ　Ｐｏ５（４０）−１，Ｉ　Ｎｅｇ ＰＡＩｇＧ−血小板関連１　ｇ　Ｇ　（ｎｇ／１０”血小板）；イムノビーズ− 血小板関連（Ｐ−関連）又は血漿イムノビーズ法の患者／コントロール比で示し た結果（陽性＞　１．３）　；ウェル−陰性（ｈｅｇ）又は陽性（Ｐｏｓ）で示 し、陽性のテスト結果をカッコ中に示した、マイクロタイタ法の結果。

＊０．１ｍｆの血漿を血小板の感作に使用＊＊　０．１８Ｘ１０”個の血小板を 検定した。

Ｆ、討論 上記結果は、慢性ＩＴＰ患者中の抗血小板自己抗体を測定するための２つの方法 に関する経験を示している：血小板関連及び血漿自己抗体の両方を測定できるイ ムノビーズ法及び血漿抗体のみを検出するのに有用なマイクロタイター法。

血小板関連自己抗体は、１１名のＩＴＰ患者のうち９名に認められた（８１．８ ％、７名は抗ＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ、２名は抗ＧＰＩｂ）。

研究した患者数が統計的評価をするには少なすぎるが、牌切除手術前後に研究し た血小板減少症患者で、はぼ同頻度で陽性の結果を得た。

血漿自己抗体は、より少ない頻度で認められた；４４名中２８名が陽性（６３， ６％）。イムノビーズ法を用いて４４名中の２４名の患者は、循還自己抗体を有 することが示された（１８名は抗ＧＰｎｂ／ＩＩＩａ、６名は抗ＧＰＩｂ）。

以前に報告されているように、マイクロタイター法では、より少ない陽性結果が 得られている（ウッズ（ｌｌｌｏｏｄｓ）等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、６３巻 、３６８〜３７５頁（１９８４年）及びウッズ（１１ｏｏｄｓ）等、ブラッド（ Ｂｌｏｏｄ）、６４巻、１５６〜１６０頁（１９８４年））マイクロタイター法 ではより少ない陽性結果しか示されなかった。４４名中わずか１２名がこの検定 法で陽性となった（５名が抗ＧＰＩｌｂ／Ｉ［Ｉａ、５名が抗ＧＰＩｂ、２名が 両方に対し陽性であった。）３名の患者は、この方法でのみ示される自己抗体を 有していた。この検定法は、牌切除手術後の患者（全て抗療性）のほぼ半分に陽 性結果を与えたが、手術前のグループでは２６名中のわずか３名のみが陽性であ った。この検定法がより重い病気を予言できるのか、または、より激しく影響を 受ける患者からの試料を受ける傾向が我々の研究室にあるのを反映しているのが 分っていない。

これらの自己抗体検定法は、血小板関連Ｉ　ｇｃ　（ＰＡ　Ｉ　ｇＧ）に対する 検定法よりも優れた利点をいくつか持っている。第１に、これらは、患者の病気 の自己免疫性を確認する決った血小板タンパク質に対する血小板関連の又は、血 漿自己抗体を、直接示すことができる。逆に、　検定法は、未知の特異性を持つ 血小板に関するＩｇＧを測定する。正常及び血小板無力症血小板に対する相対的 結合を利用する、ヴアン・リューエン（Ｙｏｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎ）等の（ブラッ ド（Ｂｌｏｏｄ））、５９巻、２３−２６頁（１９８２年）、ＰＡＩｇＧ検定法 の適用は、抗ＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ抗体をもつ患者についての間接的ではあるが 同様の情報を提供できるが、この方法は、繁雑で血小板無力症血小板は、多くの 研究室で入手できないものである。検定法を組合せて用いた抗ＧＰＩＩｂ／Ｉ［ ｌａの陽性率は、彼等のものと全く同様のものであったことは興味深い。第２に 、非免疫血小板減少症患者における自己抗体テスト結果は、これら２つの検定法 では全く陰性を示したが、一方ＰＡＩｇＧ結果は、種々の治療をほどこした多く の患者で陽性を示した（ミュラー・ニックハルト（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｅｃｋｈａ ｒｄｔ）等、ブリティッシュ−・ジャーナＪＬ／−オブ・ヘマトロタ−（Ｂｒ、 Ｊ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、）　、５２巻、４９〜５８頁（１９８２年）及びケルト ン（Ｋｅｌｔｏｎｅ）等、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、６０巻、１０５０〜１０５ ３頁（１９８２年））。ケルトン（［６１ｔｏｎｅ）等（上記）の研究で示され ているように、陽性のＰＡＩｇＧ結果は、免疫仲介血小板破壊を反映しているよ うであるが、ＰＡＩｇＧの増加が必ずしも自己抗体の存在を示しているのではな いことを知っておかなければならない。抗ＧＰＩｌｂ／■ａ及びＰＡＩｇＧ結果 の間の相違が、我々のＩＴＰ患者（１８名）のうちの１人に認められ、この主張 を支持している。彼女の自己抗体値は、牌切除手術後、その血小板数及びＰＡＩ ｇＧ結果の両方が正常化したにもかかわらず、上昇したままであった。この患者 がつづいて再発を起こしたことはこの検定法が牌切除手術の最終結果を予言する のに有効であるかもしれないことを示している。明らかに、これらのデータは予 備的である。自己抗体がここで報じられている血小板減少症コントロール患者の グループにおいて、見つからなかったにもかかわらず、コラーゲン血管病又はリ ンパ腫をもつ患者をこれらの検定法でスクリーニングしたとき、彼等が他のタイ プの自己抗体（例えば、抗ＲＢＣ抗体）をもっていることが示されているので、 これらの患者グループの何人かに陽性の結果が現れそうである。

