JPH01502985A - 白血病抑制性因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

白血病抑制性因子 発明の分野 本発明は、白血病抑制性因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）　、実質的に純粋な形態のＬＩＦの 製法、並びに組換ＬＩＦのクローニングおよび発現に関する。 発明の背景 成熟血球は、幼弱前駆細胞のクローン増殖および付随する分化によって生成する ［メトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ、　Ｄ、）、（１９８４）、ザ・ヘモポイエテイ ック・７０ニー・ステイミニレーテイング・ファクターズ（Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐ ｏｉｅｔｉｃ　Ｃｏ１ｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ）　、 エルセヴイール（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）　、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ）　］　。正常な造血細胞には、増殖および分化の２過程が密接に関連しており 、それによって短命の成熟細胞が連続的に補充される。少なくとも４種の生化学 的に明らかな成長因子、すなわちコロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ）（Ｇ−Ｃ３ＦＳＭ −Ｃ３ＦＳＧＭ−Ｃ３ＦおよびＭｕｌｔｉ−ＣＳＦ　（Ｉ　Ｌ−３）　）が、イ ン・ビトロで顆粒球およびマクロファージの前駆細胞の増殖および分化を促進す ることがわかっている［メトカルフ、（１９８７）、プロシーディンゲス・サブ ・ザ・ロイヤル・ソサイアティ・サブ・ロンドン、シリーズＢ　（Ｐｒｏｃ、　 Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｂ、）、正常細胞と比べて、白血病性骨髄細胞は、増殖および分 化が関連しておらず、幼弱前駆細胞が蓄積し、その増殖能を保持し、分化しない という特徴を有する。イン・ビトロで骨髄性白血病細胞の分化を誘導し得る生物 学的因子の性質、および特定の因子が増殖を伴わずに分化を誘導し得るかどうか に関する議論がさかんであった。増殖および分化には、異なる因子の介在が必須 であることが提案されている［サッチス（Ｓａｃｈｓ、　Ｌ、　）、（１９８２ ）、ジャーナル・サブ・セルラー・フィジオロジ−（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、）補遺、ユ、１５１〜１６４］。一方では、２つのグループが、マウ ス骨髄性白血病細胞系Ｍ１の分化を誘導し得、正常前駆細胞の増殖を促進しない 活性物質（ＭＧ　１−２またはＤ−因子）について記載し、これを精製した［リ ブトン（Ｌｉｐｔｏｎ、Ｊ、Ｈ，）およびサッチス、（１９８１）、ビオヒミ力 ・ニド・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ。 ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）　、　６−１乙−≦３−１５５２〜５６９　；　）　ミ 　ダ　（ＴｏＩＩｌｉｄａ、Ｍ、）、ヤマモトーヤマグチ（Ｙａｍａｍｏｔｏ− Ｙａ＋ａａｇｕｃｈｉ＋　Ｙ、）およびホズミ（Ｈ。 ｚｕａｉ、　Ｍ、　）、（１９８４Ｌジヤーナル・サブ・バイオロジカル・ケミ ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、２５９．１０９７８−１０９８ ２］。他方では、本発明者らが、Ｃ３Ｆの１種であるＧ−Ｃ３Ｆが、マウス骨髄 性白血病細胞系ＷＥＨＩ−３８Ｄ’の強力な分化誘導促進物質であり、かつ正常 細胞の増殖および分化の促進物質でもあることを既に示している［ニコラ（Ｎｉ ｃｏｌａ、　Ｎ、　Ａ、）　、メトカルフ、マツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　 ｉ）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｇ、　Ｒ，）、トーヤマグチ、ホズ ミ、オカベ（Ｏｋａｂｅ、　Ｔ、　）およびタカ力（Ｔａｋａｋａ、Ｆ、）、（ １９８６）、フェツス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）　、２フア一ジ分化 を誘導し得ることを示している。これらの因子間の関連は、論争の的であった。 腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）はヒト骨髄芽球細胞系ＭＬ−１の分化を促進し得る という知見［タケダ（Ｔａｋｅｄａ、　Ｌ）　、イワモト（Ｉｗａｍｏｔｏ＋　 Ｓ、）　、スギモト（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ、　Ｈ，）、タフ７　（Ｔａｋｕｍａ、 　Ｔ、）　、カワタニ（Ｋａｗａｔａｎｉ、　Ｎ、）　、ノダ（Ｎｏｄａ。 Ｍ、）％マサキ（Ｍａｓａｋｉ、　Ａ、）　、モリセ（Ｍｏｒｉｓｅ、　Ｈ，） 　、アリムラ（Ａｒｉ＋ｎｕｒａ、　Ｈ，）およびフンノ（Ｋｏｎｎｏ、　Ｋ、 ）、（１９８６）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３２３．３３８〜３４０ ］によって、状況は更に複雑なものとなった。 これらのグループのデータの不一致を解明するための試みにおいて、本発明者ら は、従来の種々の研究に用いられたクレブス■腹水癌細胞を培養したならし培地 を生化学的に分別し、正常前駆細胞に対してもＷＥＨＩ−３８Ｄ’細胞に対して も活性な真正Ｇ−Ｃ８ＦおよびＧＭ−Ｃ３Ｆだけでなく、生化学的には異なるが 機能的には同様の、Ｍ１細胞の分化を誘導し得る２種の因子をも含むことを示し た。後者の因子は、イン・ビトロでＭ１白血病細胞の増殖を抑制する能力を有す るので、白血病抑制性因子（ＬＩＦ）−ＡおよびＬＩ　Ｆ−Ｂと呼ばれ、これら はＷＥＨＩ−３８Ｄ”細胞の分化を誘導せず、正常顆粒球／マクロファージ前駆 細胞の増殖を促進しないことがわかった。 本発明の要約 本発明において、ＬＩＦは、以下の２つの性質を有する分子として定義される： 　（１）白血病細胞の分化に関連して、骨髄性白血病細胞、例えばＭ１細胞の増 殖を抑制する能力を有し、（２）本発明において記載するマウスＬＩＦまたはヒ トＬＩＦの特定の配列を有する分子と、Ｍｌ細胞またはマウスもしくはヒトマク ロファージの特異的な細胞レセプターへの結合を競合する。ＬＩＦは、種々の形 態の骨髄性白血病を抑制する非増殖性治療剤として、並びにマクロファージの機 能および感染に対する他の応答を改良する試薬、およびこれらに関する臨床試験 および研究用の試薬として使用する可能性を有する。 本発明において、ｒＬＩＦ活性を有するポリペプチド」とは、前記のようなＬＩ Ｆの性質を有するポリペプチドまたはグリコポリペプチドを意味し、本発明にお いて開示するマウスまたはヒトのＬＩＦのアミノ酸配列と完全にまたは部分的に 相同のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、これに限定されるもの ではない。 前記ＬＩＦの性質を有するものであれば、マウスまたはヒトのＬＩＦのアミノ酸 配列の一部のみと完全にまたは部分的に相同のポリペプチドをも包含する。更に 、宿主細胞において発現によって生成し、発現時には不活性であるが、宿主細胞 によって処理されて活性分子となるポリペプチドまたはグリコポリペプチド、並 びに発現時には不活性であるが、イン・ビトロまたはイン・ピボで選択的に分解 されて活性分子となるポリペプチドまたはグリコポリペプチドをも包含する。 マウスＬＩＦは、以下のような生物学的性質を有する分子である（ａ）マウス骨 髄性白血病細胞系Ｍ１の細胞において、増殖能の喪失およびそのクローン原白血 病細胞の死滅を伴ってマクロファージ分化を誘導し、作用はＧ−ＣＳＦによって 増強される。 （ｂ）Ｍｌ細胞、並びに腹腔、牌臓および骨髄からの正常マウス単球およびマク ロファージの高親和性レセプター（マクロファージ成熟または機能的活性化につ れてレセプターの数は増加する。）に選択的に結合するが、それらの組織からの 顆粒球、赤血球またはリンパ球には結合しない。 （ｃ）　”’Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆの、高親和性レセプターへの特異的結合は、Ｇ− ＣＳ　Ｆ、　ＧＭ−ＣＳ　Ｆ、　Ｍｕｌｔｉ−ＣＳ　Ｆ　（インターロイキン− ３）　、Ｍ−Ｃ３Ｆ、インターロイキン１．２．４もしくは６、内毒素または種 々の他の成長因子と競合しないが、ラベルされていないＬＩＦとは競合する。 （ｄ）正常または麻酔マウスの血清中の菌体内毒素により上昇するが、内毒素耐 性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいては上昇しない。 （ｅ）肺、唾液腺、腹膜細胞および骨幹を含む種々の組織によって生成する。 （ｆ）Ｃ３Ｆの不存在下に成長する場合の、イン・ビトロでの、正常顆粒球−マ クロファージ前駆細胞の生存時間を短縮する。 （ｇ）ＷＥＨｌ−３Ｂ　Ｄ”マウス骨髄性白血病細胞、ＧＭ−ＣＦ　ＳまたはＭ ｕｌｔｉ　−Ｄ　Ｓ　Ｆを発現するレトロウィルスの感染によって形質転換して 白血病誘発性となったマウス骨髄細胞、マウス白血病細胞系ＷＥＨＩ２６５およ びＷＥ　１９の増殖を抑制するか、または分化を誘導する能力は無い。 （ｈ）顆粒球、マクロファージ、好酸球、巨核球、赤血球および肥満細胞系の正 常前駆細胞の増殖を促進する能力が無く、正常顆粒球、マクロファージ、巨核球 、好酸球または天然細胞毒性細胞の前駆細胞のクローン増殖を抑制するか、また はイン・ビトロにおけるＣ８Ｆによる促進に対する定量的応答、もしくは連続細 胞系３２ＣＤ１゜１３およびＦＤＣＰ−１の細胞の増殖を変える能力が無い。 （ｉ）特異的細胞レセプターへの結合を、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ ）のヨウ化誘導体と競合する能力が無い。ただし、Ｇ−Ｃ３Ｆは、ＭｌおよびＷ ＥＨＩ−３８Ｄ”マウス骨髄性白血病細胞において分化を誘導し、ＬＩＦのＭｌ 細胞に対する作用を増強する能力を有する。 （ｊ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対して特異的に上昇する抗血清によってＬＩＦ 活性が阻害されることが無い。 （ｋ）マウスＬＩＦの転写が、ＬＢ３およびＥ９．Ｄ４Ｔ細胞の細胞質の構成成 分として存在し、これら細胞中の細胞内のレクチン・コンカナバリンＡによって 誘導されず、他の多くの種類の細胞中に存在する。 マウスＬＩＦは、以下のような性質をも有する：（１）還元剤（２−メルカプト エタノールまたはジチオトレイトール）存在下または不存在下にドデシル硫酸ナ トリウムを含有する８〜２５％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測 定した分子量５８．０００±ｓ、ｏｏｏ、エンドグリコシダーゼ（Ｎ−グリカナ ーゼ）による処理後の分子量２’３，０００±５，０００のサブユニットが１個 の糖タンパク質である。 （ｍ）等電点８．６〜９．３である。 （ｎ）１次アミノ酸配列は、第１０図、第１１図および第１５図に示す通りであ る。 （０）第１０図、第１１図および第１５図に示すヌクレオチド配列によってフー ド化されている。 （ｐ）特異活性１〜２Ｘ１０″ユニツト／ｊＩ９（５０ユニツトとは、１酎中で Ｍ１骨髄性白血病細胞によるクローン形成の５０％の減少を導＜ＬＩＦの量であ ると定義する）である。 （ｑ）第１９図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位によって制限処理された マウス染色体１１上の特有の遺伝子によってコード化されている（マウス／チャ イニーズ・ハムスター卵巣体細胞ハイブリッドのパネルの分析により決定）。 （ｒ）第２７図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位によって制限処理された 染色体ＤＮＡ中のヒト遺伝子配列と相同である。 ヒトＬＩＦは、天然および／または酵母誘導組換体の以下のような生物学的性質 を有する分子である： （ａ）マウス骨髄性白血病細胞系Ｍ１の細胞において、増殖能の喪失およびクロ ーン原白血病細胞の死滅を伴ってマクロファージ分化を誘導する。 （ｂ）顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球系の正常ヒト前駆細胞の増 殖を促進する能力は無い。 （ｃ）Ｇ−Ｃ３Ｆと組み合わせると、ヒト白血病細胞系Ｕ９３７の細胞の増殖を 部分的に抑制し、ＧＭ−Ｃ５Ｆと組み合わせると、ヒト白血病細胞系Ｕ９３７お よびＬＨ５Ｑの増殖を抑制する能力を有する。 （ｄ）Ｍｌ細胞およびマウスマクロファージのマウスＬＩＦレセプターに特異的 に結合し、そのような細胞に対するマウス１−６１　ＬＩＦの結合と完全に競合 する。 （ｅ゛）ヒト肝癌細胞系Ｈｅｐ−２Ｇの特異的細胞レセプターに結合する。 ヒトＬＩＦは、以下のような性質をも有する：（ｆ）成熟タンパク質中のアミノ 酸残基の約８０％がマウスＬＩＦと同じである。 （ｇ）１次アミノ酸配列は、第２５図、第２６図および第２９図に示す通りであ る。 （ｈ）第２７図に示すように制限エンドヌクレアーゼ分解部位によって制限され た染色体ＤＮＡ中特有の遺伝子によってフード化されている。 （ｉ）遺伝子配列の一部として、第２５図に示すヌクレオチド配列を有する。 本発明の第１の態様においては、白血病抑制性因子（ＬＩＦ）を実質的に純粋な 形態で提供する。本発明は、実質的に純粋なＬＩＦの製法、とりわけ、クレブス ■腹水癌細胞から精製することによる実質的に純粋なマウスＬＩＦの製法、およ びヒト膀胱癌細胞系５６３７（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＴＢ９）から精製することによ る実質的に純粋なヒトＬＩＦの製法をも提供する。実質的に純粋なＬＩＦは、Ｌ ＩＦのアミノ酸配列またはその一部をコード化する組換ＤＮＡ分子を含む酵母細 胞、哺乳動物細胞および大腸菌のような宿主細胞から製造することもできる。 本発明において、「実質的に純粋な形態」とは、適当なドデシル硫酸ナトリウム ・ポリアクリルアミドゲルで電気泳動すると、少な（とも９０％が、ＬＩＦ活性 に対応した単一のバンドとして現れるポリペプチドまたはグリコポリペプチドの 形態を意味する。 他の態様においては、完全にまたは部分的にＬＩＦタンパク質をコード化するヌ クレオチド配列を有する組換ＤＮＡクローンの単離方法を提供する。本発明は、 ＬＩＦ固有のアミノ酸配列をコード化し、更に、ＬＩＦの完全なアミノ酸配列を 推定させるヌクレオチド配列にも関する。 更に他の態様においては、本発明は、ＬＩＦ（または実質的に同様のその類縁体 ）をコード化する前記ヌクレオチド配列を完全にまたは部分的に有し、そのヌク レオチド配列がＬＩＦを完全にまたは部分的に合成および製造できる形態である 組換ＤＮＡ分子にも関する。本発明のこの態様は、クローニングベクター（例え ばプラスミド）および前記組換ＤＮＡ分子が挿入された宿主細胞にも関する。 更に、本発明は、前記組換ＤＮＡ分子の発現またはペプチド合成によって、完全 もしくは部分的に合成されたＬＩＦ、または実質的に同様のその類縁体にも関す る。 発明の詳細な記載 ＬＩＦに関する本発明の研究において、とりわけマウスおよびヒト由来のこの糖 タンパク質の他の原料を、臨床的用途および他の用途に使用可能にするという観 点から、クレブス■腹水癌細胞から有効な精製方法によってマウスＬＩＦを精製 し、これを、この因子の化学的または生合成的製造のための最初の過程として、 部分的なアミノ酸配列分析に付した。 レセプター競合アッセイにおいて、Ｉ′″５で放射性ラベルしたしＩＦを使用し て、ＬＩＦを合成および製造するマウスおよびヒト由来の細胞および組織を同定 した。この試験の結果、これらの原料の１種のｍＲＮＡによるＤ　Ｎ　Ａコピー の組換ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、予め決定したマウスＬＩＦアミ ノ酸配列の部分をコード化する放射性ラベルされたオリゴヌクレオチドと共にハ イブリッド形成することによって、マウスＬＩＦ−コード化クローンを同定し、 そのマウスＬＩＦｃＤＮＡクローンをヌクレオチド配列分折に付した。更に、ク ローン化マウスＬＩＦコード化配列を、ハイブリッド形成プローブとして使用し て、マウスＬＩＦ類縁体をコード化するヒト遺伝子を同定し、前記種交差性ハイ ブリッド形成を有効に行うことのできるハイブリッド形成条件を確立した。その 結果、ヒトのマウスＬＩＦ類縁体をコード化するＤＮＡ配列を有する組換ＤＮＡ クローンが同定された。 このようなＬＩＦ−フード化配列の確立の結果、クローン化されたマウスまたは ヒトのＬＩＦ−コード化Ｄ　Ｎ　Ａ配列を用いて、培養哺乳動物細胞、酵母また はバクテリアにおいてクローン的に純粋なＬＩＦを完全にまたは部分的に合成す るための組換ＤＮＡ分子が構成された。本発明は、このようにして製造される実 質的に純粋なしＩＦにも関する。 本発明の一態様においては、本発明は、酵母細胞、繊維芽細胞および大腸菌にお けるクローン化されたヒトおよびマウスのＬＩＦ遺伝子の発現、そのように発現 するためのクローン化遺伝子の修飾、並びに組換ヒトおよびマウスＬＩＦの生物 学的および生化学的性質の確立に関する。 この態様においても、本発明は、完全にまたは部分的にヒトまたはマウスＬＩＦ （または実質的に同様のその類縁体）をコード化するヌクレオチド配列を有し、 そのヌクレオチド配列により酵母細胞、繊維芽細胞または大腸菌において完全に または部分的にヒトまたはマウスＬＩＦが合成および製造される形態の組換ＤＮ Ａ分子に関する。本発明は、クローニングベクター（例えばプラスミド）および 前記のような組換Ｄ　Ｎ　Ａ分子を挿入された宿主細胞をも提供する。更に、本 発明は、酵母細胞におけもそのような組換ＤＮＡ分子の発現によって、完全にま たは部分的に合成されたヒトまたはマウスＬＩＦ、または実質的に同様のその類 縁体にも関する。ＬＩＦに関する本発明の研究の一態様において、ヒトおよびマ ウスＬＩＦ遺伝子配列を修飾し、酵母発現ベクターＹ　Ｅ　ｐｓｅｃｌに組み入 れた。酵母細胞は、その組換体で形質転換され、そのように形質転換された酵母 細胞のならし培地は、天然ヒトおよびマウスＬＩＦと同様の生物学的性質を有す る因子を含有することがわかった。 骨髄性白血病患者および感染症患者の処置におけるＬＩＦの使用の可能性の観点 から、本発明は、完全または部分的に、例えばクローン化ＬＩＦ−コード化ＤＮ Ａ配列を用いてまたは化学的合成によって製造されたＬＩＦ、とりわけヒ）ＬＩ Ｆを含有する薬剤組成物、並びに例えば化学合成によって、または前記クローン 化しＩＦ−コード化ＤＮＡ配列の突然変異によって製造されたＬ　１−Ｆ類縁体 の薬剤組成物にも関する。本発明の薬剤組成物は、少なくとも１種の他の生物学 的血球レギュレーター、例えばＧ−Ｃ３ＦまたはＧＭ−Ｃ８Ｆをも含有し得る。 