JPH01503355A - 多能性造血細胞集団の誘導分化へのインターロイキン‐１の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 □ 多能性造血細胞集団の誘導分化へのインターロイキン−１の使用 主里■１景 本発明は一般的にはリンホカインに関し、特に造血幹細胞の分化および増殖を促 進するための特定のリンホカインの使用に関する。

造血とは造血または血球形成組織に認められる分化的に多能性の幹細胞から種々 の成熟血球型が分化する過程を称する。これらの組織は種々の体の部位に認めら れ、例えは骨髄、肺臓および胸腺である。この過程においてより未熟で未分化の 幹細胞から前駆細胞の明白な亜集団が生じる。続いての分化過程の結果前駆細胞 並集団から血球の成熟群（例えば、顆粒球、単球、好酸球、巨核球および肥満細 胞）へ分化する。

最近の造血の研究では、造血の作用因子としての種々のホルモン様タンパク質ま たは増殖因子の役割を評価しはしめている。

分化過程の初期の段階を制御する増殖因子は集合的に多細胞系統増殖因子として 知られている。前駆細胞から専門化さ杵た細胞型が分化する後期段階に作用する ものは細胞系統一特異的増殖因子として知られている。細胞系統一特異的および 多細胞系統増殖因子間の共奏作用が血球細胞の固体発生の調整的役割をはたして いるように思われる。

そのような共奏作用関係の見本は以後へモポイエチン−１（Ｈ−１）と称する増 殖因子およびある種の細胞系統一特異的コロニー刺激因子の共同活性である。Ｈ −１は他の増殖因子と提携して多能性幹細胞の分化を誘導するその能力により同 定された多細胞系統増殖因子である。　ＧＭ−ＣＳＦまｒこは他のコロニー刺激 因子不在下においては、Ｈ−１は分化的に未熟な造血細胞の培養細胞に検出でき る影響を及ぼさない。しかしながら、ｍ−Ｃ３Ｆ、　Ｃ３Ｆ−１またはある種の 他のコロニー刺激因子存在下、任意のコロニー刺激因子単独で細胞増殖および分 化が誘導される造血細胞よりも初期の造血細胞のそれを刺激する。ヒト膀胱癌腫 細胞の無血清培養から単離されたヘモボイエチン−１の予備的特徴づけ研究およ び単球／マクロファージ細胞系統一特異的増殖因子であるＣ３Ｆ−１と連携した 検定結果がＢａｔｅｌｍｅｚら〔２土ニル　オブ　セルー−フィジオロジ−（ム 堕旦ユ賎ム）皿３７０（１９８５）　）　、　Ｊｕｂｉｎｓｋｉら〔プロシー− ゛イング　オプ　ザショ　ル　サイエンス　オブ　ザＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ）　８２：２７６４（１９８５））および５ｔａ ｎｌｅｙ　ら（−ｋｚｔ＝　（Ｃｅｌｌ）旦二６６７（１９８６）　）により報 告されている。

造血の初期の段階で細胞分化を誘導するヘモポイエチン−１の能力を考えて、治 療薬としての増殖因子に対する相当の興味が生じている。ヘモボイエチン−１に 帰因する活性を持つタンパク質の治療上の利用としては化学療法、放射線処置ま たは放射線暴露により生じた血液学上の異常の処置；ウィルスまたは細菌性病原 体に対する免疫応答の促進；白血病の処置；および骨髄移植に伴う使用などが含 まれる。

免疫原刺激に応答してマクロファージおよび他の細胞型により放出されるタンパ ク質にインターロイキン−１（ＩＬ−１）活性は帰因する°、この系列のタンパ ク質は生物学的活性の複雑な様相を伴っている。ＩＬ−１はインターロイキン− ２の放出の誘導を経た胸腺細胞分化の誘導およびＢリンパ球の分化および成熟を 刺激できる第一の免疫刺激信号である。さらに、ＩＬ−１はプロスタグランジン 産生および熱の誘導および傷の癒着の促進につながっている。ＴＬ−１に関する 有用な文献の総括はＯｐｐｅｎｈｅｉｍらによるイヌ−仁ユジ止ニー上」謬Ｆ− （１ｙ且肥Ｌユ報工α　ユニ　４５（１９８６）およびＤｕｒｕｍらによるアニ ュアル　レビューオブ　イムノロジー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　 ３　：　２６３（１９８３）などにある。