イムノビーズ及びマイクロタイター法の結果の差は興味深い。

精製したタンパク質抗原の研究から、エピトープには２つのタイプがあることが 分った（配列型と地形型）　（ベルシフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、サイエ ンス２２９巻、９３２〜９４０頁（１９８５年））。配列型エピトープは、タン パク質の１つのセクションのアミノ酸配列に関するもので、−法地形型エピトー プは、配列上では遠いが、三次元分子構造により、三次元空間においては近接し ている分子の領域に関するものである。イムノビーズ法でより大きい陽性率が出 たことの説明としては、マイクロタイター法で必要とする抗体とのインキュベー ション前の可溶化が、なんらかの理由で抗原エピトープを乱だすが、可溶化前の 抗体と血小板とのインキュベーションはこれを安定化することが掲げられよう。

マイクロタイター法は、配列型又は安定な地形型エピトープも測定するが、イム ノビーズ法は、さらに、不安定な地形型エピトープも測定するのだと推定する。

表面標識化血小板と、血漿とのインキュベーション後、ＧＰＩＩｂ／Ｉ［［ａ複 合体を沈殿化する血漿自己抗体の能力を、放射性Ｉｎｋした精製化ＣＰＩｌｂ／ ｎｌａの沈殿化の能力を比較する我々の研究室での予備実験は、この仮説を支持 している。マイクロタイター及びイムノビーズ検定法の両方で陽性の血漿（三検 体）は、精製化ＧＰＩｌｂ／Ｉ［［ａ複合体及び表面標識化血小板由来の複合体 を両方とも沈殿化することができるが、イムノビーズ法では陽性でも、マイクロ タイター法では陰性の血漿（４検体）は、表面標識化血小板由来の複合体のみを 沈殿化できる。明らかに、さらに研究することが、これらの予備的知見を確信す るのに必要であろう。

適当なモノクローナル抗体が入手できれば、両横定法とも、まだ同定されていな い自己抗体のような他のものの測定に適応しうる。慢性ＩＴＰの多くの患者は論 証できる自己抗体を持たないので、他の血小板関連抗原（例えば、ホスホリビッ ド、グリコリピッド、その他）に対する自己抗体が存在するらしい。

まとめると、本発明は特異的血小板タンパク質に対する自己抗体の測定のための ２つの検定法の使用について述べている。結果は、慢性ＩＴＰ患者の大部分が血 小板ＧＰＩＩｂ／Ｉ［Ｉａ複合体又はＧＰＩｂに対する自己抗体を持っているこ とを示した。２つの検定法でみられる陽性の結果の頻度の差は、可溶化に対する 種々の安定度のエピトープの証拠を徒供する。

２、血小板輸血患者における抗血小板免疫状態の特徴Ａ、患者と提供者 骨髄入換をもつ７名の患者を含む５１件の輸血について、研究した（表４）、研 究に入る前金ての場合に、ランダムな提供者血小板に対し、耐性であった。熱、 感染又はスペノメガリーに関する輸血効果は、提供者からの有意な増加が２４時 間以内にみられた場合に、機械的に除外しなかった。研究中、ＤＩＣの証を示す 患者はいなかった。患者１番は彼の死ぬ前数日間、全ての提供者に対し療治不能 となり、ＡＲＤＳ及び機械的呼吸をほどこされるようになったことから、研究か らはずした。患者２番は、持続的に発熱が起こり、全ての提供者に対し、療治不 能なものとなったとき、研究からはずした。彼は、流布性茸瘤感染を起こしたこ とが示された。提供者は、可能なとき家族から（ｎ−１６）、他は有料のボラン ティア団体から（ｎ−３５）選抜した。ＨＬＡ適合は、次の如くである；Ａ−９ ；　Ｂ、Ｂ２Ｘ−５ｉ　Ｃ−１９ｉ　Ｄ−８；未知、関連−７、未知、非関連− ３゜表４ 患　者　特　性 患者　年令／性別　治　療　評価可能な輸血　提供者数１　４２／Ｍ　ＡＡ、ア ローＢＭＴ　２２　１４２　３２／Ｍ　ＡＬＬ、オー）−ＢＭＴ　２　２３２１ ／ＭＡ？ＩＬ　５　３ ４３６／ＦＡＭＬ　２　２ ５４１／ＭＡＭＬ　１　１ ６　７１／Ｍ　Ａ？ｌＬ　１７　１１ ＡＡ−無形成貧血；アローＢＭＴ−同種骨髄移植；オー）−ＢＭＴ−オートロガ ス骨髄移植；ＡＭＬ−急性骨髄性白血病；ＭＤＳ−骨髄変形症 Ｂ、輸血結果の評価 各輸血事象を次に示す標準式から、１時間補正カウント増加量を計算することで 評価した。

