JPS6229984A - 植物感染性キャップ化ｒｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は植物ウィルスの分野に関する。特に。

植物、ｖＪ物および細菌のく＋）鎖ＲＮ＾ウィルスに関
し、また、ウィルスのゲノム内に外来１１ＮＡ小片を挿
入する。ここでの教示に従ってなされる修飾に関する。

この挿入小片は１次いで、宿主細胞を遺伝子的もしくは
表現的に修飾するためにこの宿主細胞内に導入される。

本発明を、単子葉植物に感染する植物のＲＮＡウィルス
すなわちチャヒキモザイクウイルス（ＢＭＶ）の修飾を
例に挙げて説明する。

（従来の技術） １１ＮＡウイルスは、そのゲノムが一本鎖１１Ｎ八から
成りそれが宿主細胞質中で直接的なＲＮＡ？、Ｊｔ製に
よって複製できるウィルスであって、広範におよぶ多く
の変異株が知られており、動物、植物および細菌に感染
する。このようなウィルスは、９通。

ウィルス粒子のキャブジッドに包まれて観察されるその
感染性ＲＮＡ　ｔＭがメソセンジャー・センス鎖であっ
て、これが直接翻訳されまた適当な条件下で直接的なＲ
ＮＡ複製過程によって複製されることから、「（→−）
鎮１？ＮＡウィルス−１と呼ばれることもある。この群
に属するウィルスには、ピコルナウィルス、　ＲＮ八へ
クテリオファージ、コモウィルス、および植物の様々な
単粒子性１１ＮＩＩウイルスや多粒子性ＩＩＮＡウィル
スが含まれるが、これに限定されない。これらウィルス
の一部を挙げると、ポリオウィルス、シンドビスウイル
ス、Ｑβバクテリオファージ、タバコモザイクウィルス
、大麦ストライブモザイクウィルス、ザザゲモザイクウ
イルス、キュウリモザイクウィルス、アルファルファモ
ザイクウィルスおよびチャヒキモザイクウイルスがある
。単一のＲＮＡ分子内にウィルスの全ゲノムが含まれて
いる場合もあるが、他方では、特に植物の多粒子性ＲＮ
Ａウィルスにおいては、ウィルスの全ゲノムは２つ以上
の異なるＲＮＡ小片から成りそれぞれが別々にキャブジ
ッドに包まれている。　（全般的な総説として、釦ｎｅ
ｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

Ｓ、　Ｌｕｒｉａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄａｒｎｅｌｌ；　
Ｐｌａｎｔ　ＶｉｒｏｌｏＢｙ　２ｎｄｅｄ、、　　Ｒ
，Ｅ、　　Ｆ、　　Ｍａｔｔｈｅｗｓ＋　　八ｃａｄｅ
ｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　（１９８１）を参照せよ。ま
た、（＋）鎖ＲＮＡの複製の全般的な総説として、　Ｄ
ａｖｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｌｕｌｌ　（１９Ｂ２）　Ｊ、
　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　６１＋１を参照せよ。）この群内では、
キャブジッドの形態、外被タンパク質、遺伝子構成およ
びゲノムの大きさに関して多くの変異が存在する。

この実証済の多様性にもかかわらず、最近の研究による
と、　ＲＮＡ複製時に働くタンパク質問には顕著な相似
性があることがわがっている。配列の相同性は、ササゲ
モザイクウィルス、ポリオウィルスおよびロ諦疫ウィル
ス間で（１’ｒａｎｓｓｅｎ、　Ｉｌ、　（１９８４）
　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３，８５５）　、またアル
ファルファモザイクウィルス、チャヒキモザイクウイル
スおよびタバコモザイクウィルスによりコードされてい
る非構造タンパク質間で（ｌｌａｓｅｌｏｆｆ、　Ｊ、
　ｅｔａｌ、　　（１９８４）、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｌｌ５Ａ　　β
」。

４３５８）　、また上記タンパク質とシンドビスウィル
スによりコードされているタンパク質の間で（Ａｌｑｕ
ｉｓｔ、　　Ｐ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　（１９８５）
　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　　５３．　５３６）　　。

報告されている。複製機能に関するタンパク質において
このような実質的な相同性があることから。

これらウィルスはその複製戦略において機械学的な相似
性を共有し、しかも進化上関連しているであろうことが
示唆される。本発明では、（＋）鎖ＲＮＡウィルスのゲ
ノムＩＩＮ／ｌに対する修飾を開示する。修飾されたＩ
？Ｎ＾を用いて所望のＲＮＡ小片を標的宿主細胞へ転移
させ、その小片を複製させることにより宿主細胞内でそ
の機能を発現させている。

本発明を例証するため、（＋）鎖ＲＮＡウィルスの共通
な複製機能を示すウィルスを選んだ。

チャヒキモザイクウイルス（ＨＶ）は、多分節状ＲＮＡ
ゲノムで特徴づけられるある種の植物ウィルスのメンバ
ーである。このウィルスの遺伝物質ばＲＮＡであり、複
製と生産的感染に必要な総遺伝情報は１つ以」二に分離
したＲＮＡ分子に分割されている。この種のウィルスを
ここでは多分節状１７ＮＡ　ウィルスと名付けるが、こ
れにはＢＭＶの他に、アルファルファモザイクウィルス
（ＡＭＶ）　、大麦ストうイブモザイクウィルス、ササ
ゲモザイクウイルス。

キュウリモザイクウィルスおよびその他多くのウィルス
が含まれる。ウィルス粒子は普通、外被タンパク質のキ
ャブジッドで包まれたＲＮＡから成る。

所定の多分節状ウィルスの全ゲノムを含有する分離した
ＲＮＡ粒子は、それぞれが同じタンパク質３、■成を有
する分離したウィルス粒子中にキャブジッド包装されて
いる。宿主植物細胞の感染は２例えば植物を必須ウィル
ス成分すべての混合物を含むウィルス調製物にさらすこ
とによって、ウィルスゲノムの各ＲＮＡ成分を含むウィ
ルス粒子が植物細胞に感染して、生じる。感染はまた。

植物細胞もしくはプロトプラストをＲＮＡ成分の混合物
にさらすことによっても、達成される。あるサブクラス
の多分節状ＲＮＩＩウィルス（ここでは、ザブクラス■
と呼ぶ）は、複製および生産的感染においてウィルスＲ
ＮＡの他に外被タンパク質を必要とする。

ＡＭＶはサブクラス■の多分節状ウィルスの１例である
。他のサブクラス（ここでは、ザブクラス■と呼ぶ）は
外被タンパク質を必要とせず、　ＲＮＡ成成 分２複製と生産的感染において必要かつ充分である。Ｉ
ＩＭＶはザブクラスＨに属する。ＢＭＷのゲノムは、　
３．２．２．８および２．１キロベースの３つのメソセ
ンジャー・センスＲＮＡに分割されている（Ａｈｌｑｕ
ｉｓｔ。

Ｐ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　（１９８１）　　Ｊ、　　
Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　１５３，２３；　　八ｈｌ
ｑｕｉｓｔ。

Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、　１７２，３６９　）。

「メツセンジャー・センス」という言葉は、ウィルスＲ
ＮＡが直接翻訳されてウィルスタンパクＮを産生じ途中
の転写段階を必要としないこと、を意味する。

ＢＭＶの３つの遺伝子成分それぞれに対する完全なｃＤ
Ｎ＾コピーは一般的な転写ベクターであるｐＰＭｌでク
ローン化されており、これはＡｈｌｑｕｉｓｔ、　ｐ。

ａｎｄ　Ｊａｎｄａ、　Ｍ、　（１９８４）　Ｍｏ１．
　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　４．２９７６に記載されてい
る。ｒｌＭＶ−ＲＮＡＩ、　ＢＭＶ−ＲＮＡ２およびＢ
ＭＶ−ＲＮＡ３のｃＤＮＡコピーをそれぞれ有するｐＢ
ＩＰ旧８゜ｐＢ２ＰＭ２５およびｐＲ３Ｉ’旧という３
つのプラスミドが選択されている。この３つのプラスミ
ドが１セントとなって完全なりＭＶゲノムを構成する。

ｒｌＭＶのｃＤＮＡを含有する３つのプラスミドそれぞ
れから得られるＤＮＡは特異的な」９ＲＩ部位で切断さ
れる。こうして作られた線状ＤＮＡは、　ＲＮＡポリメ
ラーゼで触媒される反応によりｉｎ　　ｖｉｔｒｏで転
写される。転写ベクターｐＰ旧内の修飾されたλＰＲプ
ロモーターにより、各ＢＭＶ配列のまさに５゛末端でＲ
ＮＡ合成が開始され、転写はｒｌＮＡ鋳型末端まで続行
され、このとき転写物の３゛末端には非ウィルス性の６
〜７個のヌクレオチドが付加される。

Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ、　ｔｒ、Ｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１
９８２）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１０
．６３５３で記載されているように１合成キャップ構造
ｆｆ１７ＧｐｐｐＧ存在下で転写が行われると、真のＢ
ＭＶ　ＲＮＡ　と同じキャップ化５゛末端を有するＲＮ
Ａ転写物が作られる。これらＲＮＡは、　ｉｎ　　ｖｉ
共艶の翻訳系において、また真のＢＭＶ　ＲＮＡから翻
訳されたタンパク質と同じ電気泳動上の移動性を示すタ
ンパク質を直接に作る場合において、活性のあるメソセ
ンジャーとなる。

（発明の要旨） （＋）鎖複製１１ＮＡウィルスを意味するために。

略して、　　ｒＲＮＡウィルス」という言葉を用いる。

本発明は、　ＲＮ＾ウィルスのケノムｌ？ｌＪＡはり（
来ＲＮＡ小片を含有するように修飾することができると
いう事実、およびこの（＋ｇ飾されたＲＮＡは宿主細胞
に導入されそこで複製されて夕１来１？Ｎ＾小片を発現
できるという事実に基ついている。これにより受容細胞
は表現的に形質転換され、これば同様に、生物体を遺伝
子的に形質転換するのに貢献するであろう。表現的に形
質転換される細胞は、ハ典１江　Ｐ−坊吋ル糾織培養、
細胞培養またはプロトプラストの形で修飾することがで
きる。本発明の実施例は１表現的に形質転換された植物
をフィールドの条件下または温室栽培で作るのに有用で
ある。

