RS63232B1 - Geni tolerancije na herbicide i metode njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na oblast biotehnologije. Preciznije, pronalazak se odnosi na molekule rekombinantne DNK koji kodiraju enzime koji razgrađuju herbicide. Pronalazak se odnosi i na transgenske biljke, delove, seme, ćelije i delove biljaka koji sadrže molekule rekombinantne DNK, kao i metode korišćenja istih.

Opis povezanog stanja tehnike

[0002] Proizvodnja poljoprivrednih useva često koristi transgenske osobine stvorene metodama biotehnologije. Heterologni gen, poznat i kao transgen, unosi se u biljku da bi se proizvela transgenska osobina. Ekspresija transgena u biljci daje poželjnu osobinu, kao što je tolerancija biljke na herbicid. Primeri transgenskih osobina tolerancije na herbicid uključuju toleranciju na glifosat, toleranciju na glufosinat i toleranciju na dikambu. Sa povećanjem broja vrsta korova otpornih na najčešće korišćene herbicide, na terenu su potrebne nove osobine tolerancije na herbicide. Herbicidi od posebnog interesa su herbicidi ariloksifenoksipropionat (AOPP), herbicidi fenoksi kiseline i herbicidi piridiniloksi kiseline. AOPP herbicidi, herbicidi fenoksi kiseline i herbicidi piridiniloksi kiseline pružaju suzbijanje spektra korova otpornih na glifosat, čineći tako osobinu koja daje toleranciju na ove herbicide, posebno korisnom u sistemu useva u kombinaciji sa drugim osobinama tolerancije na herbicide.

[0003] Utvrđeno je da soj Sphingobium herbicidovorans MH izolovan iz uzorka zemljišta koji razgrađuje dihloroprop identifikovan kao sposoban da raskine etarsku vezu različitih herbicida fienoksialkanske kiseline, koristeći to kao svoj jedini izvor ugljenika i energije za razvoj (HPE Kohler, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 23:336340). Katabolizam herbicida sprovode dve različite enantioselektivne alfa-ketoglutaratzavisne dioksigenaze, RdpA (R-dihloroprop dioksigenaza) i SdpA (S-dihloroprop dioksigenaza). (A Westendorf, et al., Microbiological Research (2002) 157:317-322;

Westendorf, et al., Acta Biotechnologica (2003) 23(1):3-17). RdpA je izolovan iz Sphingobium herbicidovans (GenBank pristupni broj AF516752 (DNK) i AAM90965 (protein)) i Delftia acidovorans (GenBank pristupni broj NG_036924 (DNK) i YP_009083283 (protein)) (TA Mueller, et al., Applied and Environmental Microbiology (2004) 70 (10):6066-6075.) Geni RdpA i SdpA su korišćeni za transformaciju biljaka kako bi se omogućila tolerancija useva na herbicide (TR Wright, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, (2010) 107(47):20240-5). Poboljšanje aktivnosti enzima RdpA korišćenjem tehnika modifikovanja proteina za stvaranje proteina za upotrebu u transgenskim biljkama omogućilo bi veće stope primene herbicida, čime bi se poboljšala bezbednost transgenskih useva i mere suzbijanja korova.

SAŽETAK PRONALASKA

[0004] Pronalazak obezbeđuje polipeptid koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 14. U jednom otelotvorenju, polipeptid ima aktivnost oksigenaze protiv najmanje jednog herbicida izabranog iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

[0005] Pronalazak obezbeđuje molekul rekombinantne DNK koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 14. U jednom otelotvorenju, molekul rekombinantne DNK se sastoji od sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 16, 17. U drugom otelotvorenju, molekul rekombinantne DNK koji kodira polipeptid sa oksigenaznom aktivnosti protiv najmanje jednog herbicida izabranog iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline. U drugom otelotvorenju, molekul rekombinantne DNK operabilno je povezan sa heterolognim promotorom koji funkcioniše u biljnoj ćeliji. U drugom otelotvorenju, molekul rekombinantne DNK operabilno je povezan sa molekulom DNK koji kodira hloroplast tranzitni peptid koji funkcioniše da lokalizuje operabilno povezani polipeptid unutar ćelije.

[0006] Pronalazak obezbeđuje DNK konstrukt koji se sastoji od heterolognog promotora funkcionalnog u biljnoj ćeliji, operabilno povezanog sa molekulom rekombinantne DNK koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid SEQ ID NO:14. U jednom otelotvorenju, molekul rekombinantne DNK operabilno je povezan sa molekulom DNK koji kodira hloroplast tranzitni peptid koji funkcioniše da lokalizuje operabilno povezani polipeptid unutar ćelije. U drugom otelotvorenju, molekul rekombinantne DNK kodira polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14 i ekspresija polipeptida u transgenoj biljci daje biljci toleranciju na herbicid. U drugom otelotvorenju, DNK konstrukt je prisutan u genomu transgenske biljke.

[0007] Pronalazak obezbeđuje transgensku biljku, seme, ćeliju ili deo biljke koji se sastoji od molekula rekombinantne DNK, koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima sekvencu aminokiseline SEQ ID NO:14. U jednom otelotvorenju, transgenska biljka, seme, ćelija ili biljni deo sastoji se od transgenske osobine tolerancije na najmanje jedan herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline. U drugom otelotvorenju, transgenska biljka, seme, ćelija ili biljni deo sastoji se od DNK konstrukta pronalaska. U drugom otelotvorenju, transgenska biljka, seme, ćelija ili biljni deo sastoji se od polipeptida pronalaska.

[0008] Pronalazak obezbeđuje metodu za prenošenje tolerancije na herbicid biljci, semenu, ćeliji ili delu biljke koji obuhvata ekspresiju polipeptida iz pronalaska u biljci, semenu, ćeliji ili delu biljke. U jednom otelotvorenju, metoda za prenošenje tolerancije na herbicid koristi se sa transgenskom biljkom, semenom, ćelijom ili delom biljke koji sadrži transgensku osobinu koja obuhvata molekul rekombinantne DNK pronalaska. U jednom otelotvorenju, metoda za prenošenje tolerancije na herbicid se koristi sa herbicidom izabranim iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

[0009] Pronalazak obezbeđuje metodu transformacije biljaka, koja se sastoji od uvođenja DNK konstrukta pronalaska u biljnu ćeliju i regeneracije biljke iz nje koja obuhvata DNK konstrukt i tolerantna je na najmanje jedan herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline. U jednom otelotvorenju metoda transformacije biljke obuhvata ukrštanje regenerisane biljke sa samom sobom ili sa drugom biljkom i sakupljanje semena iz ukrštanja.

[0010] Pronalazak obezbeđuje metodu za suzbijanje korova u području rasta biljaka dovođenjem u kontakt područja rasta biljaka koja sadrže transgensku biljku ili seme pronalaska sa najmanje jednim herbicidom izabranim iz grupe koju čine herbicidi AOPP, herbicidi fenoksi kiseline i herbicidi piridiniloksi kiseline, gde je transgenska biljka ili seme tolerantna na herbicid.

KRАТАK ОPIS CRТЕŽА

[0011]

Slika 1. Kontrola i MON-HT55 (SEQ ID NO:11) transgenske biljke kukuruza nakon tretmana sa kvizalofop-P. Slika 1A prikazuje kontrolne i transgenske biljke kukuruza bilo netretirane ili tretirane sa 1X kvizalofop-P (0,08 lb ai/acre). Na slici 1B prikazane su F1 hibridne kontrolne biljke kukuruza, a na slici 1C prikazane su F1 hibridne MON-HT55 transgenske biljke kukuruza. Biljke su uzgajane na dnevnim/noćnim temperaturama od (1) 20°C/20°C, (2) 28°C/20°C, ili (3) 38°C/30°C pre prskanja sa 2X kvizalofop-P.

Slika 2. Grafikoni koji pokazuju temperaturno zavisnu aktivnost modifikovanih proteina. Na slici 2A prikazana je aktivnost MON-HT55 (SEQ ID NO:11) i enzima RdpA "divljeg tipa" kada se testira sa kvizalofop-P kao supstratom. Na slici 2B prikazana je aktivnost MON-HT1 (SEQ ID NO:14), MON-HT2 (SEQ ID NO:18), MON-HT7 (SEQ ID NO:34), MON-HT8 (SEQ ID NO:37) i "divljeg" RdpA kada se testira sa kvizalofop-P kao supstratom. Na slici 2C prikazana je aktivnost MON-HT1, MON-HT2, MON-HT7, MON-HT8 i "divljeg" RdpA kada se testira sa 2,4-D kao supstratom. Podaci su normalizovani na aktivnost svakog proteina na 25°C.

Slika 3. Proteinska sekvenca "divljeg" RdpA (SEQ ID NO:60) sa primerima pozicija aminokiselina korisnim za proteinsku modifikaciju (uokvireno).

Slika 4. Prosečna ocena oštećenja nakon 2X kvizalofop-P (0,16 lb ai/acre) (4A, 4B i 4C) ili 4X 2,4-D (4 lb ae/acre) (4D i 4E) primene na F1 hibridne biljke kukuruza (homozigotni R1 koji eksprimiraju ukrsteni MON-HT x MON89034 koji eksprimiraju

MON-HT55 (SEQ ID NO: 11), MON-HT1 (SEQ ID NO:14), MON-HT2 (SEQ ID

NO:18), MON-HT3 (SEQ ID NO:22), MON-HT4 (SEQ ID NO:25), MON-HT7

(SEQ ID NO:34) ili F1 hibrid kontrola (NK603 x MON89034). Podaci o biljkama aklimatizovanim na dnevnim i noćnim temperaturama postavljenim na 20°C (20°C/20°C) pre primene 2X kvizalofop-P (Slika 4A) ili 4X 2,4-D (Slika 4D); Slika 4B prikazuje podatke o biljkama aklimatizovanim na dnevnim temperaturama od 28°C i noćnim temperaturama od 20°C (28°C/20°C) pre primene 2X kvizalofop-P; Slika 4C prikazuje podatke o biljkama aklimatizovanim na dnevnim temperaturama od 38°C i noćnim temperaturama od 30°C (38°C/30°C) pre primene 2X kvizalofop-P (Slika 4C) ili 4X 2,4-D (Slika 4E).

Slika 5. 5A i 5B: Kontrolne i transgenske biljke kukuruza koje sadrže MON-HT2 (SEQ ID NO:20, kodirajući SEQ ID NO:18) sa CTP ili bez CTP gde su biljke dobile kvizalofop-P po stopi od 16X (1,28 lb ai/acre) primenjenoj pri V2, zatim V4 i fotografijama snimljenim 10 do 14 dana nakon primene kvizalofop-P.

Slika 6A - Slika 6E. Višestruko poravnanje proteinskih sekvenci za "divlji" RdpA iz S.herbicidovorans (SEQ ID NO:60) i SEQ ID NO:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 i 46-52 sa konsenzus sekvencom (koja je data kao SEQ ID NO:61) data na dnu svake od slika 6A, 6B, 6C, 6D, 6E.

KRATAK OPIS SEKVENCI

[0012] SEQ ID NO:1-3 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT51. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0013] SEQ ID NO:4-6 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT52. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0014] SEQ ID NO:7-8 su sekvenca aminokiseline i polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona MON-HT53. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0015] SEQ ID NO:9-10 su sekvenca aminokiseline i polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona MON-HT54. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0016] SEQ ID NO:11-13 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT55. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0017] SEQ ID NO:14-17 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona, polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog dikotiledonog kodona MON-HT1.

