JPH01503593A - 光誘導プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 より１クコ）％−又： 本発明は、７　ｘ　＊　ｎ　ｔ　ｈ　ｕ　ｓまたはＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｅ ｏｌｉのごとき原核細胞または真核細胞中で所望遺伝子の発現をコントロールす るために有用な粘液細菌、特に肛■ｅｏｅｅｌｌｓ■担上胚に由来の光誘導プロ モーターに係る。但し本発明はＨｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに限定は されない、　Ｎ、　ｘａｎｔｈｕｓは有効利用可能な酵素及び抗生物質を分泌す る。しかも標準的工業条件下に培養できるので所望ポリペプチドの工業生産用微 生物として有用である０本発明によって同定され単離された新しい光誘導プロモ ーターは商業的に有用な遺伝子をコントロール下に維持し、光源の導入によって そのコントロールを所望通りにオンまたはオフに切換える。 Ｈ，＊ａｍ、ｔｈｕｓは粘液細菌の遺伝的特徴を最も顕著に示す（Ｒｏｓｅｎｂ ｅｒｇ、１９８４）細菌である。これらのグラム陰性色素細菌は滑走によって移 動し、飢餓状態になると子実体と指称される細密な多細胞複合体中に胞子（熱、 乾燥及びＸ線に耐性）を形成する。状態が改良されると胞子が新しいコロニーの 形成を開始する。Ｈ１χａｎｔｈｕｓはまた種々の細胞外酵素及び抗生物質を産 生ずる。抗生物質の１つは現在、局在広域化学療法剤として試験中である。　Ｍ 、　ｘａｎｔｈｕｓはまた、より高級な生物の進化モデルとしても有用であると 考えられてきた。従来の古典的な細菌遺伝学及び遺伝子工学に基づく細菌遺伝学 の双方が進化の研究に庸した利益をこの細菌において十分に説明することができ る０種々の菌株間のＤＮＡ交換のために多数の形質導入ファージが利用可能であ る。大腸菌ファージ（ｃｏｌｉｐｈａｓｅ）ＰｉのＤＮＡは複製されることな（ Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓに注入され得るという特性をもつ、この有利な特性を利用 し、Ｅ、ｅｏｌｉにｉｎ　ｖｉｖｏパッケージされたトランスポゾン及びプラス ミドをＭ、　ｘａｎｔｈｕｓに導入した（Ｄｗｏｒｋｉｎ　ａｎｄ　Ｋａｉｓｅ ｒ、１９８５）。 出願人等は５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｅａｌ　Ｃｅｎ ｔｒｅ＋５ｔａｎ−ｆｏｒｄ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｃ＾９４３０５、Ｕ、 Ｓ、＾、のＰｒｏｆ、　Ｄａｌｅ　ＫａｉｓｅｒのＭ、　ｘａｎｔｈｕｓ菌株コ レクションの多数のコロニー中に呈色突然変異体が存在することを知見した。こ れらの突然変異体の１つである菌株ＤＫ２７２７はトランスポゾンＴｎ５挿入の 結果としてオレンジ色コロニーを産生じた。　Ｔｎ５ｇ！発現によってカナマイ シン耐性を与える細菌トランスポゾンである。 ＤＫ２７２７が光中及び暗中の双方でカロチノイドを産生ずること、及び、Ｔｎ ５の挿入によるオレンジ色コロニーの産生は、構造遺伝子の破壊に起因するので なく、光誘導プロモーターのコントロール下のカロチノイド産生コントロール遺 伝子の活性化に起因するのであることが知見された。 ここで、この光誘導プロモーターを単離し、クローニングベクターに導入し、プ ロモーターが遺伝子発現をコントロールできるように所望遺伝子をプロモーター に隣接して導入した。 本発明に到達するまでの実験研究を以下に要約する。 まず、Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓが明光に照射されるとオレンジ色のカロチノイド色 素を産生ずることは既に公知であった。これ°らの色素が存在しないと溶菌が生 じる。従って該色素は細菌保護色素である。　Ｔｎ’２挿入の結果として暗中及 び光中の双方でカロチノイドの産生をコードするＭ、　ｘｉｎｔｈｕｓ　ＤＫ２ ７２７菌株由来の突然変異ＤＮＡを突然変異株からクローニングした。 発明者等は、正常菌株中のカロチノイド遺伝子が光誘導プロモーターのコントロ ール下にあるに違いないと推定した０次に、正常Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓ細胞から 均等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）遺伝子をクローニングした６次に正常遺伝子のプ ロモーター即ちコントロール領域を同定し、これをクローニングベクターに挿入 し、検定容易な発現産物をもつプロモーター欠失遺伝子をプロモーターのコント ロール下に配置した０次に、微生物に光が照射されるとはじめて遺伝子が活性化 することを確認した。また、光不在の場合に限りリプレッサーが遺伝子を失活さ せ得るので、プロモーターがリプレッサー系を介してオン及びオフに切換えられ ると推定した。 １９８６年６月２３日から２６日にスペインのグラナダで開催された１３ｔｈ　 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆＭｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａにおいて、カロチノイド合成に関与する 遺伝子の命名法について非公式な合意が得られた１本願の重要な対象であるΩ１ ９１１領域は、（１つまたは複数の）組ヒ遺伝子を含む、構造遺伝子であるにち がいないと推定される別の３つの遺伝子も同定され夫々組島、ｃａｒＢ及びｃａ ｒｃと命名された。吐」及びｃａｒＢは結合しているが別々の遺伝子であり、遺 伝子中の突然変異体は菌株ＭＲ７及び菌株ＭＲ１３４及びＤに２８３６に夫々存 在した（Ｍａｒｔ　１ｎｅｚ−Ｌａｂｏｒｄａ等（１９８６）、ｃａｒｃは菌株 ＭＲ４０３（Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅ等（１９８７））に挿入されたＴｎう１胚（ ｋｒｏｏｓ　ａｎｄ　Ｋａｉｓｅｒ（１９８３））の単離によって最近同定され たハカりである０組ルはｅａｒＲ及びｅａｒＡ−ｃａｒＢクラスターのいずれと も異なる染色体部分に存在することが判明した。最近発表されたＢａ１ｓａｌｏ ｂｒｅ等の文献（１９８７）は、光がβ−ガラクトシダーゼ発現をコントロール するように■ｌ遺伝子座（ＭＲ４０１）にＴｎ５−１ａｅを挿入したことを報告 している。その他の実験では、ｃａｒＢ遺伝子座がｃａｒＲ遺伝子座の陽性コン トロール下にあることが証明された。いかなる条件下でもカロチノイドを産生で きない菌株をＣａｒ−（即ちカロチノイド欠失）と指称し、カロチノイドを構成 的に産生ずる菌株をＣａｒｃと指称する。 本発明の１つの目的は、粘液細菌のカロチノイド遺伝子に由来の光誘導プロモー ターを含有する組換えＤＮＡ分子を提供することである。 