JPH01501619A - リポソーム製剤および抗生物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム　および の　る この出願は１９８５年１１月２１日に出願された共係属出願第８００，５４５号 の一部継続出願であり、この第８００，５４５号は１９８５年７月５日出願の特 許出願節７５２，４２３号の一部継続出願であり、またこのものは１９８５年６ 月２６日出願の特許出願節７４９，１６１号の一部継続出願である。

ｍ欠北！− この出願はリン酸塩の形および他の塩の形態でのアミノグリコシド類、その類似 体および誘導体に関し、またそれらを製造する方法およびそれらの用途に関する ものである。アミノグリコシドホスフェート　リポソーム類および非グアナジノ 　アミノグリコシド　リポソーム類、それらの製造および使用が殊に記載されて いド　リポソーム類と脂質の割合は約３：５０（当量１重量）より大で薬剤を入 れたグアナジノ　アミノグリコシド　リポソーム類と脂質の割合（Ｗ／Ｗ）が約 ９：２５（当量、重量）より大なるものがまた記載されている。

ｌ尻■！見 アミノグリコシド類は、微生物における蛋白質合成を阻害する能力によって特徴 づけられる種類の化合物である。アミノグリコシド類は１つのヘキソース（アミ ノサイクリトール）骨核にグリコシド結合で結ばれたアミノ糖の２つもしくはそ れ以上からなる。

これまで知られていているるヘキソース核は他のものも考えられるものの、スト レブティジンもしくは２−デオキシストレブトアたアミノ糖によって区別される ０例えばネオマイシン族は中央の２−デキオキシストレプトアミンに付けられた ３つのアミノ糖を含有する。カナマイシン及びグルタミシン族はアミノサイクリ トールに付けられたただ２つのアミノ糖を持っている。

アミノグリコシド類は次のものに包含する：ネオマイシンＢ。

パロモマイシン、リボスタマイシン、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナ マイシンＢ、アミカシン、トブラマイシン、ヴアイオマイシン、ゲンタマイシン Ｃ１，ゲンタマイシンＣ，ａ、（ゲンタマイシンＣ，，Ｃ，，Ｃ，ａおよび類似 体およびそれらの誘導体を集合的に「ゲンタマイシン」とする）、シソマイシン 、ネチルマイシン、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシン。

グアナジノ基の存在によって特徴づけられるストレプトマイシンおよびジヒドロ ストレプトマイシンは非グアナシノアミノグリコシド類よりも高％’％割合の薬 剤対脂質比でリポソーム類と結合する点で特殊であると理解される。「非グアナ ジノ」アミノグリコシド類という語はグアナジノ基を有するアミノグリコシド以 外のアミノグリコシドを包含するであろう。

残念なことに、これらの化合物の用途は種々の要因によって制約されてきた。バ クテリアにおける蛋白質合成を阻止することにしばしば使用されていると、バク テリアはアミノグリコシドの阻害効果に反抗する顕著な能力を示し始めた。アミ ノグリコシド作用に対する生物の耐性は広い範囲のアミノグリコシド類に生じて いる。アミノグリコシド使用の更なる問題は顕著に乏しい胃からの吸収性および 速い排出というものであった。アミノグリコシド類の注射は、毒性と関連してい る筋肉内注射に続いて３０ないし９０分の付近でしばしば速いピークのプラズマ 濃度となる。もう１つの制限はアミノグリコシド類はＣＮＳもはしくは眼に入ら ないことである。

人間も含めて、動物におけるアミノグリコシド類の治療の用途においては毒性の 深刻な問題が記載されてきた０例えば、高級な動物における治療上の用途は、腎 毒性および呼吸疾患における神経筋肉封鎖が最高に達するのと同様、聴覚および 前庭の（ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒ）機能の両者を仮定的に含む耳の毒性につきまと われるかもれない。

リン酸塩の形でのアミノグリコシドを提供することが本発明の目的の１つである 。改善されたリポソームとの結合性を有するアミノグリコシドを提供することが 本発明の別の目的である。更に、その埋置塩を含んだアミノグリコシドと結合し たリポソーム類の製造法を提供することも本発明の目的である。また、このリポ ソーム類が実質的にこのアミノグリコシド類と結合することも本発明の他の目的 である。更にまた、特に非グアナシノアミノグリコシド類に関して脂質に対して 高い割合のアミノグリコシドを本発明のリポソーム類が提供することも本発明の 追加の目的である。

また人間を含めた動物の治療的処理に対し薬剤授与量の形でこのようなリポソー ムを提供することが本発明の更なる目的である。

高いプラズマレベルでの非結合もしくは非会合アミノグリコシドの迅速な使用可 能性という付随性をもたせずに、静脈内への投与し得る形態のアミノグリコシド を提供することが本発明のもう１つの目的である。

見匪列ｌ料 リン酸塩、硫酸塩および他の塩の形態での、アミノグリコシド類、その類似体お よび誘導体が驚異的に有用な治療性能を有することが今や見出された。アミノグ リコシド塩はリポソーム類との結合に特に適していることが見出されている。さ らにアミノグリコシドのリン酸塩は急性毒性を減少させたかもしれない、アミノ グリコシドという言葉はそれらの類似体および誘導体を含むと理解されるであろ う。

これまで、非グアナシノアミノグリコシド類はリポソーム類とかなり限定された 結合性を有することが見出されていた。たとえばモーガン等の著、「リポソーム が結合されたゲンタマイシンの製造および性能」アンティマイクロバイアルエー ジエンツアンドケモテラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａ ｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）。

１７：５４４−５４８（１９８０）は１００１１ｇの脂質と結合した約４■もし くはそれより小のゲンタマイシンを報告している１本発明において、リポソーム は、しばしば少なくとも約４０％の使用し得るアミノグリコシドである高められ たレベルの非グアナシアミノグリコシド類と「結合Ｊされている。更に、高めら れた負荷効率でリポソームをつくる際にホスフェートとしてアミノグリコシドを 使用することがここには記載されている。グアナジノおよび非グアナシノアミノ グリコシドの両者に対してこれは真実である。「結合された」なる語はリポソー ムの水性相内でもしくはリポソームの脂質相内において、リポソーム上もしくは リポソーム内に固定されていると解されるべきである 非グアナシノアミノグリコシドに対する脂質の高められた結合が、　１００ミリ グラムの脂質に対し約１０ミリグラム（塩基当量）より大の非グアナシノアミノ グリコシドホスフェート、好ましい具体例においては１００■の脂質につき約３ ０■より大の非グアナシノアミノグリコシドホスフェート（塩基当量）を有する リポソームの製造を更に可能にした。この事は、アミノグリコシドホスフェート リポソームおよびこのようなリポソームを含有する製剤をより高い効力で製造す る事を可能にする。

脂質の非グアナジノ　アミノグリコシドへの高められた結合は。

１００ミリグラムの脂質につき約１０ミリグラム（実際の重量）より大の非グア ナジノ　アミノグリコシド（スルフェート塩）、を有する約１：１０の比（Ｗ／ Ｗ）の、より好ましい具体例では１００■の脂質につき約２０■（実際の重量） より大の非グアナシノアミノグリコシド（スルフェート塩）を有する約１　：　 ５　（ｗ／ｗ）を超える比の非グアナジノ非ホスフェートアミノグリコシド　リ ポソームを製造することを更に可能にした。アミノグリコシドの重量はこのアミ ノグリコシドの実際の重量（実際の重量”　ａｅｔ、ｖｔ。

＃）もしくはその対向イオンの重量を含めない薬剤分子の当量重量もしくは塩基 当量（当量重量＃　６ｑ、ｖｔ　’　）で表すことができる。

本発明の方法はアミノグリコシド　リポソーム類（ストレプトマイシンもしくは ジヒドロストレプトマイシンを含む）の製造を可能とし、この方法以外の方法で 得られるより高い効能の広い範囲で製造されるこのようなリポソーム類を含有す る製剤を可能とする。

（この方法によるグアナジノ　アミノグリコシド　リポソーム類は約９　：　２ ５　（ｗ／ｗ）より大の薬剤対脂質当量重量比を有す；例えば約６０■ストレプ トマイシンスルフエート１１００■Ｅ　Ｐ　Ｃ（ａｃｔ。

蔓１．）より大である。）。

脂質に対して強められた薬剤の比の製剤は薬剤投与量につき減少された脂質の投 与量を必要とし脂質の投与に伴う毒性の回避もしくは減縮することは本発明の特 別の利益である。