本性で導入される形質として好ましいものには。

パス１〜ｉｌ性、病原体面・１性、除草剤抵抗性またシ
Ｊ′剛性、修飾を受（Ｊた成長習性、および産業」１有
用なペプチドもしくは製薬を植物体中で産生ずるといっ
たような修飾を受レノだ代謝特性、があるが、これに限
定されない。修飾は、その形質に対する必要に応じて、
成長周期のいつでも適用可能である。

例えば、ベスト耐性は、穀物がそのベストにかがる危険
性がある場合においてのみ５　しかもその穀物が最もベ
ストにかかりやすい時に付与される。

他の形質は二次的な機能を強めるために用いられる。例
えば５収穫後のまぐさのタンパク質含量を増加させるた
めに用いられる。ウィルスの選択および修飾の詳細は、
当業者に周知のパラメーターに従ってなされる選択事項
である。広範囲の修飾用１？ＮＡウイルスおよび広範囲
の感受性宿主細胞型が与えられれば、　ＲＮＡウィルス
由来の修飾されたＲＮＡによって表現的にもしくは遺伝
子的に修飾を受けた細胞や生物体を、その他目的に使用
することは当業者にとって自明であろう。形質転換動物
細胞、形質転換菌体などの他の使用法も容易に考えつく
ことができる。例えば、Ｑβファージ感受性の菌体を培
養して所望の菌体濃度に達するまで増殖させ、所望の遺
伝子を有する修飾されたＱβファージを感染させること
により所望のクンバク質を短期間で大量に発現させるこ
とが可能である。

一般に、細胞もしくは生物体を表現的に形質転換する方
法は以下の工程を含有する：ウイルスＲ’ＮＡ　。

またばＲＮＡウィルスが多分節状の場合はその各ＲＮＡ
成分、に対して全長のｃｌ’ｌＮＡを形成すること；転
写ベクターへ各ｃｎＮＡをクローン化すること：非つィ
ルス性ＤＮＡ小片を挿入に対してＲＮＡ複製が妨害され
ることなく守られるような領域に挿入することにより、
　ＲＮＡ成分の少なくとも１つに対するｃＤＮＡを修飾
すること；修飾されたｃＤＮＡを転写すること。

もしくは多分節状ウィルスの場合はその多分節状ウィル
スのある１つのＲＮＡ成分に対応するｃＤＮＡそれぞれ
を転写すること；転写反応において、修飾されたｃｒｌ
ＮＡをそれに対応する修飾を受けていないものと置換す
ること；および、夕■来１？ＮＡ小片含有メソセンジャ
ー・センスＲＮＡをもつ修飾されたＩＩＩＮＡを含む各
ウィルス成分の転写されたＩＩＮＡもしくはＲＮＡ混合
物（溶液状またはキャブジッド包装された状態のいずれ
か）、を用いてウィルス感受性のプロトプラスト、細胞
、１ｌＪｉｖ７ａもしくは完全な生物体を感染すること
、の工程を含有する。この点からいえば、それに続く工
程は感染を受ける材料の型および感染経路によって変わ
ることになる。植物のプロトプラスト、細胞および組織
は、栄養増殖させて、感染を受けた特別な植物変種に合
ったあらゆる技術を用いて完全な植物体に再生させるこ
とが可能であり、これはフィールドに植え換えできる。

完全な植物体を新　全１願で感染することも可能である
。感染された植物体および植物細胞は、外来１１ＮＡ小
片を有する修飾されたウィルスＲＮＡのコピーを１細胞
当たり多数産生ずることができる。当業者に周知の原理
および方法によって望め通りにまた適切に挿入されれば
、外来ＩＩＮＡ小片は細胞内である機能を発揮すること
ができる。このような機能は、細胞内で翻訳されて所望
のペプチドもしくはタンパク質を産生ずるようなコード
機能であるか、または、細胞内である遺伝子の発現を強
めたり１弱めたり、開始または終止したりする調節機能
であろう。ＲＮＡの１小片によってもたらされ得るいか
なる機能も、原理的には細胞内で発現される。このよう
にして発現された外来ＲＮＡ小片は、形質転換された生
物体、植物体、細胞。

プロトプラストもしくはＭ１織に表現的に新しい形質を
付与する。

本発明を、クロラムフェニコール　アセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする構造遺伝子を含有する
ようにＢＭνＲＮＡを修飾すること。

およびこれを用いて大麦プロトプラス１へを表現的に修
飾しＣＡＴを合成するプロトプラストを産生ずること、
を例に挙げて説明する。ここで示されるデータは、　Ｒ
ＮＡウィルス由来の修飾されたＲＮＡを用いて細胞を表
現的に修飾することの最初の実例を表していると確信す
る。

本発明のＩＩＮ八分へは、　ＲＮＡウィルス由来のシス
に作用する複製因子および外来ＲＮＡ小片を含有する。

本発明のＲＮＡは、　ＲＮＡウィルス由来のＩ？ＮΔ小
片。

および宿主細胞でのＲＮＡ複製に必須でない部位に挿入
された外来ＲＮ＾小片、を含有する。

本発明のＤＮＡ転写転写ツクター　ＲＮＡウィルス由来
のシスに作用する複製因子および外来ＲＮＡ小片を含有
するＲＮＡに相補的な一本鎖を含むｃＩ］ＮＡを含有す
る。

本発明のＩＩＮＡ転写ベクターは、　ＲＮＡウィルス由
来のＲＮＡ小片、および宿主細胞でのＲＮＡ複製に必須
でない部位に挿入された外来１？ＮＡ小片、を含有する
ＲＮＡに相補的な一本鎖を含むｃＤＮＡを含有する。

本発明の方法は、宿主細胞を表現的もしくは遺伝子的に
形質転換する方法であって、該細胞にＲＮＡウィルス由
来のシスに作用する複製因子を含有するＲＮＡ分子を導
入し、それによって外来１７ＮＡ小片が該宿主細胞に検
出可能な形質を付与するごとにより、該宿主細胞を表現
的もしくは遺伝子的のいずれかで形質転換する。

本発明の方法は、宿主細胞を表現的もしくは遺伝子的に
形質転換する方法であって、該細胞に。

ＲＮＡウィルス由来のＲＮＡ小片および該宿主細胞での
ＲＮＡ複製にとって必須でない部位に挿入された外来１
２ＮＡ小片を有するＲＮＡを導入することを含有する方
法であって、該外来ＲＮＡ小片が該宿主細胞に検出可能
な形質を付与することによって、該宿主細胞が表現的も
しくは遺伝子的に形質転換される。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明の理解を容易にするため、終始用いられるいくつ
かの用語をここで定義する。

ハ１立不７１／　Ｘ−ここで用いられるこの用語は、ウ
ィルスのゲノムが一木鎖状の１’ｌＮＡであって、この
−木鎖が（−ｔ−）ｔＮもしくはメソセンジャー・セン
ス鎖であるウィルスを意味する。ウィルスが感染した細
胞内でのウィルス性（＋）鎖の複製は直接的なＲＮＡ複
製過程により生じ、従って宿主細胞内で逆転写という中
間過程を経るレトロウィルスの複製機構とは１区別され
る。

□ンレ（に寸り用］二る１Ｗ複製匹王−この用語ば、　
ＲＮ八へィルスのＲＮＡゲノムの一部であって、それが
シスに存在しなければならない、すなわち複製の必須条
件として各ウィルス鎖の一部として存在しなければなら
ないものを意味する。ウィルスの複製はおそらく、シス
に作用する因子と相互作用してＲＮＡ複製を行うような
トランス（拡散性の）因子が１つ以上存在するか否かに
左右されると思われる。複製にはトランスに作用する因
子が必要であるが、これらは提供された修飾ＲＮ＾上に
存在もしくはコードされる必要はなく、他のいくつかの
方法によって感染細胞内で利用可能となる。例えば多分
節状ＲＮＡウィルスの場合、トランスに作用する機能は
、細胞を形質転換するために修飾ＲＮ　Ａと同時に用い
られるウィルスゲノムの他の非修飾成分によってもたら
される可能性がある。標的細胞を前段階で修飾しておい
て、トランスに作用する機能を構成性に発現させてもよ
い。シスに作用する複製因子はウィルスＲＮ＾の１つ以
上の小片から成り、それは宿主細胞内でＲＮ＾複製によ
って複製される予定のあらゆるＲＮＡ分子上に存在しな
ければならない。小片はウィルスＲＮＡ分子の５”末端
部であるらしく、また同様に他の部分を含む可能性もあ
る。従って、このシスに作用する因子を機能的用詔とし
て定義する。ずなわち必須のｌ・ランス作用性因子を含
むことがわかっている細胞内でＲＮＡが複製する能力を
破壊するような修飾は、いずれもシスに作用する複製因
子内の修飾とみなす。反対に、ある挿入に対して複製が
妨害されることな（７その挿入に耐え得るような配列領
域に挿入するといったような修飾は、いずれもシスに作
用する複製因子外部での修飾である。ここで述べるよう
に、　ＩＩＭＶを例にとって、　ＲＮＡウィルス分子の
実質的な部分を、欠失、挿入もしくは欠失と挿入を絹み
合わせるごとによって、複製を妨害することなく修飾す
ることができる。

「Ｓ、ｔｌ−泉を本」という用語は、修飾１１Ｎへの一
部を含有するＩＩＮＡ小片のウィルス源を決定するため
に用いる。例えば、ここで述べる修飾ＲＮＡにおいては
、その実質部分はＢＭＶに由来している。由来の仕方は
、それがＲＮＡ　レヘルの直接的なＫ、■み換え、転写
。