ＢＳＡ＝体表面（Ｍ２） できる場合は、より遅い時間のＣＣＩ（８〜２４時間）も計算した。成功結果は 、１時間ＣＣＩで７５００以上と定義した。１つの例では、多くとも２４時間後 にＨＬＡ適合の兄弟からの輸血が１時間ＣＣｌ３３９１及び６時間ＣＣＩ　２６ ７０という値を与えたとき、１時間ＣＣ１７２８９及び６時間ＣＣｌ４２５２と いう値は“成功”と考える。２つの例においては、１時間後の血小板数は得られ なかったが、少ない血小板生存物の明白な非免疫学的理由と無関連の８時間ＣＣ Ｉ値“く０″という値は、不成功な・　結果の証拠と考えられる。

Ｃ，マウスのモノクローナル抗体 ＨＢ−４３は、ヒト１．ｇＧのＦｃ領域を認識する１４１０に６７細胞系列由来 のＩｇＧカッパ抗体である。ＨＢ−９５は、ヒトＨＬＡＡ、Ｂ及びＣ抗原のＨ鎖 上の単一形態エピトープを認識する、Ｗ６／３２細胞系列由来のＩ　ｇ　Ｇ　ｓ 抗体である。ＨＢ−９５は単離したＨ鎮に弱く結合するにもかかわらず、本来の ヘテロダイマーがこのエピトープの全発現に必要である。両細胞系列は、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、ＭＤ州）から入手でき 、また、プロティンＡアフィニティークロマトグラフィーで抗体を精製できる、 プリスタン・プライムドＢＡＬＢ／Ｃマウス中で腹水を作るのに用いる。

１２ｓｌ、ｌｌｉ識化は、クロラミン−Ｔ操作により行う。

Ｄ、血小板の調製と保存 （１）正常血小板 正常な成人ボランティア由来の血液をＥＤＴＡ中に吸い出し、血小板リッチな血 漿を、４００ｇ、１０分間の遠心で分離した。

血小板を１０００ｇ、１５分の遠心でペレツト化し、１．０ｍｊ！の０．０５Ｍ クエン酸バンファで（１１の蒸留水中、１４．７ｇのクエン酸ナトリウム、５． ９ｇ塩化ナトリウム、２５．０　ｇのデキストロース、０．０５Ｍクエン酸でＰ Ｈ６，２に調整）４度洗浄し、約１０９／ｍ１２になるように、クエン酸バッフ ァで再懸濁する。血小板は新鮮なもの、もしくは、サスベンジランを４℃で２４ 〜４８時間保存したものを用いた。

（ｉｉ　）提供者血小板 血小板溶解物約３　ｍｌが各泳動操作の終りに得られた。これをｌ　ｗｈｌの部 分標本に分け、７５０ｇ、９０秒間の遠心で赤血球を除去した。この血小板を、 ３０００ｇで５分間遠心し、４度洗浄した。この血小板濃縮物は、洗浄前４℃で ２４〜４８時間保存しても検定結果に影響することはなかった。

（ｉｉｉ　）血小板の保存 イムノビーズ法に関する保存の影響を検討するため、２人の正常人からの、１． ０ｍｊ！の血小板部分標本（１，３Ｘ１０”個）を４℃で懸濁液中及び液体窒素 中での凍結による保存を行ない、コントロール血漿及び高い抗ＨＬＡ抗体値を有 することが信られている２つの血漿について、１．６．１５．３０及び６０日の 間隔をおいてテストした。凍結する血漿を、プラスチックチューブ中、５％のジ メチルスルホキシドを含む自己血漿に懸濁し、−７０℃、−晩で凍結し、その後 液体窒素中に保存した。３７℃の水浴で融解後、これらを２度洗浄し、およそｌ 　ｍｌのクエン酸バッファ中に懸濁し、計数した。平行して部分標本を、プラス チックチューブ中、０．０２％アジ化す）　ＩＪウムを含む規定の食塩水中に懸 濁し、４℃で保存した。検定前、その血小板をピペッティングで再懸濁し、２度 洗浄した後計数した。