このリポソーム類の製剤において、リポソームと利用し得る薬剤の強められた結 合性は薬剤および脂質出発化合物の必要量を減少させる。

最後に高い効力の薬品製剤はその結果としてより小さな容積となり、そしてそれ は投与に際して組織を害することが少ない、このことは筋肉内投与に関して特に 本当のことである。

アミノグリコシドホスフェートおよびアミノグリコシドホスフェート　リポソー ムの製造法および使用法は以下により十分に記載される６ 変更を加えられた５ＰＬＶ方法により、最も好ましい態様ではリポソームを乾燥 して粉とし、またリポソームを安定化するという両者を必要とするが、アミノグ リコシド　リポソームを製造および利用する方法は以下により十分に記載されて いる。

この発明は少なくとも１つの脂質と少なくとも１つのアミノグリコシドのリン散 塩とを含有するリポソーム類を包含する。　このものは更に、以下のようなアミ ノグリコシドホスフェートとリン脂質とを結合したユニラメラおよびマルチラメ ラ小胞体を包含し、アミノグリコシドホスフェートとしてはネオマイシンＢ。

パロモマイシン、リボスタマイシン、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナ マイシンＢ、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシンＣ８，ゲンタマイシ ンＣ，ａ、ゲンタマイシンＣ６，ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒド ロストレプトマイシンおよびシソマイシン等があり、リン脂質としてはホスファ チジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン 、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロールの単独もしくは他の 脂質との組み合わせ等がある。この発明は以下に記載されているようにリポソー ム類と結合されているアミノグリコシドホスフェートを製造する方法を包含し、 そして特に入手し得るアミノグリコシドホスフェートと実質的に結合したリポソ ーム類を包含する。また１００ｍｇの脂質につき約１０ｍｇ、好ましくは約３０ ｍｇのアミノグリコシドホスフェートより大の非グアナジノ　アミノグリコシド ホスフェート　リポソームが包含される。

この発明には更に、リポソーム的に結合したアミノグリコシドホスフェトおよび 適当な薬剤的担体と結合した形でのこのリン酸塩の治療的に有効な量を用いての 、人間を含めた動物の治療方法を包含する。更にアミノグリコシド類のホスフェ ートの製剤も包含され、特にネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボスタマイシ ン、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラ マイシン、ゲンタマイシンＣ１，ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２， ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンおよびシソ マイシンのリン謙塩である。更につけ加えれば、グラム陰性肺炎の治療における アミノグリコシドリン象塩およびリポソーム的に結合したアミノグリコシドがこ の発明に包含される。

この発明のリポソーム類は少なくとも１つの脂質および少なくとも１つの非グア ナジノ　アミノグリコシド、好ましくは硫酸塩の形で、含有するリポソーム類そ して殊に５ＰＬＶリポソーム類を包含している。更にネオマイシンＢ、パロモマ イシン、リボスタマイシン、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシン Ｂ、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシンＣ２，ゲンタマイシンＣ，ａ 、ゲンタマイシンＣ２，ネチルマイシンおよびシソマイシンのようなアミノグリ コシド類、およびホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスフ ァチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセ ロールのようなリン脂質と結合しているマルチラメラ小胞体型のリポソーム類も 含まれるものである。この発明はアミノグリコシドと結合したリポソーム類、殊 に下記のようにアミノグリコシド硫散塩と結合したリポソーム類および特に市販 のアミノグリコシド硫酸塩と実質的に結合しているリポソーム類の製造方法を包 含する。

又、１００■の脂質につき約１０．より大そして好ましくは約２０■より大の非 グアナジノ　アミノグリコシド（実際の重量）、これは薬剤対脂質の比が各々約 １：１０および１：５に相当するが、　の非グアナジノ　アミノグリコシド　リ ポソーム類をも包含する。

更に加えて、約３：５（実際の重量／脂質の重量）より大の薬更に、この発明に は、アミノグリコシドリポソーム類、好適な薬剤担体と結合したもの、の治療的 投与で人間を含む動物を扱う方法も含まれている。特にグラム−陰性の肺炎の治 療が特記される。

この発明は、１００■の脂質につき６．２■ｅｑ、ｖｔ、で存在する少なくさも １つの非グアナジノ　アミノグリコシド、そして好ましくは１００■の脂質につ き少なくとも約１２．４■ｅｑ、ｖｔ、の非グアナシノアミノグリコシドを含有 するリポソームを包含する。これは更に、ネオマイシンＢ、パロモマイシン、リ ボスタマイシン、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカ シン。

トブラマイシン、ヴアイオマイシン、ゲンタマイシンＣ２、ゲンタマイシンＣＸ ａ（ゲンタマイシンＣ，Ｃ，，Ｃ□ａ類似体およびそれらの誘導体をｎゲンタマ イシン〃と総称する）、シソマイシン。

ネチルマイシンのような非グアナシノアミノグリコシド類、そして好ましくは硫 酸塩の形での非グアナシノアミノグリコシド類を含むのである。

この発明は少なくとも１つの両親媒性脂質を含有するリポソーム類を包含する。

この発明は、５ＰＬＶ法のリポソーム類におけるアミノグリコシド対脂質の比を 高める方法を包含し、それは脂質−有機溶媒−アミノグリコシド−水性相混合物 を様々に乾燥して粉とし、少なくとも約８時間そして好ましくは約１８約４℃に 放置することによりこの再水和された粉を安定させることによる方法である。更 にこの発明はこの脂質−有機溶媒−アミノグリコシド−水性相混合物を３ないし ８時間の間、好ましくは５時間の間、乾燥させるることを包含する。そうでなけ ればこの脂質−有機溶媒−アミノグリコシド−水性相は単にスラリーもしくはベ ーストになるまで乾燥されるだけである。

この発明は更に、遠心分離のような高エネルギーの分離方法を避けるよう十分注 意しながら透析もしくはクロマトグラフィーのような低エネルギーの分離方法に よって、アミノグリコシド　リポソーム製剤からリポソーム的に結合していない アミノグリコシドを除去することを包含する。

図面の簡単な説明 第１図は、取り込みに使用し得るゲンタマイシンホスフェート（１ｇ）に対する １００■の卵ホスファチジルコリン（“ＥＰＣ”）に取り込まれたゲンタマイシ ンホスフェート（簡ｇ）のグラフである。

第２図は　取り込みに使用し得るゲンタマイシンホスフェート（ｍｇ）に対する 捕捉、効率の百分率のグラフである。

第３図は、取り込みに使用し得るＥＰＣ（ｍｇ）に対する、１００■のＥＰＣに 取り込まれたゲンタマイシンホスフェート（＋ａｇ）のグラフである。

第４図は、取り込みに使用し得るＥ　Ｐ　Ｃ（ｍｇ）に対する捕捉効率の百分率 のグラフである。

第５図は、アミノグリコシドスルフェートおよびホスフェートのリポソーム取り 込みを比較したグラフである。

ｌ豆勿圧亙星星監 リポソーム類を含有するアミノグリコシドの有用性が動物における病気の治療と の関連で５レンク等の米国特許明細書筒４，５５２゜８０３号に記載されている 。リポソーム類により驚くほど増大したアミノグリコシドホスフェートの結合効 率は、これらの製剤を特に有効で効率のよいものとしている リポソーム類との７ミノグリコシドホスフエートの結合は非ホスフェートアミノ グリコシドのそれよりも高められていることが今や見出された。実質的に結合し ている非グアナジノ　アミノグリコシドに対して、リポーム製剤中に存在する非 グアナシノアミノグリコシドの約６０％より多くないものが、リポソーム類と結 合していないために溶液中に遊離で残っていることは理解されるべきである。

リポソーム類は取り込まれた水性相を有する閉鎖された二分子膜（ｃｌｏｓｅｄ 　ｂｉｌａｙｅｒ　ｓｅ＋ｃｂｒａｎｅｓ）を有する小胞体である。リポソーム 類はどのような種類のユニラメラ小胞体（単一の二分子膜を有する）もしくはマ ルチラメラ小胞体（たとえば、同心円の二分子膜で、それぞれが隣の膜と水性層 によって分離されていることを特徴とする玉ねぎ様構造）でもよい。

二の発明のリポソーム類は、１００■の脂質につき約１１０１Ｑのアミノグリコ シドと同一もしくはそれより大の比率でまた１００．の脂質につき約３０■の非 グアナジノ　アミノグリコシドと同等もしくはそれより大という割合で、非グア ナジノ　アミノグリコシドと結合するように製造されることができる。アミノグ リコシドホスフェートを使用した場合には、非グアナジノ　アミノグリコシドの 他の形態で利用し得るであろうよりは濃厚でその結果より潜在効力の高いアミノ グリコシド　リポソーム製剤となる。