本文中の「粘液細菌由来の光誘導プロモーター」なる用語は、天然プロモーター 配列及びその突然変異体並びにこれらの配列とハイブリダイズする配列に由来の 光誘導プロモーターを包含する。 本発明の別の目的は、粘液細菌由来の光誘導プロモーターと、発現すべきヌクレ オチド配列を該プロモーターのコントロール下に配置せしめる場所に制限部位を もつヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ配列を提供することである。 前記制限部位は、好ましくはＤＮＡ配列中に数回だけ、より好ましくは１回だけ 生じる部位である。 前記プロモーターが所望の構造遺伝子に隣接し該楕、造遺伝子が該プロモーター のコントロール下に維持され該遺伝子の発現が光の照射によって活性化されるの が好ましい。 所望遺伝子は細菌（例えば大腸菌）または菌類または動物または植物の遺伝子の いずれでもよい。 所望遺伝子は、本来は光誘導プロモーターのコントロール下に維持されない粘液 細菌の遺伝子でもよい。 本発明の別の目的は、以下の段階を含む粘液細菌ＤＮＡのクローニング方法を提 供することである０本発明方法は、（ａ）非粘液細菌宿主に由来の複製起点をも つ第１ベクターに粘液細菌ＤＮＡを挿入する、 （ｂ）第１及び第２の制限酵素を用い各制限酵素に対して各１つの制限部位を有 する前記第１ベクターを切断し、前記粘液細菌ＤＮＡ挿入物を含む制限フラグメ ントを形成゛する、（ｃ）各制限酵素に対して各１つの制限部位を第１ベクタ、 ｒの制限部位と逆起向で有する第２ベクターを前記第１及び第２制限酵素で切断 する、 （ｄ）前記制限フラグメントを前記第２ベクターの選択フラグメントと結合させ 、逆起向の粘液細菌ＤＮＡを含む前記制限フラグメントを含む第３ベクターを産 生ずる、（ｅ）第３ベクターを粘液細菌宿主に形質導入し、第３ベクターが染色 体に組込まれた宿主細胞を選択する、（ｆ）前記選択宿主細胞から染色体ＤＮＡ を単離し、粘液細菌ＤＮＡから遠い複製起点の反対側のベクターＤＮＡ内部に制 限部位をもつ制限酵素で染色体を直線化する。 （ｇ）このように産生された粘液細菌ＤＮＡを含むフラグメントの末端を結合し 宿主受容菌（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｈｏｓｔ）を形質転換する。 第１ベクターはｐＲＥＧ４２９でもよい。 第２ベクターはｐＤＡＨ１６０でもよい。 非粘液細菌宿主はμと大腸菌株でよく、大腸菌ＭＣ１０６１が好ましい。 本発明のＤＮＡ配列及び方法を使用して植物、動物、酵母のごとき真核細胞及び その他の原核細胞を含む別の宿主細胞を形質転換させ得ることが理解されよう。 この新規なりローニング方法によれば「染色体歩行」が促進される。 当業界で使用される「染色体歩行」なる用語は、重なり合うＤＮＡ配列を含むク ローンを該当染色体から順次単離することによって特定遺伝子座例えばプロモー ター領域に到達するまで染色体の大きい領域にわたってクローニングを進めてい く処理を意味する。 次に、添付図面に基づいて本発明の実施例をより詳細に以下に説明する０図面に 関する説明は明細書の末尾に要約する。 １１反ｙ亙１ 使用した菌株を表Ｉにまとめた。 ヒ■組駐ｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓをＣＴＴブイヨンまたはＣＴＴ寒天で３３℃で増 殖させた。　ＣＴＴは、１％（ｗ／ｖ）のＤｉｆｅｏ　Ｂａｅｔｏ　Ｃａ５ｉｔ ｏｎｅと１０ｍＨのＴｒｉｓ　ＢＣＩ　ｐＢ８．０と８ｍＭの１４ｇ５０４と１ ｍＭのリン酸カリウムバッファｐＨ７，６（Ｈｏｄｇｋｉｎ　ａｎｄ　Ｋａｉｓ ｅｒ、１９７））とから成る。これを１．５％の寒天で凝固させてプレートを形 成するかまたは０．７％の寒天で凝固させてＣＴＴ軟寒天を形成した。 特に注釈がないときは大腸菌はＬｅｎｏｘブイヨンまたはｔｅｎｏｘ寒天プレー トで３７℃で増殖させた（＋’１ａｎｉａＬ、ｉｓ等、１９８２）　。 ムユニ三ヱグ１１ 制限酵素及びＤＨ＾変性酵素は製造業者の指示通りに使用した。大腸菌ＮＣ１０ ６１株（Ｃａｓａｄａｂａｍ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、１９８Ｇ）をＭａｎｉａｔ ｉｓ等（１９８２）の塩化カルシウム法で形質転換した。特に注釈がない限り大 腸菌はＴｏｎｉａｔｉｓ等（１９８２）の手順で操作した。 ＤＫ２７２７が　ＤＫ６００３への トランスポゾンＴｎ５（Ｋｍ’）とＴａ２−１３２（Ｔｃ’）とは双方ともしｘ ａｎｔｈｕｓ中で発現され、大腸菌ファージＰＩ（Ｋｕｎｅｒ等、１９８１）に 導入され得る。トランスポゾンＴｎ５−１３２は、Ｔａ２のに―ｒを特定する非 反復中央領域をトランスポゾンＴｎＩＯ（Ｂｅｒｇ、等、１９８０）のＴｃ’決 定基で置換して作製された実験構築物である。 残念ながらＴｃ’決定基は容易に選択されない　Ｋｍ　ｒが薬剤耐性の選択決定 基である。Ｄに２フ２７は染色体のΩ１９１１部位に挿入されたトランスポゾン Ｔｎ５をもつ、（オームなる用語に関してはＳｏｄｅｒｇｒｅｎ　＆　Ｋａｉｓ ｅｒ（１９８３）に十分に説明されている）。 従って、クローニング実験で使用するためにＴａ２を含む菌株をまずに一〇に変 換する必要がある。このためにはＫｕｎｅｒ等（１９８１）のトランスポゾン置 換手順を以下のごとく用いる。 ５ｍＭのＣａＣＩの存在下にＴｎシラー３２含有Ｐ１ファージ（Ｐｌ：：Ｔａ２ −１３２）を４Ｘ１Ｇ−個のＤＫ２７２７細胞と感染多重度２で混合した。 室温で２０分間インキュベーション後に３ｍｌの溶融ＣＴＴ軟寒天を添加し、オ キシテトラサイクリンをいれた傾斜プレートに混合物を注入した。 傾斜プレートは、５０ｕｇ／ｗｌのオキシテトラサイクリンを含む２（ｈｌの溶 融寒天を標準へトリ皿に注入しある角度で凝固させることによって調製した。プ レートを水平状態に戻し、更に抗生物質無添加の２０ｍ１の溶融ＣＴＴ寒天を第 ２層として添加し凝固させた。 ３３℃で５日間インキュベーション後、プレート上のオキシテトラサイクリン最 小濃度場所に三日月形の集密的増殖が観察された。この集密約増殖がら離れた場 所に複数の独立コロニーが観察された。これらを採取しＫｍ’の減少及びＴｃ’ の増加を検査した。この置換は第１図のメ゛カニズムによって生じた。傾斜プレ ート系を使用した理由は、細胞死以前にＮｙｘｏｃｏｃｃｕｓ細胞にＴａ２−１ ３２のＴｃ’決定基を誘発せしむべくオキシテトラサイクリンをゆっくりと拡散 させるためである。いくつかのＫｍ”、Ｔｃ’細胞を採取し、そのうちの１つＤ Ｋ６００３の予想染色体構造をサザンプロット分析で確認した後にこの細胞をク ローニング手順に選択した。 １　ファージＰ１を　た　がらＭ、　ｘａｎｔｈｕｓへのブースミドの、　′（ Ｓｈ　ｉｓ＋ｋｅｔｓ等、１９８３に準拠する修正方法） プラスミドを担持し得る大腸菌の菌株を、５０ＩＩｇ／ａ１のカナマイシンを加 えたり、Ｂ、中で指数増殖期中期まで増殖させた。　０．５ｚ１のこの培養物を Ｐｌ：：Ｔｎラーｅｌｒｌｏｏ（Ｃｍ’を与える）と感染多重度１０で混合し、 室温で２０分間インキュベートした。 １０−ＨのＭｆＩＳＯ＜と５０１Ｊｇ７ｘｉのカナマイシンと１２．５１１ｇ／ ｗｌのクロラムフェニコールとを加えた５ｚｌのり、Ｂ、を添加し、培養物を震 盪しながら３０℃で１晩インキユベートした。