[0018] SEQ ID NO:18-21 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona, polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog dikotiledonog kodona MON-HT2. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0019] SEQ ID NO:22-24 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT3. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0020] SEQ ID NO:25-27 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT4. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0021] SEQ ID NO:28-30 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT5. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0022] SEQ ID NO:31-33 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT6. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0023] SEQ ID NO:34-36 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT7. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0024] SEQ ID NO:37-39 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT8. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0025] SEQ ID NO:40-42 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT9. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0026] SEQ ID NO:43-45 su sekvenca aminokiseline, polinukleotidna sekvenca bakterijskog kodona i polinukleotidna sekvenca optimizovanog monokotiledonog kodona MON-HT10. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0027] SEQ ID NO:46-52 su sekvence aminokiseline MON-HT11, MON-HT13, MON-HT14, MON-HT15, MON-HT16, MON-HT17 i MON-HT18. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0028] SEQ ID NO:53-59 su polinukleotidne sekvence optimizovanog dikotiledonog kodona MON-HT11, MON-HT13, MON-HT14, MON-HT15, MON-HT16, MON-HT17 i MON-HT18. Nije deo pronalaska; samo za referencu.

[0029] SEQ ID NO:60 je sekvenca aminokiseline za "divlji" RdpA iz Sphingobium herbicidovorans.

[0030] SEQ ID NO:61 je konsenzus sekvenca na slici 6A - Slika 6E.

DЕТАLJАN ОPIS

[0031] Obezbeđene su sledeće definicije i metode za bolje definisanje pronalaska i usmeravanje prosečno upućenih u stanje tehnike u praksi pronalaska. Ukoliko nije drugačije navedeno, pojmove treba shvatiti u skladu sa konvencionalnom upotrebom od strane onih koji su prosečno upućeni u relevantno stanje tehnike.

[0032] Pronalazak prevazilazi ograničenja prethodnog stanja tehnike obezbeđivanjem novih, modifikovanih proteina, koji se ovde nazivaju MON-HT proteini, i molekula rekombinantne DNK koji ih kodiraju, kao i sastava i metoda koji ih koriste. MON-HT proteini su oksigenaze koje mogu inaktivirati herbicide ariloksifenoksipropionata (AOPP), herbicide fenoksi kiseline i herbicide piridiniloksi kiseline. Kao ovde korišćeno, inaktivacija herbicida znači da herbicid više nema herbicidnu aktivnost prema biljci. MON-HT proteini pokazuju novu selektivnost supstrata, korisnu kinetiku enzima i povećanu stabilnost enzima na povišenoj temperaturi. Transgenske biljke koje eksprimiraju MON-HT protein pokazuju poboljšanu toleranciju na primenu AOPP, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

Modifikovani proteini i molekuli rekombinantne DNK

[0033] Pronalazak obezbeđuje nove, modifikovane proteine i molekule rekombinantne DNK koji ih kodiraju. Kao ovde korišćeno, pojam "modifikovan" odnosi se na ne-prirodnu DNK, protein ili organizam koji se obično ne bi nalazio u prirodi i nastao je ljudskom intervencijom. "Modifikovani protein" je protein čija je polipeptidna sekvenca koncipirana i stvorena u laboratoriji koristeći jednu ili više tehnika modifikovanja proteina, kao što je dizajn proteina koristeći mutagenezu na određenom mestu i usmerenu evoluciju koristeći slučajnu rekombinaciju DNK u cilju mutageneze DNK. Na primer, modifikovanom proteinu može biti izbačen deo sekvence (delecija) ili ubačen deo sekvence (insercija) ili u njemu može biti prisutna zamena kodirajuće sekvence u odnosu na kodirajuću sekvencu "divljeg" proteina i svaka delecija, insercija ili zamena može se sastojati od jedne ili više aminokiselina. Primeri modifikovanih proteina su ovde navedeni kao SEQ ID NO:14.

[0034] Modifikovani proteini koje pruža pronalazak su enzimi koji imaju aktivnost oksigenaze. Kao ovde korišćeno, termin "aktivnost oksigenaze" označava sposobnost oksidacije supstrata prenošenjem kiseonika sa molekularnog kiseonika na supstrat, koprodukt ili intermedijer. Aktivnost oksigenaze modifikovanih proteina koji su obezbeđeni pronalaskom može inaktivirati jedan ili više AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

[0035] Kao ovde korišćeno, "divlji tip" znači da se pojavljuje u prirodi. Kao ovde korišćeno, "molekul DNK divljeg tipa", "polipeptid divljeg tipa" ili "protein divljeg tipa" je DNK molekul, polipeptid ili protein koji se pojavljuje u prirodi, odnosno molekul DNK, polipeptid ili protein koji već postoji u prirodi. Verzija polipeptida, proteina ili DNK molekula divljeg tipa može biti korisna za poređenje sa modifikovanim proteinima ili genima. Primer divljeg proteina korisnog za poređenje sa modifikovanim proteinima koje pruža pronalazak je RdpA enzim iz soja Sphingobium herbicidovorans MH. Primer molekula DNK divljeg tipa koji je koristan za poređenje sa molekulima rekombinantne DNK koje obezbeđuje pronalazak je gen RdpA iz soja Sphingobium herbicidovorans MH. Verzija divljeg proteina ili DNK molekula može biti korisna kao kontrola u eksperimentu.

[0036] Kao ovde korišćeno, "kontrola" označava eksperimentalnu kontrolu dizajniranu za potrebe poređenja. Na primer, kontrolna biljka u analizi transgenske biljke je biljka iste vrste kao eksperimentalna biljka (to jest biljka koja se testira), ali ne sadrži transgenski umetak, molekul rekombinantne DNK ili DNK konstrukt eksperimentalne biljke. Primer kontrolne biljke upotrebive za poređenje sa transgenskim biljkama kukuruza je ne-transgenski kukuruz LH244 (U.S. Patent No.6,252,148), a sa transgenskim biljkama soje je netransgenska soja A3555 (U.S. Patent No.7,700,846).

[0037] Kao ovde korišćeno, termin "rekombinantan" se odnosi na ne-prirodnu DNK, polipeptid ili protein koji je rezultat genetske modifikacije i kao takav se obično ne bi našao u prirodi i nastao je ljudskom intervencijom. "Molekul rekombinantne DNK" je DNK molekul koji se sastoji od DNK sekvence koja se prirodno ne javlja i kao takva je rezultat ljudske intervencije, na primer, DNK molekul koji kodira modifikovani protein. Drugi primer je DNK molekul koji se sastoji od kombinacije najmanje dva DNK molekula koji su međusobno heterologni, kao što je molekul DNK koji kodira protein i operabilno povezan heterologni promotor. Primer molekula rekombinantne DNK je DNK molekul koji se sastoji od najmanje jedne sekvence izabrane iz SEQ ID NO: 15, 16, 17. "Rekombinantni polipeptid" ili "rekombinantni protein" je polipeptid ili protein koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja se prirodno ne javlja i kao takva je rezultat ljudske intervencije, na primer, modifikovanog proteina.

[0038] Termin "transgenski" se odnosi na DNK molekul veštački ugrađen u genom organizma kao rezultat ljudske intervencije, kao što su metode transformacije biljke. Kao ovde korišćen, pojam „transgenski“ znači da obuhvata transgen, na primer „transgenska biljka“ se odnosi na biljku koja obuhvata transgen u svom genomu, a „transgenska osobina“ se odnosi na karakteristiku ili fenotip koji se prenosi ili dodeljuje prisustvom transgena inkorporiranog u genom biljke. Kao rezultat takve genomske promene, transgenska biljka je nešto što se izrazito razlikuje od srodne divlje biljke, a transgenska osobina je osobina koja se prirodno ne nalazi u divljoj biljci. Transgenske biljke pronalaska obuhvataju molekule rekombinantne DNK i modifikovane proteine koje pruža pronalazak.

[0039] Kao ovde korišćeno, termin "heterologno" se odnosi na odnos između dve ili više stvari izvedenih iz različitih izvora i stoga obično nepovezanih u prirodi. Na primer, molekul rekombinantne DNK koji kodira proteine je heterologan u odnosu na operabilno povezani promotor ako se takva kombinacija obično ne nalazi u prirodi. Pored toga, određeni molekul rekombinantne DNK može biti heterologan u odnosu na ćeliju ili organizam u koji je umetnut kada se prirodno ne bi pojavio u toj određenoj ćeliji ili organizmu.

1

[0040] Kao ovde korišćeno, termin "molekul DNK koji kodira proteine" ili "molekul DNK koji kodira polipeptide" odnosi se na molekul DNK koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira protein ili polipeptid. "Sekvenca koja kodira protein" ili "sekvenca koja kodira polipeptid" označava sekvencu DNK koja kodira protein ili polipeptid. "Sekvenca" označava sekvencijalni raspored nukleotida ili aminokiselina. Granice sekvence koja kodira protein ili sekvence koja kodira polipeptid obično se određuju pozicijom početnog kodona translacije na 5'-kraju i pozicijom krajnjeg kodona translacije na 3'-kraju DNK. Molekul koji kodira proteine ili molekul koji kodira polipeptide može se sastojati od DNK sekvence koja kodira protein ili polipeptidnu sekvencu. Kao ovde korišćeno, "transgenska ekspresija", "ekspresija transgena", "proteinska ekspresija", "polipeptidna ekspresija", "ekspresija proteina" i "ekspresija polipeptida" označavaju proizvodnju proteina ili polipeptida kroz proces transkripcije DNK molekula u informacionu RNK (iRNK) i translacije iRNK u polipeptidne lance, koji se na kraju pakuju u proteine. Molekul DNK koji kodira proteine ili molekul DNK koji kodira polipeptide može biti operabilno povezan sa heterolognim promotorom u DNK konstruktu za upotrebu u ekspresiji proteina ili polipeptida u ćeliji transformisanoj sa molekulom rekombinantne DNK. Kao ovde korišćeno, "operabilno povezani" dva DNK molekula povezana na način da jedan može uticati na funkciju drugog. Operabilno povezani DNK molekuli se mogu preklapati i mogu ili se ne moraju nastavljati . Na primer, promotor je operabilno povezan sa molekulom DNK koji kodira proteine ili molekulom DNK koji kodira polipeptide u DNK konstruktu gde su dva DNK molekula tako raspoređena da promotor može uticati na ekspresiju transgena.

[0041] Kao ovde korišćeno, "DNK konstrukt" je molekul rekombinantne DNK koji se sastoji od dve ili više heterolognih DNK sekvenci. DNK konstrukti su korisni za transgensku ekspresiju i mogu biti sadržani u vektorima i plazmidima. Konstrukti DNK mogu se koristiti u vektorima u svrhu transformacije, odnosno uvođenja heterologne DNK u ćeliju domaćina, kako bi se proizvele transgenske biljke i ćelije, a kao takvi mogu biti sadržani i u plastidnoj DNK ili genomskoj DNK transgenske biljke, semena, ćelije ili dela biljke. Kao ovde korišćeno, "vektor" označava bilo koji molekul rekombinantne DNK koji se može koristiti u svrhu transformacije biljke. Molekuli rekombinantne DNK, kako je navedeno u spisku sekvenci, mogu se, na primer, insertovati u vektor kao deo konstrukta koji ima molekul rekombinantne DNK operabilno povezan sa promotorom koji funkcioniše u biljci da pokrene ekspresiju modifikovanog proteina kodiranog molekulom rekombinantne DNK. Metode za izgradnju DNK konstrukata i vektora su dobro poznate u stanju tehnike. Komponente za DNK konstrukt, ili vektor koji sadrži DNK konstrukt, obično uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: odgovarajući promotor za ekspresiju operabilno povezane DNK, operabilno povezan molekul DNK koji kodira protein i 3' region koji se ne prepisuje (3' -UTR). Promotori korisni u praktikovanju ovog pronalaska uključuju one koji funkcionišu u biljci za ekspresiju operabilno povezanog polinukleotida. Takvi promotori su raznovrsni i dobro poznati u stanju tehnike i uključuju one koji su inducibilni, virusni, sintetički, konstitutivni, vremenski regulisani, prostorno regulisani i/ili prostorno-vremenski regulisani. Dodatne opcione komponente uključuju, ali nisu ograničene na, jedan ili više sledećih elemenata: 5'-UTR, pojačivač, lider, cis-aktivni element, intron, hloroplastne tranzitne peptide (CTP) i jedan ili više selektivnih markerskih transgena.