更に、本発明は、血球形成疾患、例えば白血病および感染の疑いのある先天性疾 患におけるヒトＬＩＦ遺伝子の関連した遺伝子移動、変化または障害の検出に使 用するための診断用試薬にも関する。 実施例１ 第１〜５図は、以下に記載する精製法の種々の工程に関し、各分別工程における ＬＩＦの貯留部およびその純度を示す。 工程２に関する。バーは、工程３のためにプールされるフラクシヲＬＩＦの精製 の工程３に関する。バーは、工程４のためにプールされるフラクションを示す。 第３図：ＣＭ−セファロースＣＬ−６ＢによるＬＩＦの精製の工程４に関する。 バーは、工程５のためにプールされるフラクションを示す。 第４図：脂肪酸分析ＨＰＬＣカラムによるＬＩＦの精製の工程５に関する。アセ トニトリル３９．６〜４１．３％のフラクションをブー２５妬ポリアクリルアミ ドＳＤＳゲル上の、タンパク質標準（分子量９３．０００；６７．０００；４３ ，０００；３０，０００；２０゜０００および１４．０００）および精製ＬＩＦ （２調製）の泳動を示す。タンパク質および生物学的活性はいずれも分子量５８ ．０００のタンパク質に関連している。 工程１ クレブス■癌細胞（ＩＸ６＠）を、Ｃ５７Ｂ１６／６ｆｊ／ＷＥＨＩマウスに腹 腔内注射し、７日後にマウスを殺し、腹水を採った。細胞を遠心し、大腸菌リポ ポリサッカライド（２００ｎｇ／　ｙｔ（１’）を含有するダルベック改良イー グル培地に細胞５Ｘ１０＠個／Ｍ（ｌを再懸濁させ、空気中にｃｏ、を１０％含 有する湿式インキュベーターで３７℃で２４時間インキュベートする。細胞を再 び遠心し、ならし培地を採り、アジ化ナトリウムを０．０２％（ｖ／ｖ）とし、 ４°Ｃで貯蔵する。アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｄ　Ｃ２Ａ濃縮器でＨＩ　Ｐ　１ ０−８中空繊維カートリツジを用いてならし培地３６１２を１００３１１２に濃 縮し、ｌａＭフェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）、アジ化ナトリウ ム（０，０２％ｖ／ｖ）およびトウィーン（Ｔｖｅｅｎ）２０　（０，０２％ｖ ／ｖ）を含有するｐＨ８，０の１０＋ａＭ）リス−）（ＣＩ２緩衝液に入れ、ア ミコン撹拌容器でＹＭ−１０メンプラン上で再び２０ＲＱに濃縮する。 濃縮物を、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ［ファル マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］のカラム（２，５Ｘ　３０ＣＩ）ｌこ通し、平 衡緩衝液２００１１Ｑおよび次いで同じ緩衝液中の０．３ＭまでのＮａＣＱ直線 勾配４００１ｆｆで溶出する。流速は２５１１２／時であり５゜８１（ｌのフラ クションを集めて、アツセイに付す。（第１図参照）工里１ 勾配前段階でゲルに結合せず、マウスＭ１細胞に対する活性を有するタンパク質 のワラクシ１ンをプールし、ＹＭ−１０メンプランで濃縮し、１ｒｎＭ　ＭｇＣ Ｑｔ、１＋ｎＭ　ＰＭＳＦ、０．２％アジ化ナトリウムおよび０．０２％トウイ ーン２０を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に入れ、同 じ緩衝液で平衡化したレンチル・レクチン−セファロース４（ファルマシア）の カラム（ＩＸ４　ｃｍ）に通す。カラムを、平衡緩衝液２５ＭＱおよび次いで同 じ緩衝液中の０．５Ｍまでのα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド直線勾配置００ ｊＩＱで、流速１０１Ｃ／時で溶出する。３峠のフラクションを集め、アッセイ に付す。（第２図参照） 毛橡土 ゲルに結合し、糖で溶出され、Ｍ１細胞に対する活性を有するタンパク質のフラ クションをプールし、濃縮し、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、０゜０２％アジ化ナトリウム および０．０２％トゥイーン２０を含有する１１００ｅ酢酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ５，０）に入れ、同じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ ファルマシア）のカラム（１，ＯＸ４．Ｏｃｍ）に通す。カラムを、平衡緩衝液 ２５峠および次いで同じ緩衝液中の１．０ＭまでのＮ　ａ　ＣＱ直線傾斜１００ 峠および次いでＮａＯＨでｐＨ１０に調節した１、ＯＭ　ＮａＣｌ２２５１１２ で溶出する。流速は２　、　Ｏ１１１時であり、３．０ＩＱのフラクションを集 める。 （第３図参照） 工程５ ゲルに結合し、ＮａＣｌ２勾配で溶出され、Ｍ１細胞に対する活性を有するタン パク質のフラクションをプールし、ＹＭ−１０メンプランで２ＲＱに濃縮し、０ ．０２％トウイーン２０を含有する２０１１１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ ５，０）に入れ、０．４５μミリ’ｔ’７　（Ｍｉｌｌ　１ｐｏｒｅ）・フィル ターで濾過する。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）脂肪酸分析カラムおよび勾配プ ログラマ−付き二重ポンプを取り付けた高速液体クロマトグラフィー装置［ベッ クマン（Ｂｅｅｋｍａｎ）］のイインジャフタにプールを入れる。カラムを、ト リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０゜１％（％／ｖ）を含有する水で平衡化し、試料を 注入し、次いで水およヒ０．１％ＴＦＡ中の３４．８％（Ｖ／Ｖ）までのアセト ニトリル５分直線勾配でカラムを溶出し、次いで水および０．１％ＴＦＡ中の４ ９゜８％（ｖ／ｖ）までのアセトニトリル５０分直線勾配で溶出する。流速はｌ 　１９１分であり、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム５０μＱおよび０．４％ト ウイーン２０を含有するポリプロピレンチューブ内に１１Ｑのフラクションを集 める。（第４図参照）工程５で得られた、Ｍ１細胞に対して活性を有するフラク ションは、２つの重複する紫外吸収ピークを有していた。それぞれのピークは、 Ｍ１細胞に対する活性に関連しており、それぞれ銀染色法によるドデシル硫酸ナ トリウム・ポリアクリルアミドゲル上のＭ　ｒ　５８．０００の単一のタンパク 質バンドに対応していた。各場合において、（ＬＩＦも存在する）ゲルの平行の トラックを１ｍｍのストリップに切断し、ゲルストリップからタンパク質を抽出 し、抽出したタンパク質の、半固形寒天培地面内のＭ１細胞に対する増殖抑制お よび分化誘導能力をアッセイして評価することにより、Ｍｒ５８゜０００のタン パク質バンドがＭ１細胞に対して生物学的活性を有していることがわかった。（ 第５図参照）実施例２ 以下の実施例は、Ｎ−末端アミノ酸配列、およびトリプシンまたはブドウ球菌Ｖ ８プロテアーゼによるタンパク質分解によって生じる種々のペプチドのアミノ酸 配列を調べる工程を説明する。 実施例１の操作によって精製したＬＩＦ（１’５μｇ）を、ブラウンリー（Ｂｒ ｏｓｎｌｅｅ）　ＲＰ　３　Ｑ　Ｑビーズ（Ｃ８）を充填したミクロボア（２ｍ ｍ）カラムに通し、ＨＰＬＣ系において０．１％トリフルオロ酢酸中の０〜６０ ％アセトニトリル直線勾配で溶出した。タンパク質は、１００μｇの体積で単一 のピークとして溶出された。これを、ガラスファイバーディスクに適用し、乾燥 させ、次いで、アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅ＋ｎ）　（モデル４７０Ａ）気相タンパク質シークエンサーのシーフェンス室 に入れた。エドマン法によりタンパク質の配列分析を行い、個々のアミノ酸のフ ェニルチオヒダントイン誘導体を、アプライド・バイオシステム１２ＱＡ　ＰＴ ＨアナライザーでＨＰＬＣによって同定した。 前記操作により精製したＬＩＦの別の試料（２０μｇ）を、６Ｍグアニジン塩酸 塩、０．２Ｍ）リスーＨＣＩ２緩衝液（ｐＨ８，５）、２ｍＭジチオトレイトー ルで希釈して２１１Ｑとし、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、３０ 倍モル過剰のヨード酢酸を加え、溶液を３７℃で更に１５分間インキュベートし た。溶液を同じミクロボアＨＰＬＣカラムに通し、前記のように溶出した。還元 され、カルボキシメチル化されたＬＩＦ誘導体（ＲＯＭ−ＬＩ　Ｆ）は、未処理 ＬＩＦの３分後にカラムから溶出され、ＲＯＭ−ＬＩＦ　（２００ｕＱ”）を、 ０．０２％トウイーン２０．１ｍＭｃａｃｆｆｔおよびＴＰＣＫ−処理トリプシ ン２μｇを含有する０、１Ｍ）リスーＨＣＱ緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈して１ ｊｌＱとした。これを３７℃で１８時間インキユベートシ、混合物を再びミクロ ボアカラムに入れ、前記と同様に溶出した。個々のペプチドはυＶ吸収ピークと してあられれ、個々に集めた。これらのペプチドのいくつかは、前記と同様に直 接配列分析に付したが、他のものは同じカラムで０．９％ＮａＣｆｆ（ｐＨ６， ０）中の０〜６０％アセトニトリル勾配を用いて再精製した後に配列分析に付し た。 ＲＯＭ−Ｌ　Ｉ　Ｆの別の試料（２００μＱ＝１０μｇ）を、０１００２Ｍ　Ｅ ＤＴＡおよび０．０２％トゥイーン２０を含有する０、０５Ｍリン酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ７，８）で希釈して１１１２とし、黄色ブドウ球菌ｖ８プロテアー ゼ２μｇにより３７℃で１８時間分解した。反応混合物を同じミクロボアカラム に通し、前記のように溶出した。 ＬＩＦを同定する、アミノ末端からの２６個のアミノ酸の配列は以下の通りであ る： Ｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−＋　１ｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｘ−Ａ 　１　ａ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ａ　ｌａ−１１ｅ−Ａ　ｒｇ　−ＨPｓ−Ｐｒ ｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｎｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−＋１ ｅ−Ｌｙｓ数種のトリプシンペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである＝１、 　Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ −Ｇｉｎ−＋１ｅ−Ｌｙｓ２、　Ｎｅｔ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｙｒ　＝３、　Ｇ ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−＾５ｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　−４、Ｌｅ ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙ ｓ５、　Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ− Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ６、　Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｉ ｎ−Ｌｅｕ’−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ ７、　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−８、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ −Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ −Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ ９、　Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ ｌ　０、　Ｇｉｎ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｇｉｎ−Ａ ｌａ−Ｐｈｅｖ８プロテアーゼによるＬＩＦの分解によって生じるペプチドのア ミノ酸配列は以下の通りであった： Ａ　１ａ−Ｐｈｅ−Ｇ　１　ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ− Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｔ■@ｒ−Ｔｙ　ｒ− Ｌｙｓ−ＧＩｎ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＶａＩＧＩｎ−Ａ ｌａ−Ｐｈｅ実施例３ 以下の実施例は、放射性ラベルしたＬＩＦを得るため、およびレセプター競合ア ッセイによってＬＩＦ原を同定するための工程を説明する。 第６図は、実施例３に関する２０°Ｃにおける、放射性ヨウ素化純Ｌ　Ｉ　Ｆ　 （２Ｘ　１０’ｃｐｍ／ｎｇ）の、Ｍ１骨髄性白血病細胞への結合。 競合因子の存在下または不存在下に、Ｍｌ細胞（５Ｘ１０”）を１１５１−Ｌ　 Ｉ　Ｆ　（４Ｘ　１０’ｃｐｍ）と２時間インキュベートし、その後、ウシ胎児 血清の遠心によって、結合した放射能を未結合放射能から分離した。Ａ、非標識 純ＬＩＦおよび競合因子としての純Ｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ ３ＦまたはＭ−Ｃ３Ｆの、所定の希釈における滴定（各希釈１０μＱを加えて最 終体積８０μＱとした）。 最高濃度は、それぞれ１０’ユニット／ｍＱ：　３．５Ｘ　１０’ユニット／ｊ ＩＩ２；３×１０４ユニット／１１ｇ；５ｘ１０４ユニツト／ｌ（！：４Ｘ１０ ４ユニット／ＭＱであった。Ｂ、純ＬＩＦまたはりボポリサッカライド（Ｌ　Ｐ 　Ｓ）または種々の細胞の濃縮（４〜８倍）ならし培地または内毒素注射マウス の血清の、前記１″’Ｉ　−Ｌ　Ｉ　ＦのＭ１細胞への結合を競合する能力。 クレブス■腹水細胞ならし培地から実施例１に記載のように精製したＬＩＦを、 文献に記載の方法でチロシン残基においてｌ！Ｊで放射性ラベルし［ニコラ（Ｎ ｉｅｏｌａ、　Ｎ、Ａ、）およびメトカルフ、ジャーナル・サブ・セルラー・フ ィジオロジ−（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１２８：１８０〜１８ ８．１９８６］、比放射能的２　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／ｎｇ（７）”Ｊ　−Ｌ　 Ｉ　Ｆを調製した。”’１−Ｌ　Ｉ　Ｆは、Ｍ１骨髄性白血病細胞並びにマウス 成熟骨髄、肺臓、胸腺および腹腔滲出細胞に特異的に結合した。細胞オートラジ オグラフィー分析により、ｌ！Ｊ−ＬＩＦは、マクロファージおよびその前駆細 胞（細胞の成熟につれてレセプター数が増加する）のみに特異的に結合し、他の 造血細胞には結合しなかったことがわかった。このことは、ＬＩＦが、種々の疾 病におけるマクロファージ機能の調節のための臨床的適用に有用であり得ること を示唆している。”’Ｉ　−Ｌ　Ｉ　ＦのＭ１骨髄性白血病細胞および腹腔マク ロファージへの特異的結合は、非標識ＬＩＦによって阻害されたが、他の造血成 長因子、例えばＧ−ＣＳ　Ｆ。 ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−ＣＳＦ　（Ｃ５Ｆ−１）　、Ｍｕｌｔｉ　ＣＳＦ　（インタ ーロイキン３）、インターロイキン１．２．４．６、内毒素または他の血成長因 子によっては阻害されなかった（第６図参照）。細胞ならし培地または細胞抽出 物は、そのような細胞へのＩ−Ｊ　ｌ。 ＩＦの結合を阻害する能力を有するので、種々の細胞および組織によって製造ま たは貯蔵されるＬＩＦの存在を特異的アッセイすることができる。例えば、レク チン活性化ＬＢ３　Ｔ細胞のならし培地は、”’Ｉ−ＬＩＦのＭ１細胞に対する 特異的結合を強力に阻害したので、ＬＢ３細胞はＬＩＦを製造することがわかる 。 実施例４ 以下の実施例は、マウスＬＩＦをフード化するｍＲＮＡのクローン化相補的ＤＮ Ａコピーを得るための工程を説明する。 第７〜１０図は、以下に記載する方法の種々の工程に関する。 第７図：ＬＩＦｃＤＮＡクローンのクローニングの工程１に関する。 レクチン・コンカナバリンＡ刺激による、ＬＢ３細胞の細胞質における造血成長 レギユレーターのｍＲＮＡの蓄積。ＷＥＨＩ−３ＢＤ−細胞の細胞質ポリアデニ ル化ＲＮＡ　（５μｇ）（トラック１）、５μｇ／ｌ（ｌコンカナバリンＡを用 いて１０”細胞／Ｒ（ｌとして５時間培養したＴ細胞クローンＬＢ３細胞（トラ ック２）、および非刺激ＬＢ３細胞（トラック３）を、ホルムアミドアガロース ゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移し、Ｓ″Ｐ−ＧＭ−Ｃ５Ｆプローブ （パネル１）または”Ｐ　−Ｍｕｌｔｉ−ＣＳ　Ｆプローブ（パネルｂ）とハイ ブリッド形成した［ケルン（Ｋｅｌｓｏ、　Ａ、）　、メトカルフおよびゴー（ Ｇｏｕｇｈ、　Ｎ、Ｍ、）　、ジャーナル・サブ・イムノロジー（Ｊ、　ｌ＋ｎ ｍｕ：ＬＩＦクローンの同定に使用した合成オリゴヌクレオチ°ド。Ｎ−末端近 傍のマウスＬＩＦアミノ酸の部分（残基１５〜２６、実施例２参照）を最初の行 に示し、このペプチドをフード化するｍＲＮＡ配列の可能な組み合わせを次の行 に示し、このｍＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを下行に示す 。Ｃｙｓ１７およびＨｉｓ１８を除く全てのアミノ酸残基について、このオリゴ ヌクレオチドは、哺乳動物コード化領域に最も頻繁に使用されるコドンのみに相 補的である［グランサム（Ｇｒａｎｔｈａｍ、　Ｒ，）ら、ヌクレイツク・アシ ッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、９４３〜７３． １９８１］。Ｃｙｓ１７については、この配列はいずれのコドンにも相補的であ る。Ｈｉｓ１８については、このオリゴヌクレオチドは、頻度の低いＣＡＵフド ンに相補的である。隣接するＧｌｙコドン（頻度の低いＣｐＧジヌクオレオチド ）と共に、ＣＡＣフドンが用いられることはないと考えられた［シ二ヴアルツ（ Ｓｗａｒｔｚ、　Ｍ、　Ｎ、　）ら、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミ ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ：第８図に示すオリゴヌクレオチドとのハ イブリッド形成によるＬＩ　Ｆ　ｃ　ＤＮＡクローンの同定。 第１０　図：　Ｌ　Ｉ　Ｆ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンのクローニングの工程５に 関する。