本発明以前には、ＩＬ−１が多細胞系統増殖因子としての活性を示す事は観察さ れていない。ＧＭ−ＣＳＦと連携したＩＬ−１の生物活性が以後へモポイエチン −１と称される増殖因子のそれと一致したという予期されなかった発見に本発明 は基づいている。さらに、物理化学的および血清学の指標はＩＬ−１およびヘモ ボイエチン−１は同一物である事を示している。この発見は有用量の実質的に均 一な組み換え体ヒトＩＬ〜１の産生を可能にした最近の発明により容易にされた 。

光肌ｑ翌り 本発明は有効量のコロニー刺激因子と伴に有効量のインターロイキン−１を哺乳 類に投与する事を特徴とする哺乳類の造血幹細胞の増殖および分化を誘導する方 法を提供する。その最も好適な様相において本発明は造血細胞分化を誘導するヒ トの処置の方法を提供する。

光里夏旧史星説ユ ■シー１活性はここでＩＬ−１αおよびＩＬ−１β（Ｍａｒｃｈ　ら、ネーチャ 二（Ｎａｔｕｒｅ）　３１５　：　６４Ｈ１９８５）　：ｌと称する２つの別々 の相関するタンパク質に帰する。両方の分子とも通常約３０，０００ダルトンの 分子量を持つより大きな前駆体として合成され、それらは続いてタンパク質分解 的に処理され、約１７．５００ダルトンの分子量を持つ成熟型を得る。しかしな がら、ＩＬ−１αと異なり、ＩＬ−１βのより大きな前駆体はその成熟型にタン パク分解切断される前は生物学的に不活性である。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β のすべての活性型が本発明の処置法で有用である。ここで使用されているごとく 、“インターロイキン−１″および”ＩＬ−１″はＩＬ−１αおよびＩＬ−１β 両方の天然および遺伝子組み換え型を集合的に称する。

在する造血に関する生物活性を持つタンパク質も包含する。アミノ酸配列が実質 的に同一とは配列が同一であるがまたは合成タンパク質および天然型の間に不利 な機能的相違点を生じさせない１つまたはそれ以上のアミノ酸変化（欠損、付加 または置換）がある事を意味する。

本明細書を通じて、一般的または集合的意味において、“コロニー刺激因子”と は骨髄に認められる前駆体細胞を誘導して成熟血球細胞型へ分化せしめるリンホ カインの群を称する。特定のコロニー刺激因子、またはＣ８Ｆ、は前記の群に含 まれており、以下のものが挙げられる： （１）顆粒球−マクロファージ　コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）　１Ｃａｎ ｔｒｅｌｌら、プロシー−゛イング　オブ　ザ　ショ　ル　アカー゛ミー　オブ 　サイエンス　オブ　ザＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

釘１Ｊ旦Ｕ　斂：　６２５０（１９８５）　；（２）顆粒球コロニー刺激因子（ Ｇ−ＣＳＦ）　；　Ｎ１ｃｏｌａら、乏土二±上（３）マクロファージ　コロニ ー刺激因子（Ｍ−Ｃ５Ｆまた番よＣ３Ｆ−１）　ｉＫａｗａｓａｋｉら、サイエ ンスＣ鉦江匹紋２３Ｌ：　２９１（１９８５）；５ｔａｎｌｅｙ゛　ジャー　ル 　オブ　セルーー　バイオ　ミスト冨−（ムＣｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）２１ 　：　１５１　（１９８３）　；（４）イ７タ０イキ７−３　（ＩＬ−３）　； Ｙａｎｇら、旦（Ｃｅｌｌ）　４７：　３　（１９８６）　。

（５）エリスロボイエチン（Ｅｐｏ）；　Ｍｉｙａｋｅら、ジ　−　ル　オブバ イオロジカル　ミス　Ｌ＝ｌｕ扱二川堕、用　２５２　：　５５５８（１９７７ ）　；および （６）赤芽球−増幅活性（ＥＰＡ；またＢＰＡまたはバースト促進活性としでも 知られている）　’；　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ　らジャー　ル　オブバイオロジカ ル　ミスト１−（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　’１￥９：９９９２（１９８４ ）　；　Ｇａ５５ｏｎら、ネーチャ（Ｎａｔｕｒｅ）　３１５　ニア６Ｂ（１９ ８５）。

個々のＣ５Ｆは特定の細胞株を培養した培地から精製されるか、またはいくつか の場合は、遺伝子組み換え体微生物または細胞により発現される。ＧＭ−Ｃ５Ｆ はクローン化でき、ＥＰＡ１８３３５０に開示されている方法により発現される 。この出願の開示内容および前に引用した論文は引用によってここに含まれてい る。