Ｅ、血漿及び血清の調製及び保存 全ての検定は、特記しであるもの以外血漿を用いて行った。血漿をＥＤＴＡで抗 凝集化した全血液から、１０００ｇ１５分間の遠心で分離し、ポリプロピレンチ ューブ中に保存した。テスト血漿を輸血前及び先行する輸血後、できる限り受容 者から捕集した。

どの場合も、目的とする輸血後にテスト血漿は得られなかった。

一群の正常血小板に対するイムノビーズ法で示されたように、陽性のコントロー ル血漿が、既知で種々の高い抗ＨＬＡ抗体値を有する、多くの輸血したヒトから 得られた。陰性コントロール血漿は、輸血又は妊娠の経験をもたない正常なボラ ンティアから得た。

陽性及び陰性の両コントロール血漿は、１００．　ＯＯＯｒｐｍで１時間の超遠 心を行った。全ての血漿は、新鮮なもの又は−７０℃に凍結したものを使用した 。凍結と融解をくり返すことは避けた。

血清は、小数の陽性及び陰性コントロール血漿を、ガラスチューブ中、ＣａＣ１ 及びトロンビン存在下でインキュベーションすることで調製した。補体はＥＤＴ Ａ　（０，０２Ｍ）で不活性化した。

Ｆ、ＨＬＡイムノビーズ法 １０８個の提供者血小板部分標本を、プラスチックチューブ中１００μｌのテス ト血漿又はコントロール血漿と１時間インキュベーションすることにより感作し た。この感作血小板を３度洗浄し、９００μｌのクエン酸バッファに再懸濁し、 さらに１００μｌの１０％トリトンＸ−１００を加えて可溶化した。もし、この 検定が同日中に完了するなら、この溶解物を３０００ｇで５分間遠心し、その上 清を、１５−ｌのポリプロピレンチューブに移した。

この溶解物を可溶化につづいて一２０℃で凍結し、後日、検定しても結果に影響 はなかった。

イムノビーズは、χインチポリスチレンビーズ（ＩＩＩｌ州、ロックフォード、 ピアスケミカル社、９００２３８０４）を、ビーズ当り０．０１Ｍ　ＮａＨＣＯ ，バッフｙ５００．ｃ＋４！　（ｐＨ８，５）中、抗ヒトＴｇＧ（）ＩＢ−４３ 、ビーズ当り１０Ｍｇ）と、ローチーター上、１時間インキュベーションするこ とにより調製した。１閤１のＢ　Ｐ　Ｓ−Ｔ％＃ｅｅｎで４度洗浄後、それらを 、もう１時間２九子ウシ血清アルブミンとインキュベー）Ｌ　（１ｍＡ／ビーズ ）、残存する結合部位をブロックした。さらに４度洗浄した後、１つのビーズを 血小板溶解物を含む各チューブに加え、一定史攪拌を行ないつつ１時間インキュ ベートした。このインキュベーション中、可溶化前車小板に結合したＩｇＧアロ 抗体は、Ｆｃ領域を介して、ビーズに結合したＨＢ−４３に付着した。クラスＩ 　ＨＬＡ抗原は可溶化後そのアロ抗体のｐａｊｊＪ域に結合したままであり、従 って、このビーズに間接的に結合されることになる。このビーズをＰ　Ｂ　Ｓ− Ｔｗｅｅｎ中で４度洗浄し、１　ｗＪのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、４００、０００ ｃｐ■のＩ＊Ｊ標識化モノクローナル抗ＨＬＡ抗体（ＨＢ−９５）と１時間イン キュベートした。最後の４度の洗浄につづいてこのビーズをペーパータオル上で 乾燥させ、ベックマンのガンマ線カウンタで計数した。全てのインキユベーショ ンは、室温で行った。・ 目的とする検定は１回の陽性コントロール及び２回の陰性コシトロールと共に、 ３度行った。ある技術者は、約６時間に２４個の検定を同時に行うことができた 。