：　ｃ　Ｄ　Ｎ−ＡクローンｐＬＩＦ７．２ｂのヌクレオチド配列およ びＬＩＦアミノ酸配列配列ＲＮＡＲＮＡ類似列を、前記ＬＩＦの予想したアミノ 酸配列と共に５°から３゛に記載する；行の端の数は、その行の最後の残基（ア ミノ酸またはヌクレオチド）の位置を示す。 アミノ酸配列は、このクローンにおいてコード化された最初の残基から連続して 番号を付けた。タンパク質分析により決定したアミノ酸配列の領域には上線を付 した；これら２つの間には不一致がない。 Ｐｒｏ９は、直接アミノ酸分析（実施例２）により決定されたＮ−末端残基であ った。Ｎ−結合グリコシル化の可能性のある７個の部位は星印で示し［ノイバー ガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、　Ａ、　）ら、グリコプロテインズ（Ｇｌｙｃｏｐ ｒｏｔｅｉｎｓ）　、ゴットシャルク（Ｇｏｔｔｓｅｈａｌｋ、　Ａ、）編、エ ルセヴイール、アムステルダム、４５０〜４９０頁、１９７２コ、ｏ−結合グリ コシル化の可能性のある４個の部位は井桁部で示す［タカハシ（Ｔａｋａｈａｓ ｈｉ、　Ｉ！、）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サ ブ・サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　、米 国、８１　：　２０２１〜２０２５．１９８４コ。 Ｉｆｆｆｉ↓：　ＬＩ　ＦｍＲＮＡ含有ＲＮＡの調製クローン化マウスＴ細胞系 ＬＢ３の細胞［ケルンおよびメトカルフ、エクスペリメンタル・ヘマトロジ−（ Ｅｘｐｔｌ、　）ｌｅｍａｔｏｌ、）　、１３ニア〜１５．１９８５］を、レク チン・フンカナバリンＡで６時間刺激して、造血細胞の成長および分化を調整す る種々の因子をコード化するｍ　ＲＮ　Ａの細胞質における蓄積を向上した［ケ ルン、メトカルフおよびゴー、ジャーナル・サブ・イムノロジー、１３６：１７ １８〜１７２５．１９８６］。（例えば、第７図は、そのような刺激により、細 胞中における造血成長因子ＧＭ−Ｃ８ＦおよびＭｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆをコード化す るｍＲＮＡの製造が上昇することを示す。 ）細胞質ＲＮＡは、文献に記載の方法［ゴー、ジャーナル・サブ・モレキュラ− ・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、１６５　：　６８３〜３９ ９．１９８３］で、５Ｘ１０＠コンカナバリンＡ−刺激ＬＢ３細胞から調製した 。ポリアデニル化ｍＲＮＡ分子は、標準的な方法［マニアティス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、　Ｔ、）ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１， ｏｎｉｎｇ）　、コールド・スプリング・／１−／＜　−（ＣＯＩｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、二ニーヨーク、１９８２コにより、２サイクルのオリ ゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーによりリポソームＲＮＡから分取した。 後に、ノザン分析により、ＧＭ−Ｃ３ＦおよびＭｕｌｔｉ−Ｃ３ＦのｍＲＮＡと は異なり、Ｌ　Ｉ　ＦｍＲＮＡは、ＬＢ３細胞中に構成成分として存在し、その 量はコンカナバリンＡ刺激により向上しないことがわかった［ギアリング（Ｇｅ ａｒｉｎｇ、　Ｄ、Ｐ、）ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オ ーガニゼーション・ジャーナル（Ｅグ 前記のように調製したＬＢ３ｍＲＮＡの２本鎖ＤＮＡコピーを標準的な方法［マ ニアテイスら、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ− 、ニューヨーク、１９８２およヒコーら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３ ０９　：　７６３〜７６７．１９８４コで合成した。トリ骨髄芽球症ウィルス逆 転写酵素で触媒され、オリゴ−ｄＴを用いる反応において、細胞質ポリアデニル 化ＬＢ３ｍＲＮＡ１０μｇを、１本鎖相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）合成の鋳型と して使用した。この反応の完了後、０．３Ｍ　ＮａＯＨ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で ６５℃で１時間インキュベートすることによってｍＲＮＡを分解した。塩基を中 和し、エタノール沈澱によってｃＤＮＡを回収した後、大腸１１ＤＡＮポリメラ ーゼＩのクレ／ウフラグメントで触媒された反応において、１重鎖ｃＤＮＡを２ 本鎖の形態に変換した。次いで、１本鎖特異的ヌクレアーゼＳ１で処理すること により、ｃＤＮＡの「ヘアピン・ループ」構造を切断し、酵素末端デオキシヌク レオチジルトランスフェラーゼ［マイケルソン（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、　Ａ、輩 、）およびオーキン（Ｏｒｋｉｎ、　Ｓ−）　、ジャーナル・サブ・バイオロジ カル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、２５７　：１４７７ ３〜１４７８２．１９８２）を用いて、デオキシシチジン残基末端（残基約２０ 〜３０）を２重鎖ｃＤＮＡの各端に付加した。ｄＣ−末端ｃＤＮＡを、１．５％ アガロースゲル電気泳動により分画し、長さ５００ｂｐを越える分子を回収し、 アニーリングしてプラスミドＤＡＮ分子（ｐＪＬ３、ゴーら、ヨーロピアン・モ レキュラー・バイオキシグアノシン残基末端を付加した（マイケルソンおよびオ ーキン、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー、λ互ｌ：１４７７ ３〜１４７８２．１９８２）。末端付加ｃＤＮＡおよびプラスミド分子を文献に 記載の方法でアニーリングし［ゴーら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅａ＋ １ｓｔｒｙ）　ｓ　１９　：　２７０２〜２７１０．　１９８０］、アニーリン グしたｃＤＮＡ／プラスミド混合物で大腸菌ＭＣ１０５０［カサダバン（Ｃａｓ ａｄａｂａｎ、　Ｍ、　）およびコーヘン（Ｃｏｈ独立して形質転換されたバク テリアコロニーを、１０μｇ／＊Ｑアンピシリン含有寒天プレート上で増殖させ て選択した。５０μｇ／＊Ｑアンピシリン含有液体増殖培地で洗浄することによ り、形質転換したバクテリアコロニーを寒天プレートから回収し、１０％グリセ ロール中の１０個のプールとして一７０℃で貯蔵した。 工程３：オリゴヌクレオチド・プローブのデザインＬＩＦのアミノ末端の２６個 のアミノ酸配列と、トリプシンおよびｖ８プロテアーゼによるＬＩＦ分解により 生じる１１の異なるペプチドの残基とを決定した（実施例２参照）。これらのア ミノ酸配列は、Ｌ　Ｉ　ＦｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンを同定するため のハイブリッド形成プローブとして使用する、ＬＩＦをコード化するｍＲＮＡの 特定の領域に相補的なオリドヌクレオチドのデザインの基礎を供給した。 各天然アミノ酸は、その対応するｍＲＮＡにおいて、３個のりボヌクレオシドト リホスフェートの特定の組み合わせ（コドン）によりフード化される［例えば、 ワトソンＱａｔｓｏｎ、　Ｊ、）　、モレキュラー・バイオロジー・サブ・ザ・ ジーン□１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｔｈｅＧｅｎｅ）　、第 ３版、ベンジャミン／カミングス（Ｂｅｎ３ａｍｉｎ／Ｃｕｍｍ１ｕｓ）、メン ｏ−パーク（Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ）　、カリフォルニア、１９７６）：１゜あ るアミノ酸は、唯一のコドンによってのみ特定されるが、６種ものコドンによっ て特定されるアミノ酸もある（例えば、前掲のワトソン、モレキュラー・バイオ ロジー・サブ・ザ・ジーン）。従って、ヌクレオチド配列の多数の異なる組み合 わせが実際に特定のアミノ酸配列をコード化するので、そのペプチドをコード化 し得るすべての可能な配列を提供するためには多数の異なる退化オリゴヌクレオ チドが構成される必要がある。しかし、高度に退化したオリドヌクレオチドをハ イブリッド形成プローブとして使用することは技術的に困難である。しかし、特 定のアミノ酸のためにすべてのコドンが等しい頻度で用いられているのではなく ［グランサムら、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ、９４３〜７３．１９８１ ］、哺乳動物のゲノムにおいてＣｐＧジヌクレオチドは表現不十分であり、塩基 組み合わせから予想される頻度の２０〜２５％しか起こらない［シュヴアルッら 、ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリー、スｌ多：１９６１〜１９ ６７．１９６２コので、特定のペプチドをコード化するあり得るヌクレオチド配 列を予測し、特定のオリドヌクレオチドプローブの複雑さを軽減することがしば しば可能である。前記のように考慮して、異なるＬＩＦペプチドに対応する多数 のオリゴヌクレオチドを標準的な方法によってデザインおよび合成した。 工程４：ＬＩＦ−コード化クローンのＬＢ３ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ ング オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成によってバクテリアのコロニ ーをスクリーニングするために、前記ＬＢ３ｃＤＮΔライブラリーの各プールか らの１０，０００〜１５．０００個のバクテリアコロニーを寒天プレート（５０ μｇ／ｗＱ了ンピシリン含有）上で増殖させ、ニトロセルロースフィルターディ スクに移し、フィルターを２００μｇ／肩ρクロラムフェニコール含有寒天フレ ート上でインキュベートすることによって増幅した［ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ ＋Ｄ、）およびメセルソン（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、　Ｍ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ ）　、１追：６３〜６７．１９８０］。コロニーを元のプレート上で再増殖させ た後、第２のニトロセルロースフィルターを前記のように調］した。 このマスタープレートを短時間増殖させ、次いで４℃で貯蔵した。 プラスミドＤＮＡをバクテリアコロニーから遊離し、前記のようにニトロセルロ ースフィルターに固定シた（マニアテイスラ、モレキュラー−クローニング、コ ールド・スプリング・ハーバ−１二ニーヨーク、１９８２）。ハイブリッド形成 の前に、０．９Ｍ　ＮａＣＱ、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．２％フイコ ル、０．２％ポリビニル−ピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン、５０μｇ ｌｘＱ熱変成サケ精子ＤＮＡ、５０μｇ／ｘＱ大腸菌ｔＲＮＡＳＯ，ＩＭ　ＡＴ Ｐおよび２ｍＭピロリン酸ナトリウム中でフィルターを３７℃で数時間インキュ ベートした。０．１％ＮＰ４０を更に添加した同じ溶液中で、３７℃で１８時間 ノ＼イブリッド形成を行った。ポリヌクレオチドキナーゼによって触媒され、［ γ−”Ｐ］　ＡＰ７５００μＣ１（比活性２．ＯＯＯ〜３，０ＯＯＣｉ／ｍｍｏ （りを含有する反応において、第８図に示す合成オリゴヌクレオチド５００ｎｇ を放射性ラベルした。次いで、ＮＡＣＳ−ＰＲＥＰＡＣカラム［ベテスダ・リサ ーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）　］をその製造者の指示に従って使用したイオン交換クロマトグラ フィーによって、取り込まれなかった［γ−”Ｐ］　ＡＰＴを、放射性ラベルさ れたオリゴヌクレオチドから分離した。放射性ラベルしたオリゴヌクレオチドを 、約２０ｎｇ／ｘｃの濃度でノーイブリッド形成反応に用いた。ハイブリッド形 成後、０．９Ｍ　ＮａＣＱ　、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシ ル硫酸ナトリウム中で種々の温度（以下に記載する）でフィルターを広範囲に洗 浄し、各洗浄後、オートラジオグラフィーに付した。 洗浄を連続的に行うことの背後にある根本原理は、低温において、オリゴヌクレ オチドと少しでも相同性（約１５のヌクレオチド）を有する全てのクローンが２ 重フィルター上にオートラジオグラフィーのスポットとして現れることである。 温度が上昇すると、オリゴヌクレオチドプローブが相同性レベルの低いクローン から融解し、それ故対応するオートラジオグラフィーシグナルが無くなる。相同 性レベルの最も高いクローン（すなわちＬＩＦｃＤＮＡ配列を有する可能性の最 も高いクローン）は、最も高い温度でノーイブリッド形成を保持する。この方法 によって、最も可能性の高いクローンを直接得ることが可能となる。第９図は、 洗浄温度を４６℃から６６℃℃に上昇した際の、１５．０００のＬＢ３ｃＤＮＡ クローンを含有する１対のフィルター上における１組のクローンの挙動を示す。 いくつかのクローンは、低温においてのみオリゴヌクレオチドへのハイブリッド 形成を保持したが、６６°Ｃにおいてもハイブリッド形成を保持したものもあっ た（例えばクローン１および２）。更に分析するために後者のクローンを選択し 、対応するバクテリアコロニーをマスタープレートから取り、生成し、標準的な 方法で各バクテリアクローンからプラスミドＤＮＡを調製した（マニアティスら 、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリング・バーバー、１９８２） 。これらのクローンの予備構造分析（挿入ｃＤＮＡのサイズの評価、種々の制限 エンドヌクレアーゼの切断部位のマツピング、および異なるＬＩＦペプチドに対 応する種々のオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成の試験による）によると 、これらのクローンの各々は実際には同じであった；すなわち、これらは、同じ クロ−ニング例からの異なった単離物であった。従って、唯一のクローンｐＬＩ Ｆ７．２ｂについて更に詳細な分析を行った。 Ｉ橡５：ｐＬＩＦ７．２ｂのヌクレオチド配列の決定ジデオキシ法［サンガー（ Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　）ら、プロシーディンゲス・反応において、アルカリ性 または熱変性２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、そのｃＤＮＡに沿う ベクター（ｐ　Ｊ　Ｌ３）の領域にも、ｃＤＮＡインサート中の配列にも相補的 な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、大腸菌ＤＮＡポリメラ ーゼＩのフレノウフラグメントおよびトリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素をポリ メラーゼとして使用して、クローンｐＬＩＦ７．２ｂのＣＤＮＡ部分のヌクレオ チド配列分析を行った。このように決定したクローンｐＬＩＦ７．２ｂのＣＤＮ Ａ部分の配列を、第１０図に示す。このような分析により、終止コドンによって 中断されていない全ｃＤＮＡに及ぶ唯一の闘訳リーディングフレーム中で、ＬＩ Ｆ分子の種々のペプチドに対して予め決定された全てのアミノ酸配列がわかり得 るので、このクローンが、ＬＩＦ分子をフード化する能力を有するｍＲＮＡのＤ ＮＡコピーを含有することが確認された。しかし、このクローンは、（ａ）５° 末端においてメチオニンコドンによって開始される推定される疎水性リーダー配 列をコード化する領域を伸長せず、（ｂ）３°末端においてイン−フレーム翻訳 終止コドンを含まないので、ＬＩＦコード化領域の完全なコピーを含有する。し かし、成熟タンパク質をフード化する領域の開始を５°末端において伸長するこ とが、予め決定したアミノ末端アミノ酸配列との比較によりわかった（第１０図 のＰｒｏ９残基）。 実施例５ 以下に、マウスＬＩＦコード化領域の全コピーを構成し、このコード化領域を酵 母発現ベクターに挿入し、マウスＬＩＦを製造する工程を説明する。 第１１図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦの発現の工程１に関する：ＬＩＦのＣ −末端アミノ酸配列。ｐＬＩＦ７．２ｂリーデイングフレームのＣ−末端におけ るアミノ酸配列を示し、その下にはブドウ球菌■８プロテアーゼおよびクレブス 腹水癌細胞から精製されたＬＩＦから誘導されるトリプシンペプチドの配列を示 す。後２者のペプチドは、ｐＬＩＦ７．２ｂＬＩＦ配列に更に９個のアミノ酸を 加えたものであり、末端が同じ残基である。クローンｐＬＩＦＮＫ１の対応する 領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、最下行に示し、直接アミノ酸シーク エンシングによって決定されたＣ−末端を確認する。番号付けは第１０図の通り である。 第１２図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦの発現の工程２に関する：酵母発現ベ クターＹ　Ｅ　ｐｓｅｃｌに挿入するｐＬＩＦ７．２ｂｃＤＮＡの再構成。ｐＬ ＩＦ７．２ｂｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列およびそれによってフード化され たアミノ酸配列を上の行に示す。番号付けは第１０図および第１１図に従う。第 ２行および第３行は、それぞれｐＬＩＦ＋ｎｕｔｌおよびｐＬＩＦｍｕｔ２の配 列を示す。星印は、終止コドンを示す。ＹＥｐｓｅｃｌ［バルダリ　（Ｂａｌｄ ａｒｉ、　Ｃ，）ら、ヨーロピアン・モレキユラー・バイオロジー・オーガニゼ ーション・ジャーナル、６　：　２２９〜２３４．１９８７］およびｐＧ’ＥＸ −２Ｔ［スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｄ、Ｂ、）およびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ 、　Ｋ、Ｇ、）　、ジーン、１９８８］中にクローニングするための制限部位（ ＢａｍＨＩ、Ｈ４ｎｄＩ［［およびＥｃｏＲＩ）を示す。最下行には、Ｙ　Ｅ　 ｐｓｅｃｌ中のクルイヴエロミセス・ラクティスのキラー毒素シグナル配列の部 分配列を示す。ＢａｍＨＩ制限部位のＧｌｙ−３ｅｒコ一ド化配列は、シグナル ペプチドによって有効に認識される（バルダリら、ヨーロピアン・モレキユラー ・バイオロジー・オーガニゼーシジン・ジャーナル、旦：２２９〜２３４．