[0042] DNK konstrukti pronalaska mogu uključivati CTP molekul operabilno povezan sa protein-kodirajućim molekulima DNK koje obezbeđuje pronalazak. CTP koristan u praktikovanju ovog pronalaska uključuje one koji funkcionišu da olakšaju lokalizaciju molekula modifikovanog proteina unutar ćelije. Olakšavanjem lokalizacije proteina unutar ćelije, CTP može povećati akumulaciju modifikovanog proteina, zaštititi ga od proteolitičke degradacije, povećati nivo tolerancije na herbicid i time smanjiti nivo oštećenja nakon primene herbicida. CTP molekuli za upotrebu u ovom pronalasku poznati su u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničeni na Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (Klee et al., 1987), Petunia hybrida EPSPSPS CTP (della-Cioppa et al., 1986), signalnu sekvencu kukuruza cabm7 (Becker et al., 1992; PCT WO 97/41228) i signalnu sekvencu glutation reduktaze graška (Creissen et al., 1991; PCT WO 97/41228).

[0043] Molekuli rekombinantne DNK ovog pronalaska mogu se sintetizovati i modifikovati metodama poznatim u stanju tehnike, bilo u potpunosti ili delimično, posebno kada je poželjno obezbediti sekvence korisne za DNK manipulaciju (kao što su mesta za prepoznavanje restriktivnih enzima ili mesta kloniranja zasnovana na rekombinaciji), sekvence koje preferiraju biljke (kao što su upotreba biljnog kodona ili Kozak konsenzus sekvence) ili sekvence korisne za dizajn DNK konstrukta (kao što su sekvence koje razdvajaju ili povezuju druge sekvence ). Ovaj pronalazak obuhvata molekule rekombinantne DNK koji imaju najmanje 80% (procenat) identiteta sekvence, oko 85% identiteta sekvence, oko 90% identiteta sekvence, oko 91% identiteta sekvence, oko 92% identiteta sekvence, oko 93% identiteta sekvence, oko 94% identiteta sekvence, oko 95% identiteta sekvence, oko 96% identiteta sekvence, oko 97% identiteta sekvence, oko 98% identiteta sekvence i oko 99% identiteta sekvence do bilo koje sekvence rekombinantne DNK koja je ovde navedena, na primer, do molekula rekombinantne DNK koja sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 16, 17. Kao ovde korišćeno, termin "procentualni identitet sekvence" ili "% identiteta sekvence" odnosi se na procenat identičnih nukleotida ili aminokiselina u linearnoj polinukleotidnoj ili polipeptidnoj sekvenci referentne („upit“) sekvence (ili njenog komplementarnog lanca ) u poređenju sa test sekvencom („predmet“) (ili njenim komplementarnim lancem) kada su dve sekvence optimalno uređene (sa odgovarajućim nukleotidnim ili aminokiselinskim insercijama, delecijama ili razmacima koje ukupno iznose manje od 20 procenata referentne sekvenceu okviru poređenja ). Optimalno uređivanje sekvenci za uređivanje prozora za poređenje dobro je poznato onima koji su upoznati sa stanjem tehnike i može se sprovesti alatima kao što su algoritam lokalne homologije Smith-a i Waterman-a, algoritam za poravnanje homologije Needleman-a i Wunsch-a, pretraga za metodom sličnosti Pearson-a i Lipman-a, i kompjuterizovane implementacije ovih algoritama kao što su GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA koji su dostupni kao deo softverskog paketa za analizu sekvenci GCG<®>Wisconsin Package<®>(Accelrys Inc., San Diego, CA), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wis.

53715), i MUSCLE (version 3.6) (RC Edgar, Nucleic Acids research (2004) 32(5): 1792-1797) sa podrazumevanim parametrima. Stopa podudaranja za uređene segmente test sekvence i referentne sekvence je broj identičnih komponenti koje dele dve poravnate sekvence podeljeno ukupnim brojem komponenti u segmentu referentne sekvence, odnosno celoj referentnoj sekvenci ili manjem definisanom delu referentne sekvence. Procentualno podudaranje sekvence je predstavljeno kao stopa podudaranja pomnožena sa 100. Poređenje jedne ili više sekvenci može biti sa sekvencom pune dužine ili njenim delom, ili sa dužom sekvencom.

[0044] Modifikovani proteini mogu se proizvesti promenom (odnosno modifikacijom) divljeg proteina kako bi se proizveo novi protein sa novom kombinacijom korisnih karakteristika proteina, kao što su izmenjeni Vmax, Km, specifičnost supstrata, selektivnost supstrata i stabilnost proteina. Modifikacije se mogu vršiti na određenim pozicijama aminokiselina u proteinu i mogu biti supstitucija aminokiseline koja se nalazi na toj poziciji u prirodi (odnosno u proteinima divljeg tipa) sa drugom aminokiselinom. Primeri pozicija aminokiselina u odnosu na proteinsku sekvencu divljeg proteina RdpA (SEQ ID NO:60) korisne za proteinsku modifikaciju prikazani su na slici 3. Slike 6A, 6B, 6C, 6D, 6E pružaju

1

multi-sekventno poravnanje sekvence divljeg RdpA proteina i sekvence modifikovanog proteina SEQ ID NO:14. Modifikovani protein se može projektovati tako da ima identičnu sekvencu sa sekvencom aminokiseline SEQ ID NO:14 i sadrži najmanje jednu od ovih mutacija aminokiselina. Modifikovani proteini koje obezbeđuje pronalazak tako obezbeđuju novi protein sa jednom ili više izmenjenih karakteristika proteina u odnosu na protein divljeg tipa koji se nalazi u prirodi. U jednom otelotvorenju pronalaska, modifikovani protein ima izmenjene karakteristike proteina kao što su poboljšana ili smanjena aktivnost protiv jednog ili više herbicida ili poboljšana stabilnost proteina u poređenju sa sličnim divljim proteinom, ili bilo koja kombinacija takvih karakteristika.

Transgenske biljke

[0045] Jedan aspekt pronalaska obuhvata transgenske biljne ćelije, transgenska biljna tkiva, transgenske biljke i transgenska semena koje čine molekuli rekombinantne DNK i modifikovani proteini koje pruža pronalazak. Ove ćelije, tkiva, biljke i semena koji sadrže molekule rekombinantne DNK i modifikovane proteine pokazuju toleranciju na jednu ili više vrsta herbicida ariloksifenoksipropionata (AOPP), herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

[0046] Pogodne metode za transformaciju ćelija biljaka domaćina za upotrebu sa aktuelnim pronalaskom uključuju praktično svaku metodu kojom se DNK može uneti u ćeliju (na primer, gde je rekombinantni DNK konstrukt stabilno integrisan u biljni hromozom) i dobro su poznate u stanju tehnike. Primeran i široko korišćen metod za uvođenje rekombinantnog DNK konstrukta u biljke je sistem Agrobacterium transformacije, koji je dobro poznat onima koji poznaju stanje tehnike. Transgenske biljke se mogu regenerisati iz transformisane biljne ćelije metodama kulture biljnih ćelija. Transgenska biljka homozigotna u odnosu na transgen (to jest, dve alelne kopije transgena) može se dobiti samooprašivanjem (samooprašivanjem) transgenske biljke koja sadrži jedan alel transgena sa sobom, na primer biljke R0, da bi se proizvelo seme R1. Četvrtina proizvedenog semena R1 će biti homozigotna u odnosu na transgen. Biljke koje se uzgajaju iz klijavog semena R1 mogu se testirati na zigotnost, obično koristeći SNP test, sekvenciranje DNK ili test termičkog pojačanja koji omogućava razlikovanje između heterozigota i homozigota, što se naziva testom zigotnosti.

[0047] Biljke, semena, delovi biljke, biljna tkiva i ćelije obezbeđene pronalaskom pokazuju herbicidnu toleranciju na jedan ili više herbicida AOPP, herbicide fenoksi kiseline i herbicide piridiniloksilne kiseline. AOPP herbicidi ciljaju acetil-koenzim A karboksilazu biljke (ACCaza), koja je deo biosintetičkog puta masnih kiselina. Travnate biljke su osetljive na ove herbicide jer sadrže ACCazu osetljivu na herbicide u svojim plastidima i citosolu. AOPP herbicidi su poznati u stanju tehnike i komercijalno dostupni. Primeri AOPP herbicida uključuju, ali nisu ograničeni na, klodinafop, cihalofop, diklofop, fenoksaprop, fenoksaprop-P, fentiaprop, fluazifop, fluazifop-P, haloksifop, izoksapirifop, metamifop, propakvizafop, kvizalofop, kvizalofop-P i trifop. Herbicidi fenoksi kiseline i piridiniloksi kiseline su sintetički auksini slični biljnom hormonu rasta indolosirćetnoj kiselini (IAA). Širokolisne biljke su osetljive na ove herbicide, koji izazivaju brz, nekontrolisan rast, na kraju ubijajući biljku. Primeri herbicida fenoksi kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, 2,4-D; 2,4-DB; klomeprop; dihlorprop; fenoprop; MCPA; MCPB i mekoprop. Primeri herbicida piridiniloksi kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, triklopir; fluroksipir; aminopiralid, klopiralid i pikloram.

[0048] Herbicidi se mogu primeniti na površinu sa biljkama u razvoju koja obuhvata biljke i semena koja su obezbeđena pronalaskom kao metod za suzbijanje korova. Biljke i semena obezbeđena pronalaskom obuhvataju osobinu tolerancije na herbicide i kao takvi su tolerantni na primenu jednog ili više herbicida AOPP, ili herbicida fenoksi kiseline, ili herbicida piridiniloksilne kiseline. Primena herbicida može biti preporučena komercijalna stopa (1X) ili bilo koja frakcija ili njen umnožak, kao što je dvostruka preporučena komercijalna stopa (2X). Stope herbicida mogu biti izražene kao ekvivalent kiseline u funtama po jutru (lb ae/acre) ili funte aktivnog sastojka po jutru (lb ai/acre). Primena herbicida obuhvata najmanje jedan herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od herbicida AOPP, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline. Površina za rast biljaka može ili ne mora da obuhvata korovske biljke u vreme primene herbicida. Herbicidno efikasna doza AOPP herbicida za upotrebu na površini za suzbijanje korova treba da se sastoji od raspona od oko 0,01 lb ai/acre do oko 16 lb ai/acre tokom sezone rasta. Na primer, 1X stopa kvizalofopa-P bi bila stopa od 0,08 lb ai/acre. Herbicidno efikasna doza herbicida fenoksi kiseline za upotrebu na površini za suzbijanje korova treba da se sastoji od raspona od oko 0,01 lb ae/acre do oko 16 lb ae/acre tokom sezone rasta. Na primer, 1X stopa od 2,4-D bi bila stopa od oko 0,75 lb ae/acre do 1,0 lb ae/acre. Herbicidno efikasna doza AOPP herbicida za upotrebu na površini za suzbijanje korova treba da se sastoji od raspona od oko 0,01 lb ai/acre do oko 16 lb ai/acre tokom sezone rasta. Na primer, 1X stopa fluroksipira bi bila stopa od oko 0,13 do 0,48 lb ae/acre.