同じ培地に希釈し同じ温度でイン キュベートした指数増殖期中期の培養物を４２℃で３５分間インキュベートして ファージを誘発させた０次に培養物を３７℃で２時間インキュベートした。 培養物を強力に震盪した。得られた１００〜４００νｌのファージ溶菌液を０． ５ｘ１の指数増殖期後期のＭ、　ｘａｎｔｈｕｓと５ｍＭのＣａＣ１の存在下に 混合した。室温で４０分間インキュベーション後に３ｚｌの溶融ＣＴＴ軟寒天を 添加し、２ｈｇ／ｉ１のカナマイシンを含むＣＴＴ寒天プレートに混合物を注い だ、１晩インキユベーシヨン後に適当濃度のカナマイシンを含むＣＴＴ軟寒天を 添加することによってプレート中のカナマイシン濃度を７５ｕｇ／ｍｌに増加さ せた。更に４日または５日間インキュベーション後に適応したＭ、　ｘａｎｔｈ ｕｓ形質導入体がら形成されたコロニーが観察された。 Ω１９１１　Ｔａ２　に　のＤＮＡのクローニン（Ｒ，Ｅ、Ｇ１１ｌ、未発表の 方法使用）上記方法によって菌株ＤＫ２７２７をＫｍ”及びＴｃ’株に変換した 。 得られた菌株ＤＫ６００３を１ラスミドＩ）ＲＥ（１；４２９の受容菌として使 用しな（第２図参照）、プラスミドｐＲＥ（：４２９は前出のＰｒｏｆ　。 Ｄａｌｅ　Ｋａｉｓｅｒ研究室から容易に入手できる。プラスミドｐＲＥに４２ ９は大腸菌ファージＰ１のＰ１不和台領域を含み、該ファージによる有効な形質 導入が確保される（Ｓｈｉｍｋｅｔ等、１９８３）　。 ｐＲＥｃ４２９はまた複製起点を含む、しかしながこのプラスミドｐＲＥＧ４２ ９の自律複製は大腸菌中に限られており、１■ｒい、　ｐＲＥＧ４２９の場合、 染色体組込みは、ｐＲＥＧ４２９の予め多少短縮したｌ５５０Ｌ（ＩＳ５０’　 ）とＤＫ６００３中のＴａ２−１３２の２つのｌ５５０゜のいずれかとの間の相 同組換えによって行なわれる。第２図は可能な２つの組換え事象の１つを例示す る。ｐＲＥＧ４２９を形質導入したＤＫ６００３のコロニーのプールから染色体 ＤＮＡを精製する。このプールは各ｌ５５０°にプラスミドが組込まれた例を含 むはずである。染色体ＤＮ＾をＥｅｏＲＩ＝ｃｉＡｉまたはＢａｗｌ　Ｉで別々 に切断し、希釈し、結合した。大腸菌ＭＣ１０６１株、の形質転換後にプラスミ ドｐＤＡＨ１６１、ｐＤＡ１１１６２、ｐＤＡＨ１６３、ｐＤＡＢ１６４及びｐ ［ＩＡ）１１６５が得られた（第３図）、これらの５つのプラスミドの起点の一 例として染色体ＤＮＡをＣｌａ　ｌ−で切断して得られたｐＤＡＩ＋１６１の起 点を第２図に示す、ｐＤＡＨ１６２は染色体ＤＮＡをＥｅｏＲユで切断して得ら れた。ｐＤＡｌ（１６３は染色体ＤＮＡをＢａｍ１ｌ　Ｉで切断して得られた。 ｐＤＡＨ１６４及びｐＤＡＨ１６５は染色体ＤＮＡをす」」−で切断して得られ た。プラスミドｐＤＡＨ１６４及びｐＤＡ）１１６５はｐＲＥＧ４２９が右側ｌ ５５０（第３図）に挿入されたときに染色体から得られたものであり、ｐＤＡＩ １１６１、ｐＨＡＨ１６２及びｐＤＡＩ１１６３は左側ｌ５５０挿入物から得ら れたものである。 Ｔａ２　の１　した九　ＤＮＡのクローニンこの試験では新しい「復帰ベクター （ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）」、即ちｐＲＥＧ４２２（Ｐｒｏｆ、　 Ｄａｌｅ　Ｋａｉｓｅｒ研究室がら自由に入手し得る）から２つのＢｉｎｄｌ１ 部位を除去することによって得られたプラスミドｐ［１ＡＨＲＥＧ４２２由来の プラスミドｐＤＡＨ１６０を使用した。第９図はｐＤＡＨ１６０の横築を示す、 ｐＲＺ１０４　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、　１９７９）のＫｍ’決定基を含む旧 」旦ｌニジ１」−フラグメントを釣り」−切断ｐＲＥに４２２に結合してｐＤＡ Ｉ１１４１を形成した。■１１とム」」−との不和合末端の結合を確保するため に、シ己」−シｄ」−末端結合が生じる十分な時間の経過後にＫｌｅｎｏｗフラ グメント（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２）を使用して前記不和合末端を埋め戻 した。プラスミドｐＲＥＧ４２２はｐＲＥＧ４１１（Ｓｈｉｍｋｅｔｓ等、１９ ８３）のＥｃｏＲ１部位の１つが欠失した誘導体である（Ｒ，Ｅ、ｌ：ｉｌｌ、 ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｃｏ＠ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、　ｐＤＡＨ１４１のに一′ 決定基を含むＥｃｏＲＶ−５＋１」−フラグメントをＣｊ３Ｊ−切断ｐＲＥＧ４ ２２に挿入し、にＩｅｎｏ−フラグメントで埋め戻し次にシリ」−で切断した。 得られたプラスミドｐＤＡＨ１６０は、ｐＲＥに４２９にクローニングされた粘 液細菌Ｄ）Ｊ＾がベクター配列に対して容易に逆位になるような配向で各１つの ＥｃｏＲユ、１３３ｊｊｌ、■４及び■ｍ１１部位を含んでいた。プラスミドｐ ＤＡＩ１１６Ｇは、ＤＲＥＧ４２９を使用してクローニングされた染色体ＤＮＡ がベクター配列に対して容易に逆位になるように配置された制限部位をもつ、プ ラスミドｐＤＡ１１１６３を■１土及びＨｊ３ｊＪで切断し、Ｈ，ｘａｎｔｈｕ ｓを単離した（第４図９照）、これをｐＤＡＨ１６０の大きいｈ１ニー虹崖１フ ラグメントに結合しｐＤＡＨ１９４を形成した。このプラスミドをＤに１０１に 形質導入し、得られた同時組込み体（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）ＤＫｌｏｌ［ ｐＤＡＩ１１９４］から染色体ＤＮＡを単離した。 この染色体ＤＮＡをｌ〜Ｉで切断し単離し結合した。形質転換後に、完全ＬＬＬ ＬＩ消化によって得られた予想プラスミド（ｐＤＡＨ２０１）を同定し単離した 。 ブロモー　−ムプロープの プラスミドｐＤＡＩ１１７１は、Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓで使用するために発明者 等が横築したプロモーター融合プローブである０種々の欠失、＾ｐ１遺伝子の再 生及びＰｉ　Ｉｎｃ、フラグメントの挿入によってプラスミドｐ！’、Ｃ３７’ ｌ　（Ｃａｓａｄａｂａｎ等、１９８０）を変性した。第１０図はｐＤＡＨ１フ １の１築を示す、　ｐＭｃ８７１（Ｃａｓａｄａｂａｎ等、１９８　Ｇ）の主要 り已」−Ｓ　ａ　Ｉ　：フラグメントをｐＲＥＧ４２２のＰｉ　Ｉｎｃ。 （四」一式す」−フラグメントと結合した。得られたプラスミドｐＤＡＩ１１０ ５は大腸菌ファージＰ１に有効に形質導入され再生され、偶発的に＾ｐ１決定基 を含んでいた。不要な１ａｃＡ及び１ａｃＹ遺伝子は欠失していた。プラスミド ｐＤ＾Ｈ１０５をＮｅｏ　ｌで切断し、末端をＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｍａ ｎｉａｔｉｓ等、１９８２）で埋め戻した。ＬＬ！ＬＬで消化後に主要フラグメ ントを単離し、プロモーター欠失１ａｃＺ遺伝子をコードするｐＮｃ８７１のシ リ１」−。 勧」」−フラグメントに結合して９ＤＡＨ１７１を形成した。