ＩＬ−１βはＥＰＡ１６５６５４に実質的に記載されているごとく、末梢血液白 血球の細胞培養物から精製できる。しかしながら、最近の実験は細菌発現系を用 いてＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの組み換え型（γＩＬ−１αおよびＴ　ＩＬ− １β）を効率的に産生できる事を示した。

それ故これらの型が好適である。これらの技術による産生の詳細は以下のパラグ ラフで与えられる。

１■Ｌ−αおよび　ＩＬ−１の Ａ　ベ　−の 成熟ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βはファージλＰＬプロモーターおよびＣｌ８５ ７ｔｓ不耐熱性レプレツサーの制御上大腸菌中で発現できる。７ｒｔ、−１αお よびγＩＬ−１β産生のための発現プラスミドは、プラスミドｐＰＬｃ２８（Ａ ＴＣＣ５３０８２）、プラスミドｐｇＫ２２３−３　（ファルマシア　ファイン 　ケミカルズ　ウプサラ　スエーデン、から市販品として入手可能）およびＩＬ −１αクローンのＩＯＡ（Ｍａｒｃｈら前記文献；　ＡＴＣＣ３９９９７）およ びＩＬ−１βクローンのＩＬ−１−１４（ＡＴＣＣ３９９２５）を含むプラスミ ドから以下のごとくして構成できる。

ＩＬ−１αのための発現ベクターの生成には５ｅｔＩＩ３（ヌクレオチド３３７ −３３９）からＡｌａ”葛（ヌクレオチド８１１−８１３）に及ぶＩＬ−１α遺 伝子の３゛部分を発現ベクターｐＰＬｃ２８内へ挿入する。この事は１０Ａクロ ーンから４９９塩基対のυｕ　Ｉ　−Ｎｄｅ　Ｉフラグメントを切り出し、それ に下記の合成オリゴヌクレオチド　リンカ−を結合する事により達成される： ＡＡＴＴＣＴＡＧＧＡＴＡＡＴＴＡ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＴ 　ＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴ　ＴＡＣＡｔ、Ｔ　ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　 Ｔにのリンカ−はＩＬ−１αＳｅｒ”　”−５ｅｒ目７配列に加えて、リポソー ム結合部位であるＡｌｕ　ＩおよびＥｃｏ　Ｒ１末端およびＡＴＧ開始コドンを 含んでいる。　ｐＰＬｃ２８は続いてＥｃｏ　Ｒ１及びＮｄｅ　Ｉで完全に消化 し、アガロースゲル電気泳動により生じたより大きなフラグメントを単離する。

リンカ−１１〇八クローンおよびプラスミドフラグメントをＴ４リガーゼを用い て融合し、ここでｐｌＬＰｃの名前を持つ発現プラスミドを得る。ｐｌＬＰｃの 構成のより詳細な点はＥＰＡ１８８．８６４の開示内容に見る事ができ、この開 示内容もここＣａ５ｔｅｌｌａｚｉら、モレキュー−ゼネール　ゼネーイ、・ク ス造謄セ匹工話旦匹！肚ユＤ〜　■’７：２１１）の形質転換に用い、アムピシ リン抵抗性となす。プラスミドに担われたＩＬ−１α遺伝子を発現させるには、 形質転換したΔＨ１の培養物をＬ−ブロス中アムピシリンなしで増殖せしめる。

培養液が約０．５のＡ７□。に達したら、培養温度を約４３°Ｃに上げ不耐熱性 ＰＬプロモーターの抑制を促進する。上昇せしめた温度で約１時間保った後、細 胞を遠心分離およびドライアイス／メタノール混合物中での急速凍結により採取 する。細胞抽出物中のＩＬ−１α活性はＣｏｎ１ｏｎ、　乏土二±ル　オフ゛　 イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　１３１　＝　１２８０（１９８３） 、Ｋｒｏｎｈｅｉｍ　ラ、’；ヤー　ル　オプ　エクスペ１メン　ル　メー゛イ スｌ（ムｈユハム）　１６１　：４９０（１９８５）およびまた同時係属中の含 まれている）、により記載されている胸腺細胞の有糸分裂またはＩＬ−１変換検 定により検定された。精製過程に関する詳細は以下に示す。