Ｇ、放射性抗グロブリンテスト（ＲＡＧＴ）ＲＡＧＴは、ロブグリオ（Ｌｏ　Ｂ ｕｇｌｊｏ）等の方法２？を一部修正して行った。簡単に言うと、１０６個の洗 浄化した血小板を１００μｌの血漿と、室温で１時間インキュベーションするこ とにより怒作し、その後クエン酸バッファ中で三度洗浄した１１３Ｘ１Ｇ？個の 部分標本を、３００．　ＯＯ０ｃｐ−のＩ！Ｊ標諏した抗ヒトＩｇＧ（ＨＢ−４ ３）と３０分間インキュベートした。６Ｘ１０番個の血小板を含む三対の５０μ ｌの部分標本を先のとがった４００ｕｊのプラスチック製のミクロ遠心チューブ 中、２００μｌの３０％スクロースの上に重層し、１１，０００ｇで５分間遠心 した。−７０℃での急速凍結後、血小板ボタンを含む先端を取り、ベックマン製 のガンマ線計数器で計数した。

Ｈ０輸血研究の結果 （ｉ）ＨＬＡイムノビーズ法の特徴 同じ正常血小板に対して、１２個の陰性コントロール血漿を用いた３対の検定は ８．７　ｆ／−９，０（Ｉ　ＳＤ）の平均変化率を与えた。一般に、陰性コント ロールの絶対値は、８０〜３０Ｏｃｐ園の範囲に落ちついた。また１つの陰性コ ントロール血漿も、同血小板に対して、１０回テストを行ない、６．３＋／−６ ，６％の平均変化率を与えた。血漿の代りにクエン酸バッファを用いた検定では 陰性コントロールに匹敵する結果を与えた。

この検定が非ＨＬＡ抗原に対する抗血小板抗体を認識できる可能性を評価するた め、ＩＴＰの臨床的症候群をもつ１８名の患者由来の血漿を正常な血小板に対し てテストした。これらのうち７個は、グリコプロティンｎｂ／Ｈａ複合体に対す る血漿自己抗体を有しており、２個は、グリコプロティンＩｂに対する自己抗体 を育してあり、他のものは両方のこれら自己抗体に対し、陰性の結果を与えた。

三つの血漿はイムノビーズ法において陽性の結果を与え２個は、ＧＰＩＩｂ／ｎ ｌａ自己抗体を持ち、１個は、論証的特異性はないが、強い抗血小板抗体を有し ていた。全ての３名の愚者は妊娠そしてまたは輸血の経験があり、このことは、 アロ抗体の共存を示している。

７個の陽性及び７個の陰性コントロールは、血清を用いて行なわれ、血漿を用い て得られた結果として比較された。陰性コントロールに有意な差がないことに注 意せよ、血清陽性コントロールの絶対値は、平均して、血漿値の６０％であった 。陽性が血清を用いたことで無くなるようなことはなかった。

（ｉｉ　）検定結果の説明 平均テスト結果を平均陰性コントロール値で割って、テスト／コントロール比を 得た。１２名の正常検体を用いた実験で１．００＋／−０，１４（Ｉ　ＳＤ）　 （７）平均正常ＴＣＲ値を得た。１．４３以下のＴＣＲ値は、標準偏差３を含み 、最初陰性と決められた。実際、１．４３及び３．０の間のＴＣＲ値は、６ケー スのうちの５個のケースの成功した輸血結果と関連していた（表５）、このこと は、イムノビーズ法が残存する血小板に有意に影響を与えるのに必要なものより 低いアロ抗体レベルを検出できる証拠を説明している。

このことがランダムな変化ではないことは、全ての９Ａ適合輸血が１．４３以下 のＴＣＲ値と関連しているという観察で支持される。

臨床的目的のため、＜／＝３．０というＴＲＣ（ｉは“陰性”と考えられ、成功 した輸血結果を予想できる。

＜／＝２．０のＴＣＲ値は、同様な回顧的データ解析により、ＲＡＧＴに対し、 実験的に“陰性”と定義された。

表５ ＴＣＲ値１．４３〜３．００の輸血エピソード１　３４４　１９７　１．７−５ 　２６５９２　３９０　１５０　２．６１１７３９６３　１２３　８１　１．５ ３１１４８１４　３８０　１６６　２．２９１０２９８５　５０５　１６９　２ ．９９１２２６９６　２６６　１４３　１．８６１１５３８（ｉｎ）輸血結果の 相関関係 各々の価値ある輸血エピソードを、このイムノビーズ法が陽性（ＴＣＰ８）が陰 性（ＴＣＲＣ／＝３．０）により分類し、また、成功（１時間ＣＣＩ　＞／＝７ ５００）か不成功か（１時間ＣＣＩ＜７５００）で分類した。両横定法のデータ 及びＲＡＧＴを表６にまとめた。１８個のエピソードがイムノビーズ法で陽性と なり１６／１８（８ｇ、９％）で不成功の結果となった。３３個の場合、この方 法で陰性となり、２９／２３（８７，９％）が成功の結果を示した。陽性の検定 エピソードの平均１時間ＣＣＩは２１９９で、陰性の検定エピソードの平均１時 間ＣＣＩは１３０７２であった。