1

[0049] Primena herbicida može biti sekvencijalno ili u rezervoaru pomešana sa jednim, dva ili sa kombinacijom nekoliko AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline, herbicida piridiniloksi kiseline ili bilo kog drugog kompatibilnog herbicida. Višestruke primene jednog herbicida ili dva ili više herbicida, u kombinaciji ili samostalno, mogu se koristiti tokom sezone rasta na površinama koje obuhvataju transgenske biljke pronalaska za suzbijanje širokog spektra dikotiledonskih korova, monokotiledonskih korova, ili oboje, na primer, dve primene (kao što su primena pre sadnje i primena posle pojave ili primena pre pojave i primena posle pojave) ili tri primene (kao što su primena pre sadnje, primena pre pojave i primena posle pojave ili primena pre pojave i dve primene posle pojave).

[0050] Kao ovde korišćeno, "tolerancija" ili "tolerancija na herbicid" označava biljku, seme, biljno tkivo, biljni deo ili sposobnost ćelije da se odupre toksičnim efektima jednog ili više herbicida. Tolerancija na herbicid biljke, semena, biljnog tkiva, biljnog dela ili ćelije može se meriti upoređivanjem biljke, semena, biljnog tkiva, biljnog dela ili ćelije sa odgovarajućom kontrolom. Na primer, tolerancija na herbicid može se izmeriti ili proceniti primenom herbicida na biljku koja sadrži molekul rekombinantne DNK koji kodira protein koji može da prenese toleranciju na herbicid (testna biljka) i biljku koja ne sadrži molekul rekombinantne DNK kodirajući protein koji može da prenese toleranciju na herbicid (kontrolna biljka), a zatim se poredi oštećenje na dve biljke, gde je tolerancija na herbicid ispitne biljke naznačena smanjenom stopom oštećenja u poređenju sa stopom oštećenja kontrolne biljke. Biljka, seme, biljno tkivo, biljni deo ili ćelije tolerantne na herbicid, pokazuju smanjen odgovor na toksične efekte herbicida u poređenju sa kontrolnom biljkom, semenom, biljnim tkivom, biljnim delom ili ćelijom. Kao ovde korišćeno, „osobina tolerancije na herbicid“ je transgenska osobina koja daje poboljšanu toleranciju na herbicid biljci u poređenju sa divljom biljkom ili kontrolnom biljkom.

[0051] Transgenske biljke, potomstvo, semena, biljne ćelije i biljni delovi pronalaska takođe mogu da sadrže jednu ili više dodatnih transgenskih osobina. Dodatne transgenske osobine mogu se uvesti ukrštanjem biljke koja sadrži transgen sa sadržajem molekula rekombinantne DNK iz pronalaska sa drugom biljkom koja sadrži dodatne transgenske osobine. Kao ovde korišćeno, "ukrštanje" znači uzgoj dve individualne biljke da bi se proizvela biljka potomak. Tako se mogu ukrstiti dve transgenske biljke da bi se proizvelo potomstvo koje sadrži transgenske osobine. Kao ovde korišćeno, "potomstvo" označava potomstvo bilo koje

1

generacije roditeljske biljke, a transgensko potomstvo se sastoji od DNK konstrukta koji je obezbeđen pronalaskom i nasleđen od najmanje jedne roditeljske biljke. Alternativno, dodatne transgenske osobine mogu se uvesti ko-transformacijom DNK konstrukta za tu dodatnu transgensku osobinu sa DNK konstruktom koji obuhvata molekule rekombinantne DNK koje pruža pronalazak (na primer, sa svim DNK konstruktima prisutnim kao deo istog vektora koji se koristi za transformaciju biljke) ili insercijom dodatnih osobina u transgensku biljku koja obuhvata DNK konstrukt koji je obezbeđen pronalaskom ili vice versa (na primer, korišćenjem bilo koje od metoda transformacije biljke na transgenskoj biljci ili biljnim ćelijama). Takve dodatne transgenske osobine uključuju, ali nisu ograničene na, povećanu otpornost na insekte, povećanu efikasnost korišćenja vode, povećane performanse prinosa, povećanu otpornost na sušu, povećani kvalitet semena, poboljšani nutritivni kvalitet, proizvodnju hibridnog semena i toleranciju na herbicide, u kojima se osobina meri u odnosu na divlju biljku ili kontrolnu biljku. Takve dodatne transgenske osobine su poznate onima koji su iz ove oblasti; na primer, listu takvih osobina obezbeđuje Služba za inspekciju zdravlja životinja i biljaka (APHIS) Ministarstva poljoprivrede Sjedinjenih Država (USDA) i može se naći na njihovom veb-sajtu na adresi www.aphis.usda.gov.

[0052] Transgenske biljke i potomci koji sadrže transgensku osobinu koju pruža pronalazak mogu se koristiti sa svim metodama uzgoja koje su opšte poznate u stanju tehnike. U biljnim linijama koje se sastoje od dve ili više transgenskih osobina, transgenske osobine mogu biti nezavisno razdvojene, povezane ili kombinacija obe u biljnim linijama koje se sastoje od tri ili više transgenskih osobina. Razmišlja se i o povratnom ukrštanju sa roditeljskom biljkom i spoljnom ukrštanju sa netransgenskom biljkom, kao i o vegetativnom razmnožavanju. Opisi metoda ukrštanja koje se obično koriste za različite osobine i useve dobro su poznati onima koji poznaju stanje tehnike. Da bi se potvrdilo prisustvo transgena u određenoj biljci ili semenu, mogu se izvršiti različiti testovi. Takvi testovi uključuju, na primer, testove molekularne biologije, kao što su južno i severno blotovanje, PCR i sekvenciranje DNK; biohemijske testove, kao što je otkrivanje prisustva proteinskog proizvoda, na primer, imunološkim sredstvima (ELISA i zapadno blotovanje) ili enzimskom funkcijom; testove biljnih delova, kao što su testovi lista ili korena; i takođe, analizom fenotipa cele biljke.

[0053] Introgresija transgenske osobine u genotip biljke postiže se kao rezultat procesa konverzije povratnim ukrštanjem. Biljni genotip u koji je introgresirana transgenska osobina može se nazvati konvertovan povratnim ukrštanjem genotip, linija, samooplodni ili hibridni.

1

Slično tome, biljni genotip koji nema željenu transgensku osobinu može se nazvati nekonvertovanim genotipom, linijom, samooplodnim ili hibridnim.

[0054] Kao ovde korišćeno, termin „koji obuhvata“ znači „uključujući, ali ne ograničavajući se na“.

PRIMERI

Primer 1: Inicijalna modifikacija proteina i analiza enzima

[0055] Novi, modifikovani proteini i molekuli rekombinantne DNK koji kodiraju ove proteine su koncipirani i stvoreni u laboratoriji koristeći tehnike modifikacije proteina.

Modifikovani proteini su enzimi koji imaju aktivnost oksigenaze i modifikovani su da imaju izmenjene sposobnosti inaktivacije AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline ili oba u odnosu na divlji protein.

[0056] Šesnaest poznatih proteina sa aktivnošću oksigenaze je izabrano i korišćeno za stvaranje uređene homologe konsenzus sekvence. Ovo je korišćeno u kombinaciji sa strukturno vođenim analizama za informisanje o racionalnim strategijama dizajna. Iz ovih analiza, za mutagenezu je odabrano pet regiona, svaki dužine od 13 do 21 aminokiseline, koje se ovde nazivaju "ostrvima". Mutacije u svakom od ovih regiona su stvorene korišćenjem tehnika poznatih poznavaocima stanja tehnike, kao što su Alanine-Scanning mutacije;

Homology-Scanning mutacije; Pro/Gly Scanning mutacije; Region Swaps ili mutacije; i kombinacije ovih različitih tehnika (vidi, M Lehmann i M Wyss, Current Opinion in Biotechnology (2001) 12(4): 371-375; B Van den Burg i VGH Eijsink, Current Opinion in Biotechnology (2002) 13(4): 333-337; i Weiss et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2000) 97(16):8950-8954). Pomoću ovih metoda generisano je više od 1200 jedinstvenih modifikovanih proteina i molekula rekombinantne DNK koji ih kodiraju za dalju analizu i karakterizaciju. Zbog velikog broja modifikovanih proteina proizvedenih za testiranje i potrebe da se testira i upoređuje enzimska aktivnost svakog proteina, razvijen je visoko propusni sistem za ekspresiju bakterijskih proteina i enzimsko testiranje za brzu analizu pomoću sirovih bakterijskih ekstrakata.

[0057] Visoko propusna ekspresija bakterijskog proteina postignuta je sintezom molekula rekombinantne DNK koji kodira svaki modifikovani protein i kloniranjem u vektor bakterijske ekspresije sa C-terminalnom histidinskom oznakom (His-tag) operabilno

1

povezanom sa molekulom rekombinantne DNK. Vektori su korišćeni za transformaciju Escherichia coli (E. coli), a indukovana je i bakterijska ekspresija modifikovanih proteina. Preko noći su se kulture E. coli uzgajale u pločama sa 96 bunara, a kulture su centrifugirane da bi se bakterije peletirale. Bakterijske pelete su lizirane dodavanjem 100 ul master miksa za liziranje 10 ml Reagensa za ekstrakciju bakterijskih proteina, B-PER<®>) II (Pierce Biotechnology, Rockford, IL; kat. br.78260); 10 ul lizozima (10 ug/ml final; Lysozyme American Bioanalytical, Natick, MA; kat. br. AB011780-00005); i 40 ul Benzonase<®>Nuklease (100 jedinica/ml final, Novagen, Darmstadt, Germany; kat. br.71206-3)) na svaki bunar. Ploče su vrtložene, zatim inkubirane 30 minuta na 4°C. U svaki bunar je dodato 400 ul pufera MOPS (pH 6,57), a nepotrebni materijal je peletiziran centrifugiranjem. Supernatant lizata je pažljivo uklonjen i korišćen kao sirovi bakterijski ekstrakt za naknadnu enzimatsku analizu.

[0058] Test enzima za degradaciju herbicida, za upotrebu sa velikim protokom uzoraka, je dizajniran da testira enzimsku aktivnost modifikovanih proteina prema različitim herbicidima koristeći sirovi bakterijski ekstrakt. Aktivnost oksigenaze modifikovanog proteina (odnosno njegova enzimska aktivnost) merena je kolorimetrijskim testom krajnje tačke pomoću detekcije produkata fenola merenjem apsorbance na 510 nm iz 4-aminoantipirina i kalijum fericijanida. Ovaj test je zasnovan na testu opisanom u Fukomori i Hausinger, Journal of Biological Chemistry (1993) 268(32):24311-24317. Reakcije enzima su testirane u pločama sa 96 bunara u ukupnoj zapremini od 150 ul koje su sadržale: 20 mM MOPS pH 6,75, 50-200 uM NH4FeSO4, 50-200 uM natrijum askorbata, 1 mM alfa-ketoglutarata (aKG), 10 ul lizata ćelije E. coli koji sadrži ekspresirani modifikovani protein i supstrat (ili herbicid AOPP ili herbicid fenoksi kiseline). Po pokretanju reakcije sa supstratom, ploča je inkubirana na različitim temperaturama za različita vremena i ugašena (prekinuta) dodavanjem EDTA finalnoj koncentraciji od 6,25 mM ili dodavanjem 15 ul pufera pH 10 (50 mM borna kiselina, 50 mM KCl) praćeno sa 15 ul 0,2% 4-aminoantipirina i 15 ul 0,8% kalijum fericijanida. Merenja apsorbance izvršena su na standardnom laboratorijskom spektrometru. Testovi su skalirani po potrebi da bi se povećala propusnost. Standardne krive su generisane korišćenjem prečišćenih proteina ili standarda proizvoda.