または逆転写のいずれによる場合であっても１本発明の
目的にとって重要でない。確かに１例えばシスに作用す
る複製因子内および他の場所に修飾を加えて、得られる
複製の速度または程度を修飾できると考えられる。ここ
で例に挙げている修飾１７ＮＡの場合、転写ベクターと
して、ウィルスｌ？Ｎ／ｌのまさに、５°末端ヌクレオ
チド配列を保存しているものを用いた。まさに５゛末端
のヌクレオチド配列が所望の場合はこのようなベクター
の使用が好ましいであろうが。

ｃｌｌＮＡからウィルスＲＮ／ｌを転写する際このよう
なベクターを用いることは本発明にとって必須であると
は考えない。所定のウィルス源に由来しているＲＮＡ小
片は、その必要はないのであるが、そのウィルス内でそ
れが存在しているような小片と配列が一致するかもしれ
ない。所定のＲＮＡウィルスに由来するシスに作用する
複製因子が、　ＩＩＮへ複製が実質的に妨害されること
なく、そのヌクレオチ１゛配列内に小さい修飾を受は得
ることは理解されるであろう。

外米間り小片は、修飾される予定のウィルスＲＮＡに挿
入されるＲＮＡの小片を示す用語であって、その外来Ｒ
ＮＡ小片の由来はＲＮＡウィルス自身ではない。その起
源は、他のウィルス、または植物、動物、細菌、ウィル
スもしくは菌類のような生存生物体であればよい。また
、外来１１ＮＡは化学合成したＲＮＡでもよく、前記の
ものと組み合わせてもよい。外来１７ＮＡ小片は、ある
ＲＮＡ小片により提供されることがわかっているどんな
特有な機能をも提供するであろう。このよ・うな機能に
はコード機能があり、この場合。

ＲＮＡ　は配列をコードするメソセンジャーＲＮＡとし
て作用し、宿主細胞で翻訳されて有用なもしくは所望の
性質を有するペプチドまたはタンパク質が合成される。

ＩＩＮＡ小片はまた９例えばリポソームＲＮＡにおける
ような構造的なものであってもよく１例えばｓｎＲＮＡ
やアンチ・センスＲＮＡのように調節的なものでもよく
、触媒的なものでもよい。

特に興味深い機能はアンチ・センスＲＮＡによって提供
される。これは（−）鎖１？ＮＡと呼ばれることもあり
、実際に、標的細胞内に存在するもう１つのＲＮＡ配列
に相補的な配列であって、相補的な塩基対合を通して標
的細胞内のこのＩＩＮＡに結合してその機能を妨害でき
る。

要旨の項で概説した工程段階の様々な状況は。

必要に応じ、形質転換用因子として選ばれるウィルスと
挿入されるＲＮＡ小片の特別な状況に従って修正を加え
ることができる。例えば、挿入遺伝子が形質転換細胞で
直接翻訳されるようなメツセンジャー・センスＲＮＡの
形の場合は、その遺伝子にはイントロンのような翻訳さ
れない介在配列が存在してはならない。他方、挿入遺伝
子は自然に生じた遺伝子である必要はなく、修飾を受＆
Ｊてもよい。すなわち、１つ以上のコード小片の複合体
であるか、または１つ以上のタンパク質をコードしても
よい。ＲＮＡばまた。挿入と欠失を組み合わ−ｌで修飾
を加えることによって、修飾ＲＮＡ分子の全長または他
の性質を制御してもよい。実施例５で述べるように、　
ＢＭＶのｌ１ｌＮＡ３の実質部分が欠失しても正常なＲ
ＮＡＩおよびＲＮＡ２を含む細胞内でのその翻訳は重大
な影響を受けない。挿入される非ウィルス性遺伝子は、
それが受容細胞の翻訳機構で直接翻訳され得る形のもの
である限り、原核生物または真核生物のいずれに由来し
てもよい。従って、コード配列内にイントロンがある真
核生物の遺伝子は、その遺伝子をコードする真核生物の
メソセンジャーＲＮ／ｌに対するｃＤＮ＾コピーの形で
挿入しなりればならない。挿入遺伝子はそれ自身の翻訳
開始信号１例えばリポソーム結合部位や開始コドン（Ａ
ＩＩＧ）を持っていてもよいし、あるいは修飾される予
定のウィルスＲＮＡに最初から存在するこれら成分のう
ちの１つ以上を利用するような仕方で挿入してもよい。

当業者によく理解されている原理によれば、挿入配列の
正確な翻訳を保つためにある一定の構造」二の束縛がみ
られるにちがいない。例えば、外来性コード小片が内在
性ヨーｌ−小片と結合することを意図するのであれば、
挿入されるコード配列はリーディングフレーＪ、内にそ
れとフェイズを合わせてしかも同し翻訳方向に挿入され
なければならない。［非ウィルス１４１１という用語は
ここでは、遺伝子転送を行うために修飾されるウィルス
内には本来含有されないよ・うなあらゆるＲＮＡ小片を
含む特別な意味で用いられる。

よってこれは「外来性」と同義的に用いられる。

従って、修飾されるウィルス以外の異なるウィルス種に
由来する遺伝子は１本発明を説明するためには、「非ウ
ィルス性」や「外来性」という用語の意味内に含まれる
。例えば、ここで用いられる非ウィルス性遺伝子には、
形質転換を行うために修飾されるウィルスとは区別でき
る型の細菌ウィルス、動物ウィルスもしくは植物ウィル
スに由来する遺伝子が含まれる。さらに、非ウィルス性
遺伝子はあらゆる原核生物またしＪ真核生物に由来する
構造遺伝子であってよい。遺伝子が転送されても受容細
胞が表現的に明らかな修飾を受げないような特定の遺伝
子が存在するであろうことは当業者には理解されよう。

このようなことは例えば。

非ウィルス性遺伝子の翻訳産物が宿主細胞に対し２有毒
であったり、それが退化または加工されることによって
非機能的になったり、あるいは宿主細胞が形質転換細胞
に顕著な表現型を付与するに充分な翻訳を行うのを不可
能にする構造上の特徴が翻訳産物にある場合に生じるで
あろう。しかし本発明は、転送されるＲＮＡ小片または
遺伝子のどんな特別な性質にも左右されない。従って、
受容細胞または受容植物に対し容易に観察できる表現的
形質をイ１与しそごなうＲＮＡ小片または遺伝子が存在
するかもしれないということは本発明には無関係であり
、このことは当業者にとってはあらゆる場合において実
験することなく容易に認められることであろう。

（以下余白） 外来ＲＮＡ小片は、ウィルスＩＩＮＡまたは多分節状Ｒ
ＮＡ　ウィルスのＲＮＡ成分に対応するどのｃＤＮＡ配
列のどの好都合な挿入部位に挿入してもよい。但し。

その挿入は、宿主細胞内でのＲＮＡ複製に必須な配列を
破壊するものであってはならない。例えば。

複製時に外被タンパク質が必須ではない。ウィルスでは
、外来１？ＮＡ小片は、正規には外被タンパク質をコー
ドする領域内に挿入するかもしくは、その領域と置換し
てよい。必要に応じて、宿主細胞の好ましくない反応に
寄与する領域は欠失または不活化してよいが５但しこの
ような変化によって。

１？ＮＡが宿主細胞で複製される能力に逆の影響が生し
てはならない。多くの単一成分ＲＮＡウィルスおよび多
分節状ＲＮＡウィルスにとって、正規のＲＮ八へ製の速
度が低下することは耐え得ることでありときには好まし
い場合もある。それは、正規の感染で産生されるＲＮＡ
量は、形質転換細胞のリポソームを飽和するに充分であ
る以−１−に存在するからである。

形質転換の工程そのものは、それによってＩＩＮ＾が細
胞、完全な植物体、植物組織または植物プロ１〜プラス
トに導入され得るような手段であれば。

どのような方法によってもおこなうことができる。

非ウィルス性Ｒｈ小片を含む（１答飾されたウィルスＲ
ＮＡが、正規の感染におけるそれに相当するＲＮＡの代
わりに用いられることを除けば、宿主細胞はＲＮ／ｌの
みもしくはそれがウィルス粒子中にキャブジッド包装さ
れたもので感染させることができる。

マイクロインジェクションのような、標的細胞に１１Ｎ
Ａを導入するための他のあらゆる適切な手段が用いられ
る。ときには修飾された成分以外に本来の成分全てが含
まれることが好ましい場合もあろ・う。形質転換用成分
の混合物中で１つ以上の成分を修飾してもよい。それぞ
れの感染用成分の量は。

適当量の細胞が混合物中のその各成分のうち少なくとも
１つを受容することを保証するに充分な量でなければな
らないことは理解できよう。受容体を前処理したり、感
染率を増強するための成分を加えたり、キャブジッド包
装されたｌ？ＮΔかキャブジッド包装されていないＲＮ
Ａのいずれを用いるか。

などの感染工程における他の変更は、当業者が与えられ
た状況で所望の形質転換率を達成するために操作し得る
選択事項である。例えば、所定の植物変種に遺伝子転送
を行うために修飾される植物の多分節状ＲＮ八へィルス
は、多分節状ＦＩＮへウィルスの既知の宿主域特性に従
って選択されよう。例を挙げれば、　ＢＭＶは様々な種
の牧草、およびそれと’ｍ頻関係にある大麦、小麦およ
びとうもろこしを含む家庭用種に感染する。

培養によって感染を受ける植物細胞は、その細胞が成長
して分裂する際、順当にいけば形質転換されたままであ
ろう。それば、　ｌ’ｌＮＡ成分が複製可能であって従
って細胞分裂時に娘細胞に分配されるからである。表現
的に修飾された細胞、　ｆｌｉｌ織もしくはプロトプラ
ストから再生した植物体もまた表現的に修飾された状態
にある。同様に、形質転換された苗木のような植物体が
成育する時も形質転換された状態は維持される。形質転
換用の成分を用いるタイミングは、意図する結果により
、また植物が成育する様々な段階を通して生じる形質転
換用成分に対する感受性の変化により、左右される。