１９ ８７）。 第１３図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦ発現の工程４に関する二Ｍ１白血病細 胞の培養における酵母誘導組換ＬＩＦの生物学的活性。 酵母誘導組換ＬＩＦ　（−・−）および精製天然ＬＩＦ−Ａ（−〇−）のＭ１培 養への滴定は、Ｍｌコロニーの分化（パネルＡ）およびコロニー生成の抑制（パ ネルＢ）の同様の濃度依存性誘導を示す。各ポイントは、２培養の平均値を表す 。 第１４図：酵母細胞におけるマウスＬＩＦ発現の工程５に関する二種々の希釈度 における、真正天然マウスＬ　Ｉ　Ｆ−Ａ　（−０−）　、ガラクトースで誘導 されたＬ　Ｉ　Ｆ　ｍｕｔ　ｌ　／　Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃ１組換体を含有する酵母 細胞のならし培地（−・−）およびガラクトースで誘導されていない同じ酵母細 胞の培地（−＋−）の、天然”’Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ａとマウス腹腔細胞上の細 胞レセプターを競合する能力を示す。 工程ｌ：マウスＬＩＦのＣ−末端におけるアミノ酸配列の決定実施例４のｃＤＮ ＡクローンｐＬＩＦ７．２ｂは、マウスＬＩＦｍＲＮＡの不完全なコピーを含有 する。５′末端において、ｃＤＮＡは、Ｎ−末端アミノ酸配列分析によって決定 した最初の残基（第１０図におけるＰｒｏ９）に結合するＮ−末端の８個の残基 をコード化する。しかし、３°末端においては、ｐＬＩＦ７．２ｂは、インーフ レーム翻訳終止フドンを含まないので不完全である。直接アミノ酸シークエンシ ング（実施例２）によって決定された２種のＬＩＦペプチドのアミノ酸配列の調 査により、ｐＬＩＦ７．２ｂは３°末端においてコード化領域のわずかに２７の ヌクレオチドを欠くことが示唆された。第１１図に示すように、ｖ８−誘導ペプ チドは、ＣＤＮＡ配列の残基ＡＩａ１６２に始まり、９個の残基によってｃＤＮ Ａクローンから推測されるアミノ酸配列に至っていた。ｖ８ペプチド中に含まれ るトリプシンペプチドの末端が同じ残基であり、このことは、Ｐｈｅ１８７がタ ンパク質のＣ−末端残基であることを示唆している。この推定を確認するために 、ｐｔ、Ｉｐ７，２ｂと重複し、３゛方向に伸長するＬＩＦｃＤＮＡクローンを 単離し、ヌクレオチド配列分析に付した。 そのようなりローンを単離するための適当なｃＤＮＡライブラリーを構成し、ス クリーニングするために、ノザン法により一連の異なるｍＲＮＡ試料をスクリー ニングして、Ｌ　Ｉ　ＦｍＲＮＡ分子濃度が最高であるＲＮＡ試料を同定した。 実質的に文献に記載の方法（ゴー、ジャーナル・サブ・モレキユラー・バイオロ ジー、１６５：６８３〜６９９．１９８３）で調製した細胞質ポリアデニル化Ｒ ＮＡを、２０ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）　、５ｍＭ酢酸ナ トリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，０）および６％ｖ／ｖホルムアルデヒ ドを含有する１％アガロースゲル上で分画し、ＲＮＡ含有フィルターを、０゜２ ％フイコル、０．２％ポリビニル−ピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン、 ２ｍＭピロリン酸ナトリウム、ｌ　ｍＭ　ＡＴ　Ｐ、　８０　ｕ　ｇ／ｘ（ｌ変 性サケ精子ＤＮＡおよび５０μｇ／ｚＱ大腸菌ｔ　ＲＮＡを含有する２ＸＳＳＣ に、６７℃で数時間浸漬した。０．１％ＳＤＳを加えた同じ緩衝液中で６７℃で ハイブリッド形成を行った。ＬＩＦ転写を検出するために使用したプローブは、 ｐＳＰ６５中でサブクローン化されたｐＬＩＦ７．２ｂのＣＤＮＡインサートを 含有する約７５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ■フラグメントから成っていた。 このフラグメントは、ＣＤＮＡ配列を有するだけでなく、Ｇ−Ｃ末端およびｐＪ Ｌ３ベクター配列の約１５０ｂｐをも有していた。約２ｘｌＯ’ｃｐｍ／μｇの りボブローブは、ＢＲＥＳＡ　［アプライド（Ａｄｅｌａｉｄｅ）　］の試薬を 用いる５ＤＰ６サブクローンの転写により誘導した。このプローブは、約２ｘ　 １０’ｃｐｍ／ｚＱでハイブリッド形成に用いた。フィルターを、オートラジオ グラフィーに付す前に、２ＸＳＳＣ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中で６ ７℃で、および最後に０．２ＸＳＳＣ中で６７℃で広範に洗浄した。 このような分析により、ＬＩＦ転写物は種々の造血細胞系中に底レベルで存在し 、クレブスＲＮＡのバッチによってＬ　Ｉ　ＦｍＲＮＡのレベルには大きな差が あることがわかった。クレブス腹水癌細胞ＲＮＡの２つのバッチを選択して、２ つのｃＤＮＡライブラリーを合成した。ｃＤＮＡライブラリーは、アメルシャム （Ａｍｅｒｓｈａｍ）の試薬（製造番号ＲＰＮ、１２５６およびＲＰＮ、１２５ ７）を、その製造者の指示に従って用いて構成した；クローニングベクターはλ ＧＴＩＱであった。約４Ｘ１０’の組換クローンが得られ、ｐＬＩＦ７．２ｂの ３”末端における３６残基の配列に対応するオリゴヌクレオチドとのハイブリッ ド形成によってスクリーニングした：第１０図のヌクレオチド５００〜５３５（ 両端を含む）。 クレブスｃＤＮＡライブラリーに相当するファージプラークを、ｌＱｃ＊のベト リ皿当たり約５０．０００のプラークの密度で増殖させ、ニトロセルロースに移 し、標準的な方法で処理した（マニアティスら、モレキユラー・クローニング、 コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２）。ハイブリット形成の前に、６ｘ ＳＳＣ（ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、 ０．２％フィコル、０．２％ポリビニル−ピロリドン、０．２％ウシ血清アルフ ミン、２ｍＭｋ’：ｌ’）７酸ナトリウム、１ｍＭ　ＡＴＰ、５０ｙ／ＲＱ変性 サケ精子ＤＮＡおよび５０μｇ／ｍＱ大腸菌ｔＲＮＡ中で、フィルターを３７℃ で数時間インキ一ベートした。０，１％ＮＰ４０を含有する同じ溶液中で、３７ ℃で１６〜１８時間ノ＼イブリ・ノド形成を行った。［γ−”Ｐ］　ＡＴＰおよ びポリヌクレオチドキナーゼで比活性約１０’ｃｐｍ／μｇに放射性ラベルし、 取り込まれなかったラベルからＮＡＣＳカラム（ベテスダ・リサーチ・ラボラト リーズ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより分離した前記オリゴヌク レオチドプローブを、約２０ｎｇ／ｘＱの濃度でハイブリツド形成に用いた。ハ イブリッド形成後、５ｘＳＳＣ，０，１％ドデシル硫酸ナトリウム中で６０℃で フィルターを洗浄した。前記のように、フィルター上で陽性のクローンλＬＩＦ ＮＫＩに相当する１個のプラークを取り、低密度で再スクリーニングした。 前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したλＬ　Ｉ　ＦＮＫ　ｌ中の約９ ５０ｂｐのＣＤＮＡインサートを、プラスミドベクター［ｐＥＭＢＬ８＋、デン テ（Ｄｅｎｔｅ、　Ｌ、）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１ユニ１６ ４５〜１６５５．１９８３コ中にサブクローン化してクローンｐＬＩＦＮＫｌを 生成した。ｐＬＩＦＮＫｌのＣＤＮＡインサートのヌクレオチド配列分析は、ジ デオキシ法（サンガーら、ブロシーデインダス・サブ・ナショナル・アカデミ− ・オプ・サイエンシーズ、米国、ヱ４：５４６３〜５４６７．１９７７）によっ て、アルカリ性変性２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として用い［チェノ（Ｃｈｅ ｎ、　Ｅ、　Ｙ、　）およびシーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、ｔｌ、）、Ｄ ＮＡ、４　：１６５〜１７０．１９８５］　、ｃＤＮＡｉ：沿うベクターにもｃ ＤＮＡ内の配列にも相補的な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い 、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントおよびＡＭＶ逆転写酵素を ポリメラーゼとして用いて行った。ｐＬＩＦＮＫｌ中のＣＤＮＡインサートの部 分のヌクレオチド配列を第１１図に示す。ｐｔ、Ｉ　ＦＮＫ　１によって特定さ れるアミノ酸配列は、Ｃ−末端において、直接アミノ酸シークエンシングによっ てＬＩＦのＣ−末端を構成すると予測される９個のアミノ酸と同じであり、ｐＬ ＩＦＮＫ１ｃＤＮＡ配列において、このＰｈｅ　１８７のコドンが直接にイン− フレーム翻訳終止コドンにつながっているので、Ｐｈｅ１８７がＬＩＦのＣ−末 端残基であることが確認された。 工橡又：酵母発現ベクター中のＬＩＦコドン領域の構成ＬＩＦｃＤＮＡクローン によってコード化されたタンパク質の最初の製造が真核系（酵母）において達成 され、発現された生成物はグリフシル化され、分泌され、正確に折り畳まれた。 用いた発現ベクターＹＥｐｓｅｃｌは、クルイヴエロミセス・ラクティスのキラ ー毒素遺伝子から誘導され、イオンターロイキン１の有効に分泌することが示さ れており（バルダリら、ヨーロピアン・モレキユラー・バイオロジー・オーガニ ゼーション・ジャーナル、６　：　２２９〜２３４．１９８７）、ガラクトース 誘導性ハイブリッドＧＡＬ−ｃＹｃプロモーターから転写されたＮ−末端リーダ ー配列を提供する。 このベクター中のｐＬＩＦ７．２ｂによってフード化されたタンパク質を発現す るために、ｃＤＮＡを幾つかの手段で修飾する必要があった（第１２図参照）。 ５゛末端において、部分的な哺乳動物のリーダー配列を特定する数個のヌクレオ チドを除去するだけでなく、適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＢａｍＨ Ｉ）を設けて、クルイヴエロミセス・ラクティスリーダーを挿入させ、適当なシ グナルペプチダーゼ切断部位（Ｇｌｙ−３ｅｔ）を保持することが必要であった 。３゛末端においては、ＬＩＦのフード化領域の２種の構成がなされた。１種（ Ｌ　Ｉ　Ｆｍｕｔｌ）は、ｐＬＩＦ７．２ｂの最後のコドン（ＧＩｎ１７８）に 終止コドンがつながるように構成された。他方（Ｌ　Ｉ　Ｆ＋ｅｕｔ２）は、ｐ ＬＩＦ７．２ｂ（前記参照）に欠損していることが知られている９個のアミノ酸 残基をフード化する配列を付加し、これに翻訳終止コドンがつながるように構成 された。適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位（ＨｉｎｄＩ［ｌ）は、いずれ の構造においても構成された。これらの修飾はすべてオリゴヌクレオチド介在突 然変異誘発により達成された：ｐＬＩＦ７．２ｂの５３５ｂｐのｃＤＮＡインサ ートを持ち、Ｇ−Ｃ末端およびｐＪＬ３ベクターの部分によって制限された約７ ５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｎｌフラグメントは、プラスミドｐＥＭＢＬＳ ＋中にサブクローン化しくデンテら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１１ 　：１６４５〜１６５５．１９８３）、１本鎖ＤＮＡは、文献に記載の方法で調 製した［セサリーニ（Ｃｅｓａｒｉｎｉ＋　Ｇ、　）およびマーレイ（ｌｌｕｒ ｒａｙ、　Ｊ、Ａ、Ｈ，）　、セトロウ（Ｓｅｔｌｏｖ、　Ｊ、に、）およびホ レンダー（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ、　Ａ、）編、ジェニティック・エンジニアリ ング：プリンシブルズ・アンド・メソッズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、ブレナム・プ レス（Ｐ］ｅｎｕ＋ａ　Ｐｒｅｓｓ）　、二ニーヨーク、第８巻、１９８７］。 イン・ビトロの突然変異誘発は、文献に記載のようにして［ニスペット（Ｎｉｓ ｂｅｔ、１．Ｔ、）およびペイルハルツ（Ｂｅｉｌｈａｒｚ、　Ｍ、Ｗ、）　、 ジーン・アナリシス・テクニークス（Ｇｅｎｅ　Ｌｎａｌ、　Ｔｅｃｈｎ、）　 、２　：　２３〜２９．１９８５］、３５．５１および６１塩基のオリゴヌクレ オチドを用いて行い、概略を示したＣＤＮＡの５゛末端および３°末端を修飾し た。修飾されたＬＩＦｃＤＮＡ配列を含むＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｎｌフラグメン トを、プラスミドＹＥｐｓｅｃｌに入れ、得られる組換体中のインサートのヌク レオチド配列を決定した。 １橡３　：　Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃｌ／　Ｌ　Ｉ　Ｆ組換体の、酵母細胞への導入ビ ール酵母菌株ＧＹ　４１　［１ｅｕ２　ｕｒａ３　ａｄｅｌ　ｈｉｓ４　＋ｎｅ ｔ２　ｔｒｐ５　ｇａｌｌｃｉｒ＋；　ｘ　４００３−５ｂ、イースト・ジエネ ティック・ストック・センター（Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ ｅｎｔｒｅ）　、バークレイ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）コを、ポリエチレングリフー ル法によって形質転換した［クレベ（Ｋｌｅｂｅ。 Ｒ，Ｊ、　）ら、ジーン、λ旦：３３３〜３４１．１９８３］。形質転換体は、 ウラシル不存在下に合成最少培地［必要なアミノ酸５０μｇ／酎を追加した、２ ％炭素原、０．６７％酵母窒素成分（ディフッ；　Ｄｉｆｃｏ）　］上で選択お よび保持した。プラスミドＹＥｐｓｅｃｌ中のインサート配列の発現は、非選択 的完全培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン）または合成最少培地（いずれも２ ％ガラクトースを含有する）中で、形質転換体を増殖することによって達成され た。 工亘土：酵母誘導ＬＩＦの生物学的性質の決定酵母ならし培地の分化誘導活性お よび白血病抑制活性のアッセイを、ウシ胎児血清２０％および寒天０．３％の最 終濃度のダルベッフ改良イーグル培地中にＭ１細胞３００個を含有する培養液（ ホズミ博士、サイタマ・カンサー・リサーチ・センター（Ｓａｉｔａｍａ　Ｃａ ｎｅｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｒｅ）　、日本により提供）１１１２中 で行った。アッセイに付す材料は、連続的希釈物０．ＩＲＱとして、寒天培地中 の細胞懸濁液を添加する前に培養器に加えた。培養は、ｌＯ％ｃｏ、の水蒸気飽 和雰囲気中で７日間インキュベートした。培養は、顕微鏡を用いて倍率３５で記 録し、分散した細胞を有するコロニーまたは分散した細胞のみから成るコロニー は、分化されたと記録した。形態学的観察は、全培養を２．５％グルタルアルデ ヒド１峠で固定し、次いで顕微鏡のスライド上で乾燥した培養を、アセチルコリ ンエステラーゼ／ルクソール・ファスト・ブルー（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌ ｕｅ）　／ヘマトキシリンで染色することによって行った。 コロニー刺激活性のアッセイは、７５．００１１の０５７ＢＬ骨髄細胞を用いて 文献に記載の方法で行った（メトカルフ、ザ・ヘモポイエティソク・コロニー・ スティミニレーティング・ファクターズ、エルセヴイール、アムステルダム、１ ９８４）。ＷＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ’細胞に対する分化誘導活性のアッセイは、文献 に記載のように行ったにフラら、ザ・ヘモポイエティック・コロニー・スティミ ニレーティング・ファクターズ、？−塁一旦一：９０１７〜９ｏ２３．１９８３ ）。 非形質転換酵母、ベクターＹ　Ｅ　ｐｓｅｃｌのみを有する酵母または不完全な コード化領域（ＬＩＦｍｕｔｌ）を有する酵母の培養のものではな（、全コード 化領域（ＬＩＦｍｕｔ２）を有する酵母の培養の培地は、Ｍｌコロニーの培養に °おいて典型的なマクロファージ分化を誘導することができた（第１３Ａ図）。 精製した天然ＬＩＦを用いた場合と同様に、酵母誘導物質も、濃度を増すと、分 化するＭ１コロニーの数およびサイズを徐々に低下させた（第１３Ｂ図）。精製 した天然ＬＩＦとの比較により、酵母ならし培地は、１６．０００ユニット／Ｍ Ｑ　（約１３０　ｎ　ｇ／ｍｅ）までのり、ＩＦを含有することが示唆された。 酵母誘導ＬＩＦは、精製した天然ＬＩＦ−Ａと同様に、正常顆粒球−マクロファ ージ前駆細胞によるコロニーの形成を刺激すること、またはＷＥＨＩ−３Ｂ　Ｄ ’白血病コロニーの分化の誘導もしくは増殖の抑制を行うことはない。 セファクリル（Ｓｅｐｈａｅｒｙｌ）　Ｓ　−２００カラムによるサイズ分画に より、タレブス細胞から誘導されるＬＩＦには５８．０００ダルトンであるのに 対して、酵母誘導ＬＩＦは見掛けの分子量が６７゜０００〜１５０，０００ダル トンのタンパク質と共に溶出されることがわかった。 不完全なコード化領域（ＬＩＦｍｕｔｌ）を有する酵母のならし培地にＬＩＦ活 性が無いことは、この構造に欠損している９個の疎水性Ｃ−末端残基がＬＩＦ機 能に必要であることを示唆している。これらの残基はレセプターと相互作用し得 るが、タンパク質中で田水性のコアの部分の形成もし、それ故その欠如は、適当 な折り畳みの妨害となり得る。または、そのような残基は、ＬＩＦの有効な分泌 に何等かの形式で必要なのであろう。 工程５：酵母誘導マウスＬＩＦおよびクレブス■腹水細胞ならし培地から精製し た天然ＬＩＦ−Ａのレセプター結合特異性精製したマウスＬＩＦ−Ａ（実施例１ ）を前記のようにヨウ素化した（実施例３）。腹腔内でチオグリフ−レートによ り高レベルのマクロファージを誘導したマウスから、洗浄によって腹腔細胞を採 った。これらの細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清含有Ｈｅｐｅｓ−緩衝ＲＰＭ Ｉ培地に、２．５Ｘ１０・１５０μＱで再懸濁させた。細胞懸濁液５０ｕＱを２ ００．０００ｃｐｍの１″’Ｔ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ａ　（１０μ（１゜同じ培地中 ）および１０μＱ中の対照培地または非ラベル純マウスＬＩＦ−Ａもしくは酵母 誘導マウスＬＩＦの連続２倍希釈物と共にインキュベートした。適当な濃度にお いて、ＬＩＦｍｕｔ２構造（第１２図）含有ガラクトース誘導酵母の上澄は、腹 腔細胞レセプターへの結合を１！６１−Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ａと競合したが、非誘導酵 母上澄は競合しなかった（第１４図）。競合の度合いは、真正天然ＬＩＦ−Ａの それと同じくらいであり、このことは、酵母誘導ＬＩＦ−Ａが、ＬＩＦ−Ａ細胞 レセプターへの結合に必要なすべての情報を有することを示唆している。 実施例６ 本実施例は、哺乳動物細胞における組換マウスＬＩＦの発現のための工程を説明 する。 