[0059] Koristeći ovaj visoko propusni sistem ekspresije bakterijskih proteina i enzimskog testa, aktivnosti približno 1200 modifikovanih proteina merene su u odnosu na aktivnost odabranog divljeg proteina, RdpA. U ploči sa 96 bunara postojale su 3 kontrole (sirovi

1

bakterijski ekstrakt bez modifikovanog proteina) i 3 pozitivne kontrole (sirovi bakterijski ekstrakt sa divljim proteinom). Izmerena je apsorbancija u bunarima i izračunata aktivnost proteina pomoću sledeće formule:

gde : Aktivnostije aktivnost uzorka, Apsorbancaije apsorbanca uzorka, ApsorbancaWTje apsorbanca bunara koji sadrže ekstrakt iz E. coli koji ekspresira enzim divljeg tipa, a ApsorbancapETje apsorbanca bunara koji sadrže ekstrakt iz E. coli bez modifikovanog proteina.

[0060] Aktivnost za svaki jedinstveni modifikovani protein merena je u duplikatu i prijavljena je kao prosek dva merenja.

[0061] Na osnovu rezultata sistema za ispitivanje enzima sa visokim protokom, oko 545 jedinstvenih modifikovanih proteina je izabrano za dalju analizu pomoću prečišćenih modifikovanih proteina. U prep testu sa prečišćenim modifikovanim proteinom, lizati sirove bakterijske ekspresije pripremljeni su korišćenjem QUIAGEN<®>Ni-NTA Agarose (Qiagen, Valencia, CA, kat. Br.30230) u skladu sa protokolom proizvođača.

[0062] Prečišćeni modifikovani proteini su testirani pomoću testa enzima za razgradnju herbicida opisanog u ovom primeru 1 sa AOPP herbicidom kvizalofopom kao supstratom. Rezultati testova prečišćenih modifikovanih proteina su u velikoj meri potvrdili rezultate visoko propusnog enzimskog testa. Rezultati testa za sedam od približno 545 modifikovanih proteina prikazani su u Tabeli 1, gde je enzimska aktivnost izražena kao aktivnost uzorka u odnosu na aktivnost enzima divljeg tipa RdpA (izračunato kao što je opisano u ovom primeru 1). Ovi podaci iz ovih testova dali su iznenađujući rezultat da su kombinacije specifičnih mutacija delovale značajno bolje od drugih i pokazale da se enzimska aktivnost modifikovanih proteina može značajno promeniti.

2

Таbеlа 1.

[0063] Koristeći informacije naučene iz prvih testova, modifikacija proteina je zatim urađena kako je prethodno opisano da bi se proizveli dodatni modifikovani proteini, koji su testirani kako je opisano u ovom primeru 1.

[0064] Dalja karakterizacija proteina, kao što su Km, Vmax i analiza kristalne strukture, izvršena je pomoću pet modifikovanih proteina iz Tabele 2. Za ovu detaljnu analizu, prečišćeni protein je pripremljen na sledeći način: 2 ml prekonoćne kulture E. coli koje ekspresiraju transgen koji kodira dati MON-HT protein su korišćene za inokuliranje 500 ml bujona i uzgajaju se na 37°C 4 sata, a zatim kultivisanjem na 15°C približno 36 sati. Zatim je 250 ml bakterijske kulture od 500 ml peletirano centrifugiranjem i resuspendovano u 25 ml pufera za ekstrakciju (20 mM Tris, pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM beta-merkaptoetanola (BME), 20 mM imidazola (Fluka/Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 125 jedinica/ml benzonaze i 10K jedinica/ml lizozima (Novagen, Darmstadt, Germany). Ćelijska kaša je prošla kroz ćelijski disruptor jednom na 20000 psi, a zatim je ovaj ćelijski lizat izbistren centrifugiranjem na 35.000 x g tokom 20 minuta na 4°C. Supernatant koji sadrži rastvorljive His-tagovane proteine (sa oznakom His) korišćen je za prečišćavanje proteina. Za ovo prečišćavanje, supernatant je nanet na 1 ml HisTrap™ FF kolonu (Nickel Sepharose) (GE Healthcare, Piscataway, NJ) koristeći AKTaxpress™ sistem (GE Healthcare, Piscataway, NJ) u skladu sa standardnim protokolom proizvođača. Pufer za ispiranje se sastojao od: 20 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazola i 5 mM BME. Sastav eluacionog pufera bio je isti kao i pufer za ispiranje osim sa 500 mM imidazola. Eluat iz nikl kolone je desaltiran na koloni Quick Spin Protein Sephadex G-25 fini (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) prema protokolu proizvođača. Eluirani protein je bio u puferu koji se sastojao od: 20 mM Tris pH 7,8, 50 mM NaCl i 5 mM BME. Čistoća ekstrakta proteina je procenjena SDS-PAGE analizom. Koncentracija proteina je određena Bredfordovim testom pomoću obojenog reagensa za testiranje proteina Bio-Rad (Biorad, Hercules, CA, Cat no 500-0006).

[0065] Prečišćeni protein za modifikovane proteine analiziran je pomoću enzimskog testa opisanog u ovom primeru 1, ali sa četiri različita AOPP herbicida kao supstrata: kvizalofop-P, haloksifop, fenoksaprop i fluazifop. Standardne krive su generisane korišćenjem 2,4-dihlorofenola (2,4-DCP), koji je korišćen za proizvodnju standardne krive fenola. Količina fenola generisana u testu od strane modifikovanih proteina izračunata je na osnovu ove standardne krive. Kontrole su bile prečišćeni enzim divljeg tipa, bez enzima i bez supstrata. Enzimska kinetička merenja pet modifikovanih proteina izvršena su pomoću 0, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ili 1280 µM kvizalofopa-P, haloksifopa, fenoksapropa ili herbicida fluazifopa. Tabela 3 prikazuje Km i Vmax (izražene kao relativne vrednosti) izmerene za pet proteina sa četiri supstrata AOPP herbicida. Karakteristike proteina ovih pet modifikovanih proteina sa svakim od četiri AOPP herbicida kao supstrata pokazale su da se enzimska aktivnost, odnosno Km i Vmax, modifikovanih proteina može značajno promeniti putem modifikovanja proteina.

Primer 3: Optimizacija modifikovanih proteina

[0066] Da bi se stvorili modifikovani proteini optimizovani za aktivnost na višim temperaturama, analiza motiva proteina korišćena u prva dva kruga modifikovanja proteina kombinovana je sa podacima o strukturi kristala za nekoliko modifikovanih proteina. Ovo je korišćeno za informisanje dodatnih krugova mutageneze, izvedenih kao što je prethodno opisano, i tako je generisano oko 1400 dodatnih modifikovanih proteina. Oni su kombinovani sa približno 1200 modifikovanih proteina opisanih u primeru 1 za ukupno oko 2600 modifikovanih proteina za skrining sa novim testom osetljivosti na temperaturu kako bi se identifikovali proteini optimizovani za aktivnost na višim temperaturama.

[0067] Da bi se analizirali ovi modifikovani proteini za aktivnost na višim temperaturama, in vitro enzimski test u Primeru 1 je modifikovan tako da precizira prethodno zagrevanje svih komponenti testa na željenu temperaturu na 5 minuta pre spajanja komponenti i zatim održavanje reakcije na željenoj temperaturi tokom trajanja reakcije. Za normalizaciju merenja testa, kvizalofop-P je korišćen kao supstrat za reakciju, a aktivnost enzima je normalizovana na osnovu očitavanja na 25°C. Pomoću ovih parametara izračunata je temperatura na kojoj je aktivnost enzima bila upola manja od maksimalne (T1/2).

[0068] Zbog velikog broja varijanti za testiranje, korišćen je proces skrininga na pet nivoa. Tabela 6 prikazuje približan broj varijanti testiranih u različitim skrininzima.

Tabela 6.

[0069] Prvi skrining je urađen sa približno 2600 modifikovanih proteina i koristio je visoko propusni sistem ekspresije bakterijskih proteina i enzimskog testa sa sirovim bakterijskim lizatima kao što je opisano u Primeru 1, ali modifikovano da se sprovodi na željenim temperaturama od 25°C i 40°C sa razvojem boja nakon gašenja na 25°C. Iz ovog skrininga, izabrano je i unapređeno oko 1250 modifikovanih proteina. Drugi skrining je bio sličan, ali je uključivao normalizaciju proteina u uzorcima. Iz ovog skrininga, izabrana su i unapređena 94 modifikovana proteina. Treći skrining je koristio prečišćeni protein sa testom enzima za razgradnju herbicida kako je opisano u Primeru 1, ali je modifikovan da se sprovodi na željenim temperaturama od 25°C i 40°C sa razvojem boje nakon gašenja na 25°C. Iz ovog skrininga, izabrano je i unapređeno 47 modifikovanih proteina. Četvrti skrining je urađen korišćenjem prečišćenih proteina, koncentracije proteina su normalizovane, a skrining je uključivao kvizalofop-P i (za podskup varijanti proteina) 2,4-D kao supstrate sa testovima krajnje tačke urađenim na 23°C i 40°C. Iz ovog skrininga izabrano je i unapređeno trinaest modifikovanih proteina.

[0070] Za peti skrining, proizveden je i prečišćen rekombinantni protein za svaki od jedanaest modifikovanih proteina za dubinsku biohemijsku analizu. Ova biohemijska analiza obuhvatala je: (1) kinetičku analizu (Vmax i Km), (2) testove aktivnosti na rasponu

2

temperatura, (3) analizu topljenja proteina, (4) aktivnost na dodatnim supstratima AOPP herbicida i (5) analizu masene spektrometrije na peptidima za potvrdu identiteta. Biohemijske analize su takođe urađene sa prečišćenim rekombinantnim proteinima divljeg tipa i MON-HT55 proteinom za poređenje. Za kinetičku analizu, test bez krajnje tačke je sproveden na 23°C sa ili kvizalofop-P ili 2,4-D kao supstratom. Rekombinantni proteini za ove testove su proizvedeni u bakterijama i prečišćeni koristeći 6-His tag fuzionisan na C-terminalnom kraju proteina. Rezultati kinetičke analize sa kvizalofop-P ili 2,4-D kao supstratom prikazani su za deset modifikovanih proteina, protein divljeg tipa i protein MON-HT55 u Tabeli 7 (standardna greška je prikazana u zagradi). Vmax je izraženo kao specifična aktivnost, umol herbicid proizvod mg enzim-1 min-1; Km izražen kao mM herbicid supstrat. NDB ukazuje da aktivnost enzima može biti očigledna u većim koncentracijama herbicida, ali aktivnost u ispitivanim koncentracijama nije bila dovoljno robusna da obezbedi odgovarajuću kinetičku karakterizaciju. Za MON-HT55, nizak nivo aktivnosti (Vmax) sa 2,4-D kao supstratom rezultirao je niskim poverenjem u prijavljenu vrednost. MON-HT7 je imao Vmax sa kvizalofop-P koji je približno 40% veći od enzima divljeg tipa i Vmax za 2,4-D koji je samo oko polovine od enzima divljeg tipa. MON-HT1 je imao Vmax za kvizalofop-P koji je otprilike upola veći od onog kod enzima divljeg tipa i Vmax za 2,4-D koji je 9,5 puta veći od onog kod enzima divljeg tipa. Diferencijacija kinetike proteina za MON-HT1 i MON-HT7 bila je iznenađujuća jer postoje samo četiri aminokiselinske razlike između MON-HT1 i MON-HT7. Konkretno, MON-HT1 ima sledeće aminokiseline na naznačenom položaju: 182; F105; T112; i V273, a MON-HT7 ima sledeće aminokiseline na naznačenom položaju: L82; V105; S112; i A273.