得られたプラスミ ドｐＤＡＨ１７１（第５図及び第１０図参照）は、プロモーター欠失大腸菌１ａ ｃＺ遺伝子の上流に唯一の」す１」一部位を含む。 プラスミドｐＤＡＨ１７１分Ｈｉｎｄｌｌｌ及び旺１ユ及び１」で切断した。　 ｐＤＡＢ２０１（第４図参照）に由来のΩ１９１１　Ｔａ２の挿入部位を含む■ 隈Ｉフラグメントを挿入した。得られたプラスミドｐＤＡＨ２１３（第５図）は Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓに無用な＾ｐ′決定基しか含んでいなかった。従って、プ ラスミドｐＤＡＩ１１４１に由来のＴａ２のＫｓ＋’決定基を挿入した。得られ たプラスミドｐＤＡＩＩ２１７は光誘導プロモーターと１ａｅＺ配列とを含んで いた。これをＤＫＩＯＩに形質導入し同時組込み体を選択した。 −−シ　−ゼの　セ 定性的評価を行なうためにβ−ガラクトシダーゼを２つの方法で検定した。　４ ０ｐｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ ドを含む寒天にコロニーを採取した。この無色色素はβ−ガラクトシダーゼによ って開裂されると青色に呈色する。または１０Ｍｇ／Ｍ１の４−メチルウンベリ フェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含むＤＭＳＯをコロニーに直接噴霧した。こ の物質は開裂されるとＵｖ光で蛍光を発する４−メチルウンベリフェロンを生じ る。 定量的評価のためには、Ｍｉｌｌｅｒ（１９）２）に記載の方法で０−ニトロフ ェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを使用してβ−ガラクトシダーゼを検定した。 Ｈ，ｘａｎｔｈｕｓ　Ω１９１１ 文献に記載の適当な方法で０１９１１に隣接のＤＮＡをクローニングした。得ら れた５つのプラスミドｐＤＡＢ１６１、ｐＤＡＩ１１６２、ｐＤＡＨ１６３，ｐ ＤＡ１１１６４及びｐＤＡＩ１１６５を制限酵素分析し、第３図の制限部位地図 を作成した。Ｄに２７２フ中のＴａ２の配向及びプラスミドｐＤＡＩｉ１６１、 ｐＤＡＩ１１６２及びｐＤＡＨ１６３を大腸菌からしｘａｎｔｈｕｓ菌りに１０ １株に移入して得られたコロニーはＤＫ２フ２フと同じ色に呈色した。得られた 菌株が１ラスミド中でクローニングされたＭ、　ｘａｎｔｈｕｓの領域の縦列重 複をすべて含むことから判断すると（例えば第６図譬照）意外な結果である。 プラスミドｐＤＡ１１１５フ、ｐＤ＾［１５８（ｐＤＡＩ１１６１のサブクロー ン）、ｐＤＡＨ１６７、ｐＤＡ１１１６８、ｐＤ、八Ｈ１６９及びｐＤＡＩ１１ ７０（ｐＤ＾Ｈ１６３のサブクローン）はすべて移入によって同じオレンジ色の 表現型を与えた。　ｐＤＡＢ１６４、ｐＤＡｉ（１６５及びｐＤＡＨ１６６（ｐ ＤＡＢ１６５のサブクローン）ＤＫＩＯＩに形質導入したときはコロニーの変色 を生じなかった。この結果は、（第３図に示すように）Ω１９１１の左のＤＮＡ が関連部分であることを示唆した。 これらの結果について例えば以下の説明が考えられる。 Ω１９１１の左のＤＮＡが１７．６ｉＣｂを上回る極めて大きい転写単位を包含 し、一端がΩ１９１１の右に存在し他端が１７．６ｋｂのＣ１ａ　ｌ部位の左に 存在する。かかるプラスミドが組込まれると、相同染色体中の転写単位末端が膜 結合しく第７図）、このため遺伝子活性が失われる。この仮説が正しいとすれば 、Ω１９１１の左の領域のサブクローンはいずれも同じ結果を与えると予測され る。しかしながら、プラスミドｐＤＡＨ１９１、ｐＤＡＨ１９３、ｐＤＡＩ（２ ０２、ｐＤＡＨ２０３、ｐＤＡＨ２０４及びｐＤＡＩ（２０５（ｐＤＡＨ１６３ のサブクローン）はすべて形質導入によって黄色コロニーを形成したのでこの予 測は外れた。これらの結果は、Ω１９１１部位に挿入されたＴｎうが優性な突然 変異を生じることを示唆しているに違いない、　ｐＤＡ）１１６９等によって得 られた結果は、突然変異表現型がΩ１９１１と０．４２ｋｂのムリ」一部位との 間のＤＮＡ断片によって与えられたに違いないことを示す。 ｐＤＡＨ２０５の形質導入によってオレンジ色の表現型が生じないことはＴｎう 自体が関与したことを想像させる。これに関連して、染色体領域Ω１９１０を含 む菌株は、強い光の中で正常に産生されるカロチノイドを構成的に産生じオレン ジ色を呈色することは知見されていた（Ｂｕｃｈａｒｄ　＆　Ｄｗｏｒｋｉｎ　 １９６６）。 サザンプロット分析はΩ１９１０とΩ１９１１とが同じであることを示した０両 者は同じＴｎ５挿入物のプールに由来するのでこの知見は意外ではなかった。こ れらの情報に基づき、予想に反してＴｎ巨のΩ１９１１内挿入が遺伝子破壊を生 起せず実際には遺伝子活性化を生起すると考えるのが妥当である。 そうすれば縦列重複中で突然変異遺伝子が野性型遺伝子に対して優性を示す理由 も説明できる。遺伝子が挿入物によって活性化される場合として、遺伝子が通常 は抑制されておりリプレッサー結合部位またはオペレーター領域の破壊が生じる 場合がある。この場合、リプレッサーが結合せず従って、プロモーターが構成的 に発現されるであろう（第８図参照）０発明者等はカロチノイド産生をコントロ ールする遺伝子がΩ１９１１の左に存在すると予測した。プロモーターもΩ１９ １１の左に存在する。しかしながらプロモーターの上流のオペレーターはＤＫＤ Ｋ２７２７のＴｎ５挿入によって破壊されている。第８図は突然変異構成的プロ モーターが「正常」プロモーターを含む遺伝子に組込まれた結果を示し、プロモ ーターを含む遺伝子の内部フラグメントが組込みによって構成的表現型を生じる ことを示す、構成的プロモーターをもつ遺伝子を含むプラスミドがプラスミド挿 入物の相同染色体に組込まれると、遺伝子は構成的プロモーターのコントロール 下に維持され別のコピーは「正常」コントロール下に維持される。プラスミドが 翻訳単位（図中のｙ）内部のプロモーターから制限部位までの挿入物を含むとき 、組込みの結果として翻訳単位全長が構成的プロモーターに接続されるが、翻訳 単位の短縮コピーは野性型プロモーター（図示せず）に接続されるであろう、少 量のＭ、　ｘａｎｔｈｕｓ　ＤＮＡ（０，４２ｋｂ）の存在を考慮するとｐＤＡ Ｈ１６９及びｐＤＡ！（１７０はこのケースに相当すると考えられる。 Ω１９１１こ　って　黙　されるプロモー　−の　６、′　の１藍１ 細　の゛誘導 カロチノイド産生は野性型細胞で光誘導性であり、Ω１９１１の左の遺伝子はカ ロチノイド産生をコントロールすると考えられる。従って、正常遺伝子が光誘導 性であるという可能性が考えられる。この可能性を試験するために、Ω１９１１ にＴｎす挿入物を含まないＭ、　ｘａｎｔｈｕｓ　ＤＮＡをクローニングした。 友羞の項で記載したようにこの［ｌＮ＾は、新規な復帰ベクターｐＤＡＨ１６０ を使用してＤＫＩＯＩからクローニングした。得られたプラスミドｐＤＡＨ２０ １に由来のＤＮＡを次にプロモーター融合の構築に使用した。　ｐＤＡＨ１６９ 等の分析からはプロモーターがΩ１９１１の左のＢｇ１１部位の上流に位置する に違いないと予想されていた。