第１５図は、以下に記載する方法の工程１に関する：クローンｐＬ　Ｉ　ＦＮＫ ３のｃＤＮＡ部分のヌクレオチド配列。ｍＲＮＡ同義鎖のヌクレオチド配列を、 上部に示すＬＩＦの推定アミノ酸配列と共に５°から３°方向に示す。予め決定 したＮ−末端アミノ酸残基を＋１として示す。ｃＤＮＡの５°末端のＥｃｏＲＩ 部位および終止コドンにかかるＸｂａ　１部位（工程２においてＬＩＦフード化 領化合域ＭＰ−Ｚｅｎに挿入するのに使用した。）を示す。 工程１：マウスＬＩＦのＮ−末端リーダー配列のアミノ酸配列の決定 ｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７，２ｂおよびｐＬＩＦＮＫｌ　（前記）は、Ｌ　Ｔ 　ＦｍＲＮＡの不完全なコピーを含有する。これらは、Ｌ！Ｆタンパク質の成熟 部分の完全なフード化領域をも有するが、哺乳動物細胞からのＬＩＦの分泌に要 する完全な疎水性リーダー配列を持たない。 疎水性リーダーをコード化する領域を含有するｃＤＮＡクローンを単離するため に、クレブスｍ　ＲＮ　Ａの同じバッチを鋳型として用いて前記（実施例５）の ように構成した更に１０６のｃＤＮＡクローンを、ｐＬＩＦ７．２ｂ配列の５° 末端の３５残基および３°末端の３６残基の配列に対応する２つのオリゴヌクレ オチド（第１ｏ図における、ヌクレオチド６７〜１０２および５００〜５３５） をプローブとして用いて（前記のように）スクリーニングした。 複製フィルター上で陽性のクローンλＬＩ　ＦＮＫ２およびλＬＩＦＮＫ３を表 す２つのプラークを採り、前記のように低密度でスクリーニングした。２、ＬＩ ＦＮＫ３は、用いた２種のオリゴヌクレオチドの各々と共にハイブリッド形成す ることが示されたので、これを更に分析した。 λＬ　Ｉ　ＦＮＫａ中の約１４００ｂｐのｃＤＮＡインサートを、プラスミドベ クターｐ　ＥＭＢ　Ｌ　８°（デンテら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、 上１：１６４５〜１６５５．１９８３）中にサブクローニングして、クローンｐ ＬＩＦＮＫ３を生成した。ｐＬＩＦＮＫ３のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド 配列分析は、（前記）ｐＬＩＦ７．２ｂおよびｐＬ　Ｉ　ＦＮＫ　１の場合と同 様に行った。 ｐＬＩ　ＦＮＫ３のｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を第１５図に示し、 ｐＬＩＦＮＫ３は完全なＬＩＦコード化領域を含むことを示す：ｐＬＩＦＮＫ３ 配列中の２３〜２５の位置に開始コドン（ＡＵＧ）があり、次いで、２４個のア ミノ酸残基の疎水性リーグ配列をコード化する配列がある。コード化領域は、ｐ ＬＩ　ＦＮＫ　１によって予め決定されたものと同じ翻訳終止コドン（前記）に 至る。 ＩＮ２：ＬＩＦコード化領域の、哺乳動物発現ベクターへの導入最初に選択した 哺乳導入発現ベクターは、レトロウィルス発現ベクターｐＭＰ−Ｚｅｎであった 。このベクターは、モノニーマウス白血病ウィルス系ベク９−ｐＺ　Ｉ　ＰＮｅ ｏＳＶ　（Ｘ）から、Ｘｈ。 Ｉ発現部位を残して、近傍のＳＶ４０およびプラスミド配列と共にｎｅｏ”遺伝 子を削除することにより誘導した。ベクターの３′領域も修飾して、骨髄増殖性 肉腫ウィルス（ＭＰＳＶ）のＬＴＲ由来のエンハンサ−を組み込んだ［ボウチル （Ｂｏｖｔｅｌ、　Ｄ、　Ｄ、　Ｌ、　）ら、モレキュラー・バイオロジー・ア ンド・メディシン（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、）、土：２２９〜２５０． １９８７コ。第１に、Ｌ　Ｉ　Ｆ／ＰＭＰ−Ｚｅｎ組換体は、φ２細胞を通って ヘルパー−フリー感染性レトロウィルス粒子中に入れられるので、このベクター を選択した［マン（ＭＲｎｎ＋　Ｒ１）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　、３３　：　１ ５３〜１５９．１９８３コ。 このようなウィルス粒子は、次いで、Ｌ　Ｉ　Ｆ／ｐＭＰ−Ｚ　ｅ　ｎ組換体を 種々のマウス細胞に（感染により）有効に導入するために使用される［マンら、 セル、３３Ｌ：１５３〜１５９．１９８３コ。第２に、外来のコード化領域の発 現のためのＭＰＳＶ　ＬＴＲを有するこのベクターは、ＧＭ−Ｃ８Ｆを含む特定 の他の造血増殖および分化因子の有効な発現を起こすことがわがっている。 ｐＭＰ−Ｚｅｎへの挿入のために選択したｐＬＩＦＮＫ３のセグメントは、位置 １（ＥｃｏＲ１部位）から位置６３ｏ（終止コドンにかかるＸｂａ　１部位）に 至る一第１５図参照。このセグメントは、プレーＬＩＦのコード化領域以外はあ まり含有せず、ｍＲＮＡの不安定性をもたらす配列を有し得る３°非翻訳領域の すべてを有していないので選択した［例えば、シャク（Ｓｈａｖ、　Ｇ、　）お よびカメン（Ｋａｌｌｅｎｌ　Ｒ１）、セル、４６：６５９〜６６７．１９８６ ；ヴエルマ（Ｖｅｒｍａ、　１．　Ｍ、　）およびサッソンーコルシ（Ｓａｓｓ ｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ、　Ｐ、）　、セル、５１：５１３〜５１４．１９８７コ。 このフラグメントをｐＭＰ−Ｚｅｎに挿入するために、標準的な方法（マニアテ ィスら、１９８２、前掲書）によって、ｐｌｃ２０Ｈ［７−シｘ　（Ｍａｒｓｈ 、　Ｊ、　Ｌ。 ）ら、ジーン、３２：４８１〜４８５．１９８４］のＥｃｏＲＩおよびＸｂａ１ 部位の間にまず挿入した。次いで、このＣＤＮＡインサートを、ｐｌｃ２０Ｈプ ラスミドのポリリンカーから、５ａｉｌおよびＸｈｏ　１分解により回収するこ とによって、ｐＭＰ−ＺｅｎのｘｈＯＩクローニング部位に挿入するのに適当な 結合端を有するＬＩＦｃＤＮＡを生成した。このＬＩＦｃＤＮＡフラグメントの ｐＭ　Ｐ　−Ｚ　ｅ　ｎへの挿入は、標準的な方法（マニアティスら、１９８２ 、前掲書）によって行った。 Ｉｉ３　：　ｐＭＰ−Ｚ　ｅ　ｎ／Ｌ　Ｉ　Ｆ組換体の、マウス繊維芽球への導 入 ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ　ＤＮＡを、φ２繊維芽球にエレクトロポレーシ璽ンに よって導入した［ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら（ＰＮＡＳ）、８１ニア１６１〜 ７１６５．１９８４］　、ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦＤＮＡ３０／ｌＺｇおよびｐ ＳＶ２Ｎｅｏ　ＤＮＡ　［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。 Ｐ、　Ｊ、　）およびバーブ（Ｂｅｒｇ＋　Ｐ、）　、ジャーナル・サブ・モレ キユラー・アンド・アプライド・ジェネティクス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐ、　 Ｇｅｎｅｔ、）、１：３２７〜３４１．１９８２１３μｇを、ＤＭＥ／１０％Ｆ Ｃ３（１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッフ改良イーグル培地）１１１２中 のｌＸｌ０＠個のφ２繊維芽球と混合し、キャパシタンス２５μＦで５００Ｖの 電流をかけた［バイオラド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ−Ｐｕ ｌｓｅｒ）モデルＮｏ、１６５２０７８を使用コ。形質転換体は、まず、ｐＳＶ ２Ｎｅｏ　ＤＮＡの抗生物質０４１８に対する耐性に基づいて選択した。Ｇ４１ ８耐性φ２細胞は、標準的な方法（マンら、セル、３３：１５３〜１５９．１９ ８３）によって、４００μｇ／ｘＱで選択した。試験した１９個の０４１８耐性 クローンのうちの２個は、ｐＭＰ−Ｚ　ｅ　ｎ／Ｌ　Ｉ　Ｆ構造をも有しており 、これは、φ２ならし培地中において検出し得るＬＩＦ活性シこよって評価され た。 工程４：φ２誘導ＬＩＦの生物学的性質の決定ｐＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩＦ含有φ２ 細胞のならし培地の分化誘導活性および白血病抑制活性のアツセイを、前記のよ うに行った。ＤＭＥ／１０％ＦＣ８３ｉｄ中の１０＠個のφ２細胞の培養からの 培地の分化誘導活性をア・ツセイした。２つの陽性の培養の結果を次の表１こ示 す： Ｍ１分化誘導活性 クローン番号　（ユ＝−／　）／　１０”細胞／　ｚＱ　Ｃ，Ｍ、　）φ２一対 照　検出せず φ２−１１ａ　＞１６．０００ φ２−１１ｄ　＞１６．０００ このように、この発現系において、生物学的に活性な組換マウスＬＩＦの有意の レベルが達成できた。 ウィルスの伝播 ！染性ＰＭＰ−Ｚｅｎ／ＬＩ　Ｆレトロウィルスは、共培養により、親φ２細胞 系から系ＦＤＣ−ＰＩの造血細胞［デクスター（Ｄｅｘｔｅｒ。 Ｔ、　Ｍ、　）ら、ジャーナル・サブ・エクスペリメンタル・メデイシン（Ｊ、 ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、）　、上５２：　１０３６〜１０４７．１９８０コに移るこ とができた。ＦＤＣ−Ｐｉｌ細胞増殖のための最適濃度のＷＥＨｌ−３ＢＤ−な らし培地を含有するＤＭＥ／ＩＱ％ＦＣ３１０ｘＣ中で、１０＠個のψ２細胞を 、１０＠個のＦＤＣ−ＰＩｌ細胞混合した。 ２日間インキュベートした後、非付着ＦＤＣ−ＰＩ細胞を除去し、すべての付着 φ２細胞を洗い落とし、同じ培地３ＭＱ中で１６時間増殖させた。ならし培地を 採り、前記のように分化誘導および白血病抑制活性のアッセイに付した。結果を 次の表に示す。 ＦＤ培養を誘導した　Ｍ１分化誘導活性クローンの番号　（ユニット／１０”Ｆ ＤＣ−Ｐ　ｌ細胞）φ２一対照　検出せず φ２−１１８　約３．０００ φ２−１１ｄ　約１．５００ このように、φ２クローンであるφ２−１１ａおよびφ２−１１ｄは、生物学的 活性ｐＭＰ−Ｚ　ｅ　ｎ／Ｌ　Ｉ　Ｆレトロウィルスを造血細胞に透過させるこ とができる。従って、これらのクローンは、２ｅｎ／ＧＭ−Ｃ５Ｆウイルス感染 のために使用したものと同様に、正常マウス造血に対する天然ＬＩＦ高レベル発 現の効果の研究のために、照射マウスの造血系を再構成するのに使用し得る正常 マウス造血前駆細胞の感染に適用可能である。 実施例７ 以下に、大腸菌細胞における組換マウスＬＩＦの発現のための工程を説明する。 第１６図は、以下に記載する方法の工程１に関する：グルタチオンＳ−）ランス フェラーゼ／トロンビン切断部位／Ｌ　Ｉ　Ｆ接合部におけるヌクレオチド配列 、その接合部におけるコード化された融合タンパク質の配列。３者融合タンパク 質の、グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼのＣ−末端、トロンビン切断部位お よびマウスＬＩＦ部分のＮ＝末端を、このアミノ酸配列をコード化するヌクレオ チド配列と共に示す。トロンビンによって切断されると考えられる部位を矢印で 示す。 Ｉ［１：ＬＩＦコード化領域の大腸菌発現ベクターへの導入大腸菌におけるＬＩ Ｆ発現に用いた発現ベクターは、５ｊ２６（寄生嬬虫日本住血吸虫によってコー ド化された２５ｋＤグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，５， １，１８）　）のＣ−末端との融合として外来ペプチドを合成するための、ｐＧ ＥＸ−２７であった（スミスおよびジョンソン、ジーン、１９８８）。多くの場 合、融合タンパク質は、水溶液に可溶であり、非変性条件下に固定化グルタチオ ンアフィニティクロマトグラフィーによって粗溶菌液から生成し得ることがわか っている。このベクターｐＧＥＸ−２Ｔは、部位特異性プロテアーゼであるトロ ンビンによる分解によってグルタチオンＳ−）ランスフェラーゼキャリヤーが融 合タンパク質から切断され得るように設計されている。 プラスミドｐＬＩＦｍｕｔ２から誘導されるマウスＬＩＦの完全なコード化領域 （前記実施例５および第１２図参照）は、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント としてｐＧＥＸ−２７の多重クローニング部位に導入し、グルタチオンＳ−トラ ンスフェラーゼおよびトロンビン切断部位と同じ翻訳リーディングフレームのＬ ＩＦコード化領域３゛を配置した。このように、グルタチオンＳ−トランスフェ ラーゼ／トロンビン切断部位／ＬＩＦの３考量合タンパク質において、ＬＩＦタ ンパク質のＣ−末端をこれらの要素に配置した（第１６図参照）。トロンビン切 断部位の位置は、トロンビン切断の後に２個のアミノ酸（Ｇｌｙ−３ｅｒ）がＬ ＩＦタンパク質のＮ−末端に付属するような位置である。前記プラスミドの構成 ｐＧＥＸ−２Ｔ／Ｌ　Ｉ　Ｆは、標準的な方法によって行い、標準的な方法によ ってプラスミドを大腸菌ＮＭ５２２に導入した（ゴーおよびマーレイ、Ｉｉ２： グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ／Ｌ　Ｉ　Ｆ融合タンパク質の発現および 精製 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／ＬＩＦ融合タンパク質の発現を誘導する ために１、ｐＧＥＸ−２Ｔ／ＬＩ　Ｆ含有大腸菌ＮＭ５２２細胞の培養１０１１ ２をルリアブイヨン中で対数増殖させ、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラ ノシドを０．１　ｍＭの濃度に加えた。更に４時間増殖（その間にグルタチオン Ｓ−）ランスフェラーゼ／Ｌ　Ｉ　Ｆ遺伝子が発現する）後、遠心によって細胞 を採り、マウスリン酸緩衝生理食塩液（ＭＴＰＢＳ　：　１５０ｍＭ　ＮａＣＱ 、１６　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　ｔ　ＨＰ　Ｏ４，４ｍＭ　ＮａＨｔＰＯａ、ｐＨ７， ３）　１ｍＱに再懸濁させた。氷上で穏やかに超音波処理することによって細胞 を溶解し、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００を１％に添加した後、遠心 （１０，０００ｇ、５分間、４℃）により細胞層を除去した。透明となった上澄 を、室温で回転プラットフォーム上の５０ｘＱポリプロピレンチューブ内で、５ ０％グルタチオナガロースビーズ［イオウ結合、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　］２０ ０μＱと混合した。（使用前に、ビーズをＭＴ　Ｐ　Ｂ　Ｓに予備浸漬し、同じ 緩衝液で２回洗浄し、５０％溶液ｖ　／　ｖとしてＭＴＰＢＳ中で４℃で貯蔵し た。）吸収（５分間）後、ビーズを遠心（５００ｇ、１分間）によッテ集め、Ｍ Ｔ　Ｐ　Ｂ　Ｓ／トリトンＸ−１００で３回洗浄した。次いで、グルタチオンＳ −トランスフェラーゼ／ＬＩＦ融合タンパク質を、遊離グルタチオンとの競合に よって溶出した：ビーズは、１００μｇの５０ｍＭ）リスＨＣｇ、５ｍＭ還元グ ルタチオン（ｐＨ７，５）と共に、室温で２分間インキュベートし、遠心によっ てビーズを除去した。溶出工程は２回行い、１００．ｃｚρずつの２つの溶出物 をプールした。 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／Ｌ　Ｉ　Ｆ融合タンパク質１００μＱを トロンビンで処理した（スミスおよびジョンソン、前掲書）。 非切断およびトロンビン切断グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼＬ　Ｉ　Ｆ　 融合タンパク質１μＱを、ファルマシア・ファスト・ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　Ｐｈａｓｔ　Ｇｅ１）　（８〜２５％ポリアクリルアミド勾配ゲル）上で電気 泳動した。クーマシー・ブルーで染色後、非切断試料においては、相対分子量〜 ４６ｋＤａの単一の主要なタンパク質種があられれ、トロンビン切断試料におい ては、〜２６ｋＤａおよび〜２０ｋＤａの２つの主要なバンドが現れた［それぞ れ、融合タンパク質（４６ｋＤａ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（２ ５ｋＤａ）およびＬＩＦタンパク質（２０ｋＤａ）の推定されるサイズに相当す る］。このゲル上のクーマシー染色バンドの分子量の計算によって、元の１０ｊ ＩＱの大腸菌培養からのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／ＬＩＦタンパク 質の収量は、〜１．５μｇであったことがわかった。 グルタチオンＳ−）ランスフェラーゼ／Ｌ　Ｉ　Ｆ融合タンパク質およびトロン ビン切断ＬＩＦ試料の分化誘導活性および白血病抑制活性のアッセイは、マウス 間１細胞を用いて（前記のように）行った。 いずれのＬＩＦ試料も、生物学的に活性であり、非活性は７Ｘ１０８ユニツト／ ｊＩ９を越えることがわかった。 実施例８ マウスゲノムが、クローンｐＬＩＦ７．２ｂ中に存在する配列をコード化する遺 伝子（実施例４）に関連した他の遺伝子を含有するかどうかを決定するための工 程、およびＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置のマツプの確 定を以下に説明する。 図面は、以下に記載する方法の種々の工程に関する：第１７図二工程１に関する ：高および低ストリンジエンシー条件下におけるマウスＤＮＡのｐＬＩＦ７．２ ｂ誘導プローブとのハイブリッド形成。所定の制限酵素で分解したＢＡＬＢ／ｃ 肝ＤＮＡについて、実施例８の工程１に記載するようにＬＩＦ遺伝子配列を調べ た。左図において、２ＸＳＳＣ中で６５°Ｃでハイブリッド形成を行い、最終洗 浄は０．２ＸＳＳＣ中で６５°Ｃで行った。右図においては、ハイブリッド形成 および洗浄はいずれも６×ｓｓｃ中で６５℃で行った。左図において、線状ｐＬ ＩＦ７．２ｂプラスミドＤＮＡ（５，６ｋｂ）は、単相マウスゲノムの分子量を ３Ｘ１０＠ｂｐとして単相マウスゲノム当たり１０および１コピーに相当するＮ （それぞれ４００ｐｇおよび４０ｐｇ）で用いた［レアード（Ｌａｉｒｅｄ、　 Ｃ。 Ｄ、）、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）　、旦２：３７８〜４０６．１ ９７１コ。ハイブリッド形成ゲノムフラグメントのサイズを示す。 第１８図・工程２に関する二種々の制限エンドヌクレアーゼで分解した、１本鎖 および２本鎖のマウスＤＮＡと、マウスＬＩＦプローブとのハイブリッド形成。 分解したＤＮＡは、０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、実施例８の工程１ に記載のように、高ストリンジエンシー条件下にｐＬＩＦ７．２ｂｃＤＮＡフラ グメントとハイブリ、ド形成させた。 第１９図工工程２に関する：マウスＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断 マツプ。ｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７．２ｂに対応する配列を含有する染色体Ｄ ＮＡの領域をボックスで示す。