表６ イムノビーズ及びＲＡＦＴ結果の輸血結果との相関関係陽性検定　陰性検定 ＣＣＩ＜７５００　ＣＣＤ７５００　ＣＣＩ＜７５００　ＣＣＩ＞７５００ＲＡ ＦＴ　１５／２Ｎ？１．４χ’）　６／２１（２８，６χ）　５／３０（１６， ７χ）　２５／３０（８３，３χ）２１個のエピソードはＲＡＧＴ陽性であり、 １５／２１　（７１，４％）は、不成功な結果であった。陰性の３０個のＲＡＧ Ｔエピソードのうち、２５／３０（８３，３％）は、成功の結果を示した。

陽性ＲＡＧＴエピソードの平均１時間ＣＣＩ値は３８９７、陰性ＲＡＧＴエピソ ードの平均１時間ｃｃｒ値は１１１１８であった。

１つの例において（患者１番に関して）、最初、陽性のイムノビーズ法結果及び 不成功の結果を示した提供者は、１力月後陰性の結果及び成功の結果を与えた。

最初の輸血は、高投与量のシクロホスファミドを用いたＢＭＴの調製と金節の照 射の直前に行ない、アロ抗体産生リンパ細胞が除去され、つづいて機能していた 抗体が消失したことが示された。

この研究由来のＴＣＲと１時間ＣＣＩ結果のプロットは、ＣＣＩがＴＣＰと比例 するような介在領域なしに、陽性及び陰性結果の定義を示している。

（ｉｖ　）輸血エピソードの誤分類 イムノビーズ法により誤分類された６個のエピソードのうち、たった１件（顆粒 細胞輸血と関連している場合）がＲＡＦＴで正しく分類された、ＲＡＦＴにより 誤分類さた１１件のうちの６件は、イムノビーズ法によって正しく分類される。

５件の例において、両テストはまぎられしい結果を与えた。

初期イムノビーズ法陽性／成功結果エピソード（患者１番）において、ＴＣＲは ５．３及び１時間ＣＣＩは１６．８９７であった。

６時間後の血小板計数は、輸血前レベルに落ちた。第２の場合（患者６番）は、 ＴＣＲ２５３，７（研究における２番目に高い記録のものである）、１時間ＣＣ Ｉ　１０８０６及び１６時間ＣＣ１１９６５であった。４週間後再び同提供者が 用いられたとき、ＴＣＲは１８３及び８時間ＣＣＩは０であった。両患者は、陽 性のイムノビーズ法結果である他の提供者に対しては、不成功な結果であった。

４件の検定陰性／不成功結果のケースは、全て、生存する少数の血小板の潜在的 非アロ抗体関係の理由と関連している。第１のものは（患者２番）は発熱し、５ 日後に全ての提供者に対し、療治不能となり、研究からはずした（患者及び提供 者セクション参照）。他の３件は、患者１番を含んでいた。つまり血小板がフィ ブライル反応と関連する顆粒細胞輸血と同時に与えられたとき、第１のものが生 じ、他の２件は、その患者がＡＲＤＳのため挿管された後で、全ての提供者に対 し療治不能となる前に生じた。

（Ｖ）保存した血小板使用の容易性 冬時間での両面小板提供者に対する平均陽性コントロール／陰性コントロール比 を表７に示した。その結果は、１日から５日の間の抗原的完全性又は適用性にお ける悪化を示し、その後テストにより長い期間、さらに悪化をみせるようなこと はなかった（６０日間）。差は大きくないが、４℃での懸濁液で保存した血小板 は、凍結血小板よりわずかによい抗原的完全性を維持した。ここで用いた陽性コ ントロールは、研究中、著しい陽性を維持したが、より低い値の抗ＨＬＡ抗体を 含む血漿は、保存血小板についてテストしたとき、陰性となったことが考えられ る。研究期間の保存による血小板の有意なロスはなかった。

表７ 液体窒素中での凍結保存及び４℃での！！１！濁液保存の血小板を用いたイムノ ビーズ法の結果 液　体Ｎ、　３２．６　２０．７　２３．９　２５．３　１０．５液　体Ｎ’　 ７１．５　３０．６　３５．６　４０．５　３２．０＊データは、平均陽性コン トロール／陰性コントロール比で表わされている。