多くの植物１１ＮＡウイルスは種子によっである世代か
ら次世代へと伝えられる。この性質は植物を遺伝的に形
質転換するのに用いられる。すなわち。

ｆ１１飾されたｌ？Ｎ／ｌば、おそらく細胞質での複製
によって一世代から次世代へと伝えられ得る状態を維持
するため、ちょうど種子により伝えられるウィルス感染
が一世代から次世代へ伝えられる時に修飾ＲＮＡも次世
代へと伝えられることになる。

下記実施例は、　ＢＭＶ　ＩＩＮ八３へ修飾に適用され
るような本発明の原理、およびクロラムフェニコールア
セチル　トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺
伝子を含有する修飾されたＩＩＭＶ　ｌｌＮＡ３を大麦
プロトプラストの表現的形質転換に使用すること。

を説明するものである。便宜上、ウィルスＲＮＡに対す
る修飾で非ウィルス性リボヌクレオチド配列の挿入を含
むようなものはすべて、それにウィルスＩＩＮＡの欠失
が組の合わさっているか否かにかかわらず、そのＩＩＮ
Ａを示す番号の後にプライム符号をつけて示すことにす
る。例えば、修飾された１１Ｎ八３はＲＮＡ３”　と命
名され、より一般的には、　　ｌ１ＮＡゎはＲＮＡ１１
”　と示される。

下記実施例は１分子生物学、クローニング、植物細胞生
物学、植物ウィルス学および植物組織培養にたずされる
当業者に周知でありかつ入手可能な多くの技術を利用し
ている。これら方法は、ここで詳述されていなければ、
引ｆ列の１つもしく（才それ以上の中に充分に記載され
ている。酵素については、明細書に書かれていない場合
は、市販品を手に入れ、その指示に従ってまたは当業者
に周知の変法に従って用いたものとする。試薬、緩衝液
、および培養条件また種々の酵素で触媒される反応の条
件は、当業者には周知のものである。これら標準的技術
を包含する引用文献としては下記のものが含まれる：　
Ｒ，Ｗｕ、　ｅｄ、　（１９７９）　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　６８；Ｒ，Ｍｕ　ｅｔ　　ａｌ、
、　ｅｄｓ、　（１９８３）　ＭＯｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１００．１０１　　；Ｌ、　Ｇｒｏ
ｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｍｏ１ｄａｖｅ。

ｅｄｓ、　（１９８０）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、　　６５；Ｊ、　Ｉｔ、旧１１ｅｒ（１９７２）　Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　Ｇｅｎｅｔｉ−ｃｓ土Ｒ，１１ａｖｉｓ　　ｅｔ　
ａｌ、　　（１９８０）Ａｄｖａｎｃ、ｅｄ　　Ｒａｃ
ｔｅｒｉａ＋Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　；　Ｒ，Ｆ、　５ｃｈ
ｌｅｉｆ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｃ，Ｗｅｎｓｉｎｋ（１９Ｂ
２）　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ユｎ
　　ＭｏｌｗｕｌａｒＩｊｉ　ｏ　Ｉ　ｏ−Ｈ￥　：お
よびＴ、　Ｍａｎｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　　ａｌ、　（１
９８２）」貝堕偲可堕エ　−りタ枦−■、−０ 本文で、制限エンＦヌクレアーセの名称を例えば「Ｂｃ
ｌＴｊのように分離して用いているのは。

酵素による消化においてその酵素を用いたということで
ある。但し図中ば例外で、ここではその酵素の作用に感
受性を有する配列部位１例えば制限部位を意味している
。本文では、制限部位は１部位」という言葉をつけて２
例えば「！！９−Ｌ１部位」のように表している。ｒＩ
ｌｃｌ　　Ｂ！Ｊ７片」のように１断片」という言葉を
つけて用いる場合、その名前の酵素の作用で生じた末端
を有する線状二本鎖ＩＩＮＡ分子（例えば、制限断片）
を意味する。ｒＲｃｌ　　Ｉ／Ｓｍａ　　Ｔ断片」のよ
うなフレーズは、その制限断片がここでは堕ＬＴと鉢ｐ
　　Ｉという２つの異なる酵素の作用で生じ、その２つ
の末端が異なる酵素作用に由来することを意味している
。それら末端は粘着性（すなわち、相補的な一本鎖オリ
ゴヌクレオチトと塩基対合し得る一本鎖の突出部を有す
る）または平滑性（すなわち一本積突出部を持たない）
のいずれかの特性を持つこと５および粘着末端の特異性
は一本鎖突出部を含むヌクレオチド配列により決定され
、従ってそれを作る酵素の特異性によって決定されるこ
と、に注目して欲しい。

プラスミドはすべて９例えばｐＰ旧のように、最初にｒ
ｐ　Ｊを下げて書きそれに文字と数字を続けて書いて表
す。ｐｐ旧に挿入された完全なりＭＶ　ｃｒｌＮＡのク
ローンはｐＢｘＰＭｙという形式で示す。ここで。

Ｘは１．２または３でありクローン化されたｌ′ＩＭｖ
成分（ずなわぢ、ＲＮＡＩ、２または３に由来すること
）を示し、ｙは任意の分離番号である。従って、　−ｆ
ｕｒｌの３つのプラスミドｐＢＩＰ旧３　、　ｐｒ１２
Ｉ’Ｍ２５およびｐ８３Ｐ旧はそれぞれＲＭＶのＲＮＡ
１，２および３の完全なｃＤＮＡコピーを保持し、そし
てそれらが−組となって完全なりＭＶのゲノムを表ず。

クローニング、選択およびベクターの特定の段階により
。

利用される。纏」♂Ｌン１ツユユニ（ＩＥ、　　＜１−
０の菌体にｌ多くなる。ここで用いる菌体ばすでに報告
されているものでるが、公に利用可能なこれと等価な多
くの菌体があり、これらを使用してもよい。

ここで示された菌体の代わりにある特別な微生物を用い
ることは、当業者が周知の原理に従って利用できる恒例
の選択事項である。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

去施汎上：転写さセ、たＢＭＶ−ｃＤｌｊＡ■怒雑（ｉ
ｎ　　ＸＬＬす〉−の転写〉転写反応液としては、２５
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ、　ｐｌ！　８．０１５　ｍ
Ｍ　ＭｇＣＩｚ／１５０　ｍＭ　ＮａＣ！／１ｍＭ　　
ジチオスレイ１〜−ル／各２００．ｕＭのｒ／ｌＴｒ’
。

ｒＣＴＰ、およびｒＵＴＩ’／２５　＃　Ｍ　ｒＧＴＰ
１５００μＭ　ｍ７ＧｐｐｐＧ（ｒ’−Ｌ　Ｒｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）　／プラスミドＩＮＮΔ（０，１ｔｔ
ｇ／μｍ）／エセリシア・コリー（都刈児１σ巾−他）
ＲＮＡポリメラーゼ（０，０５ユニツト／　μＩ）　（
Ｐｒｏｍｅｇａ旧ｏｔｅｃ、、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗ
ｌ）を含有するものを用いた。

反応液を３７°Ｃで３０分間インキユヘートした。この
間にｒＧＴｒ’はほぼなくなる。追加のｒＧＴＰを２５
μ門まで添加してさらに３０分間インキコーヘートを続
けた。

キヤソプ構造を持たない転写物用には、　ｍ７Ｇｐｐｐ
Ｇは除き、　ｒＧＴＰは２００メＩＭまで増やし、　ｒ
ｌＮ八とポリメラーゼの濃度は２倍にして、インキュへ
−１・を１時間行なった。ＥＤＴ＾を１０ｍＭまで添加
して反応を停止し、続いて接種緩衝液で直接稀釈するか
またはフェノール抽出するかした後でエタノール沈澱に
より核酸を回収した。たいていの実験では、３つのＢＭ
Ｖ成分全てを表すプラスミドをプールして。

転写に先立って各ＢＭＶ配列の３°末端より３塩基対後
の特異的なＥｃｏ　ＲＴ部位で切断した。第１図はＥｃ
ｏ　Ｒ１で切断したｐＢ３Ｐ旧の地図である。ＲＮＡＩ
またはＲＮＡ２のｃＤＮＡを含有するｐＰ旧の地図もこ
れと同じであるが、但しｒ　ＢＭＶ−ｃＤＮＡ　Ｊと書
かれた領域がＲＮＡＩまたはＲＮＡ２のｃＤＮ八である
。

〈感染性の試験〉大麦（ｔｌｏｒｄｅｏｍ　　　ｖｕｊ
旺猥１６．　ｃｖ。

Ｍｏｒｅｘ）の７日苗にカーポランダム粉をふりまき。

ヴイリオンＲＮＡまたはｉｎ　　ｖｉｔｒｏの転写混合
物を５０ｍＭ　）リス燐酸、　ｐＨ８，０／　２５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１／　５ｍＭ　　ＥＤＴ＾／ベントナイト（
５■／ｍＡ）中に加えて接種した。

径１４ｃｍの１つのボットに１５〜３０個の植物体を入
れ。

１植物体当たり１０〜３０μｌの上記接種＋Ａ斜を用い
て処理した。接種７〜１４「ｉ後に、植物体にモザイク
の徴候があるかどうかを記録した。

（Ｂ　Ｍ　Ｗの単離〉接種して１４日ｆ＆、　５ｈｉｈ
、　ａｔ　ａｌ。

（１９７２）　、Ｊ、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　６４，３
５３に述べられているようにして、大麦の植物体からウ
ィルスをｉ３離した。

但し、四塩化炭素の代わりにクロロポルムを用い。

また遠心分画の代わりに２回目のポリエチレングリコー
ル沈澱を行なった。フェノール抽出とエタノール沈澱に
よりウィルスＲＮＡを単離した。

＜ＩｔＭＶ　ｃＤＮＡクローンおよびその一神　μ」卯
□−転写物の感染性試験〉 ｎＭＶの３つの遺伝的成分すべてに対ずろ完全なｃ、Ｉ
Ｉ　Ｎ　Ａコピーを、一般的な転写ヘクターであるｐＰ
旧でクローン化することは、　Ａｈｌｑｕｉｓｔ、　Ｐ
、　ａｎｄ　Ｊａｎｄａ。