この発明のアミノグリコシドホスフェート　リポソーム類は当業界でよく知られ ている方法によってつくられる。パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）等〔ジャーナルオ ブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｌ、、）１３，２３８−２５２（１９６５））の最初のリポソームの調製は 、リン脂質を有機溶媒中に懸濁し１次いで蒸発乾燥させて、その反応容器上にリ ン脂質膜を残留させることを包含する。ついで、水性溶液の適等量が加えら れ、混合物は“膨潤”され、そして、その結果得られたマルチラメラ小胞体類（ ＭＬＶＳ）からなるリポソーム類は機械的手段で分散される。得られた二分子膜 の構造はこの脂質の疎水性（非極性）″尾部”はこの二分子膜の中心方向へ向い 、一方親水性（極性）゛′頭部”は水性層の方向へ向かっているようなものであ る。この技術は、パパハジオバウルス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｌｏｓ）及 びミラー（−１１１ｅｒ）　（バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・ラント・ アクタ（Ｂｉｏｈｉ■。

Ｂｉｏ　ｈ□ｓ、　Ａｃｔａ、　１３５．６２４−６３８（１９６７））によっ て記載された超音波処理された小さいユニラメラ小胞体類（ＳＴＪＶｓ）及び大 きいユニラメラ小胞体類（ＬＵＶｓ）の展開のための基礎を提供する。

パンガムの教示およびパパハジオパウルスの教示はこの中に参考に引用されてい る。

、アミノグリコシドホスフェート類についてのこの発明の実施においては、実質 的に均等のインターラメラ溶質分布をもつものとして特徴づけられるクラスのリ ポソーム類が好ましい、この好ましいクラスのリポソーム類はレンダ等への米国 特許第４，５２２゜８０３号で定義されている安定なプルリラメラ小胞体類（Ｓ ＰＬＶ）として名づけられでおり、ファウンティン等への米国特許第４．５８８ ，５７８号で記載されている単相の小胞体を包含しており、またメイヤー等、バ イオヒミカエトバイオフィジカアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｅａ　Ａｅｔａ、）８１７：１９３−１９６（１９８５）、「凍結−融 解マルチラメラ小胞体においてＩ！ｌＩ察される溶質分布および取り込み効率」 に記載されている凍結及び融解マルチラメラ小胞体（ＦＡＴＭＬＶ）を包含する が、これらの教示は参考にこの中に引用されている。

大きいユニラメラ小胞体は、キュリス（Ｃｕｌｉｓ）等の１９８５年１０月１６ 日出願、米国特許出願第７８８，０１７号１発明の名称“ユニラメラ小胞体類の 製造のための押出し技術”（ＬＵＶＥＴＳ）中に記載された方法による押出し装 置を用いて改造することができ。

この関連部分は参考にこの中に引用されている。この技術によってＬＵＶＥＴ小 胞体類をつくるために、ＭＬＶｓは膜フィルターを通して約７００ｐｓｉまでの 圧力下押し出される。これらの小胞体類は、その押出し技術を行なう前に少なく とも１回の凍結と融解のサイクルにさらされることができる；この操作は、バリ イ（Ｂａｌｌｙ）等の１９８５年１１月２１日出願、米国特許出願第８００，５ ４５号、発明の名称“改良された取り込み効率を有するマルチラメラリポソーム 類”中に記載されており一この関連部分は参考にこの中に引用されている。

小胞体を製造するために使用される他の技術は、逆相蒸発小胞体（ＲＥＶ）を形 成するようなもの、パパハジオバウルス等米国特許第４，２３５，８７１号があ り、これは参考にこの中に引用されている。

ここで使用されている脂質という言葉は、脂質材料の疎水性部分が二分子膜の方 向を向き、一方親水性部分がその水性相の方に向くような、二分子膜となるどの ような好適な物質をも意味するのである。

脂質化合物の２つの一般的なりラスがアミノグリコシドホスフェートとして本発 明において有用である。最もすぐれたものはトリグリセライドのような高度に疎 水性の化合物である。とうもろこし油は混合トリグリセライド類の便利で経済的 な原料として用いられるが、他の植物油、やしから油、ココナツト油、大豆油。

ひまわり油、サフラワー油、ココア脂その他を用いることもできるが、これらに 限定されることはない、特定の分子種が同様に採用できる。このような種はトリ ラウリン、トリミリスチン、トリパルミチンおよびトリステアリン、または他の 脂肪酸同様にそれらの化合物の脂肪酸アシル鎖が非均−形態で導入されている他 のグリセリルエステルであることもできるが、これらに限られることはない、他 に広い範囲のコレステロールエステルのような長鎖疎水性化合物の広いクラスも 使用し得る１石油シェリー℃ような長鎖有機混合物が許容し得る脂質化合物であ ることが見出される。

種々のコレステロール類および他のステロール類およびそれらの水溶性誘導体が アミノグリコシドホスフェート　リポソーム類を製造するためにこれまで使用さ れてきた；特にジャノフ等。

「ステロイド性リポソーム」なる名称のつけられた１９８５年９月１０日出願の 米国特許出願第７７３，４２９号を参照されたい、１９８５年３月１４日に発行 されたメイヒュー等Ｗ０８５１００９６Ｂは。

アルファートコフェロールおよびその成る種の誘導体を含有するリポソーム中に 薬剤を取り込むことによって薬剤の毒性を減少させる方法を記載している。また １種々のトコフ、エロール類およびそれらの水溶性誘導体がリポソームを形成す るために使用されているが、「アルファートコフェロールを基とする小胞体」と いう名称をつけられた１９８６年１０月１５日出願のジヤンプ等の米国特許出願 第７８６，７４０号を参照されたい、そしてこのものは参考にこの中に取り入れ られている。このグループの好ましＬ／％ものはコレステロールヘミサクシネー トおよびトコフェロールヘミサクシネートである。ただ１つの規制は、疎水性化 合物は１本発明の他の成分と複合しないときには、このリポソーム類の製造に使 用するために選ばれる特定の有機溶媒に溶解し得るべきである。

この発明においてアミノグリコシドホスフェートとして使用される脂質化合物の 第２の広いクラスは特性において１両親媒性である。ホスフェート、カルボキシ ル、スルフェート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロおよび他の似た基の存在の 故に親水性の性質がその分子に与えられることができるであろう、疎水性は長鎖 の飽和および不飽和脂肪族炭化水素基でそれらの基は１つもしくはそれ以上の芳 香族、脂環式基もしくは異次環基で置換されているような基を包含するが、それ らに限定されることのない基を含むことに関連し得るであろう、この好ましい両 親媒媒性化合物はホスホグリセライド類で、その代表的な例はホスファチジルコ リン、ホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルコリン、リソホス ファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシト ール、ホスファチジンは、シミリストイルホスファチジルグリセロールおよびジ ホスファチジルグリセロール単独もしくは他の脂質との組み合わせである。シミ リストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンもしく はジステアロイルホスファチジルコリンのような合成飽和化合物又はジオレオイ ルホスファチジルコリンもしくはシリルオイルホスファチジルコリンのような合 成不飽和種もまた使用し得るであろう、スフィンゴ脂質およびグリコスフィンゴ 脂質種の化合物のようなリン性のものを欠く他の化合物も脂質として指定される グループの中に入る。

両親媒性脂質は、下記の改造ＳＰＬＶｇ製法によってつくられるアミノグリコシ ドのための最初のリポソーム構造の要素として必要である。改造５ＰＬＶＩｉ製 アミノグリコシド　リポソーム類を形成するために、これらの両親媒性脂質はト リグリセライド類やステロール類を含む他の脂質と混ぜることができる。

アミノグリコシド　リン酸塩については、リポソーム類を有するステロールを製 造する方法は、閉鎖２分子膜を形成し得るステロールの有機駿誘導体の塩形態を 水性成分を取り込む完全閉鎖２分子膜を形成するに十分な量、水性緩衝液に添加 することを包含する。この混合物を振とつすることによってマルチラメラ小胞体 の懸濁液が形成される。この水性緩衝液がｚ液中にこの塩の対向イオンをまた含 有する場合には、小胞体の形成は促進される。

この懸濁液にエネルギーを与えると、例えば超音波、またはフレンチ圧縮セル（ フレンチ　プレス）もしくは適当な孔経の多孔性フィルターを通してこの小胞体 め押出しをすると、マルチラメラステロール小胞体をユニラメラ小胞体に変換す ることになるであろう。