Tabela 7.

[0071] Aktivnost enzima u opsegu temperatura detaljno je analizirana za MON-HT1, MON-HT2, MON-HT7 i MON-HT8. Ovi testovi su sprovedeni kao što je gore opisano. Kvizalofop-P ili 2,4-D je korišćen kao supstrat za ove reakcije i aktivnost je normalizovana na osnovu aktivnosti enzima divljeg tipa na 25°C. Dobijene krive aktivnosti prikazane su na slici 2B (sa kvizalofop-P kao supstratom) i slici 2C (sa 2,4-D kao supstratom). Koristeći kvizalofop-P kao supstrat, MON-HT55 je bio najosetljiviji na temperaturu, sa T1/2od 29°C. Enzim divljeg tipa je imao T1/2od 38°C. MON-HT1 i MON-HT8 su bili manje osetljivi na temperaturu od enzima divljeg tipa sa T1/2od 42°C i 41°C, respektivno, na temperaturama na kojima je enzim divljeg tipa 90% neaktivan. MON-HT2 i MON-HT7 su bili mnogo manje osetljivi na temperaturu sa T1/2od 46°C, odnosno 47°C, na kojima su temperature enzima divljeg tipa potpuno neaktivne. Kada je 2,4-D korišćen kao supstrat, enzim divljeg tipa je imaoT1/2od 36°C. MON-HT2, MON-HT7 i MON-HT8 su bili malo osetljiviji na temperaturu sa nižim

2

T1/2od enzima divljeg tipa. MON-HT1 je bio nešto manje osetljiv na temperaturu, sa T1/2oko 1°C višim od enzima divljeg tipa.

[0072] Takođe je sprovedena analiza topljenja proteina. Za određivanje topljenja proteina, prečišćeni enzim je dodat u ploču sa 96 bunara u standardnom skladišnom puferu (30 mM Tris pH7.5, 150 mM NaCl) sa ili bez 50 uM Fe2+ i 1,0 mM aKG. Zatim je otkriveno odvijanje proteina sa SYPRO<®>orange boja za bojenje gelova (Invitrogen™ catalog # S6651, Life Technologies, Grand Island, NY) u BioRad CFX96™ PCR mašini u realnom vremenu (BioRad, Hercules, CA) sa očitavanjima između 10°C i 95°C u koracima od 0,5°C. T1/2(ovde, temperatura na kojoj je 50% proteina odmotano) prikazano je u Tabeli 8. Enzim divljeg tipa pokazao je stabilizaciju sa 50 uM Fe2+ i 1,0 mM aKG. Nasuprot tome, 50 uM Fe2+ i 1,0 mM aKG imali su mali uticaj na stabilnost bilo kog od modifikovanih proteina. MON-HT55, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT6 i MON-HT10 su imali temperature topljenja u rasponu od 41°C do 48°C, što je ispod temperature topljenja enzima divljeg tipa. MON-HT1, MON-HT2, MON-HT5, MON-HT7, MON-HT8 i MON-HT9 su imali temperature topljenja između 58°C i 67°C, što je 8°C do 17°C više od enzima divljeg tipa. Za MON-HT7 i MON-HT1 razlika u tački topljenja je bila 11°C u puferu bez Fe2+ i aKG i 8°C u puferu sa Fe2+ i aKG. Ovo je bilo iznenađujuće jer postoje samo četiri aminokiselinske razlike između dva enzima. Ovi podaci o tački topljenja enzima potvrđuju da su modifikovani proteini optimizovani za stabilnost proteina na višim temperaturama. Ovi podaci takođe odgovaraju rezultatima testa aktivnosti enzima za proteine, sprovedene na različitim temperaturama.

Tabela 8.

2

[0073] Aktivnost enzima varijanti MON-HT proteina sa haloksifopom, fenoksapropom, fluazifopom i dihlorpropom kao supstratima određena je pomoću testa aktivnosti enzima sprovedenog na 23°C sa prečišćenim enzimom. Aktivnost je zabeležena kao maksimalna aktivnost kao procenat aktivnosti enzima divljeg tipa, koji je postavljen na 100%. Podaci su dati u Tabeli 9. Sa haloksifopom kao supstratom, MON-HT 1 je imao maksimalnu aktivnost koja je bila veća od aktivnosti enzima divljeg tipa. Sa fenoksapropom kao supstratom, MON-HT1 je imao maksimalnu aktivnost koja je bila veća od aktivnosti enzima divljeg tipa. Sa dihlorpropom kao supstratom, MON-HT 1 je imao maksimalnu aktivnost koja je bila veća od aktivnosti enzima divljeg tipa.

Tabela 9.

[0074] Identiteti enzima su potvrđeni pomoću masene spektroskopije. Za ovu analizu, prečišćeni protein je separisan na gelu PAGE i obojen. Obojene trake su zatim isečene, obezbojene i tripsinski digestirane koristeći standardne protokole. Tripsinski digestirani preparati proteina separisani su na Dionox UltiMat<®>3000 RSLCnano LC sistemu (Thermo Scientific, Sunnyvale, CA) koristeći Thermo Scientific<™>AQUASIL<™>C-18 Javelin<™>Guard kolonu u standardnim uslovima i ubrizgani za MS-MS analizu koristeći Thermo Scientific<™>Q Exactive<™>hibridni kvadrupol- orbitrap maseni spektrometar (Thermo Scientific, Sunnyvale, CA).

2

[0075] Da bi se optimizovali proteini za povećanu aktivnost u prisustvu herbicida fenoksi kiseline, izvršeno je računarsko modifikovanje proteina na kristalnoj strukturi za nekoliko modifikovanih proteina. Ovo je korišćeno za informisanje dodatnih krugova mutageneze, izvedenih kao što je prethodno opisano, ali koristeći bakterijsku sekvencu, SEQ ID NO:15, kodirajući proteinsku sekvencu MON-HT1 (SEQ ID NO:14) kao početnu sekvencu. Toplotna stabilnost enzima je testirana sa testovima ograničenog topljenja proteina. Iz ovog skrininga izabrano je i unapređeno 7 modifikovanih proteina za testiranje na biljkama. Izabrane su tri varijante enzima za detaljnu karakterizaciju pomoću prečišćenih proteina, gde su koncentracije proteina normalizovane, a skrining je obuhvatio kvizalofop-P i 2,4-D kao supstrate, kao i dodatne herbicide prikazane u Tabeli 10 i Tabeli 12 i karakterizaciju topljenja proteina.

[0076] Kinetička analiza korišćenjem testa koji ne analizira samo krajnje produkte sprovedena je na 23°C sa kvizalofop-P ili 2,4-D kao supstratom, kao što je detaljno gore navedeno za prečišćeni protein enzima divljeg tipa, MON-HT1, MON-HT13, MON-HT15 i MON-HT17. Podaci pokazuju značajno i neočekivano povećanje enzimske aktivnosti MON-HT13, MON-HT15 i MON-HT17 u odnosu na RdpA enzim divljeg tipa i MON-HT1 enzim kada je testiran sa 2,4-D kao supstratom. Tačnije, sve tri varijante su pokazale približno 2,5 do 3 puta povećanje aktivnosti (Vmax) u odnosu na MON-HT1. Enzimska aktivnost MON-HT13, MON-HT15 i MON-HT17 varijanti sa kvizalofopom kao supstratom bila je približno slična aktivnosti MON-HT1. Vidi Tabelu 10.

Tabela 10.

2

[0077] Analiza topljenja proteina je sprovedena kao što je detaljno opisano prethodno.

Temperature topljenja MON-HT13, MON-HT15 i MON-HT17 bile su slične temperaturi topljenja MON-HT1 sa T1/2u puferu u opsegu 55-58°C, i sa T1/2u puferu plus Fe2+ i aKG u opsegu 60-62°C. Ovi podaci ukazuju da varijante MON-HT13, MON-HT15 i MON-HT17 imaju sličnu toplotnu stabilnost enzima u poređenju sa MON-HT1. Ovi podaci o tački topljenja enzima potvrđuju da su modifikovani proteini optimizovani za stabilnost proteina na višim temperaturama. Pogledajte tabelu 11.

Tabela 11.

[0078] Enzimska aktivnost varijanti MON-HT proteina sa triklopirom, fluroksipirom, MCPA, MCPB, mekopropom kao supstratima, određena je pomoću testa enzimske aktivnosti sprovedenog na 23°C sa prečišćenim enzimom. Aktivnost je zabeležena kao maksimalna aktivnost kao procenat aktivnosti enzima RdpA divljeg tipa, koji je postavljen na 100%.

Podaci su dati u Tabeli 9. Za proteinsko ispitivanje MON-HT1 sa herbicidima triklopirom i fluroksipirom kao supstratom, postojala je detektabilna aktivnost, posebno u modifikovanoj varijanti, ali aktivnost nije bila dovoljno robusna da bi se kvantifikovala. Nije bilo detektovane aktivnosti za proteinski testirani MON-HT1 sa herbicidom MCPB kao supstratom. Enzimska aktivnost sa mekopropom kao supstratom je smanjena za MON-HT1, u poređenju sa RdpA enzimom divljeg tipa. Neočekivani rezultat je bio da je enzimska

2

aktivnost sa MCPA kao supstratom bila približno 6 puta veća za MON-HT1. Pogledajte Tabelu 12.

Tabela 12.

Primer 4: Ekspresija modifikovanih proteina u kukuruzu

[0079] Deset jedinstvenih modifikovanih proteina optimizovanih za aktivnost na višim temperaturama izabrano je za transformaciju kukuruza i analizu u biljkama. Proizvedeni su DNK konstrukti za ekspresiju ovih modifikovanih proteina sa korišćenjem kodona optimizovanim za ekspresiju monokotiledona koristeći metode poznate onima koji poznaju stanje tehnike. Poboljšivači, promotori, lideri, introni, CTP i 3'UTR testirani su u raznim kombinacijama sa modifikovanim proteinima u ovim DNK konstruktima. Konstrukti DNK su korišćeni za transformaciju nezrelih embriona kukuruza (LH244) sa ovim vektorima koristeći Agrobacterium tumifaciens i standardne metode poznate u stanju tehnike. Regenerisane R0 transgenske biljke uzgajane su u stakleniku.

[0080] Biljke transgenskog R0 kukuruza su pregledane primenom kvizalofop-P (2X) plus 2,4-D (2X) 7 do 10 dana nakon transplantacije (generalno odgovara V3-V4 fazi rasta). Svi testirani konstrukti proizveli su biljke koje sadrže jedinstvene događaje koji su prošli R0 skrining. Biljke R0 same su generisale homozigotno seme R1, a R0 je takođe korišćen kao muška biljka za ukrštanje sa samooplodnim biljkama koje sadrže MON89034 kukuruza za generisanje segregacionog hibridnog semena F1 za terenska ispitivanja efikasnosti.