Ｍ、　　（１９８４）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｌ、４．２８７６に記載されている。これらクローンの
ＩＩＮＡをＥｃｏ　ＲＩで切断して（第１図）１合成キ
ャップ構造存在下で１ρ　■匹±で転写してＢＭＷ成分
の完全なＲＮＡコピーを作ることができる。これらコピ
ーは、真のＲＭＶ　ＲＮＡ　と同じキャップ構造を有す
る５”末端を持ち、かつその３゛末端には６〜７個の非
ウィルス性ヌクレオチドが付加されている。

これらクローン化したＤＮＡおよびその転写物の感染性
を試験するために、　ｐＢ］Ｐ旧８．　ｐＲ２ＰＭ２５
およびｐ８３Ｐ旧の３つのプラスミドを選んだ。この選
ばれたクローンはそれぞれ、　ＢＭＶのｌｌＮＡｌ、　
ｌｌＮＡ２およびＲＮＡ３のｃＤＮＡコピーを含有して
おり、それらが−組となって完全なりＭＶのゲノムを表
現する。我々の研究室で繁殖したＢＭＶの自然単離体は
ロシア株という一般名で示される。Ｅｃｏ　Ｒ１で切断
した旧プラスミドの混合物、およびキャップ構造を有す
るその転写産物の混合物を大麦の植物体に接種した。こ
れと並行して、同じプラスミド由来の転写されてないＤ
ＮＡを接種した。正規のウィルス性徴候が生じるか否か
で評価したところ、転写されたプラスミドの混合物は感
染性を有するが、転写されていないプラスミドの混合物
は感染性を持っていなかった（表１）。表１は、　ｐｃ
ｏ　ＲＴで切断した旧プラスミｌ−′、転写されたＲｃ
ｏ　Ｒ１切断旧プラスミ１′、およびロシア株ＩＩＭＶ
のヴイリオンＩＩＮＡの感染性を、接種月料の濃度を変
えて比較したものである。

（以下余白） 表１ １　　　　　　１００　　　　　　　０／２］６　　　
　　　　０．４　　　　　　　０／２１偽接種 ハ社狂年−転写により１プラスミド当たりＮ１勺３つの
ＢＭＶ転写物が作られる（Ａｈｌｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　
Ｊａｎｄａ。

１９８４）。従って、ボット４，５および６において。

接種材料中のＢＭＶ転写物総含■ばそれぞれ７５．７．
５および０．７５ｎｇ／　ｐ　ｌ程度である。

プラスミドの転写混合物で認められた感染性の本質をよ
り明確に特徴づ６Ｊるために、転写プロ１〜コールに種
々の変更を加えてその影響を調べた。

感染性には、　ＢＭＶの３つの遺伝的成分すべてを表現
するクローンが転写される必要があった。さらにこの感
染性は、転写前のＩｊｉｎｆＩあるいし、ｒ転写後のＲ
Ｎａｓｅ　Ａに感受性であった。しかし、転写前の１１
Ｎａｓｅ　Ａあるいは転写後の１ｌｉｐｆｌは、感染性
に重大な影響を及ぼさなかった。１ｌｉｎ　ｆｌば、　
ｐＰ旧内の８部位、およびＢＭＶＬ、　ＢＭＶ２またＢ
ＭＶ３のｃＤＮＡ内ではそれぞれ１５部位、１０部位ま
た１２部位を切断する。

これらの結果から、観察された感染性はｊＡ　　幻」［
頒転写物に起因し、そのＤＮｌ＃型には直接起因しない
ことが確証される。また、プラスミドを転写前に切断し
ないか、あるいはｂ遍」で切断した（　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ
末端の７塩基丁流よりむしろ２７００塩基下流を切断す
る）場合は、感染性は認められなかった。（ｉＬって２
感染性は転写物の３゛末端の構造の影響を受けることが
わかる。最後に、Ｕ　計」τ里転写時にキャンプ類似物
を除いた場合Ｇ」、接種材料濃度を２０倍高くしても感
染は検出されなかった。

ｕｃｏ　Ｉｌｌで切断したｈ１プラスミドか頓印　ｙ−
口−（９−で転写されたｌｉＮへの感染性は、真のＩＩ
ＭＶ　ｒｌＮＡの感染性に比べ明らかに低かった。ある
重量のｊρ　ｖ−ｊ−１Ｈ９−転写ＲＮ／ｌで作られた
感染植物体の数ば３その１／１０の重量の真のＢＭνＲ
ＮＡで作られたものと近かった（表１）。接種材料中に
プラスミドＩＩＮＡ鋳型が存在することがこの影響の原
因ではなかった。何故なら、同じプラスミドＤＮΔを真
のＩＩＭＶ　ＩＩＮＡに加えてもその感染性に影響はな
かったからである。

く徴候性とＢＭＷの複製の関係〉」１記徴候がＢＭＷの
複製を正確に反映していることを確かめるために。

いくつかの分子試験を行なった。真のＢＭＶ　ＩＩＮＡ
かＢＭＶのｉｎ　　秩ｕＬ転写物のいずれかを接種した
稙物体で徴候を示したものおよび無徴候性のものの葉か
らＩＩＮＡを抽出し、その全ＲＮＡ　　（Ｇａｒｇｅｒ
、　Ｓ、　Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｌ２１に記載されてい
る）のニトロセルロース　ドラ１ヘブ１フソトを３２ｐ
でラヘルしたクローン化１１ＭＶ　ｃＤＮＡをプローブ
として行なった。徴候を示した葉ば金側とも正のハイブ
リダイゼーション反応を示し。

また無徴候性の葉は１例を除いて全てにおいて負の反応
を示した。その１つの例外とは、　ｉｎ　　ｖｉｔｒ。

転写物を接種しておいた植物体から得たもので。

それは目に見える徴候は示さなかったが正のハイブリダ
イゼーション信号を示した。

ｃＤＮＡ転写物を感染させた植物体から単離したウィル
スは、抗ＢＭＶ抗血清を用いた二重拡散法において、ロ
シア株ＢＭＶと血清学的に同等である。転写物を感染さ
せた植物体から単離したＢＭＶをフェノール抽出すると
４つのｌｉＮ八が得られ、これらはロシア株のヴイリオ
ンＲＮ＾とともに移動してＲＭＶに特異的なりＮへプロ
ーブとハイブリダイズし、それに続く接種で高い感染性
を有する。従って、植物の多分節状１１ＮＡウイルスの
感染は、もっばら。

適当にクローン化したうイルスｃｌｌＮＡに由来し、そ
の手段は単純な転写過程による。

以下の実施例において、関連のある制限部位の位置は第
１図を参照する。

プラスミドｐＢ３ＰＭ１．　ｒ）ＮＡ　（Ａ１ｑｕｉｓ
Ｌ　Ｐ、　ａｎｄ　Ｊａｎｄａ。

門、　　（１９８４）　”）をΣリエＩとＸ町ｒ１で切
断し、　ｒｌＮ八ポへメラーゼＩのクレノー断片で処理
してプラント末端とした（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａ
ｌ、　（１９８２）」也ｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ：　
　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、　　
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ）　ａ約５．２
ｋｂの断片を低融点（１，ＭＴ）アガロースゲル（Ｓａ
ｎｇｅｒ　ｅｔ　　ａｌ、　（１９８０）　Ｊ、　Ｍｏ
ｌ。

Ｂｉｏｌ、　１弧、　１．６１）から単離し、　Ｔ４　
ＤＮＡＩＪガーゼ処理により再環状化し、これをエセリ
シア・コリー（Ｅ、　　ｃｏ旦）Ｊ旧師成分へ形質転換
した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、そのＲ
Ｆ　Ｉ′１ＮＡをＳａｌ　　ＴとＥｃｏ　Ｒ１で同時に
消化して、５ａｌＩ部位の再生と所望の断片の欠失を確
認した。外被遺伝子の錘！、、−Ｔから沌Ｄ−Ｉまでの
領域を有し、　ｐ８３ＴｌｃＰ］。

で示される昨−の試験クローンを以後の実験用に選んだ
。

旦ｒ、ｏ−Ｒ１で消化したｐ８３Ｄｅｌ”１０を、ギャ
ップ化する条件（ＡＩ＋１ｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｊａｎ
ｄａ＋　１９８４）下で、　−Ｒｃｏ−１１１で消化し
たｐＨｌＰ旧８およびｐＨ２ＰＭ２５　　（Ａｈｌｑｕ
ｉｓｔａｎｄ　Ｊａｎｄｓ、　１９８４　）とともに転
写し、この転写物を１．　ｉ　ＣＩ沈ＴＡ２　（Ｒａｌ
ｔｉｍｏｒｅ　（ＩＱ６６）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉａ
ｌ、　１８゜４２１）によりプラスミドＩＩＮＡ鋳型か
ら分冊（シた。

Ｌｏｅｓｃｈ　Ｆｒ１ｅｓ　ａｎｄ　１ｌａｌｌ　（１
９８０）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

、１７．３２３の記載に従って大麦プロトプラストを調
製し、」−記転写物をＳａｍａｃ　ｅｔ　ａｌ、　（１
９８３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙｊ−：３−ｊ、　４５５に
記載のようにして接種した後、　　［３１１］ウリジン
存在下でインキュへ一トシた。全ての核酸を抽出し、１
、ｏｅｓｃｈ　Ｆｒ１ｅｓ　ａｎｄ　ｌ１ａ１１，１９
８０に従ってアクリルアミド−アガロースゲルで分析し
た。

ｐＲ３１１ｃｒ’ｌｏ由来の欠失を受げた９ＮＡ３１．
’、Ｊ：、複製しかつ欠失型のザブゲノムＩｌＮ　Ａ　
４を生じることが認められた。（ＲＮＡ４は感染中に作
られる。　ＩＩＮＡ３のザブゲノム断片である）。本実
施例番よ、外被タンパク質をコードするＲＮＡ３の実質
部分は、ウィルスＲＮＡの複製を妨げることなく欠失さ
れ得ることを示している。