Ｈ０輸血研究結果の討論 本研究において、イムノビーズ法は、クラスＩ　ＨＬＡ抗原に対する抗血小板ア ロ抗体を特性化するのに適用され、その結果を血小板交差適合性の問題に応用さ れる。この結果はテストが、血小板輸血成功の予想法としてより広いスケールの 応用を保障する十分な予想値を与えることを示している。理想的には、予期され る提供者が提供者集団に入ったとき、保存血小板に有するであろう。ランダム提 供者血小板に対する応答が小さい患者に出合ったとき、その血漿を共通したＨＬ Ａ抗原と表わすよう選ばれた、小数の正常な血小板に対して検定することができ る。もし陰性ならＨＬＡ抗原に対するアロ免疫化以外の問題があるようであり、 また、高価につく単一の提供者血小板を避けることができる。もし陽性ならば、 ＨＬＡ適合血小板が示されるであろう、これらが入手できない大きさの場合、最 適物が提供者集団及びそれらの保存血小板から選らび出され、陰性テスト結果の ものが選抜される。

我々の研究はわずか６０日までにしかならないが、他の研究では、より長い期間 可能であることが示されている。

イムノビーズ法に対する１つの潜在的欠点は、そのＨＬＡ特異性である。多くの 著者は、血小板特異的抗原に対するアロ抗体は、あるパーセントの輸血の失敗を 説明でき、通常、ＨＬＡ−数置小板そしてまたは、論証できるリンパ細胞毒性抗 体に対する応答が少ないことによることを示している。しかし、血小板特異的抗 原に対するアロ抗体を、この設定においては結論的に示すことは困難であり、そ れらのほんとうの意味はまだ不明である。バーマン（Ｈｅｒｍａｎ）等は、ＨＬ Ａ適合血小板に対して療治不能である７名の患者を研究するのにウェスタンプロ ットを用い、グリコプロティンｎｂ／ｍａ分子に関する血小板特異的抗原に対す る抗体を示すことができなかった。彼等は、血小板特異的抗原に対する抗体は一 般に存在しないと結論した。ＲＡＧＴ陽性でイムノビーズ法陰性である。５１件 中わずか１件の輸血結果の知見はこのことを指示する。これらのケースの全部で はないにしろ、多くのものが未確認の非免疫的因子によるようである。しかし、 現在、ＨＬＡ特異的イムノビーズ法が残存する不十分な血小板に対し陰性である 場合、他の血小板関連抗原に対する抗体の存在を評価するための、同様なＨＬＡ 特異的検定法又はＲＡＦＴをめるのが賢明のようだ。

これまで述べてきたものは本発明を説明するためのもので、これを制限する意図 ではない０本発明の真の精神及び範囲を逸脱することなしに、多くの変化及び修 正が可能であろう。