中心線の上部（Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ５）および下部（ Ｘｂａ　Ｌ　ＢａｍＨＩ、Ｐｓ　ｔ　Ｔおよび５ｔｕｌ）に示された制限部位は 、中心線上に配置できなかった。線の下部の複合群の部位の相対配置は図に示す 通りである。 −ン１においては、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス胚Ｄ　Ｎ　Ａを電気泳動し、 レーン２においては、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＤＮＡを電気泳動し、 レーン３〜８においては、ハイブリッドクローンｌ−１８Ａ　ＨＡＴ、Ｉ−１８ Ａ−２ａ−８ＡＧ　；　ＥＢＳ５８　；　ＥＢＳ　１１；ＥＢＳ４；およびｌ− １３Ａ−１ａ−８ＡＣのＤＮＡｆ！−電気泳動した［コリー（Ｃｏｒｙ、　Ｓ、 　）ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジ ャーナル、２：２１３〜２１６．１９８３］。これらのハイブリッドのマウス染 色体内容は、フリーラ、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニ ゼーション・ジャーナル、２：２１３〜２１６．１９８３に記載されている。す べてのＤＮＡは、ＢａｍＨＩで分解される。マウスＬ■Ｆ遺伝子を有する３ｋｂ 　ＢａｍＨＩフラグメントの位置を示す。 工ｊ■ユニマウスゲノム中のＬＩＦ関連遺伝子の数の決定タレブス■細胞のなら し培地が、Ｍ１細胞の分化を誘導し得る、２つの生化学的に異なるが、機能的に は同様の因子（ＬＩＦ−ＡおよびＬＩＦ−Ｂ）を含有するというデータ（実施例 １）に基づいて、我々は、精製およびクローン化した種に関連するマウスゲノム 中に何個の遺伝子があるかを決定しようとした。種々の制限エンドヌクレアーゼ によって切断したマウスゲノムＤＮＡのサザンプロットを、高および低ストリン ジエンシーの条件下に、ｐＬＩＦ７．２ｂから誘導したプローブと共にハイブリ ッド形成した。 ＢＡＬＢ／ｃマウス肝臓からの高分子量ゲノムＤＮＡ２０μｇを種々の制限エン ドヌクレアーゼで完全に分解し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分画し 、ニトロセルロースに移した。ハイブリッド形成の前に、５ｘＳＳＣ（低ストリ ンジエンシー）または２ｘＳＳＣ（高ストリンジエンシー）（ＳＳＣ＝０．１５ Ｍ　ＮａＣＱ。 ０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．２％フイコル、０．２％ポリビニルピ ロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン、２ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ 　ＡＴＰ、５０Ｍｇ、／ｌＱ変性サケ精子ＤＮＡおよび５０Ｍｇ／ｚＱ大腸菌ｔ ＲＮＡ中で、フィルターを６５℃で数時間インキュベートした。ハイブリッド形 成は、０．１％ＳＤＳを含有する同じ溶液中で、６５℃で１６〜１８時間行った 。次いで、第１７図に詳細に示すように、５ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６５ ℃において（低ストリンジエンシー）、または２ＸＳＳＣ，０゜１％ＳＤＳ中で ６５℃において、次いで０．２ｘＳＳＣ＋；：より６５℃で（高ストリンジエン シー）フィルターを洗浄した。使用したノーイブリッド形成プローブは、前記の ように、ニックトランスレーションにより比活性約４×１０＠Ｃｐｍ／μｇに放 射性ラベルしたｐＬＩＦ７．２ｂのｃＤＮＡインサートの約７５０ｂｐのＥｃｏ ＲＩ−Ｈｉｎｄ［［フラグメントであり、約２Ｘ１０’ｃｐｍ／ｘ１２の濃度で ハイブリッド形成に使用した。 マウス肝臓ＤＮＡ　（第１７図）においても、クレブス■細胞、ＬＢ３Ｔ細胞お よびＷＥＨＩ２６５単核細胞由来のＤＮＡ　（図示せず）においても、ＬＩＦプ ローブは、それぞれ約１１．３および１３ｋｂｐの独特のＥＣｏＲＩ％　Ｂａｍ ＨＩおよびＨｉ　ｎｄＩＩＩフラグメントを検出した。ハイブリッド形成の同じ パターンは、高ストリンジエンシー（０，２ｘ　ｓ　Ｓ　Ｃ，６５°Ｃ）および 低ストリンジエンシー（６ｘＳＳＣ，６５℃）のいずれにおいても明らかであっ た（第１７図）；低ストリンジエンシーハイブリッド形成および洗浄条件下には 、他の明らかなバンドは無かった。同様に独特のノ＼イブリッド形成フラグメン トは、Ｐｓｔ　１％５ｔｕＩ、５ａｃｌ、ＥｃｏＲ５およびＢｇｌＩＩ＝切断ゲ ノムＤＮＡにおいても検出された（第１７図）。更に、第１６図に示す実験にお いては、ｐｔ、ｒｐ７．２ｂプラスミドＤＮＡは、単相マウスゲノム当たり１０ および１コピー当量の濃度で含まれていた（トラック１および２）；ゲノムＬＩ Ｆ配列のハイブリッド形成強度は、独特の遺伝子標準強度と有意に異なってはい なかった（トラック２）。 以上のデータより、マウスゲノム中でＬＩＦ遺伝子は独特であり、類縁物は存在 しないことがわかる。すなわち、ＬＩＦの２つの種は、異なる遺伝子の産物であ るが、同じ遺伝子産物の転写後または１訳後の変種と考えられる。 工程２：マウスＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断マツプの確定 マウスＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置を決定し、この遺 伝子の分子フィンガープリントを提供するために、マウス肝またはクレブス腹水 癌細胞のＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで分解し、工程１に記載のよう にサザン分析に付した（高ストリンジエンシーハイブリッド形成および洗浄条件 下）。このような実験の例を第１８図に示す。この分解産物のサイズの分析によ り、ＬＩＦ遺伝子の各切断部位の位置のマツプを作成することができる（第１９ 図）。 工梶鼻：マウスＬＩＦ遺伝子の染色体配置マウスＬＩＦ遺伝子が位置している染 色体を決定するために、種々のマウス染色体を有する６つのマウス−チャイニー ズ・ハムスター卵巣体細胞ハイブリッド細胞系のＤＮＡを試験した［コリー（Ｃ 。 ｒｙ、　Ｓ、）ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼー ション・ジャーナル、λ：２１３〜２１６．１９８３；フラング（Ｆｒａｎｃｋ ｅ、　Ｕ、）ら、サイトジェネティクス・アンド・セル・ジェネティクス（Ｃｙ ｔｏｇｅｎｅｔ、　Ｃｅ１１．　Ｇｅｎｅｔ、）　、上９：５７〜８４．１９７ ７］。（高ストリンジエンシーハイブリッド形成および洗浄条件下に）工程１に 記載のように行ったサザン分析により、マウスＬＩＦ遺伝子を含む３ｋｂｐ　Ｂ ａｍＨＩフラグメントは、すべてのハイブリッド存在しないことがわかった（第 ２０図）。染色体１１は、これらの系（コリーら、ヨーロピアン・モレキユラー ・バイオロジー・オーガニゼーシ目ン・ジャーナル、２：２１３〜２１６．１９ ８３）のいずれにも保持されていない唯一のマウス染色体であるので［マウス− チャイニーズ・ハムスターハイブリッドの特性（フラツグら、サイトジェネティ クス・アンド・セル・ジェネティクス、１９：５７〜８４．１９７７）］、ＬＩ Ｆ遺伝子がこの染色体上に存在すると考えられる。同様に、マウスＧＭ−Ｃ３Ｆ 遺伝子［バー０’７　（Ｂａｒｌｏｗ、　Ｄ、Ｐ、）　ラ、ヨーロピアン・モレ キユラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、６：６１７〜６２ ３．１９８７］およびＭｕｌｔｉ−ＣＳＦ遺伝子［イーレ（１ｈｌｅ、　Ｊ、　 Ｎ、　）およびコザック（Ｋｏｚａｋ、　Ｃ，Ａ、）　、ナショナル・カンサー ・インステイテコート、フレデリック・カンサー・リサーチ・ファシリティ、ア ニニアル・レポート（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、 　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ、 　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ）、１９８４］　も染色体１１に存在することが 、遺伝子結合の研究により確認されている（バーロウラ、ヨーロピアン・モレ牛 ニラ−・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、旦：６１７〜６２３ ．１９８７）。 大奥測度 本実施例は、クローンマウスＬＩＦｃＤＮＡを、ヒト遺伝子もしくはｍＲＮＡま たはヒトＬＩＦコード化配列含有ＤＡＮクローンの確立する工程を説明する。 第２１図は、以下に記載する方法の工程２に関する：マウスおよびヒト由来のゲ ノムＤＮＡに対する種々の条件下におけるクローンｐＬＩＦ７．２ｂのｃＤＮＡ の３′Ｐ−ラベルフラグメントのハイブリッド形成。各場合において、トラック １はマウス（ＬＢ３）ＤＮＡ１５μｇを含有し、トラック２および３はヒトＤＮ Ａ　［それぞれ細胞系ラジ（Ｒａｊｉ）またはラモス（Ｒａｍｏｓ）由来］　１ ５μｇを含有する。各フィルターに適用されたハイブリッド形成および洗浄条件 は、工程２に記載する。マウスＬＩＦ遺伝子を含有する約１０ｋｂｐのＥｃｏＲ ＩフラグメントおよびヒトＬＩＦ遺伝子を含有する約９ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラ グメントを矢印で示す。分子量標準を左に示す。２つの異なるオートファジオグ ラフィー照射を示す（１６時間および６２時間）。 工山■工：ｐＬＩＦ７．２ｂのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのフラグメントの調製および放射 性ラベル ｐＬＴＦ７．２ｂプラスミドＤＮＡを大腸菌ＭＣ１０６１中で増殖させ（カサダ バンおよびコーヘン、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー、１３旦 ：１７９〜２０７．１９８０）、標ｔＩ的な方法で大腸菌から抽出しくマニアテ ィスら、モレキユラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュ ーヨーク、１９８２）　、Ｃ５ＣＱ勾配遠心によって精製した。このように精製 したｐＬＩＦ７．２ｂプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ およびＨｉｎｄｎｌで切断して、〜７７ｏｂｐのｃ　ＤＮＡ含有フラグメントを ベクター（ｐ　Ｊ　Ｌ３）から遊離させ、これを１゜５％アガロースゲル電気泳 動によってベクター配列から分画した。 このように精製したｐＬＩＦ７．２ｂｃＤＮＡフラグメント２００ｎｇを、１０ ０μＣｉ　［α”Ｐ］　−ｄＡＴＰ含有反応において二ノクトランスレーション により放射性ラベルして、比活性約３×１０＠Ｃｐｍ／μｇとした［リグビー（ Ｒ４ｇｂｙ、　Ｐ、Ｗ、Ｊ、）　、ディックマン（Ｄｉｅｃｋｉｌａｎｎ、　Ｍ 、）　、ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ、　Ｃ，）およびバーブ（Ｂｅｒｇ。 Ｐ、）、ジャーナル・サブ・モレキユラー・バイオロジー、１１３：２３７〜２ ５１．１９７７］。１Ｍ過塩素酸ナトリウムおよび３３％インプロパツールの存 在下に沈澱することにより、放射性ラベルしたｃＤＮＡフラグメントを、取り込 まれなかったラベルから精製した。 工程２：マウスおよびヒトゲノムＤＮＡのサザンプロットとｐＬＩＦ７．２ｂｃ ＤＮＡプローブとのハイブリッド形成制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断 した、マウスＴ細胞系ＬＢ３　（レーンｌ）および２種のヒトＢ細胞系（ラジお よびラモス；レーン２および３）由来の高分子量ゲノムＤＮＡ（１５μｇ）を、 標準的な方法で０．８％アガロースゲル電気泳動し、ニトロセルロースに移した （サザン、ジャーナル・サブ・モレキユラー・バイオロジー、旦８　：　５０３ 〜５１７．１９７５）。これらの３種のＤＮＡのそれぞれを含有する５個の同じ サザンプロットを調製した。ハイブリッド形成前に、０．９Ｍ　ＮａＣｆｆ、０ ．０９Ｍクエン酸ナトリウム、０．２％フィコル、０．２％ポリビニルピロリド ン、０１２％ウシ血清アルブミン、５０μｇｌｔｉＱ熱変性サケ精子ＤＮＡ、５ ０μｇ／ｘＱ大腸菌ｔＲＮＡ、０．１ｍＭ　ＡＴＰおよび２ｍＭピロリン酸ナト リウム（フィルターａ％ｂ％ｃＳｄ）、または０．３ＭＮａＣｇ、０．０３Ｍク チン酸ナトリウムおよび同じ他の成分（フィルターｅ）中で、５５℃で数時間フ ィルターをインキュベートした。工程１において調製したＩＰ−ラベルｐＬＩＦ ７．２ｂｃＤＮＡのハイブリッド形成は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを更 に含有する前ハイブリッド形成と同じ溶液中で、５５℃（フィルターａＳｂ。 Ｃ）または６５℃（フィルターｄ％ｅ）で１６時間行った。ｓｔｐ、−ラベルｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａは、ハイブリッド形成前に沸騰によって変性し、〜１０’ｃｐｍ／ ｙＱでハイブリッド形成に使用した。 ハイブリッド形成後、０．９Ｍ　ＮａＣＱ−０，０９Ｍクエン酸ナトリウム、０ ．１％ドデシル硫酸ナトリウム中で５５℃（フィルターａ）、６０℃（フィルタ ーｂ）もしくは６５℃（フィルターｃＳｄ）で、または０．３Ｍ　ＮａＣＱ、０ ．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０゜１％ドデシル硫酸ナトリウム中で６５℃で（ フィルターｅ）、フィルターを洗浄した。完全に洗浄後、コダックＸＡＥ−５フ ィルムおよび２つの増幅スクリーンを用いて一７０℃でフィルターをオートラジ オグラフィーに付した。第２１図は、このような実験の結果を示し、２つのハイ ブリッド形成／洗浄条件（フィルターｄおよびｅ）において、マウスＬＩＦ遺伝 子（約１０ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント上に存在）およびヒトＬＩＦ遺伝子 の両方（約９ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント上に存在）が、残留バックグラウ ンド非特異的ハイブリッド形成の上に検出された。試験した他のすべての条件に おいては、バックグラウンドハイブリッド形成のレベルが高く、許容不可能であ った（フィルターａ、ｂ、ｃ）。 実施例１０ 本実施例は、マウスＬＩＦ類似クローン化ヒト遺伝子を得るための工程を説明す る。 図面は、以下に記載する方法の種々の工程に関する。 第２２図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニングの工程１に関する：マウスＬＩＦｃ ＤＮＡプローブを使用するサザンプロットハイブリッド形成によるＬＩＦ遺伝子 の検出。ヒト細胞系ＲＡＭＯ８のゲノムＤＮＡを、所定の制限エンドヌクレアー ゼで切断し、実施例１９の工程１に記載の条件下に、ｐＬＩＦ７．２ｂから誘導 したマウスＣＤＮＡフラグメントとハイブリッド形成させた。 第２３図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニングの工程１に関する：種々のハイブリ ッド形成条件下における、マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブを用いるサザンプロッ トハイブリッド形成によるＬＩＦ遺伝子の検出。制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩで切断したヒト細胞系ＲＡＭＯ３（Ｈ）またはマウス肝ＤＮＡ　（Ｍ）　１ ７）ゲノムＤＮＡを、種々のハイブリッド形成および洗浄条件下に、マウスＬＩ ＦｃＤＮＡプローブ（ｐＬＩＦ７．２ｂ）とハイブリッド形成させた。ハイブリ ッド形成のための温度およびＳＳＣ濃度を上行に、洗浄条件を次行に示す（実施 例１０の工程１参照）。 第２４図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニングの工程２に関する：ＬＩＦ遺伝子ク ローンの３試料の制限エンドヌクレアーゼ切断。クローンλＨＧＬ　Ｉ　Ｆ　１ 、λＨＧＬ　Ｉ　Ｆ　２およびλＨＧＬＩＦ３のλファージのＤＮＡ１７１７ｇ を、Ｓａ　Ｉ　ＴＳＢａｍＨＩまたはＰｓｔｌで分解し、０．８％アガロースゲ ルで電気泳動しく左図）、ニトロセルロースに移し、（前記のように）ｐＬＩＦ ７．２ｃＤＮＡとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成フラグメントのお よそのサイトＬＩＦ遺伝子（Ｈ）にかかるλＨＧＬＩ　Ｆ　１の１．３ｋｂｐの セグメントのｍＲＮＡ類似鎖のヌクレオチド配列を５”から３°方向に示す。ｃ ＤＮＡクローンｐＬＩＦ７．２ｂ％ｐＬＩＦＮＫ１およびｐＬＩＦＮＫ３から誘 導されるマウスＬ　Ｉ　Ｆ　ｍ　ＲＮ　Ａ　（Ｍ）の相当するヌクレオチド配列 をヒト遺伝子の下に小文字で示す。マウスおよびヒトの配列が同じ箇所は、星印 で示す。マウスＬＩＦと同様に推定された成熟ヒ）ＬＩＦのＮ−末端残基を＋１ とする。 第２６図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニングの工程３に関する：ヒトＬＩＦのア ミノ酸配列およびマウスＬＩＦとの比較。直接アミノ酸シークエンシング、およ びｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７．２ｂ。 ｐＬＩＦＮＫｌおよびｐＬＩＦＮＫ３の分析によって決定した成熟マウスＬＩＦ （Ｍ）のアミノ酸配列を上行に示し、λＨＧＬ　Ｉ　Ｆ　１の配列から推測され るヒ）ＬＩＦ（Ｈ）の相当する配列を下に示す。 同一箇所は星印で示す。 第２７図：ヒトＬＩＦ遺伝子のクローニングの工程４に関する：ヒ）ＬＩＦ遺伝 子の制限エンドヌクレアーゼ切断地図。ｐＬＩＦ７゜２ｂ類似ヒト遺伝子（第２ ５図）のエクソンをボックスとして示す。 遺伝子翻訳方向は、ライン下の矢印によって示す。 マウスＬＩＦｃＤＮＡクローンｐＬＩＦ７．２ｂの放射性ラベルしたフラグメン トをハイブリッド形成プローブとして用いて、ヒトＬ■Ｆ遺伝子を検出する方法 は既に開示されている。第２２図は、種々の制限エンドヌクレアーゼで切断した ヒトゲノムＤＮＡにおいてヒ）ＬＩＦ遺伝子を検出する方法を示す。このような 分析および図示されていない他のゲルにより、ヒトＬＩＦ遺伝子が存在する、種 々の制限エンドヌクレアーゼによって生成したＤＮＡフラグメントのサイズがわ かった。このデータは、ヒト遺伝子の検出のためのハイブリッド形成プローブと してマウスプローブを使用し得る条件を確立するためだけでなく、ヒトゲノムＬ ＩＦクローンの同定に有用な診断用制限マツピングデータを提供するためにも、 本実施例の後の工程において重要である。 マウスおよびヒトのＬＩＦ配列の間の相同性が高いことは、ＢａｍＨＩで切断し たマウスおよびヒトゲノムＤＮＡを、マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブと共に、種 々のハイブリッド形成および洗浄条件下にハイブリッド形成することによってわ かった（第２３図）。