ｒ　ＩＬ−１βはここでｐｌＬＰβと称する類似のプラスミドの構成により産生 される。このベクターは、ｐ■２２３−３のＢａｒｎ旧／　Ｅｃｏ　Ｒ１フラグ メントをλＰＬプロモーターを含むｐＰＬｃ２８からのＳａｕ　３Ａ／ＥｃｏＲ Ｉ”ｅ置き換える事により構成されたｐｌＬＰｃ（Ｍａｒｃｈ　ら、前記文献） から組み立てられる。このプラスミドをＥｃｏ　ＲＩおよびＰｓｔ　Ｉで完全に 消化し、最も大きいフラグメントを（１）ヒトルー１β遺伝子を含む（Ａｌａ目 ’からＣ００）ｌ末端が活性タンパク質をコードしている）　ｐｌＬ−１−１４ （ＡＴＣＣ３９９２５）からの６６９塩基対り虹■／Ｐｓｔ　１フラグメントお よび（２）下記のＥｃｏＲ１／Ｈｐａ１合成ヌクレオチドに連結する： ＡＡＴＴＣＴＡＧＧＡＴＡＡＴＴＡ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＣＧＡ 　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ、　ＣＴＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴ　 ＴＡＣＣＧＴ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＡＧＴ　ＧＡＣＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＧ ＣＧＡＧ　ＧＣプラスミドｐｌＬＰβは続いて大腸菌ΔＨ１またはＰＬ転写の不 耐熱性レプレッサーを含む他の細胞の形質転換に使用する。約０．５のＡｔ２゜ まで増殖せしめた後、前に記載したごとく熱誘導により１１Ｌ−１β遺伝子の発 現が得られる。７１Ｌ−１αの場合のごとくγＩＬ−１β活性は前に引用した胸 腺細胞の有糸分裂またはＩＬ−１変換検定を用いて同定できる。

Ｂ　ンパク　マｌ 均一なタンパク質を得る為に用いられる一般的な精製図式には細胞ペレットから の最初の酸抽出、続いてのＳＰＳ　（スルホプロピルセファデックス；ファルマ シア）カラムクロマトグラフィ一工程およびＤＥＡＥ−セファセル（ファルマシ ア）カラムからの溶出が含まれている。最終的精製のため、ｒ　ＩＬ−１αを含 むカラム分画は、続いてフェニル　セファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）ニ 加え、一方ＩＬ−１β含有分画はプロジオン　レッド　アガロース（ベセスダ　 リサーチ　ラボラトリ−、ガイセルスバーグ、メリーランド、米国）カラムに注 ぐ、内毒素による汚染から生酸物を保護するため、精製プロトコールを通して無 菌緩衝液を使用する。クロマトグラフ分画はバイオ−ラド総タンパク質検定（バ イオ−ラド　ラボラトリーズ、リッチセント、カリホルニア、米国）によりタン パク質濃度をモニターし、Ｋｒｏｎｈｅｉｍニより記述されている５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ　（ジ　−　ル　オブ　エクスゝ１メン　ル　メースン（へハＬ伽ム）部− ：　４９０（１９８５）　）またしよ他の適した技術により精製の進展を評価す る。カラム分画のＩＬ−１活性は前に参照したＩＬ−１検定により決定できる・ 最初の抽出緩衝液のｐＨを変化させた実験より、ｐ）１２．８での大腸菌細胞懸 濁液からγＩＬ−１αの抽出が夾雑物を有意な量沈澱せしめ、一方７１Ｌ−１α の回収を良好にする事が示された。しかしながら２．０および３．５の間のｐＨ 変異を持つ緩衝液が成功裡に使用できた。ｙｏ、−ｉβが含まれる同様の実験で は、望まれないタンパク質が沈澱する一方、γＩＬ−１βが可溶化するのはｐＨ ３，９が最適であった。しかしながら３．５および４．５の間のｐＨ変異を持つ 抽出緩衝液が成功裡に使用できる。この最初の抽出工程のための最適のｐＨは発 酵バッチ間で変化するであろう。このため、大量の物質が含まれる場合は特に最 適ｐＨを決定するため小規模な試行が行われるであろう。

最初の酸抽出を達成するには、前に記載したごとくして得られた細胞ベレットを ５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭフェニルメチルスルホニル　フルオリド（ＰＭＳ Ｆ）を含むｐＨ８の３０ｍＭのトリス−）ＩＣ／緩衝液に懸濁するが、その際約 ２．５リツトルの大腸菌培養物から得られるペレットを懸濁するのに約２０ｄの 緩衝液を用いる。得られた懸濁液はドライアイス／メタノール浴中で急速に凍結 せしめた後融解する。次に５ａ＋ＭＥＤＴＡおよび２５０ｘ／ｄのシンザイムを 含む選択されたｐＨの２００ｄの３Ｏｎ＋Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液を懸濁液 に添加する。得られる酸懸濁液は３７°Ｃの水浴上６０分間インキュベートする 。インキュベーションに続き、抽出物はドライアイス／メタノール浴中で急速に 凍結し、融解した後３８、　ＯＯＯｘｇで４５分間４°Ｃにて遠心分離する。上 澄液を注意深くデカントし次の精製工程で使用する。