リポソーム類は、脂質二分子膜で閉鎖されている水性媒体を取り込んでいる。こ の水性媒体は１例えば水もしくは溶解された塩もしくは緩衝液を含有する水であ ることができる。このような塩もしくは緩衝液の例としては塩化ナトリウムおよ びリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）であることができる、他の緩衝液としてホウ酸 塩、クエン酸塩、トリス−ＨＣｊｌ　［トリス−（ヒドロキシメチル）−７ミノ メタン塩酸〕およびＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチル　ピペラジン−Ｎ １−２−エタンスルホンＥＩりを包含するが、これらに限定されることはない、 緩衝液は約２．０および約１４．０のｐＨ範囲であることができる。アミノグリ コシドホスフェートについての好ましい具体例においては、この製剤はＨＥＰＥ Ｓ緩衡液（緩衝０　＋＊Ｍ　ＮａＣＱ、２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７，０ ゜ホウ謙塩緩衝液（１００ｍＭ　Ｎａ２ＨＣＯ，、５０ｍＭ　Ｈ，Ｂ　Ｏ，、ｐ Ｈ８゜５、もしくはクエン酸緩衝液（１５０ｍＭクエン酸ナトリウム）　、　Ｐ Ｈ８゜５で水和される。

リポソーム薬剤搬送システムにおいて、治療剤は、ここではアミノグリコシドで あるが、該リポソーム中に取り込まれ、続いて治療される患者に投与される０例 えばラーマン等、米国特許第３゜９９３．７５４号；シアーズ、米国特許第４， １４５，４１０号；パパハジョポロス等、米国特許第４，２３５，８７１号；シ ュナイダー、米国特許第４，２２４．１７９号；レンク等、米国特許第４，５２ ２，８０３号およびファウテイン等、米国特許第４，５８８，５７８号を参照さ れたい。

薬剤性のリポソーム製剤は、好ましい具体例においては、注射に好適なリン酸塩 もしくはクエン酸塩で緩衝された生理的食塩水もしくは水に入れて搬送投与され る。

このアミノグリコシドホスフェート　リポソーム類は任意に脱水されることがで き、それによって使用までの長い期間の貯蔵を可能にする。このリポソームを脱 水するために標準的な凍結−乾燥装置もしくは同様の機器が使用され得る。リポ ソームは又、それらを減圧下におくことによって簡単に脱水することができる。

そうでなければ、リポソームおよびそれらを包囲している媒体を脱水の前に液体 窒素中で凍結させることができる。まず、凍結をしてからの脱水は、１９８５年 ７月２６日に出願されたジヤンプ等の発明の名称二゛″脱水されたリポソーム” なる米国特許出願第７５９．４１９号の方法に従って、その製剤中に１もしくは それ以上の保護糖の存在下で行うことができる。該出願の関連分は参考にこの中 に引用されている。用いることのできる保護糖の例はトレハロース、マルトース 、シュークロース、グルコース、ラクトースおよびデキストランを包含するが、 これらに限られることはない。

あるいは、マルチラメラ小胞体は保護糖はなしに、凍結の前に脱水を行うことが できる。この脱水されたリポソーム類が使用されるときには、該リポソームに水 溶液１例えば蒸留水を単に添加することによって再水和が完了し、それらを再水 和せしめる。

この発明のアミノグリコシドはリポソームと結合させて投与されることができ、 そしてもし望まれるならば、投与の意図された経路および標準的な薬学的慣習に 関して選択された薬剤的に許容し得る担体（例えば生理的食塩水もしくはリン酸 塩緩衝液）と混合して、リポソームと結合した形で投与される。リポソームと結 合されたときのアミノグリコシドの投薬量は、一般にはそのアミノグリコシド単 独の場合のそれとなるであろう；投与量は、患者の年令１体重および状態を含め た多くの要因を考慮して処方医師によって設定されるであろう、担体に対する活 性成分の割合は熟慮された投与量の他にそのアミノグリコシドの化学的性質、熔 解性および安定性に依るのは当然であろう、非経口投与、すなわち静脈内１Ｍ腔 内、筋肉内、皮下もしくは乳腺内の経路での注射にはリポソーム組成物の８Ｍ溶 液が製造される。静脈用には、溶質の総濃度はこの製剤を等張性にするよう調製 されるべきである。

それらの使用の他の例においては、リポソームと結合したアミノグリコシドはゲ ル、油、エマルジョン等があるがそれらに限定されることはない広い範囲の普通 の投与形態で取り込まれることができる１例えば、リポームと結合したアミノグ リコシドを含有する懸濁液をリポソーム製剤における成分として、その水性相に 添加することができる。このような製剤は、普通のクリーム、ペースト、軟こう 、・ゲル、ローション等直接の適用のためのものとして投与されることができる 。

１、アミノグリコシド類のリン酸塩 このアミノグリコシド類は各々、グリコシド性の結合によって基本となる６員の 炭素環に結合した１つもしくはそれ以上のアミノ糖を含有している０種々のリン は塩がホスフェート基を有する象での滴定によって形成される。一般に、ホスフ ェートをアミノグリコシドに共有結合的に結合させるよりはアミノグリコシドの リン酸塩を形成するこの方が容易である。

例えば、ゲンタマイシン塩基は５つの滴定し得るアミノ基を有している。

滴定剤（ｔｉｔｒａｎｔ）の選択、特定のアミノグリコシド、溶媒および温度を 含めた種々の要因によって多くのリン酸塩が理論的ｌ：可能である。

１足度　髪＊ Ｈ３Ｐ　０４Ｇｅｎｔｌ　（Ｈ，Ｐ　０４）　＆Ｎａｐ、ＰＯ４Ｇｅｎｔ、（Ｈ ，ＰＯ４）、ＮａｓＮａｇ　ＨＰ　Ｏ，Ｇｅｎｔ（ＨＰ○、）、Ｎａ、。

本Ｇ　ｅｎｔ　＝ゲンタマイシン塩基 明らかに、多くのリン酸塩基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　＋ｍｏｉｅｔｉｅｓ）と結 合する能力を有するアミノグリコシドはリン酸塩結合の度合’Ｉｔｓ　Ｌ；（ｉ ｎｄｅｇｒｅｓｓ）使用され得る。しかしながら、この発明の実施番二当たって は、好ましいアミノグリコシド類は約１　：　１．６から約１：５のアミノグリ コシド分子対リン酸塩の比率を持って（する、ここで用いられるアミノグリコシ ドとしては少なくとも１つのリン酸塩と結合しているアミノグリコシドを参照す るであろう。

２、ゲンタマイシンのホスフェート形態の製造ゲンタマイシンホスフェートはこ の発明の好まい１アミノグリコシドホスフエートである。ゲンタマイシン塩基Ｉ ｔ以下で述べるようにゲンタマイシンサルフェートから製造され、そして続いて リン酸による滴定によってホスフェートに実質的Ｌ：変換し。

このホスフェートを７ミノグリコシドと結合させるように十分低いＰＨとさせる １通常約２．５のＰｉ（が適当であろう。

一般にアミノグリコシドホスフェートは、アミノグリコシドとホスフェートの両 者を十分に溶解するが認めろるほどには酸性でない溶媒ならばどのように溶媒を 用いても製造することができる。水性溶媒、特に水が好ましい、現在のＰＨがホ スフェート滴意剤およびアミノグリコシドの原料の特徴となるであろう、ホスフ ェートの原料はリン酸およびリン駿ナトリウムもしくはリン酸カリウムのような 金属リン酸塩である。温度および圧力は臨界的なものでなく、ａ準的な温度およ び圧力がしばしば最も便利である。該温度はアミノグリコシドが安定でいる温度 を超えるべきではない。

３．７ミノグリコシドホスフエート　リポソーム類の製造リポソーム類は、上記 の引用されている文献に記載された多数の方法のいずれによっても製造すること ができる。又は、水性相を脂質のない有機溶媒と混合させる方法によってリポソ ーム類を製造する方法を採用することができる。米国特許第４，５Ｊ１８，５７ ８号に記載された単相小胞体（ＭＰＶｓ）は、（ａ）有機溶媒中への脂質の分散 液をつくり、（ｂ）水性相がその中でカプセルに入れられるような二相混合物を 形成するように、この分散液を水性相中で７ミノグリコシドホスフエートと一緒 にしてそして（ｃ）その有機溶媒を除去するという一般的な方法で形成される。