転写可能なりＭＶ　ｃＤＮＡクローンの構築およびその
使用については既に記載されている（Ａｈｌｑｕｉｓｔ
　ｅｔａｌ、、　１９８４ａ、　１９８４ｂ）。転写物
の３゛末端を特定するために、最初に述べたプラスミド
を、転写に先立って、　ＢＭＶ　ｃＤＮΔの３゛末端の
ちょうど外側にあるＥｃｏ　ＲＩ部位で切断することに
より、まず綿状化する。しかし、このようなは匪」■切
断は、転写物に６〜７個の非ウィルス性ヌクレオチドを
付加することになり、従ってｌ’！ｃｏ　ＲＩ部位を持
ちＩ’１ＭＶに連関した外来性の配列を転写する場合不
都合である。

このような問題を解決するために、　ｌ’ｓｔ　Ｔ部位
。

ずなわちＰｓｔＴエンドヌクレアーゼで認識され切断さ
れる１つの配列を含むヌクレオチド配列を。

ｐＢ３ＰＭｌ内のＲＭＶ　ｃＴ］ＮＡに直接隣接させて
挿入し、もう１つの切断部位を作った。構築段階は第２
図を参照して進めた。第２図に示されたＩＩＮＡ配列は
プラス（＋）鎖のみで、これはＢＭＶ　ＲＮＡのＲＮＡ
配列と等価である（相補的ではない）と定義される。

このＶ旦し１部位の挿入は、既報の鏡虹１部位をうＪ、
ダＰＲプロモーターに隣接させて挿入すること（Ａｈｌ
ｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｊａｎｄａ＋　１９８４）と大体
同様である。まずｐＢ３ＰＭ１　（第１図）の０．９ｋ
ｂ錘Ｖ１−旺Ｒ１断片を低融点アガロースゲルから単離
し、Σ、ｉｆ　　１とμｃｏ　Ｒ１で切断した旧３ｍｐ
９ヘサブクローン化した。

Ｘ−ｇａｌ／ＩＰＴＧプレー１・上で無色の組換え体プ
ラークを選択した後、　ＢＭＶ配列の挿入をジデオキシ
ヌクレオヂド　シーフェンシング（Ｂｉｇｇｅｎ　ｅｔ
　ａｌ。

（１９８３）　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　八ｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　　ｌｌ５Ａ　　　８０．　３９６３）に
より確かめた。Ｍ１３／ｌ’１３Ｅｓ１で示される単一
クローンを以後の実験用に選んだ。２１ヌクレオチドの
ミスマツチプライマー（第２図）を化学合成し精製して
９Ｍ１３／Ｂ３Ｆ、Ｓｌの５ｓｒｌＮＡから３２ｐでラ
ベルしたｒｌＮＡをプライマー合成するのに用いた。合
成後。

このＤＮＡをＡｖａ　Ｔを用いて旧３ベクター内のプラ
イマーの末端にある部位で切断し、その５゛末端にミス
マツチプライマーをまた内部にＢＭＷ３配列を有するよ
うなラベルした主ＤＮＡ断片をアルカリ性の低融点アガ
ロースゲル（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８
２）で精製した。ＤＮＡの第２鎖に圏（リバースプライ
マー（八ｈｌｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｊａｎｄａ＋　１９
８４）をつげてブライマー合成し、こうして得られた合
成ｄＳｌ′ｌＮ八を■し■で切断した後、　ＢＭＶ　Ｒ
ＮＡの３′側配列に連関してミスマツチプライマーを有
するような約０．３６ｋｂのｄｓＤＮＡ断片を低融点ア
ガロースゲルから単離した。次いでこの１祈片を、　Ｘ
ｂａ　　ｌ−３ｍ乞」で切１折したＭ１３ｍｐ１９　へ
サブクローン化した。Ｘ−ｇａｌ／ＴＰＴＧプレート上
で無色の組換え体プラークを選択し、！ｉに■部位がＢ
ＭＶ　ｃＤＮＡと正しく連関していることをジデオキシ
　シーフェンシングにより確かめた。選択されたＭ１３
クローンに由来する０、３６ｋｂ袢ａＩ−Ｅｃｏ　ＲＩ
断片をｐＢ３ＰＭｉ内の耗と■部位と各ａｌ　　Ｔ部位
の間に再クローン化して１プラスミドｐＢ３ΩＰ１を得
た。Ｉ’ｓｔ　　Ｉで切断したｐＢ３ΩＰ１から転写し
たＩＩＮＡの配列は、３″末端の八が無いことを除＆Ｊ
ば、　ＩＩＭＶＲＮＡ３の配列と等しいであろう。

ヌ１１用本二β小顛貯Ａ刊誘□導用（二ぶり■菌りロラ
ーにスプラスミドｐＢ３ΩＰｌ　（実施例３）を声す−
■とＸ−リーク−■とで切断して外被タンパク質遺伝子
の大部分を欠失させた。但し、外被タンパク質をコード
する配列の最初に存在しＡＩＩＧ開始コドンを含む７個
のヌクレオチドは残しておいた。ＤＮ八へリメラーゼＩ
のクレノー断片で処理してプラント末端とし。

得られた大きい方のＤＮＡ断片を低融点アガロースゲル
から準離した。プラスミドｐＲＲ３２５（Ｂｏｌｉｖａ
ｒ。

１９８７）をＴａｑ　　Ｉで消化し、タレノーポリメラ
ーゼで処理した後、クロラムフェニコール　アセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ｉＭ伝子を含む７８０ｂｐ
の断片を単離した。このようにして単離された７８０ｂ
ｐの断片は、完全なＣＡＴ遺伝子、およびＣＡＴ遺伝子
コード配列の５′末端に隣接するｐＢＲ３２５の短い小
片を含有していた。ｐＢ３Ω目の大きい１す片と３倍過
剰モルのＣＡＴ断片とをＴ４　ＩＩＮＡリガーゼを用い
て連結し、エセリシア・コリー（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）　
Ｊ旧０１菌体へ形質転換した。アンピシリン耐性でｊバ
択した形質転換体に由来するプラスミドＤＮＡを、　Ｉ
ｊｐａ−Ｒ１とＰｓｔ　　Ｉとによる二重消化およびゲ
ル電気泳動によって選別して、　ＣＡＴ遺伝子が挿入さ
れていることを確認するとともにＢＭＶ３　ｃＤＮＡ配
列に対するその方向性を決定した。ＢＭＶ３コード配列
と同じ方向性のＣＡＴ遺伝子コード配列を有するプラス
ミドｐ８３ｃ＾４２．および逆の方向性のＣＡＴ　１ｌ
ｌｔ伝子を有するプラスミドｐ８３ＣＡ５２を、以後の
実験用に選んだ。

ｐ＋（３ＣＡ４２のようにＣＡＴ遺伝子が順方向で挿入
されると、　ＣＡＴコード配列はＢＭＶ外被遺伝子の開
始コドンとフレームを合わせて連関されることになる（
第３図）。外被のＡＵＧから翻訳が行われると。

本来のＣＡＴ遺伝子産物の出発点の前に１２個の追加の
アミノ酸を有するような融合タンパク質が作られること
になる。

同様の構築として、第４図で示すように、　ｐｎ３Ω３
をり↓」消化してタレノー　ポリメラーゼでプラント末
端端とした後ＩＩＡＮリガーゼで連結することにより、
　　ｐＢ３Ω３の錘し１部位に同じＣＡＴ断片を挿入し
た。ｃＡＴ遺伝子の方向性が異なる２つのクローンを単
離した。すなわち、　ＣＡＴ遺伝子コード配列が転写方
向と逆方向で入っているｐＨ３ｃＡ３１　と。

ＣＡＴ遺伝子コード配列が転写方向と同方向で入ってい
るｐ８３Ｃ八２１である。第４図はまた。　ｐＨ３ｃＡ
２１における。　ＢＭＷ由来の配列と細菌由来の配列の
接合点領域のヌクレオチド配列を示している。コントロ
ールとして、第５図に示すようなｐＢ３ＤｃＰと称され
る。挿入を含ます錘しＩ／Ｘｂａｌが欠失したｐＢ３を
構築した。第５図には、ザブゲノムの転写開始部位と再
連結部位の領域の配列をも示しである。他のコントロー
ルとして、プラスミドル８３ｃへ４２（第３図）をΣａ
ｌ　　Ｉで切断し、クレノーＤΔＮポリメラーゼとデオ
キシヌクレオチドを用いてくぼんだ３゛末端を修復し、
得られたプラント末端を再結合することにより、　ｐＨ
３ｃＡ４２からＣＡＴコード配列を欠失させた。

ハユｔｌで切断したｐＨ３ｃＡ４２　ＤＮＡ、に虹Ｉｌ
ｌで切断したｐＢＩＰ旧８　ＤＮＡ、および４四−Ｉ１
１で切断したｐＢ２ＰＭ２５ＯＮ＾を転写し、　ＬｉＣ
］沈澱したものをプロトプラス１・に接種した（実施例
１）。インキュベートシて２２時間後にプロトプラスト
を凍結融解により破壊した。標準的な方法（ｌｌｅｒｒ
ｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａ！。

（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３．２０９；　Ｓｈ
ａｗ、　（１９７５）　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ＋
、　５３．７３７）で分析することにより、これがＣＡ
Ｔ活性を有することを認めた。細胞ライゼートを［＋４
ｃ］クロラムフエニコールとともにインキュベートし１
次いで既報の手順に従って１反応物と生成物分離用のシ
リカゲル薄層プレートをオートラジオグラフにかけた。