前記の抽出工程からの上澄み液を、樹脂へのＩ’Ｌ−１活性の非特異的吸着を減 少せしめるため０．１！）リドンＸ−１００（ポリオキシエチレンエーテル；シ グマケミカルカンパニー、セントルイス、ミズーリ、米国）および１０％子牛脂 児血清で前もって条件を整えであるＳＰＳ　Ｃ−２５カラムに注ぐ。最初に１． ＯＮ　ＮａＯＨの添加により粗抽出のｐＨを約４．０に上げ、得られる溶液を前 もって１抛ｉクエン酸ナトリウム、ｐＨ４，０で平衡化しであるＳＰＳ　Ｃ−２ ５を含む２０Ｘ２．５　ｃｍのカラムに注ぐ。カラムを３カラム容量の１０＋ｏ Ｍ２−　（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨｓ、ｏで 洗浄し、所望のタンパク質はカラムから１０ｍＭ　）リス−Ｈ（Ｊ、ｐＨ８，１ で溶出する。１０雌の分画を集め、５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析う、更なる精製のた め４°Ｃで保存する。

前の工程からのＩＬ−１活性含有分画を合併し、前もって１０ｍＭ　）リス−Ｈ Ｃｌ、ｐｏ８．１で平衡化したＤＥＡＥ−セファセルを含む１．５×２．５ｃｍ ０カラムに加える。ＤＥＡＥカラムを５カラム容量の出発緩衝液で洗浄し、総計 で２カラム容量のＮａＣ１直線濃度勾配で溶出せしめる。ＴＩＬ−１αを溶出す るには０　６００＋ＩＩＭ　ＮａＣ１の濃度勾配範囲を用い；ｒｌＬ−１βのた めには０　４００ｍＭ　ＮａＣ１の濃度勾配を使用しく両方の勾配とも１０１ト リス−ＨＣｌ、　ｐｏｓ、１中）、５ｍＦの分画を集め、５ＯＳ−ＰＡＧＥで分 析し、更なる精製のため４°Ｃに保つ。

ｒ　ＩＬ−１α含有分画に充分量の固体硫酸アンモニウムを添加し、０．５Ｍの 最終濃度とする。得られた溶液はその後１０ｎ＋Ｍ　）リス−ＩＣ／緩衝液（こ れも硫酸アンモニウムが０．５Ｍ）　ｐＨ８，１で平衝化したフェニルセファロ ースＣＬ−４Ｂを含む３０Ｘ２．５　ｃｍカラムに応用スる。カラムは５カラム 容量の出発緩衝液で洗浄し、０．５Ｆで始まり、ＯＭで終了する約３カラム容量 の硫酸アンモニウムの減少直線濃度勾配により溶出する。最後に、カラムを約１ ００−の１０１トリス−ＨＣｌ、　ｐ）１８．１で溶出し、１０ｍ２づつの分画 を集めｒ　ＩＬ−１α含有分画をプールし、濃縮してＫｒｏｎｈｅｉｍら（前記 文献）により記載されるごと＜　ＳＰＳ　Ｃ−２５に再び注ぎ、ｐＨ８，２の１ ０ｍＭリン酸緩衝塩？容液（ＰＢＳ）を用いてγＩＬ−１αを溶出する。

ＤＥＡＥ力ラム工程から得られるγＩＬ−１β含有分画を１０ｍＭ　）リス−Ｈ Ｃｌ緩衝液で１＝４に希釈してイオン強度を４０ｍＭ以下に減少せしめた後、ｐ Ｈ８，１の１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液で前もって平衡化しであるプロジオン レッド　アガロースを含む２０Ｘ２．５゜、のカラムに注ぐ。カラムを５カラム 容量の出発緩衝液で洗浄した後、５カラム容量のＯからＩＭのＮａＣ１直線濃度 勾配を持つ１０ｍＭトリス−ＩＣ／緩衝液、ｐＨ８，１で溶出する。１０−の分 画を集め、分析した後前記ｒ　ＩＬ−１αで記載したごとく濃縮する。精製され たγＩＬ−１αおよびｒ　ＴＬ−１βは一７０’Ｃで保存する。