特に、１つの脂質もしくは脂質および水性成分の混合物が一相（ｍｏｎｏｐｈａ ｓｅ）を形成するのに十分な量で有機溶媒もしくは有機溶媒配合物に添加される 。この溶媒（類）は、膜ができるまで蒸発させら九る。続いて適当量の水性成分 が添加され、Ｍ　Ｐ　Ｖ　ｓっを形成するために上記膜を再懸濁しそして激しく 撹拌する。

この工程で使用される有機溶媒もしくは溶媒配合物は水と混合し得るものでなけ ればならず、一旦水と混合したらＭＰＶｓをつくるために使用される脂質を溶解 するべきである。

例えば、次の条件を満たす一種の有機溶媒もしくは溶媒混合物がこの方法では使 用することができる。：　（１）５ｍｌの有機溶媒が０．２ｍ　Ｑの水性成分と 一相を形成し、そして（２）脂質もしくは脂質混合物がこの一相中に溶解し得る 。

この発明の方法で使用し得る溶媒は、エタノール、アセトン、２−プロパツール 、メタノール、テトラヒドロフラン、グライム（ｇｌｙｍｅ）、ジオキサン、ピ リジン、ジグライム、１−メチル−２−ビロリドン、ブタノール−２，ブタノー ル−１，イソアミルアルコール、イソプロパツール、２−メトキシエタノール、 もしくはクロロホルムとメタノールの混合物（例えば１：１のｖ　／　ｖ比で） を包含するがこれらに限定されることはない。

溶媒の蒸発は、その−相を保持し溶媒の蒸発を促進する好適な温度および圧力で 行われるべきである。実際のところ、選択される温度および圧力は、ＭＰＶｓを 形成するために使用される脂質の相−転移温度には依存していない、この後者の 点の利点は、望ましい性質を有する熱１ａｂｉｌａアミノグリコシド類がジステ アロイルホスファチジルコリンのようなリン脂質から製造されるＭＰＶｓに導入 されることができるということで、これはリン脂質の相−転移温度より上の温度 でのみ従来のリポソーム中に形成されることができるものである。

アミノグリコシドホスフェートの安定なブリラメラ小胞体。

５ＰＬＶｓは次のようにして製造される：１つの両親媒性脂質もしくは脂質混合 物を有機溶媒中に溶解する。多くの有機溶媒が適当であるが、ジエチルエーテル 、フッ素化炭化水素類およびフッ素化炭化水素類とエーテルの混合物が好ましい 、この溶液に水性相および取り込まれるべきアミノグリコシドが添加される。こ の二相性混合物は、溶媒を蒸発しながら溶媒の中で水性化合物を乳化することに よって５ＰＬＶｓにＲ換される。蒸発は、いずれの蒸発技術によっても１例えば 混合物に不活性ガスの流れを通したり、加熱したり、真空にする等によって音波 をあてながら行うことができる。使用される溶媒の容積は水の容積よりも十分な 量多くなければならず、それによって水性物質はこの混合物中に完全に乳化する ことができる。実際には、１容量の水性相に対し最低限大体３容量の溶媒が使用 され得る。実際に、溶媒対水性相の比率は水性相１容量に対して溶媒１００もし くはそれ以上まで変えることができる。脂質の量はその乳化小滴を含むために必 要とされる量を超えるように十分でなければならない（水性相１ｍ（ｌにつき約 ４０■の脂質）、この上限は実用性および効率によってのみ決められるもので１ 例えば５ＰＬＶｓは水性相１ｍｌにつき１５ｇの脂質でつくることができる。

この方法は従来のリポソーム類よりも異なった超分子１１Ｉｉ織を有するリポソ ーム類を製造する。本発明によれば、この全工程は使用される脂質の相転移温度 とは関係なく約４℃−６０”Ｃの温度範囲で行うことが出来る。この後者の利点 は望ましい性質を有する熱に不安定なアミノグリコシド類がジステアロイルホス ファチジルコリンのようなリン脂質から製造される５ＰＬＶｓに導入されること ができるが、リン脂質の相転移温度より上の温度でしが従来のリポソームには形 成されなかったものである。

ＦＡＴＭＬＶｓをつくるための好適な方法の】つの実施例は次のようである＝１ もしくはそれ以上の選択された脂質を、その脂質をクロロホルムのような有機溶 媒に溶解し、ついでその有ｔＳ媒を蒸発することによって、好適な容器の内壁に 沈着させ、カプセル内に取り込まれるべき（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）アミノ グリコシドホスフェートを含有する水性相を該容器に添加し、この水性相をして 該脂質を水和せしめ、そして得られた脂質ＷＡ濁液を機械的にかきまぜ（例えば ねじれ回転、うず巻回転）でリポソーム類形成させ、このものは次いで凍結−融 解工程に付される。

さもなければ１機械的かきまぜを採用することによって１もしくはそれ以上の選 択された脂質が水性相中に分散されてマルチラメラ小胞体（ＭＬＶＳ）を製造し 、これらもまた凍結−融解工程に付される。この工程はゲルｌ液体結晶転移温度 を超えた温度で約１−１Ｏ分間を要する。

Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓを製造するための脂質濃度は少なくとも約５０■／ｍｌ水性溶媒 である。より低濃度では高い取り込み効率を有するマルチラメラ小胞体を形成す るのがより難しい、好ましい脂質濃度は約１００および１１０００１ＩＩ／　ｍ 　Ｑ水性溶媒の間であり、より好ましくは１００−６００ｘ／　ｍ　１２で更に より好ましくは１００−４００ｍｇ／ｍ　Ｑである。

洗浄剤も有Ｉｔ＆溶媒も必要とされない。

結果としてＦ　Ａ　Ｔ　Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓを得る凍結−融解サイクルはその分散さ れたリポソーム混合物のすばやい凍結そして続く定温浴中での水性相を融解せし める温度にまで該凍結混合物を加温することを必要とする。採用される温度は一 般にそのゲルｌ液体結晶転移のための転移温度より高い、約２５−５０℃、好ま しくは約４０℃の定温浴が一般に効果的である。

液体窒素浴がこの凍結工程に特に効果的であることが見出されている。この凍結 −融解サイクルの数が得られるＦＡＴＭＬＶの性質に影響を与えている。一般に 平衡ラメラ内浸透バランス（ｅｑｕｉｌｉｂｒｕｉｕｍ　ｉｎｔｅｒｌａｍｅｌ ｌａｒ　ｏｓｍｏｔｉｃ　ｂａｌａｎｃｅ）を得るために３回もしくはそれ以上 に、好ましくは約５回もしくはそれ以上の凍結−融解サイクルが必要とされる。

液体窒素および４０℃の定温浴での約５回の凍結−融解サイクルが好ましいＦ　 Ａ　Ｔ　Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓをもたらす。

４、アミノグリコシド　の　理学的　途このアミノグリコシド類は広範囲のスペ クトルの抗生物質として分類され得る。抗細菌スペクトルに関しては、それらに は類似性があるがまた相当の相違もあるので、一般的な言い方は避けるべきであ る。この発明のアミノグリコシド類およびリポソーム的に結合したアミノグリコ シド類はグラム−陰性肺炎の治療に治療的に有効な投与量において有用である。

アミノグリコシド類は１もしくはそれ以上の薬剤的に許容し得る担体との組み合 わせで投与され得る。このような担体は当業界でよく知られている。アミノグリ コシド類は好ましくは筋肉内もしくは静脈内的に授与される。居部的な眼への適 用に対しては眼のための溶液および軟膏もまた利用される６局部的な適用のため のいくつかの場合にはクリームが使用できる。

ゲンタマイシン（塩基当量）は例えば約８時間毎に約１−１．７■／体重１ｋｇ の割合でまたは約７〜１０日間、６時間毎に０．７５〜１．２５■／艙の割合で ＩＭもしくはＩＶｆｉ与されることができる。しかしながら、実際の投与量を決 めるに当たっては、腎臓の機能不全。

使用されるアミノグリコシド類、動物およびその現在の状態を含めて多くの事− 柄が考慮される。アミノグリコシド類の治療的な有効な量は、その適用の個別性 からみて、目的とする結果を得る投与量であろう、リポソームと結合したアミノ グリコシドホスフェートのＩＭもしくはＩＶ製剤は食塩水溶液中に！！！濁され て投与されるのが好ましい。

５、アミノグリコシドの　゛された５ＰＬＶ　が　比上皇大豊旦立友 新規な方法によって製造された５ＰＬＶｓは次のようにして製造される６両親媒 性の脂質もしくは脂質混合物が有機溶媒中に溶解される。多くの有機溶媒が好適 であるが、ジエチルエーテル。