ハイブリッド形成および洗浄のストリンジエンシーを高め ると、バックグラウンドが低下し、マウスプローブと共にハイブリッド形成して いる〜３ｋｂｐの特有のフラグメントがあられれた。ヒト遺伝子が、０．２ＸＳ ＳＣ中で６５℃においても実質的なハイブリッド形成を保持したことは重要であ る。 ＩＨ２：ヒトゲノムライブラリーのスクリーニングおよびＬＩＦ遺伝子含有クロ ーンの単離 ５ａｕ３Ａで部分的に切断し、λファージクローニングベクターＥＭＢ　Ｌ　３ 　Ａに結合したヒトゲノムＤＮＡのライブラリーについて、マウスｃＤＮＡをプ ローブとしてハイブリッド形成することにより、ＬＩＦ遺伝子含有クローンをス クリーニングした。ＬＩＦｃＤＮＡのフラグメントは、放射性ラベルし、ハイブ リッド形成条件は、前記の通りであった（実施例４）。ゲノムライブラリーを示 すファージプラークを、１０ｃｍのベトリ皿当たり〜５０．０００プラークの密 度で培養し、文献に記載のようにニトロセルロースに移した（マニアティスら、 モレキユラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−１１９８２）。 ハイブリッド形成前に、６ｘＳＳＣ（ＳＳＣ＝’０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、０．０ １５Ｍクエン酸ナトリウム）、０゜２％フィコル、０．２％ポリビニルピロリド ン、０．２％ウシ血清アルブミン、２ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ　ＡＴ Ｐ、５０μｇ／ｘＱ変性サケ精子ＤＮＡおよび５０μｇ／ｘＱ大腸菌ｔ　ＲＮＡ 中で６５℃で数時間フィルターをインキュベートした。ハイブリッド形成は、０ ．１％ＳＤＳを含有する同じ溶液中で、６５°Ｃで１６〜１８時間行った。［α ”Ｐ］　ｄＡＴＰを用いてニックトランスレーションにより比活性〜２　ｘ　１ ０＠ｃ　ｐｍ／μｇに放射性ラベルしたＬｌブリッド形成に使用した。ハイブリ ッド形成後、６ｘＳＳＣ，０゜１％ドデシル硫酸ナトリウム中で６５°Ｃで広範 に洗浄し、次いでオートラジオグラフィーに付した。複製フィルター上の陽性の プラークを取り、前記のように低密度で再スクリーニングした。 ３種のクローンλＨＧＬＩＦＩ、２および３をこのようにして同定および精製し た。これらのクローンの関係を調べ、ヒトＬＩＦ遺伝子を含むかどうかを調べる ために、各クローンからＤＮＡを調製し、以下の制限エンドヌクレアーゼで切断 した：クローン化ゲノムＤＮＡの全セグメントを切断する５ａ１１、並びにＬＩ Ｆ遺伝子内およびその周辺において切断するＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌ：　（前 記のように）それぞれ、〜３ｋｂｐおよび１．８ｋｂｐおよび０．６ｋｂｐの固 有のフラグメントを生成する。組換ファージＤＮＡを切断し、アガロースゲル上 の電気泳動により分画（第２４図、左図）した後、ＤＮＡをニトロセルロースに 移し、（前記条件下に）マウスＬＩＦｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させ て、ＬＩＦ遺伝子を有するフラグメントを明らかにした（第２４図、右図）。こ の分析により、次のことがわかった （ａ）３種のクローンはいずれも同じであると考えられる、（ｂ）いずれも、マ ウスＬＩＦプローブと相同の領域を有するゲノムＤＮＡの〜９ｋｂｐセグメント を有する；（Ｃ）マウスｃ　Ｄ　Ｎ　Ａと相同の領域は、ヒトＬＩＦ遺伝子に特 有の３ｋｂｐＢａｍＨＩフラグメント上並びに１．８および０．６　ｋ　ｂ　ｐ Ｐｓｔｌフラグメント上に存在する（前記）。このように、３種のクローンはい ずれもヒトＬＩＦ遺伝子を含む染色体Ｄ　Ｎ　Ａのセグメントを有することがわ かった。 工橡且：ヒ）ＬＩＦ遺伝子のヌクレオチド配列の決定マウスＬＩＦｃＤＮＡプロ ーブとハイブリッド形成する前記λＨＧＬＩＦＩの〜３ｋｂｐのＢａｍＨＩフラ グメントをプラスミドベクターｐＥＭＢＬ８”に再クローン化してクローンｐＨ ＧＬＩＦＢａｍｌを生成し、ヌクレオチド配列分析に付した。ヌクレオチドシー フェンシングは、アルカリ変性２本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、遺 伝子中の配列に相補的な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントおよびトリ骨髄芽球症ウィ ルス逆転写酵素をポリメラーゼとして使用して、ジデオキシ法によって行った（ サンガーら、プロシーディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイ エンシーズ、米国、７４：５４６３〜５４６７．１９７７）。 ＬＩＦ遺伝子にかかるＢａｍＨＩフラグメントの全ヌクレオチド配列（２８４０ ｂｐ）を決定し、そのうちの１２９７ｂｐを第２５図に示す。この配列をマウス Ｌ　Ｉ　ＦｍＲＮＡ配列と並べると、成熟ヒトＬＩＦタンパク質をコード化する 配列が、６９３ｂｐのイントロンによって分離された２つのエクソン上に存在す ることがわかった（第２５図）。成熟タンパク質をコード化する領域では、ヌク レオチドおよびアミノ酸配列レベルのいずれにおいても、２種間の相同性が高い 。エクソン１においては８８％の核酸配列（１１４／１２９残基）および９１％ のアミノ酸配列（３９／４３）が、成熟タンパク質フード化領域（位置５８〜１ ８６）と同じである。エクソン２はやや相同性が低く、コード化領域において、 ヌクレオチドレベルで７７％（３１８／４１１）およびアミノ酸レベルで７４％ （１０１／１３６）である。成熟タンパク質全体としては、ここで決定したマウ スおよびヒ）ＬＩＦ配列は、挿入または欠失無く１４０〜１７９位置（７８％） において同じである（第２６図）。そのうえ、相違の多くは、少々の置換にすぎ ない（Ｌｙｓ：Ａｒｇ、Ｇｌｕ：ＡｓｐおよびＬｅｕ　：Ｖａ　ｌ　：Ａｌａ） 。 成熟ＬＩＦのＮ−末端プロリン残基のコドンの５゛で、（第２５図の位置５８） ヒト遺伝子は、はとんどの疎水性リーダーをコード化する領域を通してマウスＬ 　Ｉ　ＦｍＲＮＡ配列と同じである。しかし、このｍＲＮＡおよび遺伝子配列は 、特有のＲＮＡ切断部位（ＴＣＣＣＡＧ）で異なるので、リーダー全体がこのエ クソンにおいてコード化されているのではない［マウント（Ｍｏｕｎｔ、　Ｓ、 　Ｍ、　）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１０：４５９〜４７２．１ ９８２］。５°未翻訳領域およびリーダーの最初の残基を特定するエクソンは、 この切断部位の１０９７ｂｐ５’中に存在しない。マウスＬＩＦ遺伝子において 、疎水性リーダーの最初の６個のアミノ酸配列を特定するエクソンは、同様の切 断部位の〜１．５ｋｂｐ５′に位置する。 ＩＨ４：ヒトＬＩＦ遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断地図の決定 ヒトＬＩＦ遺伝子中およびその周辺の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置を 決定し、この遺伝子の分子フィンガープリント提供するために、ヒトゲノムＤＮ Ａ　（ＲＡＭＯ３細胞系由来）を種々の制限エンドヌクレアーゼで１本および２ 本鎖の状態で切断し、使用したプローブが前記工程３に記載のｐＨＧＬＩＦＢａ ｍｌから誘導し、ニックトランスレーションによって放射性ラベルした３ｋｂｐ のＢａｍＨ１フラグメントであったことを除いては実施例８に記載のようにサザ ンプロット分析に付した。）、ＨＧＬＩＦｌおよびｐＨＧＬＩＦＢａｍｌの分析 から誘導した第２２図に示すデータと同様に、そのように誘導したデータ（図示 せず）を分析することにより、得られた制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第２ ７図に示す。 実施例１１ 本実施例は、酵母細胞中で発現させるためのクローン化ヒ）ＬＩＦ遺伝子の修飾 、並びにそのように誘導された組換ヒ）ＬＩＦの生物学的および生理学的性質の 決定に関する。 第２８図：工程１に関する：　Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃｌに組み込むヒ）ＬＩＦ遺伝子 の修飾に使用するオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチド（ａ）は、コード化 領域の５”末端（第２５図の残基３１〜６９）に相当する。オリゴヌクレオチド （ｂ）は、コード化領域の中央（第２５図の残基１６３〜１８６および８８０〜 ９０３）に相当する。エクソンｌに相補的なこのオリゴヌクレオチドの部分には 、ダラシ二で下線を付し、エクソン２に相補的な部分には、点線を付す。オリゴ ヌクレオチド（Ｃ）は、コード化領域の３′末端（第２５図の位置１２７９から ）に相当する。オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｂ）は、示された制限エンド ヌクレアーゼ切断部位を導入する。 第２９図：工程１に関する：クローン化ヒトＬＩＦ遺伝子の突然変移誘発により 誘導された合成ヒトＬＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれによってコー ド化されたアミノ酸。オリゴヌクレオチド（ａ）および（Ｃ）（第２８図）によ って導入されるＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ［ｌ切断部位を示す。（マウスと同様 に）成熟ＬＩＦの推定Ｎ−末端アミノ酸を＋１とする。 第３０図：工程３に関する：精製天然マウスＬＩＦ希釈物（〇−−−Ｏ）および ガラクトースで誘導したＹ　Ｅ　ｐｓｅｃｌ／　ＨＬ　Ｉ　Ｆ組換体含有酵母細 胞ならし培地（・□・）による、Ｍ１白血病細胞コロニーにおける分化の誘導。 Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃｌ／　ＨＬ　Ｉ　Ｆ組換体含有非誘導酵母培養の培地（○□○ ）は不活性であった。複製７日培養の平均データを示す。 第３１図：工程４に関する：酵母誘導ＨＬＩＦと天然マウス＋１５１−ＬＩＦと の、マウスＭ１細胞特異的レセプターへの結合の競合。 天然”’Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ａの結合を競合する能力を前記のように試験した。 工程に酵母における発現のためのヒ）ＬＩＦ遺伝子の修飾ヒトＬＩＦ遺伝子およ び前記ヌクレオチド配列を有する組換ＤＮＡクローンの単離を前記のように行っ た（実施例１０）。成熟ヒトＬＩＦ’ンバク質をコード化する２エクソンにがか る１２９７ｂｐのＤＮＡのヌクレオチド配列を第２５図に示す。 酵母細胞において、酵母発現ベクターＹＥｐｓｅｅｌを用いてマウス組換ＬＩＦ を予め調製した（実施例５）。このベクターは、ガラクトース誘導性ハイブリッ ドＧＡＬ−ＣＹＣプロモーターから転写された、クルイヴエロミセス・ラクティ スのキラー毒素遺伝子から誘導されたＮ−末端リーダー配列を提供する。 このベクター中でヒ）ＬＩＦ遺伝子によってコード化されたタンパク質を発現す るためには、いくつかの手段で遺伝子を修飾する必要があった。成熟タンパク質 をコード化する領域の５°末端において、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ切 断部位を導入して、クルイヴエロミセス・ラクティスリーダーをフレームに挿入 させ、適当なシグナルペプチダーゼ切断部位（Ｇｌｙ−３ｅｔ）を保持した。 ここでも、マウスｃＤＮＡ　（ｐＬＩ　Ｆ７．２ｂ）に適用したのと同様の修飾 を行った。中央において、６９３ｂｐＯ間に入った配列を除去し、２つのエクソ ンを同じ翻訳リーディングフレームに融合した。３°末端において、天然終止コ ドンの３°に第２の翻訳終止コドンを直接導入し、ＹＥｐｓｅｃｌに挿入するＨ ｉｎｄＩ［［部位を導入した。 修飾はすべてオリゴヌクレオチド介在突然変異誘発によって行った：ＬＩＦ遺伝 子にかかる〜３ｋｂｐ　ＢａｍＨＩのフラグメントをプラスミドｐ　ＥＭＢ　Ｌ 　８°中にサブクローン化しくデンテら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、 １１　：１６４５〜１６５５．１９８３）、１本鎖ＤＮＡはＦ１重感染によって 調製した。イン・ビトロ突然変異誘発は、それぞれ３９．４８および３９塩基の オリゴヌクレオチドを用いて、文献［ニスペット（Ｎｉｓｂｅｔ、　１．　Ｔ、 　）およびバイルハルツ（Ｂｅｉｌｈａｒｚ、　Ｍ、Ｌ）　、ジーン・アナリシ ス・タクニクス（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｅｈｎ、）　、２　：　２３　２ ９．１９８５］に記載のように行い、前記のように遺伝子の５°末端、中央およ び３゛末端を修飾した（第２８図参照）。修飾ヒトＬＩＦコード化領域のヌクレ オチド配列を第２９図に示す。 工程２　：　Ｙ　Ｅｐｓｅｃｌ／ＨＬ　Ｉ　Ｆ組換体の酵母細胞への導入ニス・ セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＧＹ１°（１ｅｕ２　Ｕｒａ３　 ａｄｅ２　ｔｒｐｌ　ａｉｒｙ；Ｇ、ｃｅｓａｒｅｎｉ、　ＥＭＢＬハイデルベ ルク）を、ポリエチレングリフール法によって形質転換した（クレベら、ジーン 、２５　：　３３３〜３４１．１９８３）。形質転換体を選択し、ウラシル不存 在下に、合成最少培地（必要なアミノ酸５０μｇ／ｚＱを補給した、２％炭素源 、０．６７％酵母窒素ベース（ディフコ））上に保持した。２方法のいずれかに より、組換体ＨＬＩＦを調製した。 （１）Ｕｒａ°形質転換体を２％ガラクトース含有非選択的培地中で定常期で増 殖させ、培地のＬＩＦ活性をアッセイした。（２）Ｕｒａ”形質転換体を２％グ ルコース含有選択的最少培地中で定常期で増殖させた。次いで、細胞を洗浄し、 同じ体積の２％エタノール含有選択的最少培地に再懸濁させ、グルコ−スリプレ 、２シランを補うために８時間増殖させた。次いで、細胞を２％ガラクトース含 有合成最少培地で希釈（１：１０）することによってＨＬＩＦインサートの転写 を誘導した。誘導から種々の時間後に培養上澄試料を採り、ミリポアフィルタ− （０，２μｍ）で濾過し、ＬＩＦ活性を直接アッセイした。 工梶鼻：酵母誘導ＨＬＩＦの生物学的性質の決定マウスおよびヒトのＬＩＦの配 列が高度に類似しているという観点から、酵母誘導ヒ）ＬＩＦのマウスＭｌ細胞 に対する活性を評価した。酵母ならし培地の分化誘導活性および白血病抑制活性 のアッセイは、２０％ウシ胎児血清および０．３％寒天の最終濃度のダルベツコ 改良イーグル培地中にマウスＭ１細胞（ホズミ博士、サイタマ・カンサー・リサ ーチ・センター、日本による提供）３００個を含有する１ｉｌＱの培養中で行っ た。アッセイする試料は、寒天培地中の細胞懸濁液の添加前に、連続希釈した０ 、ＩＪＩＩ２の体積で培養器に加えた。培養は、空気中１０％ｃｏ、の水蒸気飽 和雰囲気中で７日間インキュベートした。培養は、解剖顕微鏡を用いて３５倍の 倍率で、分散した細胞のコロナを有するか、または分散した細胞のみから成る分 化したコロニーを記録した。コロニーの形態学的検査は、全培養を２．５％グル タルアルデヒド１酎で固定し、次いで顕微鏡スライド上で乾燥した培養をアセチ ルコリンエステラーゼ／ルクソール・ファスト・ブルー／ヘマトキシリンで染色 することによって行った。 同じ酵母細胞の非誘導培養の培地、非形質転換酵母またはベクターＹ　Ｅ　ｐｓ ｅｃ　ｌのみを含有する酵母の培養の培地ではなく、Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃｌ中にヒ トコード化領域を含有する酵母のガラクトース誘導培養の培地は、Ｍｌコロニー の培養において特有のマクロファージ分化を誘導することができた（第３０図） 。マウスＬＩＦの場合のように、濃度を高めると、酵母誘導ヒト試料も、Ｍ１コ ロニー分化の数およびサイズを徐々に低下した。精製天然マウスＬＩＦと比較す ると、酵母ならし培地はヒトＬＴＦを５０．０００ユニｙト／ｘＱまで含有する ことがわかった。 精製マウスＬＩＦ−Ａ（実施例１）を前記のようにヨウ素化した。 Ｍ１細胞を洗浄し、ｌＯ％ウシ胎児血清含有Ｈｅｐｅｓ−緩衝ＲＰＭＩ培地中に ２．５ｘｌＯ“１５０μｇで再懸濁させた。５０μρ中の細胞を２００．０００ ｃｐｍの”’Ｉ−ＬＩＦ−Ａ　（同じ培地中１０μｇ）および１０μＱの対照培 地または非ラベル純マウスＬＩＦ−Ａの連続２倍希釈物またはＹ　Ｅ　ｐｓｅｃ ｌ／　ＨＬ　Ｔ　Ｆ構造を有する酵母形質転換体のガラクトース誘導もしくは非 誘導培養のならし培地と共にインキュベートした。 Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃｌ／　ＨＬ　Ｉ　Ｆ組換体含有ガラクトース誘導酵母細胞のな らし培地は、マウス腹膜細胞上の特異的細胞レセプターへの天然マウス”’Ｉ− ＬＩＡ−Ａの結合を、天然および組換マウスＬＩＦ−Ａと同程度に、３７℃（第 ３１図）およびＯ′Ｃ（図示せず）において競合することができた。非誘導酵母 細胞の培地およびベクターＹＥｐｓｅｃｌのみを含有する酵母細胞の培地は競合 しなかった。従って、１次アミノ酸配列の高度の相同性に匹敵して、マウスおよ びヒトＬＩＦにおいてレセプター結合領域は高度に保持されることがわかる。 工程５：酵母誘導ヒトＬＩＦの精製、シーフェンシングおよびヨウ素化 ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムに結合し、塩傾斜によって溶出したＬ ＩＦ活性を工程２においてプールしたことを除いては、Ｙ　Ｅ　ｐｓｅｃｌ／　 ＨＬ　Ｉ　Ｆ組換体含有ガラクトース誘導酵母細胞のならし培地中のヒトＬＩＦ を、実施例１の工程２および４によって精製した。精製した酵母誘導ヒトＬＩＦ を、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）５０ｔｔ（ｌ中のヒトＬＩ Ｆ１μｇを、２ＭＮａＣｌ２中のＮａ”’Ｉ　（２，７μｆｆ）１ｍＣｉおよび ０．２ｍＭ　ＩＣＱ５μｇと共に６０秒間インキュベートすることによって放射 性ラベルした。０．０２％トウイーン２０および０．０２％アジ化ナトリウムを 含有するリン酸緩衝（２０ｍＭ、ｐＨ７，４）生理食塩液（０，１５Ｍ）中で平 衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ　（ファルマシア）のカラム反応混合物を通 すことによって、＋″’Ｉ−ＬＩＦを、取り込まれなかった１１５１から分離し た。ヒト”Ｊ−ＬＩＦを８〜２５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアミドゲル上で 電気泳動すると、見掛けの分子量１７０．０００の単一の広いバンドがあられれ た。ヒ）”’Ｉ−ＬＴＦがマウス間１細胞および骨髄細胞に特異的に結合したこ とから、ヒトＬＩＦが、マウスＬＩＦレセプターへの結合能力を有することを確 認した。