Ｃ°告　１の 造血増殖因子活性を検定するため、特定のＣＳＦと共に５−フルオロウラシルの 投与を伴うネズミ非付着性骨髄細胞の増殖を誘導す之試料の能力で試料を評価し た。以下に記載する検定にはＧＭ−Ｃ５Ｆを用いているが、造血細胞誘導活性の 検定には他のコロニー刺激因子を用いる事もできる。

８−１２週令のＣ３Ｈ／Ｈｅｊ　マウス（ジャックソン　ラボラトリ−）に１５ ０■／ｋｇｌＶの用量で５−フルオロウラシルを投与する。この処置の次の日に 動物を殺し、大腿骨および脛骨を除去する。

筋肉組織を除き、骨を４°Ｃにて媒質中に保つ。検定過程を通して用いられる媒 質は１０％ウマ血清（ＨＳ）を補い、２５−５０ｊｔｇ／、ｒｎｌのペニシリン 、ストレプトマイシン、およびゲンタマイシンおよび５　Ｘ１０−５Ｍの２−メ ルカプトエタノールを含むＲＰＭ１１６４０である。しかしながら、最初の骨髄 細胞の採取は血清を含まない媒質中で実施する。

注射筒に冷媒質を満たし、骨の関節のキャップまたは末端をはさみで切る。２５ ゲージの針を通して媒質を注入する事により骨から骨髄細胞が遊離する。各々の 大腿骨に対して４ｄの媒質を使用し、一方脛骨当り２ｄが使用される。細胞塊は １８ゲージ針を３度通す事により崩解せしめる。次に細胞を一度２２ゲージ針を 通し、最後に２５ゲージ針を通してポリプロピレンチューブ内へ入る。得られる 懸濁液は続いて６−１０°Ｃにて１０００　２０００ｒｐｍで遠心分離する。細 胞を採取し、血清を含んだ新鮮な媒質に再懸濁し、ｄ当り６Ｘ１０’の生きてい る核のある細胞濃度となす。

細胞を９６ウエル平底マイクロタイタープレート（５０μｌの容量）内の検定さ れる試料の希釈系列に加える。各々の試料はＣ３０Ｊ１１の容量で）　Ｃａｎｔ ｒｅｌｌらのブユ之二ｆイング　オブ　ブー工注２」−ル　アカー゛ミー　オブ 　サイエンス　オブ　ザＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、１１２　：　６２５０（１９８５）お よびＥＰＡ１８３．３５０　（その開示内容はここに引例として含まれている） に記載されているごと＜　ＨＰＬＣで精製された２０ユニツト／ＩｄのＧＦＩ− Ｃ５Ｆを含む媒質で希釈された試料を含んでいる。陰性の対照としてＧＭ−ＣＳ Ｆのみを含むウェルを準備する。

陽性の対照として２０ユニット／ｄＧＭ−ＣＳＦで連続的に希釈された培養ＨＢ Ｔ５６３７付着性ヒト膀胱癌腫細胞（ＡＴＣＣ）ｌＴＢ９）のｉ縮上清の試料を 用いる。Ｈ−１活性を含む媒質を得るため、細胞を１０％子牛脂児血清（ＦＣＳ ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０培地中コンフルエントになるまで増殖せしめる。

細胞をその後湿り気を与えた５％ＣＯ２を含む空気雰囲気下７２時間培養する。

得られる培養培地を採取し、２０００ｘｇで遠心分離して細胞破片を除き、直ち に使用するか将来のために凍結する。硫酸アンモニウムで（８０％飽和）でタン パク質を沈澱せしめる事により培地が濃縮でき、再懸濁し、ＰＢＳ中ｐＨ７，２ ，４°Ｃにて透析する。

検定されるべき試料を含むプレートは３７°Ｃにて５％ＣＯ□中７２時間インキ ュベートする。この期間の終期に２５μＩ中２μＣｉの３Ｈ−チミジン（デュポ ン、ウィルミングトン、プラウエア、米国；７０　８０Ｃｉ／ｍＭ）で１６−１ ８時間細胞をパルスラベルする。細胞をガラス繊維フィルター上に採取し、蒸留 脱イオン水で溶菌し、液体シンチレーション計測により取り込まれた放射活性を 分析する。Ｈ−１活性の単位は陽性対照標準物と比較して計算される。