[0081] Terensko ispitivanje efikasnosti sprovedeno je sa segregacionim F1 hibridnim biljkama, sa 50% hemizigota i 50% onih koji nisu imali transgen. Tolerancija na kvizalofop-P (2X) plus 2,4-D (2X) procenjena je korišćenjem dva režima primene herbicida: (1) kvizalofop-P (Assure II) pri 0,16 lb ai/acre (2X) plus 0,25% v/v nejonskog surfaktanta (NIS) primenjenog u VE-V2 fazi rasta, zatim istog u V4 fazi rasta, zatim istog u V8 fazi rasta i (2) 2,4-D amin pri 2lb ae/acre (2X) plus kvizalofop-P pri 0,04 lb ai/acre (0,5X) plus 0,25% v/v NIS primenjenog u VE-V2 fazi rasta, zatim 2,4-D amin pri 2lb ae/acre (2X) plus 0,25% v/v NIS primenjenog u V4 fazi rasta, zatim istog u V8 fazi rasta.50% biljaka koje su bile nulte za transgen uklonjene su prvom primenom kvizalofopa-P u fazi rasta VE-V2. Parcele su vizuelno ocenjene 10-14 dana nakon primene na oštećenje useva na skali od 0 do 100, pri čemu "0" nije bilo, a "100" je bilo potpuno uništenje useva. Tabela 13 prikazuje prosečnu ocenu oštećenja u V4 i V8 fazama rasta za oba režima prskanja. Ocene oštećenja od<10% smatrane su veoma dobrom tolerancijom, a ocene oštećenja od <20% smatrane su dobrom do povoljnom tolerancijom. Procenat ocene oštećenja sa 2X primenom 2,4-D u V8 fazi rasta kretao se od visokih 40% do niskih 0. Slično tome, procenat oštećenja sa 2X primenom kvizalofopa-P u V8 fazi rasta kretao se od visokih 90% do niskih 0. Varijacije u ocenama oštećenja između biljaka koje ispoljavaju isti protein su verovatno posledica varijacija u dizajnu konstrukta ili mestu insertacije transgena. Ovi podaci su potvrdili da su biljke sa ekspresijom modifikovanih proteina imale toleranciju na primenu herbicida 2,4-D i kvizalofopa pri stopi od 2X.

Tabela 13.

[0082] Test aktivnosti enzima u biljkama za osetljivost na toplotu je korišćen za određivanje uticaja povišenih temperatura rasta na toleranciju herbicida transgenskih biljaka koje sadrže optimizovane modifikovane proteine. Da bi se testirala tolerancija kvizalofop-P na povišenim

1

temperaturama rasta, F1 hibrid (proizveden ukrštanjem R1 homozigotne biljke sa onom koja eksprimira jedan od MON-HT proteina sa MON89034 samooplodnog kukuruza) seme kukuruza je uzgajano u komori za rast 10 dana na dnevnoj temperaturi od 28°C i noćnoj temperaturi od 20°C sa 50% vlažnosti. Nakon 10 dana, biljke su premeštene na aklimatizaciju na 3 dana na jednom od tri različita režima dnevne i noćne temperature: (1) dnevne i noćne temperature podešene na 20°C; (2) dnevne temperature na 28°C i noćne temperature na 20°C; ili (3) dnevne temperature na 38°C i noćne temperature na 30°C. Na kraju perioda aklimatizacije, biljke su uglavnom bile u V4 fazi rasta i bile su prskane sa 2X kvizalofop-P. Deset dana nakon tretmana biljke su bodovane za oštećenja na skali ocena od 1 do 5 gde „0“ nije uočena vidljiva povreda, „1“ je hlorotična pegavost, „2“ je hlorotična prugavost, „3“ su lisni jaz ili suze, „4“ su biljke sa zakržljalim rastom i/ili uvijenim listovima, a „5“ su mrtve biljke ili nije uočen rast. Rezultati su prikazani na slici 4. F1 hibridne biljke kukuruza sa ekspresijom MON-HT55 pokazale su dobru toleranciju (ocene oštećenja oko 2) na tretmane prskanjem kada su dnevne/noćne temperature bile 20°C/20°C (Slika 4A) ili 28°C/20°C (Slika 4B) u odnosu na F1 hibridne kontrolne biljke (događaji NK603 X MON89034 kukuruza) (ocena oštećenja 5). Kada su dnevne/noćne temperature bile 38°C/30°C F1 hibridne biljke sa ekspresijom MON-HT 1, imale su ocene oštećenja ≤ 1 (Slika 4C). Modifikovani proteini optimizovani za aktivnost na višim temperaturama obezbedili su toleranciju AOPP herbicida kada su biljke sa ekspresijom ovih modifikovanih proteina bile izložene visokim temperaturama.

[0083] Za testiranje tolerancije 2,4-D na povišenim temperaturama rasta, proizvedene su hibridne biljke F1 ukrštanjem biljke R1 koja sadrži MON-HT1, sa samooplodnom biljkom koja sadrži događaj MON89034 kukuruza. Hibridne biljke F1 uzgajane su u stakleniku nedelju dana na minimalnoj temperaturi od 20°C i maksimalnoj temperaturi od 28°C sa 50 do 80% vlažnosti. Nakon 1 nedelje, biljke su premeštene na aklimatizaciju tokom tri dana na jedan od dva različita režima dnevne i noćne temperature: (1) dnevne i noćne temperature podešene na 20°C ili (2) dnevna temperatura na 38°C i noćna temperatura na 30°C. Na kraju perioda aklimatizacije, biljke su uglavnom bile u V4 fazi rasta i prskane su sa 4X 2,4-D aminom. Deset dana nakon tretmana biljke su bodovane na oštećenja koristeći skalu oštećenja od 0 do 100, pri čemu je „0“ bez oštećenja, a „100“ je mrtva biljka. Kada su biljke aklimatizovane na dnevnim/noćnim temperaturama od 20°C/20°C pre primene 4X 2,4-D amina, biljke F1 koje sadrže MON-HT1 imale su prosek ocena oštećenja <10%, a kontrolne biljke su imale prosek ocena oštećenja <20% (Slika 4D). Kada su biljke aklimatizovane na

2

dnevnim/noćnim temperaturama od 38°C/30°C pre primene 4X 2,4-D amina, biljke F1 koje sadrže MON-HT1 imala su prosek ocena oštećenja <10% (Slika 4E), a F1 kontrolne biljke imale su prosek ocena oštećenja 50% (Slika 4E). Ovi rezultati su pokazali da su modifikovani proteini optimizovani za aktivnost na višim temperaturama obezbedili toleranciju herbicida 2,4-D kada su biljke sa ekspresijom ovih modifikovanih proteina bile izložene visokim temperaturama.

[0084] Odvojena ispitivanja efikasnosti na terenu za kvizalofop-P i 2,4-D sprovedena su na dve lokacije, svaka sa F1 hibridnim transgenskim biljkama proizvedenim ukrštanjem samooplodne biljke koja sadrži događaj MON89034 kukuruza sa R1 biljkom koja sadrži MON-HT55 (sa CTP), MON-HT1 (sa ili bez CTP), MON-HT2 (sa ili bez CTP), MON-HT3 (sa CTP), MON-HT4 (sa CTP), MON-HT5 (sa CTP), MON-HT6 (sa CTP) ili MON-HT7 (sa CTP). Kao kontrola korišćene su transgenske F1 hibridne biljke koje sadrže događaj NK603 x MON89034 kukuruza.

[0085] U terenskom ispitivanju efikasnosti za toleranciju na kvizalofop-P i osetljivost na kletodim, korišćen je jedan od četiri tretmana herbicidom: (1) kvizalofop-P (Assure II) na 0,32 lb ai/acre (4X) plus 0,25% v/v nejonski surfaktant (NIS) primenjen u VE-V2 fazi rasta, zatim isti u V4 fazi rasta, zatim isti u V8 fazi rasta; (2) kvizalofop-P na 0,64 lb ai/acre (8X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE do V2 fazi rasta, zatim isti u V4 fazi rasta, zatim isti u V8 fazi rasta; (3) kvizalofop-P na 1,28 lb ai/acre (16X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE do V2 fazi rasta, zatim isti u V4 fazi rasta, zatim isti u V8 fazi rasta; ili (4) kletodim na 0,25 lb ai/acre (1X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u V8 fazi rasta. Parcele su vizuelno ocenjene 10-14 dana nakon primene na oštećenja useva na skali od 0 do 100, pri čemu je "0" nema, a "100" je bilo potpuno uništenje useva. U Tabelama 14 i 15 prikazane su prosečne ocene oštećenja nakon primene herbicida u V4 ili V8 fazi rasta.

[0086] Biljke koje sadrže MON-HT1 (sve operabilno povezane sa CTP) pokazale su veoma dobru toleranciju na kvizalofop-P sa ocenama oštećenja manjim od 15% u svim stopama primene i u V4 i V8 fazama rasta. Ocene oštećenja za kontrolne biljke nakon primene kvizalofop-P iznosile su 99,5%. Ovi rezultati ukazuju da su biljke koje sadrže MON-HT1 operabilno povezane sa CTP imale veoma dobru toleranciju na sekvencijalne primene kvizalofop-P.

[0087] Biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno vezanim CTP imale su bolju toleranciju na kvizalofop-P od biljaka koje sadrže MON-HT1 bez operabilno vezanog CTP. Biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno vezanim CTP imale su ocenu oštećenja od 0 do 5,5% u svim aplikacijama kvizalofop-P u poređenju sa ocenom oštećenja od 3,3% do 18,8% biljaka koje sadrže MON-HT1 bez operabilno vezanog CTP.

[0088] Sve transgenske biljke su imale ocene oštećenja iznad 90% na primenu 1X kletodima (0,25 lb ai/acre) primenjenog u V8 fazi rasta, demonstrirajući upotrebu ovog herbicida za volontersku kontrolu u transgenskim biljkama koje sadrže modifikovane proteine.

[0089] U terenskom ispitivanju efikasnosti za toleranciju na 2,4-D, korišćen je jedan od četiri tretmana herbicidima: (1) 2,4-D amin pri 2 lb ae/acre (2X) plus 0,25% v/v nejonski surfaktant (NIS) primenjen u VE do V2, zatim V4, a zatim V8; (2) 2,4-D amin pri 4 lb ae/acre (4X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE na V2, praćen V8; (3) 2,4-D amin pri 8 lb ae/ara (8X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE do V2, zatim V4, zatim V8 kukuruza; ili (4) 2,4-D amin pri 16 lb ae/acre (16X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE do V2, zatim V4, zatim V8. Parcele su vizuelno ocenjene kao gore. U Tabelama 14 i 15 prikazane su prosečne ocene oštećenja nakon primene herbicida u V4 odnosno V8 fazi rasta.

[0090] Biljke koje sadrže MON-HT1 operabilno vezan sa CTP pokazale su veoma dobru toleranciju na 2,4-D sa ocenama oštećenja manjim od 10% i manjim od 17% u svim stopama primene u V4 i V8 fazama rasta. Ovi rezultati ukazuju da su biljke koje sadrže MON-HT1 imale dobru toleranciju na sekvencijalne primene 2,4-D.

Biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno vezanim CTP generalno nisu pokazale značajne razlike u toleranciji na 2,4-D u odnosu na biljke koje sadrže MON-HT1 bez operabilno vezanog CTP kao što je viđeno sa aplikacijom kvizalofop-P. Biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno vezanim CTP imale su 0 do 16,3% ocenu oštećenja u svim aplikacijama 2,4-D u poređenju sa 0 do 13,8% ocene oštećenja biljaka koje sadrže MON-HT 1 bez operabilno vezanog CTP-a.

4

Tabela 14.