精製酵母誘導ヒ）ＬＩＦ　（約１０μｇ）を、実施例２に記載のように アミノ末端アミノ酸シークエンシングに付し、単一の配列： １１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｘ−Ａｌａ　、、、。 がわかった。これは、マウス配列（実施例２参照）：Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ− ＋１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｌａ　０．、。 の４番目のアミノ酸から始まることを除いては、ヒ）ＬＴＦの推定アミノ酸配列 （第２６図）と同じである。このことは、精製した酵母誘導ヒトＬＩＦが、マウ ス配列の対応する最初の３個のアミノ酸を欠いているが、生物学的に活性であり 、マウスＬＩＦレセプターに結合し得ることを示している。最初の３個のアミノ 酸は、ＬＩＦの生物学的活性に重要でないことがわかる。 実施例１２ 本実施例は、推定天然ヒ）ＬＩＦ分技を同定し、部分的に精製するための工程を 説明する。 図面は、以下に記載する方法の種々の工程に関する：第３２図：推定ヒ）ＬＩＦ の同定の工程２に関する：ヒト膀胱癌細胞系５６３７　（ＡＴＣＣＮｏ、ＨＴＢ ９）（−口−）粗もしくは（−＋−）ＤＥＡＥ非結合フラクションのならし培地 または天然マウスＬＩＦ−Ａ（−〇−）の種々の希釈物の、マウス１１６ＩＬＩ Ｆ−Ａのマウス腹膜細胞上の細胞レセプターへの結合を競合する能力。ヒトＧ− Ｃ３Ｆ（−ロー）は結合を競合する能力がないことも示されている（未希釈＝５ μｇ／ｘＱ）。 第３３図：推定ヒ）ＬＴＦの同定の工程３に関する：ヒト膀胱癌細胞系５６３７ のならし培地の、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムによる分画、前記マ ウスＬ　Ｉ　Ｆ−Ａの分画（実施例１）と同様の溶出、この分画による個々のフ ラクションの、マウス間１細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。Ａ図は塩傾 斜、Ｂ図は５６３７ならし培地の分画、Ｃ図は比較のためのクレブス■細胞なら し培地の分画を示す。 第３４図：推定ヒトＬＩＦの同定の工程３に関する：レンチルーレクチン・セフ ァロース４Ｂカラムによる、ヒト膀胱癌細胞系５６３７のならし培地の分画（前 記マウスＬ［Ｆ−Ａの分画と同様に溶出（実施例１））およびこの分画による個 々のフラクションの、マウス腹膜細胞の分化コロニー生成を誘導する能力。Ａ図 はα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド傾斜、Ｂ図は５６３７ならし培地の分画、 Ｃ図は比較のためのクレブス■細胞ならし培地の分画を示す。 Ｉ：数種のヒト細胞系のならし培地の、半固型寒天培養中のＭ１マウス骨髄性白 血病細胞の分化誘導および増殖抑制の能力をアッセイした（本発明の実施例５の 工程４と同様）。数種の細胞系はそのような活性を示し、そのうち膀胱癌細胞系 ５６３７の活性は最も高レベルであった。しかし、５６３７細胞系は、Ｍ１細胞 の分化を誘導し得るヒトＧ−Ｃ３Ｆ　［ニコラら、ネイチャー、３１４：６２５ 〜６２８．１９８５；ウェルテ（Ｗｅｌｔｅ、　Ｋ、　）ら、プロシーディンゲ ス・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンンーズ、米国、８２：１５２６〜 １５３０，１９８５］を生成スルコとがわがッティル［）　！　ｆ　（Ｔｏｍｉ ｄａ、　Ｍ、）ら、ＦＥＢｓ・レターズ（ＦＥＢＳ　ｔ、ｅｔｔ、）、２゜ヱ： ２７１〜２７５．１９８６；ネヵーズ（Ｎｅｃｋｅｒｓ、　Ｌ、　Ｍ、）およヒ プルズニーク（Ｐｌｕｚｎｉｋ、　Ｄ、Ｈ，）　、エクスベリメンタル・ヘマト ロジー（Ｅｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、）　、１５　：　７００〜７０３．１９８ ７］。 ５６３７細胞が真正ヒ）ＬＩＦを（Ｇ−Ｃ３Ｆに加えて）生成することを確認す るために、５６３７ならし培地を更に以下の工程２および３に付した。 Ｉ橡２：５６３７細胞のならし培地を２０倍濃縮し、マウス腹膜細胞の特異的細 胞レセプターへの天然マウス…Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ　Ａ１７）ｔ。 合を競合するその能力を試験した。この競合結合アッセイは、本発明の実施例５ の工程５に記載した通りである。５６３７細胞ならし培地は、細胞レセプターへ のマウス”’Ｉ−ＬＩＦ−Ａの結合を競合する活性を有しており、この活性を５ ６３７ＣＭ　（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ａ）ＤＥＡＥ非結合フラクソン中で濃縮した（第３ ２図）。ヒトおよびマウスＧ−Ｃ５Ｆは、非常に高い濃度でも”’Ｉ−Ｌ　Ｉ　 Ｆ−Ａ結合部位を競合しないので、５６３７ならし培地中に、マウスＬＩＦレセ プターを特異性に認識し得る同様のヒ）ＬＩＦ活性が存在することがわかる。こ のことは、１次アミノ酸配列の高い相同性に匹敵して、レセプター結合領域にお けるマウスおよびヒトＬＩＦの保存が強いことを示す。 工撲ｌ：ヒト膀胱癌５６３７細胞のならし培地（１０％ｖ　／　ｖウシ胎児血清 中２１２）を４ｏｒ、σに濃縮し、タレブス■腹水細胞ならし培地からのマウス ＬＩＦに対する前記の場合と同ように、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−５Ｂおよ びレンチル−レクチン−セファロース４Ｂで連続的にクロマトグラフィーに付し た。５６３７細胞のＭ１分化誘導活性（推定ヒ）ＬＩＦ）を、マウスＬＩＦの場 合と同様にＤＥＡＥ−セファロースによるクロマトグラフィーに付すと、いくつ かの活性はカラムに結合しなかったが（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ａ）　、残りは結合し、塩 傾斜により溶出された（ＬｒＦ−Ｂ）（第３３図）。同様に、レンチル−レクチ ン−セファロースクロマトグラフィーにおいて、推定ヒトＬＩＦに挙動はマウス ＬＩＦと同様であり、活性の１部はカラムに結合し、このことは糖タンパク賃上 にマンノース含有炭水化物が存在することを示す（第３４図）。このように、マ ウスＭ１細胞分化誘導におけるその交差反応性、マウスＬＩＦ細胞レセプターを 特異的に認識するその能力、およびその生化学的分画性によって、５６３７細胞 ならし培地中のヒト活性は、マウスＬＩＦの天然ヒト類縁体の基準を満たす。 ５６３７細胞ならし培地からの天然ヒトＬＩＦを、実施例１の工程２および４に よって精製した；工程２から非結合ＬＩＦ活性のプールおよび工程４からＬＴＦ 活性の結合。このプールされたり、ＩＦ活性を、ブラウンリーＲＰ３０ＱＣ８カ ラムを、最初は０．１％ＴＦＡ中のＯ〜６０％ＣＨ、ＣＮ傾斜を用い、次いで０ ．１％ＴＦＡ中の４５〜５５％ＣＨ，ＣＮ傾斜を用いて２回使用したことを除い ては実施例１の工程５と同様に逆相ＨＰＬＣによって分画した。第２の傾斜にお いて、ヒトＬＩＦは５０％ＣＨ３ＣＮで溶出され、８〜２５％傾斜ドデシル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、見掛けの分子量７３．０ ００の主要な銀染色バンドが現れた。天然精製ヒ）ＬＩＦを実施例１０の工程５ に記載のように放射性ヨウ素化し、酵母誘導ヒト”’Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆに関して 記載たように（実施例１１の工程５）、マウス骨髄細胞およびマウス骨髄細胞に 特異的に結合させた。 Ｆｔｃ、２゜ ＦｔＧ、、Ｊ。 ＥｔＧ、　４． ００・２０・４０・６０・８１・Ｏ ｆ ｈＧ　、　５゜ ａ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ　ｂ、マルチ−Ｃ５ＦＦｔＧ、７゜ Ｆｔｃ、８− ｌ１＊＊　…… ＦＩＧ、ρ Ａ　Ｆ　ＯＩ’！　Ｋ　Ｋ　Ｌ　Ｇ　Ｌ　ＯＬ　Ｌ　Ｇ　Ｔ　’＋’　ＫＡ　Ｆ 　Ｑ　ＲＫ　Ｋ　Ｌ　Ｇ　ＣＱ　Ｌ　Ｌ　Ｇ　Ｔ　Ｙ　Ｋ’Ｑ　Ｖ　Ｉ　Ｓ　Ｖ 　Ｖ　Ｘ　Ｑ　Ａ　Ｆ　Ｉ−’）７ｏＳン　＜７９１”ＦＩＧ、　／ｉ ＡｓｎＡｓｎＶａ　ＩＧ　ｌｕ　Ｌｙ　ｓ　ＬｅｕＣｙｓ　Ａｌ　ａＰｒ　ｏＡ ｓｎＭｅ　ｔＴｈｒＡｓ　ｐＰｈｅＰｒ　ｏＳｅｒ　ＰｈＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧ ＡＡＡＡＧＣＴＡＴＧＴＧＣＧＣ（：ＴＡＡＣＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＣＣＡ ＴＣＴＴＴ　３００ＱＩＡ、ｌ　ＣＴ　ｙ　ｒＬｅｕＳｅｒＡ　ＩａＳｅｒ　Ｌ ｅｕ”、　ｈｒＡｓ　ｎ　ｒ　Ｉ　ｅＴｈｒＡｒｏＡｓｃ＋Ｇ　Ｉｒ＋ＬｙｓＶ モ■ ＴＣＧＣＡＴＡ（：ＣＴＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＡＴＡＴＣＡＣＣ ＣＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＴＣ！、００ｈσ１５Ａ。 ＧＩｕＡｌｃＰｈｅＧｌｎＡｒ；ＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｙｃｙｓＧｌ　ｎＬｅ ｕＬｅｕＧｌｙＴｈｒＴｙｒＬｙＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧ τＴＧＧＧττＧＣＣ４こＣＴＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＴＡＣＡＡ　６００Ｆ／Ｇ ７５Ｂ。 ゲルタテχン ｆａｌ　Ｓ’−ＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＣＴＴＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＣ （：ＣＴＣＣＣＣＡＴＣ−３’ｆｉｌ　５’−ＣＣＣＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＴ ＡＴＴＣＴＣＴＡＴＴＡＣＡＣＡＧＣ（：ＣＡＧ（Ｅ（ＥＣＧＡＧＣＣＧＴＴニ ーＥ’（ＣＩ　Ｓ’ＣＡＧＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴ ＴＧＴＧＣＴＧＴＧＡＡＣ−３’Ｆｔｒ：；、２８゜ ｈＧ、／７ ０　−　０）　ｆｆｒ−〜 、−−−＋ＯＬ＋’ ｈＧ、／８゜ ｈＧ、／９゜ ｈＧ、　２０゜ ａｂ　（ｄ　ｅ ボッ ６ｘＳＳＣ６５Ｃ ＥｔＧ、　２２゜ Ｂａｍ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ＤＮＡ ｈＧ、２４゜ Ｍ　０（ｌｃｌＱｔｔ９ｔｃ］（（Ｃｔ　ｔＱ（ｔ７．（ｔＱＣｒｇｇｔ↑゛Ｍ 　（（Ｃ］ｔｔｔＣ（（ＱＱ（ＱＱ（（］ｔＣ１９００ＱＣ９（？Ｑｔ（］ｔ９ Ｃ９゜Ｍ　ｒｃ（ｔｎ−、Ｃ９ＣＩＣ’）７ＣＣ４ｑこｑｇｑｃ：（［（−、Ｃ 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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋な形態の白血病抑制性因子（ＬＩＦ）を含有する組成物。 ２．ＬＩＦがマウスＬＩＦである請求の範囲第１項記載の組成物。 ３．ＬＩＦがヒトＬＩＦである請求の範囲第１項記載の組成物。 ４．グルコシル化または非グルコシル化しＩＦを精製する方法であって、（ａ） 粗しＩＦを陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付し、増加塩勾配によりＬ ＩＦを溶出し、（ｂ）工程（ａ）の生成物を、マンノースに対する親和性を有す るレクチンによるアフィニティカラムクロマトグラフィーに付し、マンノース誘 導体でＬＩＦを溶出し、（ｃ）工程（ｂ）の生成物を陽イオン交換カラムクロマ トグラフィーに付し、増加塩勾配でＬＩＦを溶出し、（ｄ）工程（ｃ）の生成物 を、ＨＰＬＣ条件下に逆相カラムクロマトグラフィーに付し、増加アセトニトリ ル勾配でＬＩＦを溶出することを含んで成る方法。 ５．粗ＬＩＦは、クレブスＩＩ腹水癌細胞ならし培地から成り、該培地からマウ スＬＩＦを精製する請求の範囲第４項記載の方法。 ６．粗ＬＩＦは、ヒト膀胱癌細胞系５６３７ならし培地から成り、該培地からヒ トＬＩＦを精製する請求の範囲第４項記載の方法。 ７．適当な宿主細胞でのＬＩＦ活性を有するポリペプチドの発現をコード化する ヌクレオチド配列を有する組換ＤＮＡ分子。 ８．第１５図、第２６図および第２９図に示すアミノ酸配列から成る群から選択 するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有す る組換ＤＮＡ分子。 ９．前記ヌクレオチド配列は、クローンｐＬＩＦ７．２ｂ、ｐＬＩＦＮＫ２、ｐ ＬＩＦＮＫ３およびｐＨＧＬＩＦＢａｍ１のＬＩＦコード化インサートから成る 群から選択するＬＩＦコード化インサートに相当する核酸プローブとハイブリッ ド形成する請求の範囲第７項記載の分子。 １０．ヌクレオチド配列が、真核生物宿主での第１５図、第２６図および第２９ 図に示すアミノ酸配列から成る群から選択する成熟ポリペプチドアミノ酸配列と 少なくとも部分的に相同である成熟ポリペプチドを含むポリペプチドの発現をコ ード化する請求の範囲第６項記載の分子。 １１．成熟ポリペプチドは、第２９図に示すアミノ酸配列と完全に相同である請 求の範囲第１０項記載の分子。 １２．前記ヌクレオチドは、ＬＩＦを結合する細胞レセプターに結合するポリペ プチドの発現をコード化し、ＬＩＦの細胞レセプターへの結合は、マウスまたは ヒトの天然ＬＩＦによって競合的に阻害されるものである請求の範囲第７項記載 の分子。 １３．複製開始点を更に含み、それによりクローニングベクターとして使用する のが適当な請求の範囲第７項記載の分子。 １４．前記ヌクレオチド配列に操作可能に結合するプロモーター配列を更に含み 、それにより発現ベクターとして使用するのが適当な請求の範囲第１３項記載の 分子。 １５．請求の範囲第１４項記載の組換ＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞であ って、前記プロモーターのコントロール下にＬＩＦ活性を有するポリペプチドを 発現する細胞。 １６．ＬｌＦ活性を有するポリペプチドの製法であって、（ａ）請求の範囲第１ ３項記載の宿主細胞を準備し、（ｂ）前記細胞を、ＬＩＦ活性を有するポリペプ チドの発現を誘導する条件下に培養し、（ｃ）前記ポリペプチドを回収すること を含んで成る方法。 １７．ポリペプチドが、第１５図、第２６図および第２９図に示すアミノ酸配列 から成る群から選択するアミノ酸配列と少なくとも部分的に相同である成熟ポリ ペプチドを含む請求の範囲第１６項記載の方法。 １８．成熟ポリペプチドが、第２９図に示すアミノ酸配列と完全に相同である請 求の範囲第１６項記載の方法。 １９．ポリペプチドが、宿主細胞によってグリコシル化されている請求の範囲第 １６項記載の方法。 ２０、宿主細胞が酵母細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。 ２１．プロモーターが、ガラクトース誘導ハイブリッドＧＡＬ−ＣＹＣプロモー ターである請求の範囲第１６項記載の方法。 ２２．前記分子が、前記ヌクレオチド配列に操作可能に結合するシグナル配列を 更に含み、該シグナル配列は、ポリペプチドの分泌を司るリーダー配列の発現を コード化している請求の範囲第１６項記載の方法。 ２３．シグナル配列は、クルイヴェルミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子の シグナル配列から誘導される請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．宿主細胞が、ビール酵母菌種の細胞である請求の範囲第２０項記載の方法 。 ２５．宿主細胞が哺乳動物の細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。 ２６．宿主細胞が、レトロウイルス発現ベクターで形質転換されたものである請 求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．ベクターが、モロニーマウス白血病ウイルスから誘導されたものである請 求の範囲第２５項記載の方法。 ２８．ベクターが、骨髄増殖性肉腫ウイルスのＬＴＲエンハンサーを更に含む請 求の範囲第２７項記載の方法。 ２９．前記ベクターが、天然ＬＩＦｍＲＮＡの３′未翻訳部位を欠く請求の範囲 第２８項記載の方法。 ３０．宿主細胞が造血細胞である請求の範囲第２５項記載の方法。 ３１．宿主細胞が大腸菌細胞である請求の範囲第１６項記載の方法。 ３２．ベクターが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／ＬＩＦ融合タンパク 質の発現を司るベクターである請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３．ベクターが、グルタチオンＳ−トランスフエラーゼ／トロンビン分解部位 ／ＬＩＦ融合タンパク質の発現を司るベクターである請求の範囲第３２項記載の 方法。 ３４．請求の範囲第１６項記載の方法により調製されるＬＩＦ活性を有するポリ ペプチド。 ３５．アミノ酸配列がいずれの天然型ＬＩＦのそれとも同じでないＬＩＦ活性を 有するポリペプチド。 ３６．天然マウスＬＩＦのアミノ酸残基１７９〜１８７を含むアミノ酸配列を有 する請求の範囲第３５項記載のポリペプチド。 ３７．天然マウスＬＩＦの少なくとも最初の３個のアミノ酸残基を欠くＮ−末端 を有する請求の範囲第３６項記載のポリペプチド。 ３８．骨髄性白血病細胞の増殖を抑制する方法であって、ＬＩＦ活性を有するポ リペプチドの薬学的有効量を薬学的に許容し得る形態で投与することを含んで成 る方法。 ３９．Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを投与すること をも含んで成る請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０．ＬＩＦ活性を有するポリペプチドを、薬学的に許容し得る担体および／ま たは希釈剤１種またはそれ以上と共に含有する薬剤組成物。 ４１．前記ポリペプチドが、第１５図、第２６図および第２９図に示すアミノ酸 配列から成る群から選択するアミノ酸配列と少なくとも部分的に相同である成熟 ポリペプチドを含む請求の範囲第４０項記載の組成物。 ４２．成熟ペプチドが、第２９図に示すアミノ酸配列と完全に相同である請求の 範囲第４１項記載の組成物。 ４３．血球の生物学的調節物質を更に少なくとも１種を含有する請求の範囲第４ ０項記載の組成物。 ４４．前記他の調節物質が、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペ プチドである請求の範囲第４３項記載の組成物。 ４５．クローンｐＬＩＦ７，２ｂ、ｐＬＩＦＮＫ１、ｐＬＩＦＮＫ３およびｐＨ ＧＬＩＦＢａｍ１のＬＩＦコード化インサートから成る群から選択するＬＩＦコ ード化インサートの配列またはサプ配列、または相当するｍＲＮＡの配列または サプ配列に対応する核酸配列少なくとも１個を含む診断用試薬またはプローブ。