従ってＢｇｌ１１部位の上流のＤＮＡを正しい配 向でプロモーター欠失大腸菌１ａｃＺ遺伝子（友韮参照）に結合した。得られた プラスミドを適当に操作後、Ｌ■ｒ堕に移入してＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１７コ （第５図）を形成した。この菌株に光を照射すると、ＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１ ７］細胞を暗闇に維持したときよりも多量のβ−ガラクトシダーゼ（ＩａｃＺ遺 伝子の産物）が産生じた。注目すべきは、暗闇で増殖した細胞が、構成的発現レ ベルの存在を示すβ−ガラクトシダーゼを産生じたことである。 プロモー　−の０導のメカニズム 前述のごとく、Ω１９１１の左の遺伝子の構成性は簡単には、リプレッサー結合 部位がΩ１９１１菌株のＴｎ５挿入物によって破壊されたことにあると説明でき る。この場合、このリプレッサーの欠失した突然変異体を単離することが可能で あろう、かかるリプレッサー突然変異体の予想される表現型はＤＫ２７２７と同 じくカロチノイドの構成的産生であろう。 ５ｔａｎｆｏｒｄのＫａｉｓｅｒ細菌株コレクション中にこのような菌株が３種 類存在しＤＫ７１７、ＤＫ７１８及びＤＫ４０６と命名された。これらの菌株は すべて化学的突然変異誘発手順で単離された（表１参照）、　ＤＫ７１７はＤＫ ２７２７と同じくオレンジ色であったが、ＤＫ７１８及びＤに４０６は極めて濃 いオレンジ色であり暗闇で多量のカロチノイドを産生した（Ｆ、Ｎｕｒｉｌｌｏ 、ｐ、ｅｒｓｏｎａｌ　ｅｏｍ−ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、プラスミドｐＤＡＨ ２１７をＤＫ７１７、ＤＫ７１Ｂ及びＤＫ４０６に形質導入すると、ＤＫ７１７ 中ではβ−ガラクトシダーゼは光誘導を維持していたがＤＫ７１８及び０Ｋ４０ Ｂにおいては構成性になっていた。これは、後者の２つの菌株がリプレッサーを 失ったことを意味する。 々の　の　−　−シ　−ゼ゛の　ｔ゛ 値 ＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１７］（第５図）を暗闇で培養し培養物を部分した。第 １１図に示す時点で一方の培養物に１２０μＥ／輸”／ｓの光を照射した。他方 の培養物は暗闇に維持した。標本を採取しβ−ガラクトシダーゼを定量し結果を 第１１図に示す、光中で増殖した培養物は暗闇で増殖した培養物のほぼ４０倍の β−ガラクトシダーゼを産生じた。照射条件（ｌｉｇｈｔ　ｒｅｇｉｍｅ）を任 意に選択し、異なる照射条件下の誘導の増減を試験するために段階的に実験した 。ＤＫ７１７［ｐＤＡＨ２１７］　、Ｄに７１Ｂ［ｐＤＡＨ２１７］ＤＫ４０６ ［ｐＤＡｆ１２１７］及びＤＫ１０５Ｇ［ｐＤＡｌ１２１７コを使用して実験を 反復した。観察されたβ−ガラクトシダーゼ活性の最大及び最小レベルを第１１ 図のごとき結果から抽出し表２に示す。 ＤＫ７１８［ｐＤＡＨ２１７］は２倍の光誘導β−ガラクトシダーゼ活性を維持 しており、これはＤに７１８の突然変異によってリプレッサーが完全には失活し ていないことを意味する。　ＤＫ４０６［ｐＤ＾８２１７］は光中の誘導を増加 せず、非誘導（構成的レベル）のＤＫ１０５０［ｐＤＡＨ２１７］：比較しｒ　 光中：ｉ　ｆ、：はＢｉ　ＩＩ　１’　１０００倍以上のβ−ガラクトシダーゼ を産生した。双方のＤＫ４０８［ｐＤＡＨ２１７］の増殖サイクルでβ−ガラク トシダーゼ比活性の増加が観察され、これはβ−ガラクトシダーゼ合成が増殖率 より高速なので産生が定常状態に到達しなかったことを意味する。 ＤＫ７１７［ｐＤＡＨ２１７］におけるβ−ガラクトシダーゼの誘導は暗闇で４ 倍であり光中で１７倍であった。これはＤＫ７１８及びＤＫ４０８と違ってＤＫ ７１７中では光誘導遺伝子のリプレッサーが影響をうけて肛を至ことを示す、ｃ ａｒｃ表現型は、通常はｃａｒＲによって調整されているがここで抑制解除され た遺伝子の突然変異に起因すると推定される。　ＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１７］ に比較してＤＫ７１７［ｐＤＡＨ２１７］における光誘導がはるかに減少してぃ 〕゛　る理由は、光誘導発色団がＤＫ７１７中に構成的に存在しているカロチノ イドによって遮蔽されているからであろう。 リプレッ　一部　の Ｍａｒｔ　：ｎｅｚ−Ｌａｂｏｒａ等（１９８８）は、ＤＫ４０６及びＤに７１ ８中の傷害（Ｉｅｓｉｏｎ）従ってリプレッサーがΩ１９１ｏの近傍従ってΩ１ ９１１の近傍に存在することを証明した。従って発明者等は、ｐＴＩＡＩ１１６ １、ｐＤＡＢ１８４及ヒｐＤＡＩＩ２０１　（第３２　）　ヲＤＫ４０６及ヒＤ Ｋ７１８に形質導入した。ｐＤＡＨ１６４はＣａｒ’表現型に全く影響を与えな かった。従って我々は、リプレッサーに対する遺伝子が第３図のようにΩ１９１ １の右に存在しないと結論した。　ｐＤＡＢ１６１及びｐＤＡＨ２０１を含む形 質導入体の多数が、前者では明るいオレンジ色で後者では黄色に呈色した。赤／ 濃いオレンジに呈色する形質導入体は少数であった。従って、リプレッサー遺伝 子は第１１図に示すようにΩ１９１１の左のＤＮＡにコードされていると結論し た。少数の赤色形質導入体は、別の遺伝子（Ｓｈｉｓｉｋｅｔｓ等、１９８３） でみられるような移入野性型リプレッサー遺伝子の遺伝子変換に起因すると推定 された。 リプレッサーの位置は、第３図の染色体の下方に示すように繰り込み間係（ｎｅ ｓｔｅｄ　５ｅｒｉｅｓ）の複数７ラスミドを菌株ＤＫ４０６及びＤＫフ１８に 形質導入することによって限定される。 ｐＤＩＩＩ２０５を含むすべての試験プラスミドが多くの場合にＣａｒ’表現型 を破壊した。従って、　ＤＫ４０６及びＤに７１８中で突然変異したリプレッサ ー遺伝子は、第１２図で「フラグメント＾」で示される旺Ｌｌ　−江ｄフラグメ ントに担持されているに違いない、従ってリプレッサー遺伝子は、該遺伝子が作 用する光誘導プロモーターの直°ぐ下流に存在する。 ｅａｒＢのゞ　の 発明者等は我々の先の特許出願である英国特許第８６１５２６３号において、光 誘導プロモーターの下流にカロチノイド合成の活性物質が存在することを予測し た。この予測はＢａ１ｓａｌｏｂ−ｒｅｓ等によってｉｌ　ｔｌｔされた。更に 我々自身の実験で、活性物質をコードする遺伝子のより正確な位置を確認した。 Ｊ）ＤＡＢ２０５をＤＫＩＯＩに形質導入したとき、カロチノイド産生ハ依然ト Ｌ　”Ｃ光誘導性テアル、　ＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１７］実Ｍ　（第５図）で 示すように凪が７０モーターの下流に存在するので活性化遺伝子の一端が除去さ れているはずである。従って、活性化遺伝子の他端はＬｔＬＩＩ−５！ｉＬフラ グメントの内部に閉じ込められているはずである。そうでないと第７図に示すよ うなｐＤＡＪ１２０５の組込みによって活性化遺伝子が失活するであろう、従っ て、活性化物質は、光誘導プロモーターのリプレッサーと同様に、少なくともそ の一部が田ｕ、５３ｉＪＬフラグメント内部でコードされていなければならナイ 、コレハ、欠失１１株ＤＫ１０１−２２３、ＤＫｌｏｌ−２２４及ヒＤＫ１０１ −２２５の構築によって確認された。