国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）細胞表面抗原と免疫反応を起こすことができる抗体を細胞と混合し 、細胞感作反応混合物を作る、（ｂ）上記細胞感作反応混合物を、上記抗原及び 上記抗体を含む免疫複合体を形成するのに十分な時間維持し、それにより、感作 細胞を作る、 （ｃ）上記免疫複合体がステップ（ｂ）でできた場合、上記感作細胞を溶解して 、可溶化免疫複合体を含む水性成分を作る、（ｄ）上記水性成分を、上記免疫複 合体を特異的に結合できる固体サポートと混合し、そのことにより、固／液相混 合物を作る、（ｅ）上記固／液相混合物を、存在する免疫複合体が上記固体サポ ートに結合するのに十分な時間維持しも、固相結合複合体を作る、 （ｆ）ステップ（ｅ）でできた結合複合体の存在を検定する、以上、（ａ）〜（ ｆ）のステップを含む、細胞試料について、細胞表面抗原の存在を検定する方法 。
2. （２）（ａ）検出すべき表面抗原をもち、この抗原と免疫反応を起こす、この抗 原に対する抗体を含む免疫複合体を有する細胞の検定のための部分標本を準備す る、 （ｂ）上記部分標本の細をを溶解し、細胞破片及び、免疫複合体が存在するとき は、可溶化した免疫複合体を与える、（ｃ）上記の可溶化した免疫複合体の存在 を検定する、以上（ａ）〜（ｃ）のステップを含む細胞表面抗原の存在を検出す る方法。
3. （３）上記部分標本の細胞が血小板である請求項（２）記載の方法。
4. （４）上記免疫複合体の上記抗体が自己抗体である請求項（３）記載の方法。
5. （５）上記自己抗体が、グリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体又は、グリコ プロテインＩｂを指向するものである、請求項（４）記載の方法。
6. （６）上記血小板が、第１のヒト由来のもので、かつ、上記抗体が第２のヒト由 来のアロ抗体である、請求項（３）記載の方法。
7. （７）上記免疫複合体の抗体が、主要組織適合性複合体抗原を指向するものであ る、請求項（３）記載の方法。
8. （８）主要組織適合性複合体抗原がＨＬＡ抗原である、請求項（７）記載の方法 。
9. （９）（ｉ）ステップ（ｂ）における細胞破片を、存在する可溶化した免疫複合 休から分離する、 （ｉｉ）上記の分離した免疫複合体を固体サポートに固定し、固相固定化免疫複 合体を作る、 （ｉｉｉ）その後、固相固定化免疫複合体として、免疫複合体の存在を検定する 、 以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップをさらに含む請求項（２）記載の方法。
10. （１０）（ａ）予期される提供者の血小板を患者由来の血清又は血漿の部分標本 と混合し、水性の液体混合物を作る、（ｂ）上記混合物を、血清又は血漿中に存 在するアロ抗体が、血小板抗原と免疫反応を起こすのに十分な時間、生物学的検 定条件下で維持し、免疫複合体を作る、 （ｃ）上記混合物の血小板を溶解し、細胞破片及び、上記アロ抗体と、上記血小 板抗原が上記混合物中に存在する場合は、可溶性免疫複合体を作る、 （ｄ）上記免疫複合体の存在を検定する、以上（ａ）〜（ｂ）のステップを含む 、提供者と患者との間の血小板適合性を検定する方法。
11. （１１）（ａ）分類すべき細胞試料の部分標本を、探している実質的に全てのグ ループの細胞表面抗原に共通した抗原エピトープと反応する抗体と反応させ、免 疫複合体を作る、（ｂ）上記試料の細胞を溶解し、細胞破片及び免疫複合体を作 る、（ｃ）可溶化した免疫複合体を、一群の細胞表面抗原の少なくとも１つの特 異的細胞表面抗原エピトープと免疫反応を起こす指示されたパラトープ分子と反 応させ、第２の免疫複合体を作る、（ｄ）上記第２の免疫複合体の存在を検定す る、以上（ａ）〜（ｄ）のステップを含む一群の細胞表面抗原の存在について、 細胞を分類する方法。
12. （１２）上記細胞表面抗原のグループがＨＬＡ抗原である請求項（１１）記載の 方法。
13. （１３）（ａ）血小板試料を溶解し、可溶化した血小板表面抗原一抗体複合体を 含む水性成分を作る、 （ｂ）上記水性成分を、上記血小板表面抗原一抗体複合体と免疫反応を起こすこ とができる固体サポートと混合することにより、捕獲反応混合物を作る、 （ｃ）この捕獲反応混合物を、上記固体サポートが存在する上記血小板表面抗原 抗体複合体と免疫反応を起こすのに十分な時間維持し、固相免疫反応産物を作る ことにより維持固体サポートを作る、 （ｄ）上記維持固体サポートを、上記固相免疫反応産物の上記抗原一抗体複合体 と免疫反応を起こすことができる標識化抗体分子と混合することにより、標識反 応混合物を作る、（ｅ）上記標識反応混合物を、上記標識抗体分子が、ステップ （ｃ）で形成した、上記固相免疫反応産物と免疫反応を起こすのに十分な時間維 持し、標識化固相複合体を作る、（ｆ）ステップ（ｅ）でできた標識化した固相 複合体の存在を検定し、上記血小板試料中の血小板表面抗原一抗体複合体の存在 を検定する、 以上（ａ）〜（ｆ）のステップを含む、血小板試料中の血小板表面抗原一抗体複 合体を検定する方法。
14. （１４）（ａ）血小板試料を、血小板表面抗原と免疫反応できる抗体分子と混合 することにより、血小板免疫複合体を作り、血小板感作反応混合物を作る、 （ｂ）上記感作反応混合物を、上記血小板免疫複合体の形成に十分な時間維持し 、抗体感作血小板を作る、（ｃ）上記感作血小板を溶解し、上記免疫複合体がス テップ（ｂ）で形成するとき、可溶化感作血小板免疫複合体を含む水性成分を作 る、 （ｄ）上記水性成分を、上記可溶化血小板免疫複合体と免疫反応を起こす固体サ ポートと混合し、捕獲反応混合物を作る、（ｅ）上記捕獲反応混合物を、上記固 体サポートが、存在する上記可溶化血小板免疫複合体と免疫反応するのに十分な 時間維持し、固相免疫反応産物を作ることにより、維持固体サポートを作る、 （ｆ）上記維持固体サポートを、上記固相免疫反応産物の上記血小板免疫複合体 と免疫反応する標識化抗体分子と混合することにより、標識反応混合物を作る、 （ｇ）上記標識反応混合物を、上記標識抗体分子が、ステップ（ｅ）でできた上 記固相免疫反応産物と免疫反応するのに十分な時間維持することにより、標識固 相複合体を作る、（ｈ）ステップ（ｇ）でできた、標識化固相複合体の存在を検 定し、これにより、上記血小板試料中の血小板表面抗原の存在を検定する、 以上（ａ）〜（ｈ）のステップを含む、血小板表面抗原について血小板試料を検 定する方法。