第６図にその結果を示す。Ｃｍのしるしがついたレーン
は［＋　４　ｃ　］　クロラムフェニコールのみを流し
たものである。他の反応液のＣＡＴ活性は、　Ｃｍで示
される本来の型の他に、　ＬＡ−Ｃｍ　（１−アセテー
ト　クロラムフェニコール）や３Ａ−Ｃｍ（３−アセテ
ート　クロラムフェニコール）で示されるアセチル化さ
れた型のクロラムフェニコールが出現することにより示
される。ＣＡＴ−ｍｉまたＣＡＴのしるしがついたレー
ンは、偽接種プロトプラストの抽出物が存在する場合あ
るいは緩衝液のみの場合において、真の細菌ＣＡＴによ
り作られた生成物を示している。パネルＡは、　ｐｎｌ
Ｐ旧８およびｐＨ２ＰＭ２５の転写物に加え、各レーン
につきｐｒ１３ｃＡ２］　　（Ｃへ２１　で示されたレ
ーン）　、　ｐｎ３ｃ八３Ｉ（Ｃへ３１で示されたレー
ン）　、　ｐ８３Ｃ八４２（Ｃへ４２で示されたレーン
）　　、　ｐＢ３ｃ八５２へＣへ５２で示されたレーン
）　、　ｐ８３ｃ八６１（Ｃへ６１　で示されたレーン
）。

またはｐＢ３Ｉ’Ｍ１　（３−１で示されたレーン）、
の転写物を接種したプロトプラスト って作られた生成物を示している。パネルＢには。

ｐＢＩＰ旧８　（］と示す）　、　ｐＨ２Ｉ’ｌ’１２
５　　（２と示す）。

ｐＲ３１”Ｍｌ　（　３としめず）およびｐＢ３ｃへ４
２（３６と示す）を様々に組合わせて接種したプロトプ
ラストの抽出物から得られた生成物が示されている。並
行して行なった試験において，偽接種プロトプラスト ｐＨ２ＰＭ２５　ニ加えテＥｃ．ｏ　ＲＴ切断ｐＢ３Ｐ
ＭｌかＰｓｔ　　Ｔ切断ｐｒｌｃＡ５２のいずれか由来
の転写物を接種したプロトプラストでは．検出可能なＣ
ＡＴ活性は認められなかった。第６図に示された結果は
，細胞が表現的に形質転換したことを証明しており．ま
た非つイルス性の挿入コード小片を含むＲＮＡ−３’が
適当な感染条件下でこの転写を行い得ることを示してい
る。

１　−１−　２　＋　３°という組合わせの場合のみＣ
ＡＴ遺伝子の発現がもたらされ，この発現がウィルスの
ＲＮＡ複製に依存していることがわかる。

プラスミドｐ８３ＰＭＩ　ＤＮＡを以ゆユＩで切断し，
　Ｔ４ＯＮ八ポリメラーゼ処理してプラント末端とし，
リン酸化した１２ｂｐの合成りａｍ　ＩＩＩリンカ−（
Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａＬ．　１．９８２）に連結し
た。フェノール／クロロホルム抽出してエタノール沈澱
をした後，このＤＮＡをリンカ−１μｇ当り４０ユニッ
トの捏」−旧で３７°Ｃ。

１６時間処理して切断した。１％（ｗ／Ｖ）低融点アガ
ロースゲルで電気泳動を行なった後，エチジウムプロミ
ド染色したＤＮへの大きい方のハンドを溶出しくＳａｎ
ｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、　１９８０）、次いで約２ｎｇ
ｌｌＮＡ／μ１反応液でＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
処理することにより再環状化し．これを感受性エセリシ
ア・コリー（ＩＥ．　　ｃｏｌｉ）　ＪＭＩＯＩ　ヘ形
質転換した。無作為に選択したアンピシリン耐性形質転
換体由来のＲＩ’　ＤＮＡをハ（ｌｌｒとＩＥｃｏ　Ｒ
１とで同時消化し，ゲル電気泳動で選別してＩｌａｎ；
　ｌ！Ｉリンカ−が所望の位置に存在することを確認し
た。ｐＢ３Ｃ４９で示される単一クローンを以後の実験
用に選んだ。

且ａＩで切断したｐＢ３ＰＭＩ　ＤＮ八へ２μｇを，室
温。

１８０、＋ｚ＃の反応液中で．１２ユニツトのＢａｌ　
３１を用いて処理した（Ｇｕｏ　ｅＬ　ａｌ．　（１９
８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．　１１　
、　２２３７）　、酵素添加後２，４，６，８。

１０および１２分目に３０ＩｔＡずつ分別した。４０ｍ
Ｍ　ＥＤＴ＾２５メｌｌを加えることにより各分別にお
けるヌクレアーゼ消化を停止し，フェノール／クロロボ
ルム抽出を２回連続して行なった。分別をプールし。

ＤＮ八をエタノ−Ｊしで沈澱させた。このＤＮＡをＤＮ
八へリメラーゼＩのクレノー断片で処理してプラント末
端とし，　１２ｂｐの合成りａｍ　ＩＩリンカ−を付加
した（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ．、１９８２　）　
、フェノール／クロロボルム抽出とエタノール沈澱をし
た後，　ＤＮＡをした。生成物を低融点アガロースゲル
に流し。

ｐ８３ＰＭ１の約４．２ｋｂ硅虹■／ハ［Ｉ断片および
そのＢａｌ　３１で欠失しリンカ−に結合した生成物を
含む高分子量分画を溶出し，　ｐ８３Ｃ４９の約１．５
ｋｂハｔＴ−ハｍｌ（Ｉ断片を過剰モル加えこれと混合
した。連結後，　ＤＮＡを感受性エセリシア・コリー（
Ｅ．　　ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ菌体へ形質転換した。無
作為に選択したアンピシリン耐性形質転換体からＲＦ　
ｒｌＮＡを調製し。

これをＢａｍ旧とＥｃｏ　ＲＩとで二重消化しアガロー
スゲル電気泳動を行って選別した。ｐ８３ＰＭ１の３８
遺伝子（第１図）内にある最初のＣｌａ　　Ｔ部位から
Ｉｉ　ｃ．。

ＲＩに向かって様々な範囲にわたる欠失を有するプラス
ミドをこのデータを用いて選択した。選択したプラスミ
ドをＥｃｏ　ＲＴで切断して転写を行い（実施例１）、
この転写物を，　Ｅｃｏ　Ｒ１で切断したプラスミドｐ
ＢＩＰＭ１１３およびｐＢ２Ｐ？１２５からの転写物存
在下で大麦プロトプラストを感染するのに用いた。

同様の技術を使って．ｐＢ３Ｐ旧のＳａｃ　　１部位に
傾１旧リンカ−を挿入し．さらに２つのＢａｌ　３１欠
失ライブラリーを構築した。１つは５゛からＳａｃ　　
Ｔ部位にのびる欠失を有し、他方は３゛からＳａｃユ■
部位までの欠失を有するものである。選択したＥｃｏ　
Ｒ［切断プラスミドの転写物を、大麦プロトプラスト系
においてり沈□１７１切断ｐＢＩＰＭ１８とＥＣＱ　Ｒ
Ｔ切断ｐＢ２Ｐ門２５の転写物存在下で試験Ｌ７た。リ
−ａ　　Ｔ部位とＳａｃｊ部位のいずれかにリンカ−が
挿入したｐｒｉ３ＰＭ１誘導体の転写物，およびいずれ
か一方の部位から数１００塩基に到るまでのびた欠失を
有するｐＢ３ＰＭ１　誘導体の転写物，はこのような条
件下で複製されることが認められた。従って，　３ａ遺
伝子と外被タンパク質遺伝子における実質的な欠失，す
なわち９ゆ−１部位かＳａｃ　１部位のいずれか一方か
ら少なくとも数１００塩基にわたる欠失は，その欠失を
有するＲＮＡの複製を妨げることなく．作ることができ
る。こうした欠失により大きな挿入物用の場所ができる
が，複製されたＲＮＡ３’　をウィルス粒子ヘパソケー
ジするにはまだ大きさに制限がある。ＲＮＡ３に由来す
る，　ＲＮＡの残存部分は．　ＢＭＶ　ＲＮＡのシスに
作用する複製因子を含んでいる。３ａ遺伝子と外被遺伝
子は，実施例で用いた感染条件下では，　ＲＮＡ複製ま
たは修飾ＤＡＴ遺伝子の発現に必要でなかった。

しかし他の条件下では．これら遺伝子のいずれか一方あ
るし料Ｊ両方は重要な二次機能を発揮し．例えば完全な
植物体の継代時に全体的な感染を促進したりする。欠失
は望ましくないがしかしくｌ’ｉ　ｆｊｊ　Ｒ　１１　
Ａの長さが１十面体のＢＭＶキャブジッドのパッケージ
ング制限に対して長ずぎる場合は，桿状ウィルスの外被
タンパク質を発現させて修飾＋１ＮＡをキャブジッド包
装することが可能であろう。

（考察および結論） 上１本の実施例は，多分節状ＲＮ／ｌ　ウィルスのＩｌ
Ｎ／１成分に実質的な修飾である欠失および挿入の両方
をほどこし，適当な感染条件下でウィルスＲＮＡの複製
が妨げられないことを示している。ＲＮＡウィルスの，
　ＲＮＡ複製に必須でない領域内に挿入された遺伝子材
料は翻訳され得る。ＢＭＶの場合，　ＲＮＡ３の実質部
分を欠失しても複製能力は失われない。

従って遺伝子がその５゛末端に適切なリポソーム結合部
位と翻訳開始信号を持っていれば．多分節状ＲＮＡウィ
ルスのＲＮ／ｌ成分の可欠領域内に挿入された遺伝子は
すべて形質転換細胞で翻訳され得る。

これら信号はウィルスによっであるいは挿入物によって
提供されることも可能であり，また翻訳可能な構築物を
作る手段は当業者に可能な範囲内にある。

上述した原理はＩＩＭＶ　ＩＩＮＡ３の場合を例にとり
説明したものであるが，あらゆるＩＮ八へィルスのあら
ゆる成分が説明した型の修飾に対して候補になることは
明らかである。例えば外来ＲＮＡ小片は，複製能力を損
なわないような，　ＢＭＶのＲＮＡＩまたはＩｔ　Ｎ　
Ａ　２のどの部位に挿入することも可能である。同様に
。