第１２図の染色体部分を欠失させ欠失場所 に大腸菌ファージｆｄに由来の転写ターミネ−ターに結合した薬剤耐性マーカー （カナマイシン耐性）を挿入することによってプラスミドｐＤＡｆ（２２３、ｐ ＤＡＦＩ２２４及びｐＤＡＢ２２５を構築した。プラスミドｐＤＡＨ２２３、ｐ ＤＡＨ２２４及びｐＤＡ）Ｉ２２５の形質導入及び遺伝子置換を順次行なって欠 失部をＤに１０１に挿入した。プラスミドを失ったがＫｉｎ’を保持した形質導 入体をサザンプロット分析で確認した。かかる形質導入体はすべてＣａｒ−であ った、従って、予想した通り活性化物質の消失はリプレッサーの消失に対して上 位（ｅｐｉｓｔａ−ｔｉｅ）であった。 Ｎ、　ｘａｎｔｈｕｓ　のｅＪＬｒ　の４　モール種々の突然変異体及び構築物 の活性化物質及びリプレッサーの位置及び観察された表現型を第１２図に示すよ うな遺伝子活性の光誘導モデルにまとめた。リプレッサーはオペレータ一部位（ ０）に結合しプロモーター活性を抑制する。 このリプレッサー活性は光（またはその産物）によって抑制される。この抑制メ カニズムは現在研究中である。プロモーターが活性化されると転写が開始され、 より多量のりプレッサーとｅａｒＢの活性化物質が合成され、リプレッサーは光 中で失活する。活性化物質及びリプレッサーは同じ遺伝子でもよくまたはＳａｃ 　Ｉフラグメント内部でコードされた異なる２つの遺伝子でもよい、活性化物質 の活性は、■遺伝子が暗闇で活性化されるＣａｒ’表現型で示されるように光と 無関係である。リプレッサーを失活させる光が存在しなくなると生レギユロンが 遮断される。光を除去するためには、光源をオフに切換えるかまたは新しく合成 されたカロチノイドによって光（または光産物）を吸収する。 黙亦　リプレツ　−のクローニング Ｓａｃ　Ｉフラグメントを組込んだＤＮＡを第１３図のごと（ＤＫ４０６及びＤ Ｋ）１８からクローニングした０発明者等は、配列決定の研究を開始するために ＤＮＡをサブクローニング中である。 ＤＫ４０６をその前駆細胞と比較できるように釣り」−、肚ｄ領域もＤＫ１０５ ０からクローニングした。 ［−叫１臭１１１ 第１図はＤＫ２７２７中のＴｎ５のＴｎ５−１３２置換を示す、　Ｐｌ：：Ｔｎ ５−１３２を方法の項に記載したようにＭ、　ｘａｎｔｈｕｓ菌りに２７２７株 に導入した。　Ｔｎ５及びＴｎ５−１３２の末端で２つの相同挿入配列ｌ５５０ 間の組換えが生じた。トランスポゾンの各末端のｌ５５０は長さ１．５ｋｂで１ つの塩基対以外は等しい（＾ｕｅｒｓｗａｌｄ等、１９８０）　、組換え後、図 示の染色体構造をもつＤＫ６００３を残してＰＩ　：　：Ｔｎ巨が消滅する。 第２図はΩ１９１１に隣接のＤＮＡのクローニングを示す、ｐＲＥに４２９をＤ Ｋ６００３に形質導入した。プラスミドｐＲＥＧ４２９は相同組換えを介して左 ＠　ｌ５５０または右側ｌ５５０に組込まれた０判り易いように右側のｌ５５０ に対する組込みだけを図示しな、これらの組込み事象によってＫｍ’コロニーが 生じる。がかるコロニーのプールからＤＮＡを単離し、方法の項で記載のごとく 制限酵素消化及び結合を行なった。消化が完全であると想定し、組込みによって 得られたＤＮＡに図示のごとく山王を使用すると、大腸菌の形質転換によってＫ ｍ’コロニーを生じた唯一のＩ）Ｎ＾はｐｔｌＡＩ（１６１であった。旺祁ユに よる消化はｐＤＡ１１１６２ヲ生じ、ｈｌｌＧ：：よる消化！１ｐＤＡＨ１６３ を生シタ（図示せず）。 第３図はΩ１９１１に隣接のＤＮＡの制限地図を示す、Ω１９１１に対する各制 限部位の順序及び間隔をＤＮＡのｋｂで示す０本文中で扱った稚々のプラスミド 中に存在するＭｙｘｏｅｏｅｅｕｓＤＮ＾の位置を示す０判り易くするためにプ ラスミドのベクタ一部分は図示しない、　Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓ　ＤＮＡに隣接 のプラスミドにもｌ５５０が存在するときはこれも図示する。プラスミドの番号 対、即ちｐＤ＾旧５フとｐＤＡＨ１５８、ｐ［１ＡＨ１６７とｐＤＡＴ１１６８ ゜ｐＤＡＨ１８９とｐＤＡＲ１７０及びｐＤＡｌ（２０３とｐＨＡＨ２０４は、 ２つの交互方向の双方でＭ、　ｘａｎｔｈｕｓ　ＤＮＡがベクターに挿入された ことを示す。 第４図はＴｎ５非挿入の染色体ＤＮＡのクローニングを示す。 方法の項に記載したようにプラスミドρＤＡ！１１９４を構築した。 ＤＫＩＯＩに形質導入すると、図示の同時組込み体が形成された。　ＨｉｎｄＩ ［［で消化し結合させるとプラスミドｐｏ＾Ｈ２Ｏ１が得られた。これを大腸菌 における形質転換によって選択した。 第５図はプロモーター融合プローブの構築を示す、結果の項で概説した試験は、 第３図に示すごとく光誘導プロモーターが１則部位の右に存在する可能性を示し た（Ｂ２で示す）、ｐＤＡｌ１２０１に由来のｈｕｌ−フラグメントの右の染色 体ＤＮＡは、ｐＤＡ）１１７１中のプロモーター欠失大腸菌１ａｅＺ遺伝子の上 流に挿入されていた。ｐＤ＾旧４１に由来のＫｍ’決定基を再導入後に得られた プラスミドｐＤＡＩＩ２１７をＤＫＩＯＩに形質導入してＩＩＫＬＯｌ［ｐＤＡ Ｈ２１７］を産生した。光による画情性促進能を菌株ＤＫ１０１［ｐＤＡＨ２１ ７コで試験した。 第６図はＤＫＩＯＩへのクローンＤＮＡの逆形質導入を示す、プラスミドを０Ｋ ＩＯＩに形質導入した。得られたｐＤＡ！１１６１同時組込み体を一例として示 す、どの場合にも新しい接合部にベクター配列をもつクローンＤＮＡの縦列重複 が形成された。 第７図は転写単位の部分フラグメントを含むプラスミドの組込み効果を示す、左 側の場合は、１つの完全及び１つの不完全転写単位が生じる。この場合前者は後 者を補完すると予想される。右側の場合は、プラスミドが転写単位の内部フラグ メントを含む、野性型染色体に組込むと双方のコピーで転写単位が破壊される。 第８図は「正常」プロモーターを含む遺伝子に対する突然変異、構成的プロモー ター組込みの効果を示す。 第９図は新規な「復帰」ベクターｐＤＡＩ１１６０の構築を示す。 第１０図はプラスミドｐＤＡＨ１７１の構築を示す。 第１１図はＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１７］によるβ−ガラクトシダーゼ産生に対 する光の影響を示す、　ＤＫｌｏｌ［ｐＤＡＨ２１７］細胞の培養物を２つのフ ラスコに分は入れて３０℃で攪拌した。矢印で示す時点で一方のフラスコを１２ ｈＥ／ａ”／ｓの白色光で照射し、他方のフラスコを暗闇に維持した。３つまた は４つの重複標本を特定間隔で採取し、タンパク及びβガラクトシダーゼを定量 した。誤差線（ｅｒｒｏｒ　ｂａｒ）はβ−ガラクトシダーゼ読取値の広がりを 示す、白丸は光照射細胞、黒丸は光非照射細胞の平均値を夫々示す。 第１２図は、Ｍ、　ｘｉｎｔｈｕｓのカロチンイド憶扛）遺伝子の光活性化のモ デルを示す、三官能遺伝子が存在するかまたはｃａｒＢのプロモーターのリプレ ッサー及び活性化物質をコードする別々の２つの遺伝子の存在が予測された。活 性化物質の機能でなくリプレッサーの機能が光依存性であり光によって失活され る。