ハロゲン化炭化水素およびハロゲン化炭化水素とエーテルの混合物が好ましく、 メチレンクロライドとの混合物が最も好ましい。

この溶液に水性相およびリポソーム的に結合されるべきアミノグリコシドが添加 される。この段階ではアミノグリコシド硫酸塩が最も好ましい、この二相混合物 はこの水性物質を溶媒を蒸発しながら、より好ましい具体例では乾燥するまで蒸 発しながら有機溶媒中で乳化することによって５ＰＬＶｓに変換される。蒸発は いずれの蒸発技術によっても１例えば混合物を不活性ガスの流れを通したり、加 熱したり、真空にする等によって行うことができる。

乾燥、そして特に粉末への乾燥は、好ましい態様においては約３ないし８時間に わたって、好ましくは約５時間にわたって、そして好ましくは振とうしながら、 最も好ましくは高速で振とうしながら、最も好ましくは高速で振とうしにがら行 われる。乾燥温度は約２５℃から４５℃までの間である。この温度は使用される 溶媒の沸点もしくはそれより高い温度であってはならず、もちろんこの温度は糸 の圧力のと共に変化する。メチレンクロライドを用いて約４０℃が好ましい、粉 末にまで乾燥するのでなければペースサもしくはスラリーまでの乾燥が許容し得 る。使用される有機溶媒の容量は水性物質が混合物中に完全に乳化され得るよう に水の容量に比例しなれればならない、実際のところ、１容量の水性相に対し大 体１容量の溶媒が最低使用されることができる。事実、水性相に対する溶媒の比 は１容量の水性相に対し１００もしくはそれより大の容量まで変えることができ る。脂質の量はこの乳化液滴を被覆するに必要な量を超えるように十分でなけれ ばならない（水性相１ｍｆｌにつき約４０■の脂質）、この上限は実用性および 効率性によってのみ制限されるが一５ＰＬＶｓは水性相１ｒｒ＋ｆｌにつき１５ ■の脂質でつくることができる。

粉末が形成された場合、この得られた製剤は次いで再水和される。この物質がし ばらくの間”安定化”されるように許容されているということが、この方法の限 界である。安定化のための温度は臨界的ではないが、より低い温度であれば（凍 結より高い）リポソームの崩壊が少なくなる。すなわち安定化は好ましくは約４ ℃でおこなわれる。安定化の期間は最低８時間で、好ましくは少なくとも約−日 である。安定化の後、非結合のアミノグリコシドは除去されることができ、これ は好ましい態様において行われる。

結合していないアミノグリコシドの除去がリポソームの本来の姿に不利に影響を 及ぼさない方法で行わなければならない。食塩水溶液に対する透析はこのような 低エネルギータイプの非不利益方法である。遠心分離はリポソームの本来の姿に 不利な影響を及ぼすであろう高エネルギー法であり利用されるべきではない、ク ロマトグラフィーのような当業界で知られている他の低エネルギータイプの方法 もまた使用され得る。

結合していないアミノグリコシドを除去する前にリポソーム類は大きさを決めら れる０人間の静脈に用いられる場合には約３〜５μ■に大きさを決めるのが好ま しいｍ：の大きさを超えると毛細管り障害が起きる可能性がある。

サイジングは均質化およびスチールのメツシュ、まっすぐの径のもしくはねじれ た径のろ過、ポリカーボイ・−トおよび他の高分子物質の膜フィルターを含めた ろ過による押出しを含めたいずれの方法によっても行うことができる。

再水和の前にリポソーム混合物が半分に乾燥されることを最適の結果は要求する 。最適の結果のために更に、結合されていないアミノグリコシドの除去の前にリ ポソームを一晩安定に放置することが要求される。更にこの方法による最も好ま しい結果はアミノグリコシドの硫は塩形態を使用することから生じる。これは特 にゲンタマイシンの場合に真実であ机しかしながら、硫酸塩、　−塩化物、酒石 酸塩を包含するアミノグリコシド塩がアミノグリコシド遊離塩基同様に考慮され る。疎水性基と共に形成されるアミノグリコシド塩もまたこの発明の範囲内で考 慮される。このような疎水性基は脂肪象１例えばパルミテート、ミリステートお よびステアレートである。

この発明のリポソーム類を製造する前述の方法によって、アミノグリコシドは高 められたレベルでリポソームと結合し、溶液中で遊離のまま残ってはいない、実 質的に結合していることについては、約６０％より多くない製剤中に存在する非 グアニジノアミノグリコシドがリポソームと結合していないというように理解さ れるべきである。

いくつかの例においては、ＥＰＣのグラムあたり約２００１１ｇ（当量重量）よ り大の非グアニジノ非ホスフェートアミノグリコシド濃度を有するリポソーム分 散液が得られ、またいくつかの例では３６０■（当量重量）という高い度合いの ものが得られた。

リポソーム類と結合したアミノグリコシドそして特に改造５ＰＬＶ製造によって つくられた本発明のアミノグリコシドの非ホスフェートが、今までの技術に比べ て脂質に対する薬剤の比を高めた。この発明はリポソームは、約３　：　５０　 （Ｗ／　Ｗ）　、これは１００■の脂質に対し約６．２■の非グアニジノアミノ グリコシド（当量重量）であるが、の比率と同等もしくはそれより大の比率で非 グアニジノアミノグリコシドと結合するように、そして高い場合にハ約３：２５ 、これは１００■の脂質に対し約１２．４■の非グアニジノ非ホスフェートアミ ノグリコシド（当量重量）もしくはこれより高い比率で結合するように調製され ることができる。これはより濃縮されそして潜在力のある非グアニジノアミノグ リコシドリポソーム製剤とする。この製剤は、この発明の方法によって製造され たグアニジノアミノグリコシドリポソームに対するリポソーム結合の強化という 結果になり、このようなグアニジノアミノグリコシドリポソーム類は１００．の ＥＰＣと結合した約６０■のストレプトマイシン硫酸塩（実質重量）を有して、 約９　：　２５（当量重量／重量）より大の脂質に対する薬剤比を得たのである 。

末産貫よ ゲンタマイシンホスフェート この変換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）においては、２００■のゲンタマイシン塩基 が１　ｍ　ｌの水に溶解された。ついでこのものが当量点になるまで滴定された 。Ｈ，Ｐｏ、８５％（重量：容量）に対しては当量点ｔｔＰＨ２，５であった。

この反応は標準的温度、圧力で行われた。

必要ならば、ゲンタマイシン塩基はゲンタマイシン疏葎塩からイオン交換クロコ トグラフィによって製造することができる。ＡＧｌ−ＸＢ（水酸化物形態）のよ うなアニオン交換樹脂が蒸留して脱イオン化された水（αＨ２０）中に懸濁され る。ｍ造指導に従いカラム、便利には２．６■ＩＤＸ３３ｄｌがあけられ十分な 水で清浄された。この実施例では２本のカラムの容積のαＨ２０で十分であった が個々の装置は当業者によく知られている独自の要求があるであろう、αＨ２０ 中のゲンタマイシン硫酸塩は中程度の流速でこのカラムに流された。２００■／ ｍＱのゲンタマイシン硫ｍ溶液１００ｍＱで５０ｍ　Ｑ　／時間の流速が便利で ある。続いてこのカラムがαＨ２０で洗浄された０分画が集められゲンタマイシ ンを含有する分画は貯められ凍結乾燥された。この塩基の力価（ｐｏｔｅｎｃｙ ）が、生物学的分析やこの薬剤物質のトリニトロベンジルａｄｄｕｃｔ（ｓ）の 分光光学決定法を包含する多くの技術によって決定され得る。この塩基はリン酸 およびリン酸ナトリウム緩衝液を用いた水性滴定によってホスフェートに変換さ ムた。

失豊叢且 アミノグリコシドホスフェートリポソーム　の　々のゲンタマイシン゛　におけ る前駆体リポソーム　の製。

１６個の丸底フラスコを４つの群としておいた。各群は、卯ホスファチジルコリ ン（ＥＰＣ）のような脂質を薄膜もしくは粉状の形態で、各々５０．１００．２ ００および３００■を含有する４つのフラスコを有していた０群１における小胞 体は５０ｍｇ　／　ｍ　Ｑアミノグリコシド（ここでは全ての群においてゲンタ マイシンである。）でつくられた、最初に５０ｑ／ｍＱのアミノグリコシドの１ ．０ｍ　ｍの試料（ａｌｉｑｕｏｔｓ）がこの群を形成している４つ分かれたフ ラスコ中にピペットで入れられ、それらは激しく撹拌された。完全に混合すると 均一で乳状ま粘性物を有すＭＬＶ製剤を得た。これらの試料はプラスチックのｃ ｒｙｏｖｉａｌｓに移された。それからこの試料は凍結−融解法で処理された。