活性の単位は標準品に比較して５０％最大ｃｐｍを与えるのに必要とされる希釈 率の逆数として定義される。

Ｄ　ＩＬ−１の１ 本発明の方法の実施に際しては精製ＩＬ−１を処置に必要とする治療有効用量水 準で哺乳類に投与する。有効用量水準は、より低い用量水準で処置を始め、造血 細胞の増殖および分化が起こるまでＩＬ−１投与量を上げていく事により決定さ れる。一般的に、体重聡当り１０から１．０００．０００単位のコロニー刺激因 子活性と共に投与してその治療用量は体重眩当り１０から１．ＯＯｏ、０００単 位のＨ−１活性の範囲になるであろう。使用されるコロニー刺激因子は意図する 治療効果に依存してＧＭ−Ｃ３Ｆ、　Ｇ−Ｃ５Ｆ　５ＣＳＦ−１、ＩＬ−３、Ｅ ｐｏまたはＥＰＡまたはコロニー刺激因子の混合物でありうる。

注射は投与の最も実際的な方法であり、静脈内、筋肉内または腹腔内のいづれで もよい。中性に緩衝化された塩溶液または同一種の血清アルブミンを混和した塩 溶液が適当な希釈剤である。好適には同一種型のＩＬ−１を使用する。

以下の実施例はＩＬ−１およびヘモポイエチン−１として以前知られていた因子 が同一物である事を示す血清学的および物理化学的研究を記載している。

実−」１−別一」− Ｈ８１０Ｍ１゛のＨ−１およびＩＬ−１′　の丑″１ＨＢＴ細胞培養からの培養 培地（コンディションド・メディウム：ＣＭ）を採取し、ｉｏ、　ｏｏｏダルト ン分子量カットオフを持つ中空繊維限外濾過装置を用いて濃縮する。得られる濃 縮ＣＭを２０ｍＭトリス−ＨＣＺ、ｐＨ７，５および０．０１％トゥイーン２０ （ポリオキシエチレンソルビタン　モノラウラート、シグマ）に調製し、同一の 緩衝液でスラリー化したセファロースＣＬ−６８−２００と４°Ｃにて接触せし める。攪拌しながら硫酸アンモニウム固形物をスラリーに徐々に添加し、約７５ ％飽和の最終濃度となす。得られる混合物は一夜放置した後樹脂を減圧濾過によ り回収し、カラム内へ注ぐ。カラムを２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５， ０，２χトウイ一ン２０中３Ｍから叶の範囲の硫酸アンモニウムの濃度こう配で 溶出する。

分画を集め、適当な緩衝液に対して透析した後前記５−フルオロウラシル骨髄検 定によりＨ−１活性を検定する。活性分画（約１３６ｄ）をプールし、ＬＭ（Ｎ Ｈ４）２５０４．２０ｍＭ　）リス−ＨＣ／、　ｐＨ７，５，０，０２％トウ・ イーン２０で前もって平衡化せしめであるフェニルセファ０−スＣＬ−４Ｂを含 む１．６Ｘ１１ｃｍ　（２２戚）のカラム上に注ぐ。

カラムを１カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した後、ＩＭからＯＭ（ＮＨ４）　 ｚｓＯａの濃度こう配範囲で溶出する。１０ｄづつの分画を集め、適当な緩衝液 に対して透析した後、５−フルオロウラシル骨髄検定およびＩＬ−１変換検定の 両方で検定する。各々の検定で観察されたピーク活性は一致した分画にあった。