はどこされた挿入および／もしくは欠失がウィルスＲＮ
Ａの複製を妨げないのであれば，他のＲＮＡウィルスの
ＲＮＡ成分を同じ様にして操作することもできる。うイ
ルスＲＮＡ成分の修飾りこより．宿主細胞に翻訳可能な
遺伝子材料を運ぶためのベクターとする操作には次の２
つの原理が含まれる：　ｆｌｌＲＮＡ成分のｃＤＮＡを
，ウィルスｃｒｌＮＡから複製可能なＲＮＡを転写する
ことのできる転写ベクターへクローン化すること，およ
び（２）ウィルス成分の１つの中にあって、構造遺伝子
を挿入できるような，複製に必須でない領域を同定する
こと，である。従って修飾されたＲＮＡは，　ＩＩＮΔ
ウィルスに由来するシスに作用する複製因子および挿入
された夕）来１？ＮＡ小片を最低限含むことになろう。

添付のクレームに記載されているように，ここで教示お
よび開示されることに従ってかつ具体的に示される他の
変更および改良は本発明の範囲内にあるとめなす。

↓ユ慢ー面の簡単な喋吸 第１図はＥｃｏ　ＲＴで線状化したプラスミドｐＨ３Ｐ
旧（計５．７　ｋｈ）の概略図であり．選択された制限
部位を示している。第２図は様々なりローンにおＬＪる
ＢＭＶ３　　ｃＤＮＡの３”末端周辺の配列を示す図で
ある。但し，各ＤＮＡ配列の（＋）鎖だけを示している
。第３図はプラスミドｐＢ３ΩＰ．およびそれにＣＡＴ
遺伝子が転写方向と同方向で（ｐＨ３ｃＡ４２）またハ
逆方向で（ｐＢ３ＣＡ５２）挿入されたプラスミドの概
略図である。第４図はプラスミドｐｒ１３ΩＰ，および
それにＣＡＴ遺伝子が転写方向と同方向で（ｐＨ３ｃＡ
２１）または逆方向で（ｐＢ３ＣＡ３］．）で挿入され
たブラスミドの他の実施例を示す概略図である。第５図
はｐＢ３゜およびそれから３−些−Ｔ　／Ｘｈａ　　Ｉ
が欠失し挿入を含まないようなコントロールとしてのプ
ラスミドｐＢ３１１ｃＰの概略図である。第６図は、様
々なプラスミドの転写物を接種した大麦プロトプラスト
の抽出物から得られた生成物をオートラジオグラフにか
けた結果を示す図であって、大麦細胞におけるＣＡＴ遺
伝子の発現を調べるものである。

以」−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＲＮＡウィルス由来のシスに作用する複製因子およ
   び外来ＲＮＡ小片を含有するＲＮＡ分子。 ２、前記外来ＲＮＡ小片がペプチドまたはタンパク質を
   コードする特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ３、前記外来ＲＮＡ小片がアンチセンスＲＮＡを有する
   特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ４、前記外来ＲＮＡ小片が構造ＲＮＡを有する特許請求
   の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ５、前記外来ＲＮＡ小片が調節ＲＮＡを有する特許請求
   の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ６、前記外来ＲＮＡ小片が触媒機能を持つＲＮＡを有す
   る特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ７、前記シスに作用する複製因子が動物ウィルスに由来
   する特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ８、前記シスに作用する複製因子が植物ウィルスに由来
   する特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子。 ９、前記シスに作用する複製因子が多分節状植物ウィル
   スに由来する特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ分子
   。 １０、前記シスに作用する複製因子がタバコモザイクウ
   ィルスに由来する特許請求の範囲第１項に記載のＲＮＡ
   分子。 １１、前記シスに作用する複製因子がアルファルファモ
   ザイクウィルスに由来する特許請求の範囲第１項に記載
   のＲＮＡ分子。 １２、前記シスに作用する複製因子がチャヒキモザイク
   ウィルスに由来する特許請求の範囲第１項に記載のＲＮ
   Ａ分子。 １３、ＲＮＡウィルス由来のＲＮＡ小片、および宿主細
   胞でのＲＮＡ複製に必須でない部位に挿入された外来Ｒ
   ＮＡ小片、を含有するＲＮＡ。 １４、前記外来ＲＮＡ小片が非ウィルス性のタンパク質
   またはペプチドをコードするＲＮＡを有する特許請求の
   範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 １５、前記外来ＲＮＡ小片が調節機能、構造機能、ある
   いは触媒機能を持つＲＮＡを有する特許請求の範囲第１
   ３項に記載のＲＮＡ。 １６、動物ウィルス由来のＲＮＡ小片を有する特許請求
   の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 １７、植物ウィルス由来のＲＮＡ小片を有する特許請求
   の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 １８、多分節状植物ウィルス由来のＲＮＡ小片を有する
   特許請求の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 １９、前記ＲＮＡがＢＭＶのＲＮＡ＿ｎ’である特許請
   求の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 ２０、前記ＲＮＡがＡＭＶのＲＮＡ＿ｎ’である特許請
   求の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 ２１、ＴＭＶのＲＮＡ＿ｎ’由来のＲＮＡを有する特許
   請求の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 ２２、ウィルス外被タンパク質のキャプシッドで包まれ
   た特許請求の範囲第１３項に記載のＲＮＡ。 ２３、ＲＮＡウィルス由来のシスに作用する複製因子お
   よび外来ＲＮＡ小片を含有するＲＮＡに相補的な一本鎖
   を含むｃＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ベクター。 ２４、ＲＮＡウィルス由来のＲＮＡ小片、および宿主細
   胞でのＲＮＡ複製に必須でない部位に挿入された外来Ｒ
   ＮＡ小片、を含有するＲＮＡに相補的な一本鎖を含むｃ
   ＤＮＡを含有するＤＮＡ転写ベクター。 ２５、前記ｃＤＮＡの一本鎖が非ウィルス性のタンパク
   質またはペプチドをコードするＲＮＡに相補的である特
   許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ転写ベクター。 ２６、前記ｃＤＮＡの一本鎖が調節機能、構造機能、あ
   るいは触媒機能を持つＲＮＡに相補的である特許請求の
   範囲第２４項に記載のＤＮＡ転写ベクター。 ２７、前記ｃＤＮＡの一本鎖が動物ウィルス由来のＲＮ
   Ａ小片に相補的である特許請求の範囲第２４項に記載の
   ＤＮＡ転写ベクター。 ２８、前記ｃＤＮＡの一本鎖が植物ウィルス由来のＲＮ
   Ａ小片に相補的である特許請求の範囲第２４項に記載の
   ＤＮＡ転写ベクター。 ２９、前記ｃＤＮＡの一本鎖が多分節状植物ウィルス由
   来のＲＮＡ小片に相補的である特許請求の範囲第２４項
   に記載のＤＮＡ転写ベクター。 ３０、前記ｃＤＮＡの一本鎖がＢＭＶのＲＮＡ＿ｎ’に
   相補的である特許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ転
   写ベクター。 ３１、前記ｃＤＮＡの一本鎖がＡＭＶのＲＮＡ＿ｎ’に
   相補的である特許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ転
   写ベクター。 ３２、前記ｃＤＮＡの一本鎖がＴＭＶ由来のＲＮＡに相
   補的である特許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ転写
   ベクター。 ３３、宿主細胞を表現的もしくは遺伝子的に形質転換す
   る方法であって、該細胞にＲＮＡウィルス由来のシスに
   作用する複製因子を含有するＲＮＡ分子を導入し、それ
   によって外来ＲＮＡ小片が該宿主細胞に検出可能な形質
   を付与することにより、該宿主細胞を表現的もしくは遺
   伝子的のいずれかで形質転換する方法。 ３４、前記外来ＲＮＡ小片がペプチドまたはタンパク質
   をコードする特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３５、前記外来ＲＮＡ小片がアンチセンスＲＮＡを有す
   る特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３６、前記外来ＲＮＡ小片が構造ＲＮＡを有する特許請
   求の範囲第３３項に記載の方法。 ３７、前記外来ＲＮＡ小片が調節ＲＮＡを有する特許請
   求の範囲第３３項に記載の方法。 ３８、前記外来ＲＮＡ小片が触媒機能を持つＲＮＡを有
   する特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 ３９、前記シスに作用する複製因子が動物ウィルスに由
   来する特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４０、前記シスに作用する複製因子が植物ウィルスに由
   来する特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４１、前記シスに作用する複製因子が多分節状植物ウィ
   ルスに由来する特許請求の範囲第３３項に記載の方法。 ４２、前記シスに作用する複製因子がタバコモザイクウ
   ィルスに由来する特許請求の範囲第３３項に記載の方法
   。 ４３、前記シスに作用する複製因子がアルファルファモ
   ザイクウィルスに由来する特許請求の範囲第３３項に記
   載の方法。 ４４、前記シスに作用する複製因子がチャヒキモザイク
   ウィルスに由来する特許請求の範囲第３３項に記載の方
   法。 ４５、前記宿主細胞が動物細胞である特許請求の範囲第
   ３３項に記載の方法。 ４６、前記宿主細胞が植物細胞である特許請求の範囲第
   ３３項に記載の方法。 ４７、前記宿主細胞が単子葉植物細胞である特許請求の
   範囲第３３項に記載の方法。 ４８、宿主細胞を表現的もしくは遺伝子的に形質転換す
   る方法であって、該細胞に、ＲＮＡウィルス由来のＲＮ
   Ａ小片および該宿主細胞でのＲＮＡ複製にとって必須で
   ない部位に挿入された外来ＲＮＡ小片を有するＲＮＡを
   導入することを含有する方法であって、該外来ＲＮＡ小
   片が該宿主細胞に検出可能な形質を付与することによっ
   て、該宿主細胞が表現的もしくは遺伝子的に形質転換さ
   れる方法。 ４９、ｐＢ３ＣＡ４２、ｐＢ３ＣＡ２１、およびｐＢ３
   ＣＡ６１から成る群より選択された特許請求の範囲第２
   ４項に記載のＤＮＡ転写ベクター。