この方法は残りの３つの群につＮ１てもくり返された。

群２における試料は１００■／　ｍ　Ｄのアミノグリコシドで形成され、同じよ うに４つのＥＰＣの出発重量を有していた。同様に群３における４つの試料は２ ００■／　ｍ　１１のアミノグリコシドで形成され、また群４における４つの試 料は４００■／　ｍ　（ｌのアミノグリコシドが形成されていた。得られた１６ の試料のセットは４つの群ニ整えられ、各々は脂質とアミノグリコシドの異なっ た出発比を有していた。

凍結−融解サイクル。　このアミノグリコシド：脂質混合物はｃｒｙｏｖｉａｌ ｇに移され、それから先端が覆われた。しかしながらこのｃｒｙｏνｉａｌの封 が、膨張したり凝結したりするガスが凍結および融解の聞出ることを許している ことはよいことであった。各々のびんは、このびんを液体窒素タンク中に浸すた めに用いられている金属エクステンダーに固定されていた。

各試料はこの脂質を水性アミノグリコシドと混合するために激しく撹拌された。

このびんは液体窒素容器中直ちに入れられた。

薬剤−脂質相互作用を高めるために、これらの試料はさっと混合され、凍結の際 には均質で乳状の粘性をもっていた。

１つの試料が完全に凍結したとき（約１分）、このびんは４℃の水浴に移され完 全に融解された。融解の後、このびんは激しく撹拌され、相が分離する機会をも つ前に液体窒素中にこのびんを戻して入れることによって次の凍結−融解サイク ルを直ちに開始した。最良の結果を得るためには最低約５回の凍結−融解サイク ルが必栗とされた；しかしながら、ある種の化合物の取り込みは凍結−融解サイ クルの数を約１０にまで増加させることによって増加することが見られた。

ゲンタマイシンホスフェートを使用する前述の方法の結果は第１図から第４図に 示されている１種々のアミノグリコシドホスフェートに対しては、最適の７ミノ グリコシド濃度および最適のアミノグリコシド：脂質比を決定する際に有用とな り得る。ゲンタマイシンホスフェートの重量は、特に違うように注意書きされて いないならば、このホスフェート対向イオンの重量を参照することなく活性剤の 量で記載されている。

叉１匠ｌ 、準的な　法による１グアナシノアミノグリコシドサルフエートおよびアミノグ リコシドホスフェートのリポソーム的取り立九夙土蚊 Ａ　トブラマイシン　第５図から見ることができるように。

ホスフェートの形態におけるトブラマイシンのリポソーム的会合はサルフェート の形態におけるトブラマイシンよりはるかに効果的であった。トブラマイシンの 試料（総重量０．５ｍρ中に１００■）をリン酸（第５図、ぬりつぶした円で印 がつけられている）もしくは破談（第５図、ぬりつぶした四角で印がつけられて いる）で適当なＰＨに調整された。このトブラマイシンは、続いて１０回の凍結 −乾燥サイクルを利用した実施例２の凍結−融解法により卵ホスファチジルコリ ンに添加された。この結果は、より大なる結合効率となるのが、単にアミノグリ コシド含有の水性相のｐＨによるものではないことを明らかに示している。第５ 図に示されている全ｐＨ領域にわたってトブラマイシンホスフェートはトブラマ イシンサルフェートよりもよりリポソーム的に結合している。このトブラマイシ ンはリン酸で滴定されているのでホスフェート結合はリポソーム結合につれて増 大する。ｐ）１２．５ではトブラマイシンホスフェートに対する取り込み効率が ＥＰＣ１■につき約０．３５■のトブラマイシンホスフェート濃度を有するリポ ソーム分散液を３５％の収率を超えであるいははるかに超えるものであった。

ミカシンーＰＯ９のリポソーム的結合の比較テストが行なわれた。

このサルフェートを形成するためにホスフェート緩衝食塩水中でのアミカシンの 遊離塩基がＨ，ＳＯ，でＰＨ２，０まで滴定された。

アミカシン結合は約１０．３７．５０および８０■で比較された。続いてレンダ （Ｌａｎｋ）らの米国特許第４，５２２，８０３号の５ＰＬＶ法によりリポソー ム類が製造された。アミカシン／リポソーム結合は分光スペクトル分析によって 測られ、どの場合もアミカシンサルフェート形態に対するよりもアミカシンホス フェートに対する方が少なくとも約１７３は大であった。

ヌｆｆｉ された　、比の！ポソームのアミノグリコシドの”された５ＰＬＶ法 ηＩｌ！！　リポソームの　゛ １ｇの脂質（卵ホスファチジルコリン“ＥＰＣ”）を５０ｏｍ　ｆｔの丸底フラ スコ中で乾燥して膜とした。この脂質を約５０ｍ　１２のメチレンクロリドを用 いて再懸濁した。

この混合物に７ミノグリコシドの水溶液を添加した。この水溶液は９ｍｆｌ−の ０．９％食塩水（重量／容量）中０．５ｇのゲンタマイシンサルフェート（実際 重量）であった。得られた混合物は撹拌器によって撹拌した。この方法で前駆体 リポソームが生じた。

、和、そして　置工 このリポソーム混合物を窒素雰囲気下でかき混まぜた。圧力は減ぜられたが、こ の試料が乾燥して粉となるまで沸点より下に保たれた。この方法は４０℃で約４ ないし５時間を要した。この混合物は窒素下約９ｍＱの蒸留水および４１ｍΩの ０．９％食塩水（重合／容量）で再水和した。この混合物は何の凝集物もかたま りもない乳白色の色が得られるまでかき混まぜた。この工程は約４０℃で２時間 を要した。この混合物は４℃で１日間放置もしくは安定化された。

１」１ この試料を続いて約７００ｐｓｉまでの圧力でポリカーボネート直進後膜フィル ターを通して押出すことによって約３ｕｍにまでサイジングした。ろ通抜この物 質は約２日０．９％の食塩水（重量／容量）に対して透析した。この透析でリポ ソーム的に結合していない全てのアミノグリコシドを実質的に除去した。この工 程の結果は第１表および第２表に示されている。第１表は、リポソーム類を粉に まで乾燥せずまた透析をせずに非結合のアミノグリコシドを遠心分離除去したも のに対する。この方法でのアミノグリコシドと脂質との増大された結合効率を示 している。

第２表は、リポソーム類を粉にまで乾燥せずまた透析をせずに非結合のアミノグ リコシドを遠心分離除去したものに対する。この方法の使用で得られる増大され たアミノグリコシド対脂質の比を示している。

】二」−二艮 しするゲンタマイシンの結合の％ ２７．０３　３５．３ ２４．５８　７２．６ １７．２７　５１．２ ２２．０２　６２．０ ３２．７１　４１．０ ゲンタマイシン／１００　脂 粉になるまで乾燥されて　粉になるまで乾燥されたいない　の２合物　五孤魚盈 査隻 遠心分離により除去された　透析により除去された１０．８　２０．５ 前述の実施例は本発明を単に説明するだけのものであり決して制限するものでは ない、他の実施例は当業者にとって直ちに明らかであろう、この発明は請求の範 囲によってのみ制限されるであろう、前述の実施例は本発明を単に説明するだけ のものであり決して制限するものではない、他の実施例は当業者にとって直ちに 明らかであろう、この発明は請求の範囲によってのみ制限されるであろう。

取り込み効率％ ■　ゲンタマイシン７１００■ＥＰＣ 取り込み効率％ 第５図 アミノグリコシドＰＯ４およびＳｏ、のリポソーム的取り込みの比較＋２３４５ ６７ 水和後のＰＨ 国際調査報告 １″′Ｎ１′陶９＾β崗１°Ｏ″均　ＰＣＴ／υ５５７１０００７７