２．５−フルオロウラシル骨髄検定およびＩＬ−１変換検定におけるＨＢＴ−Ｃ ＦＩから精製された＋（−１活性と精製組み換え体ＩＬ−１αおよロウラシルＨ −１検定で検定した。精製組み換え体ＩＬ−１ｃｒおよびＩＬ−１β（１０ｘｒ ／ｄ）の試料も同様に検定した。結果は下記の表１に示しである： 表１−ＨＢＴ−Ｃ？ＩからのＨ−１およびＩＬ−１αおよび！Ｌ−１βの活性の ＨＢＴ　ｌ’［ｉｆｉ　７８８．０００　４７４セファロースＣＬ−６Ｂ（ビー ク）　１８．４　ｘ　１０’　１３３４フエニルセフアロース（ピーク）　１４ 　ＸＩＯ’　７００免疫沈降物　４　ＸＩＯ’　３２６ 組み換え体ＩＬ−１α　Ｉ　ＸＩＯ”　８４３．０００組み換え体ＩＬ−１β　 １　ｘｌＯ’　４７．０００３、ＨＢＴＣＭフェニルセファロース分画からのＨ −１活性のウサギボＩクロー　ルー−ＩＬ−１αおよびＩＬ−１による　２以下 のごとくして、ＨＢＴ　ＣＭから精製されたＨ−１活性の沈降に抗ｒＬ−１αお よび抗ＩＬ−１β抗血清を使用した。１．５ｉのふた付の試験管に入れた２００ ｐ１の精製Ｈ−１に、１ｍｇ／ｌ１１１！ウシ血清アルブミンを含む１６４０培 地で１＝５０および１：５００に希釈した２００μｌの抗血清（抗ＩＬ−１α、 抗！Ｌ−１βまたは混合物）を加え、得られる溶液はおだやかに振とうしなから ４°Ｃにて３０分間インキュベートする。各々の試験管に２００μｌのタンパク 質Ａアガロース（２０％１６４０培地中；バイオラド）を添加し、４°Ｃにて一 夜インキユベートする。各々の試験管は４°Ｃにて３分間遠心分離し、上澄液を デカントし検定のため保存する。各々試験管内のアガロースペレットは１０％Ｆ Ｃ５を含む４００ｐｌの１６４０培地で２度洗浄した後４００ｐＺの０．１Ｍグ リシン−ＨＣｌ　ｐＨ３，０と接触せしめる。得られる混合物は３０分間２２° Ｃにておだやかに混合しながらインキュベ−、Ｌ／：遠心分離する。抗血清が結 合したタンパク質を含ム上澄液を集め、５−フルオロウラシルおよびＩＬ−１変 換検定により検定する。結果を下記表２に示した： 表２．抗ＩＬ−１αおよび抗ＩＬ−１β抗血清を用いたＨ−１およびＩＬ−１′ 　の　疫゛　および口 （Ｈ−１活性およびＩＬ−１活性は単位／ｄ）この実験の結果はＩシー１変換お よび５−フルオロウラシル骨髄増殖検定で測定されたごとく抗ＩＬ−１αがＨ− １およびＩＬ−１活性を沈降せしめる事を示している。結合された活性はグリシ ン−ＨＣｌ抽出物として回収できる。抗ＩＬ−１αで沈降されないものにはＨ− １活性は検出できなかった。ＴＬ−１βに対する抗血清もまたいくらかＨ−１活 性を結合する。

タンパク譬電気泳動／イムノブロンティング実験（ウェスタン　プロット）が実 施され、）ＩＢＴ−ＣＭからのＨ−１活性を含むタンパク質試料はゲル電気泳動 により大きさで分離され、基質に移され抗ＩＬ−１αで暴露された。抗体が結合 した基質上のタンパク質バンドはペルオキシダーゼ−結合抗−マウスＩｇＧおよ び適当な株を用いて検出される。この実験ではタンパク質試料は抗ＩＬ−１αが 結合した組成物を含み、精製された組み換え体ＩＬ−１αの分子量と区別つかな い分子量を持つ事が示された。

国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．有効量のコロニー刺激因子と共に有効量のインターロイキン−１（ＩＬ−１ ）を哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳類の造血幹細胞の増殖および分化 を誘導する方法。
2. ２．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、エ リスロポイエチンおよびＥＰＡからなる群より選択される請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．ＩＬ−１がＩＬ−１αである請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．ＩＬ−１がヒトＩＬ−１αである請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．ＩＬ−１がヒγＩＬ−１αである請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦからなる群よ り選択される請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．ＩＬ−１がＩＬ−１βである請求の範囲第２項記載の方法。
8. ８．ＩＬ−１がヒトＩＬ−１βである請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．ＩＬ−１がヒトγＩＬ−１βである請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦからなる群 より選択される請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．有効量のコロニー刺激因子と共に有効量のインターロイキン−１（ＩＬ− １）を哺乳類に投与することを特徴とし、白血病またはリンパ腫の治療のため哺 乳類の白血病のまたはリンパ腫の細胞の分化を誘導するための方法。
12. １２．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、 エリスロポイエチンおよびＥＰＡからなる群より選択される請求の範囲が第１１ 項記載の方法。
13. １３．ＩＬ−１がＩＬ−１αである請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．ＩＬ−１がヒトＩＬ−１αである請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．ＩＬ−１がヒトγＩＬ−１αである請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦからなる群 より選択される請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．ＩＬ−１がＩＬ−１βである請求の範囲第１２項記載の方法。
18. １８．ＩＬ−１がヒトＩＬ−１βである請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．ＩＬ１がヒトγＩＬ−１βである請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．コロニー刺激因子がＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦからなる群 より選択される請求の範囲第１９項記載の方法。