更に、マークを付けた点に挿入されたＴｎう挿入物（オペ−レータ−）がリ プレッサー結合を遮断しプロモーター活性が構成性になり従って活性化物質が構 成的に合成されると推定される１組カ活性に構成性を与える点突然変異は「フラ グメント＾」の内部に存在する。　ＤＫＩＯＩ−２２３、ＤＫｌｏｌ−２２４及 びＤＫＩＯＩ−２２５は白抜き枠で示される江ｖｉｔｒｏ構築された欠失を含む 菌株である。これらの菌株は光中でのカロチノイド合成能を喪失していた（Ｃａ ｒ−）。 略号は以下を意味する。０＝オペ−レータ−１Ｐ＝プロモーター、＋＝正の調節 、−＝負の調節、　ｈｖ＝光。 注、配向は第３図の逆。 第１３図はＤＫ４０６及びＤＫフ１８の突然変異リプレッサー及びＤＫ１０５０ のリプレッサーのクローニングを示す、プラスミドｐＤＡＨ１８６（第３図）を ＤＫ４０ｅ％ＤＫ７１８及びＤＫ１０５０に形質導入した。得られた形質導入体 の染色体ＤＮＡを単離し、ＣｓＣ１勾配で精製した。これらのＤＮＡを次にムは 」−で開裂し、サイズ分画し、結合し、受容大腸菌を形質転換した。に−１及び ＾ｐ１を示す形質転換体を選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。各場合に、図 の下部に示した予想構造の１ラスミドが得られた。　ｐＤＡＨ１６６が「フラグ メントＡ」を含まないので、クローニングプロセスで遺伝子変換が生じなかった 。従って、ＤＫ４０６、ＤＬフ１８及びＤＫ１０５０に由来の「フラグメント＾ 」が単離された。 表ユ 菌株　遺伝子型　表現型 ヒ■赳赳旦 ｘａｎｔｈｕｓ ＤＫＩＯＩ　５１１３旦　群運動性の部分欠如星印（本）菌株の出発前駆細胞 ＤＫフ１フ本５ＬＬＡｉμ日オレンジ色コロニーＤＫ７１８寧ＬＬＬＡｉ■且」 濃いオレンジ色コロニーΩ１９１１ ＤＫ２７２７富　Ｕ上Ａｌ　田旦Ω１９１１にＴｎ５（Ｋｍ’）挿入断片をもつ 運動性欠如オレンジ色コロニー ＤＫ６Ｇ０３章　ｕ１１■１１ＤＫ２７２７のΩ１９１１　Ｔｎ５のＴｎ５−１ ３２（Ｔｃ’）置換 りに１０５０　野性型Ｍ、　ｘａｎｔｈｕｓ菌株ＤＫ４０６　ｒｅｄ　ＤＫ１０ ５０の濃いオレンジ色突然変異体 Ｐ１大腸菌ファージ Ｐｌ：：Ｔｎ５−１３２−　Ｔｎ５−１３２（Ｔｃ’）挿入物をもつ野性型ＰＩ Ｐｌ：：Ｔｎ９　ｃｌｒｌｏｏ　Ｔｎ９（Ｃｍ’）挿入物をもつ熱誘導Ｐ１ｃｌ ｒｌｏ。 大腸菌ＮＣ１ＮＣ１０６１（Ｃａｓａｄａ　＆　Ｃｏｈｅｎ　１９８０）全部の 菌株がＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５ｔａｎｆ ｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ、　５ｔａｎｆ ｏｒｄ、　Ｃ＾９４３０５、υ、Ｓ、＾。 のＰｒｏｆｅｓｓｏｒ　Ｄａｌｅ　Ｋａｉｓｅｒの細菌株コレクションから自由 に入手できる。 民ス ｐＤＡＨ２Ｉ７が組込まれた種々の菌株の光中及び暗中のβ−ガラクトシダーゼ 発現の最小値及び最大値 菌株　表現型　最小値　最大値　最大値１本　（光り　（暗り ＤＫＩＯＩ　野性型　１０．８９　４３１．２８　１５．０５［ｐＤＡＨ２１） ］ ＤＫ７１７　ＤＫＩＯＩのＣａｒ’誘導体　２．５３　４３．５２　１０．２２ ［ｐＤＡＨ２１７］ １ｉ ＤＫ７１８　ＤＫＩＯＩのＣａｒ’誘導体　１０８．４　２６７７．５　１３４ ７．７　’［ｐＤＡＨ２１７］ ＤＫ１０５０　野性型　３．７１　３５１．５５　ｉｉ　２３．０６［ｐＤＡＩ ＋２１７］ Ｄに４０６　ＤＫ１０５０のＣａｒ’誘導体　１６０．６　３４０１．１’　４ ０７７．９”［ｐＤＡＨ２１７］ ｉ実験開始のときに暗闇で増殖した細胞の構成的β−ガラクトシダーゼ発現レベ ル ｉｉ実験終了後もβ−ガラクトシダーゼの比活性は経時的増加を維持した。 京（βガラクトシダーゼの比活性ｎ０７１ｇタンパク）１単位（Ｕ）のβ−ガラ クトシダーゼ活性は、３７℃で１分間に１１ＪモルのＯ−ニトロフェノール−β −Ｄ−ガラクトシドから１μモルのＯ−ニトロフェノールを産生ずる活性を示す と定義される。 プラスミドｐＤＡＨ２１７を保有する大腸菌ＮＣ１０６１の培養物はブダペスト 条約の規定に従って１９８６年６月２０日にＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、 Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｔａｔｉｏｎ、　Ｐ、０．Ｂｏｘ　３１．１３５＾ｂｂｅｙ 　Ｒｏａｄ、＾ｂｅｒｄｅｅｎ、　５ｃｏｔ−ｌａｎｄ　ＡＢ９８ＢＤに受託番 号Ｎ、Ｃ，１，８，１２２６９で寄託された。 プラスミドｐＤＡＨ２０１を保有する大腸菌ＥＤ８８１２の培養物はブダペスト 条約の規定に従って１９８７年６月１９日にＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎ　ｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａに受託番号Ｎ、Ｃ，１， ８，１２４９３で寄託された。大腸菌ＥＤ８８１２は出、島ト用、ｈｌ、臆ｅＺ （８１５）、江品、些パ、■弧、回、Ｓ−１λ−１λ・であり、Ｅｄｉｎｂｕｒ ｇｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　５ｃｏｔｌａｎｄ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇ ｄｏ−の培養物コレクションから自由に入手し得る。 ゛　び　に　しｔ−１ Ｐｉ　Ｉｎｅ、有効なＰ１形質導入を促進するＰ１不和合領域ｏｒｉ　大腸菌の 複製起点 Ｋｍ’／Ｋｍ“カナマイシン耐性／感受性Ｔｃ’／Ｔｃ”テトラサイクリン耐性 ／感受性＾ｐ’／＾ｐ“アンピシリン耐性／感受性Ｃｍ’／Ｃｍ”クロラムフェ ニコール耐性／感受性ｌ５５０　１Ｓ５０挿入配列 １ａｅＺ　プロモーター欠失大腸菌１ａｃＺ遺伝子Ω１９１１中のＴｎ５部位 Ｂ　Ｂａｗｌ　１部位 Ｂ２　ＬｔＬＩＬ部位　Ｄ　ｂ」」一部位Ｃ吐１部位　Ｎ　ジ四」一部位 Ｈ３ＬＬ！Ｌ！ｌＬ１部位　Ｐ　ｈｌ」一部位ＲＥｅｏＲ■部位　Ｒ５ＥｅｏＲ Ｖ部位Ｓ　シｄ」一部位　＾ｐ１　Ａｐｒ遺伝子の一部Ｓｓ　む」」一部位 Ｘ　リ四」一部位 Ｍ　Ｍｌｕｌ ａｌ　ミリリットル ■　マイクログラム ９１　マイクロリットル ｋｂ　キロ塩基対 （以下余白） Ａｕ醪３ｗａｌｄ、Ｅ、入、、Ｇ、Ｉ、ｕｄｗｉｇ　ａｎｃ、Ｊ、５ｃｈａｌｌ ｅｒ　（１９８０）ＣＯＬ（！　Ｓｐｒｉｎｇ　！ｉａｒ！：＋ｏｒ　５ｙｍｐ 、Ｑｕａｎセ、Ｂｉｏｌ、４５ｔ１０７−１１３゜Ｂ４！Ｌ１ｓａ１ｏｂｒｅ、 　＋：ｒ　−Ｍ−７ＲｕＬ７Ｌ−ＶＩＬＺｑｕａＺ、只、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｍｕ ｒｉｌｌｏｚＦ、、７＠　（１９８〕）Ｐｒｏｃ、Ｗａｔｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、υＳλ。 ＄１４，２１５９−２３６２ ｍｓｒｇ、　Ｄａ　）！ニー＃　ＣｍΣｇｎｅｒ、　Ｂ、σ、　；Ｌｒ５ｃｈｅ ｌ、　Ｊ、　Ｈｏｗａｒｄ。 