Claims (61)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１つのアミノグリコシドのリン酸塩を含有するリポソーム。
2. ２．リポソームがユニラメラである請求の範囲１のリポソーム。
3. ３．リポソームがマルチラメラである請求の範囲１のリポソーム。
4. ４．アミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボスタマイシン、 リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラマイ シン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、ネチ ルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンもしくはシソマ イシンである請求の範囲１のリポソーム。
5. ５．アミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲４のリポソーム。
6. ６．アミノグリコシドがトブラマイシンである請求の範囲４のリポソーム。
7. ７．アミノグリコシドがアミカシンである請求の範囲４のリポソーム。
8. ８．アミノグリコシドがストレプトマイシンである請求の範囲４のリポソーム。
9. ９．更にリン脂質を含有する請求の範囲４のリポソーム。
10. １０．リン脂質がホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスフ ァチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンもしくはホスファチジルグリ セロールである請求の範囲９のリン脂質。
11. １１．リン脂質がホスファチジルコリンである請求の範囲１０のリン脂質。
12. １２．アミノグリコシドホスフェート。
13. １３．アミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボスタマイシン 、リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラマ イシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、ネ チルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンもしくはシソ マイシンである請求の範囲１２のアミノグリコシドホスフェート。
14. １４．薬剤的に許容し得る担体中の請求の範囲１３のアミノグリコシドホスフェ ート。
15. １５．アミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲１４のアミノグリコ シドホスフェート。
16. １６．アミノグリコシドがトブラマイシンである請求の範囲１４のアミノグリコ シドホスフェート。
17. １７．アミノグリコシドがアミカシンである請求の範囲１４のアミノグリコシド ホスフェート。
18. １８．アミノグリコシドがストレプトマイシンである請求の範囲１４のアミノグ リコシドホスフェート。
19. １９．下記の工程を含有する、少なくとも１つのアミノグリコシドのホスフェー トを脂質と結合の形で含有する組成物の調製方法： （ａ）アミノグリコシドホスフェートを水溶液中に分散させる工程、及び （ｂ）アミノグリコシドを脂質と結合させるのに許容される条件下該水溶液を脂 質を結合させる工程。
20. ２０．アミノグリコシドホスフェートがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボ スタマイシン、リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシ ン、トブラマイシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイ シンＣ２、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシン もしくはシソマイシンである請求の範囲１９の方法。
21. ２１．アミノグリコシドがゲンタマイシンホスフェートである請求の範囲２０の 方法。
22. ２２．治療的に有効な量のアミノグリコシドをホスフェートの形で投与すること を包含する、人間を含めた動物の治療方法。
23. ２３．ホスフェートを好適な薬剤的担体との結合の形で投与することを更に包含 する請求の範囲２２の方法。
24. ２４．薬剤的担体が脂質化合物である請求の範囲２３の方法。
25. ２５．アミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボスタマイシン 、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラマ イシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、ネ チルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンもしくはシソ マイシンである請求の範囲２２の方法。
26. ２６．アミノグリコシドがリポソームと結合している請求の範囲２２の方法。
27. ２７．アミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲２６の方法。
28. ２８．グラム陰性肺炎の治療における請求の範囲２２の方法。
29. ２９．グラム陰性肺炎の治療における請求の範囲２６の方法。
30. ３０．アミノグリコシドとホスフェート源とを塩形成を許容し得る溶媒中で結合 させる工程を台有するアミノグリコシドのホスフェートの調製方法。
31. ３１．アミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボスタマシン、 リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラマイ シン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、ネチ ルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロストレプトマイシンもしくはシソマ イシンである請求の範囲３０の方法。
32. ３２．アミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲３１の方法。
33. ３３．ホスフェート源がリン酸である請求の範囲３０の方法。
34. ３４．１００ｍｇの脂質にっき少なくとも約１ｍｇの非グアナジノアミノグリコ シド（塩基当量）で存在する少なくとも１つの非グアナジノアミノグリコシドを 合有するリポソーム。
35. ３５．非グアナジノアミノグリコシドが１００ｍｇの脂質につき少なくとも約３ ０ｍｇの非グアナジノアミノグリコシドの量で存在する請求の範囲３４のリポソ ーム。
36. ３６．非グアナジノアミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボ スタマイシン、リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシ ン、トブラマイシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイ シンＣ２、ネチルマイシン、もしくはシソマイシンである請求の範囲３４のリポ ソーム。
37. ３７．非グアナジノアミノグリコシドがリン酸塩の形態である請求の範囲３６の リポソーム。
38. ３８．非グアナジノアミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボ スタマイシン、リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシ ン、トブラマイシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ２ａ、ゲンタマイ シンＣ２、ネチルマイシン、もしくはシソマイシンである請求の範囲３５のリポ ソーム。
39. ３９．非グアナジノアミノグリコシドがホスフェートの形態である請求の範囲３ ８のリポソーム。
40. ４０．水性溶媒、水性溶媒１ｍｌにつき少なくとも約５０ｍｇの脂質濃度を含有 する、水性相を含有するアミノグリコシドホスフェート中に溶質を均一に分布さ せたリポソームの製造法であって、有機溶媒もしくは洗浄剤の不存在下、次の工 程を包含するもの：（ａ）水性溶媒中に脂質を分散させてマルチラメラ小胞体を 形成し、 （ｂ）このマルチラメラ小胞体を素早く凍結させて凍結液体−水性溶媒混合物を 得、そして （ｃ）この混合物をあたためて水性溶媒を融解させる。
41. ４１．工程（ｂ）および（ｃ）が少なくとも約５回引き続いて行われる請求の範 囲４０の方法。
42. ４２．アミノグリコシドホスフェートがアミノグリコシドがネオマイシンＢ、パ ロモマイシン、リボスタマイシン、リヴイドマイシン、カナマイシンＡ、カナマ イシンＢ、アミカシン、トブラマイシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシン Ｃ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、ジヒドロ ストレプトマイシンもしくはシソマイシンである請求の範囲４０の方法。
43. ４３．アミノグリコシドホスフェートがゲンタマイシンである請求の範囲４２の 方法。
44. ４４．少なくとも約３：５０（Ｗ／Ｗ）の薬剤対脂質比（当量重量）で存在する 少なくとも１つの非グアナジノ非ホスフェートアミノグリコシドを含有するリポ ソーム。
45. ４５．アミノグリコシドが少なくとも約３：２５（Ｗ／Ｗ）の薬剤対脂質比（当 量重量）で存在する請求の範囲４４のリポソーム。
46. ４６．アミノグリコシドがネオマイシンＢ、パロモマイシン、リボスタマイシン 、リヴィドマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、トブラマ イシン、ゲンタマイシンＣ１、ゲンタマイシンＣ１ａ、ゲンタマイシンＣ２、ネ チルマイシン、もしくはシソマイシンである請求の範囲４４のリポソーム。
47. ４７．アミノグリコシドが硫酸塩の形態である請求の範囲４４のリポソーム。
48. ４８．アミノグリコシドが硫酸塩の形態である請求の範囲４６のリポソーム。
49. ４９．アミノグリコシドがゲンタマイシンである請求の範囲４８のリポソーム。
50. ５０．ゲンタマイシンが少なくとも約３：２５（Ｗ／Ｗ）の薬剤対脂質比（当量 重量）で存在する請求の範囲４９のリポソーム。
51. ５１．リポソームが少なくとも１つの両親媒性の脂質を含有する請求の範囲４４ のリポソーム。
52. ５２．リポソームがマルチラメラである請求の範囲４４のリポソーム。
53. ５３．マルチラメラリポソームがＳＰＬＶリポソームである請求の範囲４４のリ ポソーム。
54. ５４．リポソームがマルチラメラである請求の範囲４５のリボソーム。
55. ５５．マルチラメラリポソームがＳＰＬＶリポソームである請求の範囲４５のリ ポソーム。
56. ５６．薬剤（当量重量）対脂質の比が少なくとも約９：２５（Ｗ／Ｗ）で存在す る少なくとも１つのグアナジノアミノグリコシドを含有するリポソーム。
57. ５７．アミノグリコシドがストレプトマイシンである請求の範囲５６のリポソー ム。
58. ５８．リポソームがマルチラメラである請求の範囲５６のリポソーム。
59. ５９．マルチラメラリポソームがＳＰＬＶリポソームである請求の範囲５８のリ ポソーム。
60. ６０．１００ｍｇの脂質につき少なくとも約６．２ｍｇのアミノグリコシド（当 量重量）で存在する少なくとも１つの非グアナジノ非ホスフェートアミノグリコ シドを含有するリポソームの治療的有効量を投与することを包含する、人間を含 めた動物の治療方法。
61. ６１．グラム陰性肺炎の治療における請求の範囲６０の方法。