Ｌ、　Ｊｏｈｎｓｒｕｄ、　Ｒ，八、　Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ａｒｓｄ　Ｔ、口 、　Ｔｉ５ｔｙ　（９１８０）ＣＯＬ（！　ｓｐｒｔｎｇ　Ｅａｒｂｏｒ　５ｙ ｉｐ、　ｇｕａｎヒ、　Ｂｉｏｌ、　４５＝１１５−１２３゜Ｂｕｃｈａｒｄ、 　Ｒ，Ｐ、　ａｎｄ　Ｍ、・Ｄｗｏｒｋｉｎ　（１９６ｇ）　Ｓ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ。 １ｔ５３５−５４５゜ Ｃａ５ａｄａｂａｎ　Ｍ、　；１．　ａｎｄ　Ｓｏ　、ＩＬ　Ｃｏｈｅｎ　（１ １８０）　＋Ｌ　Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌゆ　１３８＝Ｌフ９−２０７゜Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍ、　Ｓ、ｔ　 Ｊａ　Ｃｈｏｗ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ　（１９８０）　Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４３＝９７１−９８０゜刀−がりクトシターセ゛Ｊ郡 名＋ｌ＋１（ＴＪ、ｒｓＢタンハ０り・カ国際調査報告 ＩＪＩｌｕ−ｗｎｍｍ　ｈａ、ｋｗ＋ｍ　ＮＬ　ＰＣＴ／ＧＢ　１１７１００４ ４０

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．粘液細菌に由来の光誘導プロモーターを含む組換えＤＨＡ配列。
2. ２．粘液細菌に由来の光誘導プロモーターと発現させるべきヌクレオチド配列を 該プロモーターのコントロール下に配置せしめる位置に制限部位をもつヌクレオ チド配列とを含むＤＮＡ配列。
3. ３．制限部位に導入されたヌクレオチド配列の発現がプロモーターのコントロー ル下に維持されることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．プロモーターがカロテノイド合成遺伝子に由来することを特徴とする請求項 １から３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ配列。
5. ５．プロモーターがＭ．ｘａｎｔｈｕｓに由来することを特徴とする請求項１か ら４のいずれかに記載のＤＮＡ配列。
6. ６．プロモーターがＭ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体のΩ１９１０またはΩ１９１１領 域に由来することを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ配列。
7. ７．プロモーターがＭ．ｘａｎｔｈｕｓのｃａｒＲ遺伝子に由来することを特徴 とする請求項６に記載の組換えＤＮＡ配列。
8. ８．発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の組 換えＤＮＡ配列。
9. ９．発現させるべきポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合した粘 液細菌由来の光誘導プロモーターを含みＤＮＡ配列が本来はプロモーターに作動 的に結合していないことを特徴とする組換えＤＮＡ配列。
10. １０．請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡ配列によって形質転換された宿 主生物。
11. １１．細菌、酵母細胞、植物細胞または動物細胞であることを特徴とする請求項 １０に記載の宿主。
12. １２．大腸菌またはＭ．ｘａｎｔｈｕｓであることを特徴とする請求項１１に記 載の宿主。
13. １３．（ａ）組換えＤＮＡ分子を産生すべくポリペプチド配列をコードする遺伝 子配列を粘液細菌由来の光誘導プロモーターの作動コントロール下に配置し、 （ｂ）前記組換えＤＮＡ分子で宿主受容菌を形質転換し、（ｃ）プロモーターが 誘導されて遺伝子発現が行なわれるように宿主に光を照射することを特徴とする ポリペプチドの産生方法。
14. １４．プロモーターがカロテノイド合成遺伝子に由来することを特徴とする請求 項１３に記載の方法。
15. １５．プロモーターがＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに由来することを 特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
16. １６．プロモーターがＭ．　ｘａｎｔｈｕｓ染色体のΩ１９１０またはΩ１９１ １領域に由来することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. １７．プロモーターが発現ベクターであることを特徴とする請求項１３から１６ のいずれかに記載の方法。
18. １８．ベクターがｐＤＡＨ２１７、ｐＤＡＨ２０１またはその逆位、欠失または 挿入突然変異体であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
19. １９．宿主が細菌、酵母、動物細胞または植物細胞であることを特徴とする請求 項１３から１８のいずれかに記載の方法。
20. ２０．宿主が大腸菌またはＭ．ｘａｎｔｈｕｓであることを特徴とする請求項１ ９に記載の方法。
21. ２１．宿主が大腸菌ＭＣ１０６１またはＭ．ｘａｎｔｈｕｓ　ＤＫ１０１である ことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. ２２．請求項１３から２１のいずれかに記載の方法で産生されたポリペプチド。
23. ２３．（ａ）粘液細菌ＤＮＡを非粘液細菌宿主に由来の複製起点をもつ第１ベク ターに挿入し、 （ｂ）前記第１ベクターを、該ベクターが夫々に対して各１つだけの制限部位を 有する第１及び第２の制限酵素で切断して前記粘液細菌ＤＮＡインサートを含む 制限フラグメントを形成し、 （ｃ）第１ベクター中の制限部位に対して逆の配向で前記第１及び第２の制限酵 素の各々に対して各１つだけの制限部位をもつ第２ベクターを第１及び第２の制 限酵素で切断し、（ｄ）前記制限フラグメントを前記第２ベクターの選択フラグ メントと結合して粘液細菌ＤＮＡを逆配向で含む制限フラグメントを含む第３ベ クターを形成し、（ｅ）第３ベクターを粘液細菌宿主に形質導入し、第３ベクタ ーを染色体に組込んだ宿主細胞を選択し、（ｆ）前記選択宿主細胞から染色体Ｄ ＮＡを単離し、染色体を粘液細菌ＤＮＡから遠い複製起点の反対側のベクターＤ ＮＡ内部に制限部位をもつ制限酵素で直線化し、 （ｇ）このように形成された粘液細菌ＤＮＡ含有フラグメントの末端を結合し、 宿主受容菌を形質転換するステップを含むことを特徴とする粘液細菌ＤＮＡのク ローニング方法。
24. ２４．第２ベクターがｐＤＡＨ１６０またはその逆位、欠失または挿入突然変異 体であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。