Тabela 15

Primer 5: Procena efekta peptida koji targetiraju hloroplast na ekspresiju optimizovanih modifikovanih proteina kukuruza

[0091] Za procenu različitih peptida koji ciljaju hloroplast (CTP) konstruisani su vektori za transformaciju biljaka, od kojih se svaki sastoji od molekula rekombinantne DNK optimizovanog za ekspresiju monokotiledona i kodiranje MON-HT1 (SEQ ID NO:16). Vektori su nastali korišćenjem iste kombinacije promotora, lidera, introna i 3'UTR, ali sa jednim od tri odvojena CTP (A, B ili C) ili bez CTP operabilno vezanog sa sekvencom koja kodira protein. Vidi Tabelu 16. Konstrukti DNK su korišćeni za transformaciju nezrelih embriona kukuruza (LH244) koristeći Agrobacterium tumifaciens i standardne metode poznate u stanju tehnike. Regenerisane R0 transgenske sadnice uzgajane su u stakleniku. Biljke R0 generišu R1 homozigotno seme. Biljke R0 su takođe korišćene kao mužjaci za ukrštanje sa biljkama koje sadrže događaj MON89034 kukuruza za generisanje segregacionog F1 hibridnog semena za terenska ispitivanja efikasnosti osobina.

[0092] Odvojena terenska ispitivanja efikasnosti osobina za kvizalofop-P i 2,4-D sprovedena su na dve lokacije, svaka sa homozigotnim samooplodnim transgenskim biljkama (R2 ili R4 generacija). U ovim terenskim ispitivanjima primenjen je jedan od dva herbicidna tretmana: (1) kvizalofop-P (Assure II) pri 0,16 lb ai/acre (2X) plus 0,25% v/v nejonskog surfaktanta (NIS) primenjenog u V4 fazi rasta, zatim istim u V8 fazi rasta; ili (2) 2,4-D amin pri 2 lb ae/acre (2X) plus 0,25% v/v nejonskog surfaktanta (NIS) primenjenog u V4, zatim V8. Ocene oštećenja (procenat oštećenja useva pri V4 (CIPV4) ili V8 (CIPV8)) su uzete 10 do 14 dana nakon primene V4 i V8. Greška je izračunata korišćenjem LSD (0,05). Rezultati su pokazali da su ove biljke imale toleranciju na 2X sekvencijalne aplikacije bilo kvizalofop-P ili 2,4-D sa ocenama oštećenja ispod 10% nakon V4 i V8 aplikacija. Vidi tabelu 16.

Tabela 16.

[0093] Uzorci listova su prikupljeni iz biljaka koje sadrže transgenske kasete koje kodiraju MON-HT1 sa i bez CTP sekvenci kako bi se utvrdila ekspresija mRNK transkribovane iz transgenske kasete koja kodira modifikovane proteine. Kvantigen<®>analiza je urađena na ekstraktima uzorka lista kako bi se odredila mRNK ekspresija transgenske kasete. Za ove testove, sonda je bila slična uobičajenoj 3'UTR sekvenci prisutnoj u svakoj ekspresionoj kaseti koja se koristi za generisanje transgenskih biljaka. Relativna ekspresija je izračunata normalizacijom na domaćinske gene kukuruza. Uzorak listova je prikupljen iz svake od osam biljaka za svaku konfiguraciju konstrukta koja se koristi za pravljenje transgenskih biljaka, a prijavljeni relativni podaci o ekspresiji mRNK su prosek od osam uzoraka sa standardnom greškom.

[0094] Biljke koje sadrže transgenski konstrukt koji kodira MON-HT 1 (SEQ ID NO:14) imala su višu relativnu transgensku mRNK ekspresiju za konstrukte koji sadrže ili 'A' ili 'B' CTP nego za konstrukte bez CTP ili sa 'C' CTP. Vidi tabelu 17.

Tabela 17.

[0095] Odvojena terenska ispitivanja efikasnosti osobina za skrining pritiska kvizalofop-P i 2,4-D sprovedena su na jednoj lokaciji, svaka sa F1 hibridnim transgenskim biljkama proizvedenim ukrštanjem biljke koja sadrži događaj MON89034 kukuruza sa biljkom R1 koja sadrži MON-HT1 sa i bez operabilno vezanih CTP sekvenci. Kao kontrola korišćene su transgenske F1 hibridne biljke koje sadrže događaje NK603 x MON89034 kukuruza.

[0096] U terenskom ispitivanju efikasnosti osobina za toleranciju na kvizalofop-P, korišćen je jedan od tri tretmana herbicidima: (1) kvizalofop-P (Assure II) pri 0,32 lb ai/acre (4X) plus 0,25% v/v nejonski surfaktant (NIS) primenjen u VE-V2 fazi rasta, zatim isti u V4 fazi rasta, zatim isti u V8 fazi rasta; (2) kvizalofop-P pri 0,64 lb ai/acre (8X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE-V2 fazi rasta, zatim isti u V4 fazi rasta, zatim isti u V8 fazi rasta; ili (3) kvizalofop-P pri 1,28 lb ai/acre (16X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE-V2 fazi rasta, zatim isti u V4 fazi rasta, a zatim isti u V8 fazi rasta. Parcele su vizuelno ocenjene kao prethodno. Tabela 18 prikazuje prosečne ocene oštećenja nakon primene herbicida u V4 (CIPV4) odnosno V8 (CIPV8) fazi rasta. Ocena oštećenja za kontrolne biljke nakon svih primena kvizalofop-P bila je 100%. Greška je izračunata korišćenjem LSD (0,05).

Tabela 18.

[0097] Biljke koje sadrže MON-HT 1 sa bilo kojim od tri operabilno povezana CTP (A, B ili C) imala su bolju toleranciju na kvizalofop-P od biljaka koje sadrže MON-HT 1 bez operabilno povezanog CTP. Biljke koje sadrže MON-HT 1 sa operabilno povezanim 'A' CTP imale su 0 do 15% ocene oštećenja u svim aplikacijama kvizalofop-P. Biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno povezanim 'B' CTP imale su ocenu od 2,5% do 20% za oštećenja u svim aplikacijama kvizalofop-P. Biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno povezanim CTP 'C' imale su ocenu oštećenja od 0 do 20% u svim aplikacijama kvizalofop-P u poređenju sa biljkama koje sadrže MON-HT1 bez operabilno povezanog CTP koji je imao ocenu oštećenja od 2,5% do 37,5% u svim aplikacijama kvizalofop-P.

[0098] Biljke koje sadrže MON-HT1 sa bilo kojim od tri operabilno povezana CTP imale su bolju toleranciju na kvizalofop-P od biljaka koja sadrže MON-HT8 sa bilo kojim od tri operabilno povezana CTP. Pri najvišoj stopi (16X) primene kvizalofopa, biljke koje sadrže MON-HT1 sa operabilno povezanim CTP 'A' imale su nešto veću toleranciju od biljaka koje sadrže MON-HT1 sa operabilno povezanim CTP 'B' ili 'C'.

[0099] U terenskom ispitivanju efikasnosti svojstava primenjena su tri herbicidna tretmana za toleranciju na 2,4-D: (1) 2,4-D amin pri 4 lb ae/acre (4X) plus 0,25% v/v NIS primenjen na VE-V2, zatim V4, pa V8; (2) 2,4-D amin pri 8 lb ae/acre (8X) plus 0,25% v/v NIS primenjen u VE-V2, pa V8 kukuruz; ili (3) 2,4-D amin pri 16 lb ae/acre (16X) plus 0,25% v/v NIS primenjen na VE-V2, pa V4, pa V8. Parcele su vizuelno ocenjene kao prethodno.

[0100] Tabela 19 prikazuje prosečne ocene oštećenja na kukuruzu nakon primene 2,4-D herbicida u V4 (CIPV4), odnosno V8 (CIPV8) fazi rasta. Ocena oštećenja za kontrolne biljke nakon svih primena 2,4-D kretala se od 80% do 96,25%. Pri najvišoj stopi 2,4-D (16x) primenjenoj u V8, biljke koje sadrže MON-HT 1 operabilno povezan sa bilo kojim od tri CTP (A, B ili C) imale su bolju toleranciju od biljaka koje sadrže MON-HT1 koji nije operabilno povezan sa CTP. Biljke koje sadrže MON-HT1 sa ili bez operabilno povezanog CTP imale su bolju toleranciju na 2,4-D u svim ispitivanim primenama u poređenju sa biljkama koje sadrže MON-HT9 ili MON-HT10 sa operabilno povezanim 'A' CTP. U opsegu primena 2,4-D relativno rangiranje tolerancije je bilo: biljke koje sadrže MON-HT1 imale su bolju toleranciju od biljaka koje sadrže MON-HT2 koje su zauzvrat bile bolje od biljaka koje sadrže MON-HT8. U skladu sa podacima iz ispitivanja pritiska kvizalofop-P, biljke koje sadrže MON-HT1, MON-HT2 ili MON-HT8 operabilno povezan sa CTP 'A' pokazale su neznatnu matematički, ali ne i statistički značajnu prednost u odnosu na tranzitni peptid 'B' i 'C'. Greška je izračunata korišćenjem LSD (0,05).

Tabela 19

Primer 6: Ekspresija optimizovanih modifikovanih proteina u soji

[0101] Modifikovani proteini su izabrani za analizu u transgenoj soji. Izrađeni su DNK konstrukti za ekspresiju MON-HT 1 (SEQ ID NO:14) sa optimizovanom upotrebom kodona za ekspresiju dikotiledona metodama poznatim onima koji poznaju stanje tehnike.

Poboljšavači, promotori, lideri, introni, CTP i 3'UTR u raznim kombinacijama operabilno su povezani sa modifikovanim proteinima u ovim DNK konstruktima. DNK konstrukti su korišćeni za transformaciju soje koristeći Agrobacterium tumifaciens i standardne metode poznate u stanju tehnike. Regenerisane R0 transgene sadnice uzgajane su u stakleniku.

Otprilike 9 nedelja nakon transformacije u fazi 1-2 trolisnog lista, identifikovani su pojedinačni R0 događaji i prskani sa 2,4-D herbicidom po stopi od 0,5X (0,375 lb ae/acre), 2X (1,5 lb ae/acre) ili 4X (3,0 lb ae/acre). Otprilike 2 nedelje nakon primene herbicida, biljke su ocenjene na oštećenje herbicidom na skali od 1 do 3, gde je 1 = malo do nikakvo oštećenje (<20%), 2 = umereno oštećenje (20-50%) i 3 = teško oštećenje (>50%).

[0102] Biljke R0 soje koje sadrže svaki od konstrukata pokazale su toleranciju na 2,4-D sa malim do nikakvim oštećenjem (<20% oštećenje) ili umerenim oštećenjem (20-50%). Podaci su dati u Tabeli 9. To je ukazivalo na to da modifikovani proteini MON-HT 1 i MON-HT2 mogu da pruže toleranciju na 2,4-D u biljkama soje.

4

Tabela 20

[0103] Pri 2X stopi primene, sojine biljke koje sadrže MON-HT1, pokazale su odličnu toleranciju na 2,4-D tretman, o čemu svedoče sve osim dve pojedinačne kopije biljke sa ocenom oštećenja od <20%. Pri stopi primene od 4X, od jedanaest biljaka u jednoj kopiji koje sadrže MON-HT1, pet biljaka je imalo ocenu oštećenja <20%, a šest biljaka je imalo ocenu oštećenja od 20-50%. Ovi rezultati ukazuju da su biljke soje koje sadrže MON-HT1 (SEQ ID NO:14) imale toleranciju na 2,4-D pri 4X stopi primene. Vidi Tabelu 21.

Tabela 21.

Primer 7: Tolerancija na sintetičke auksine fluroksipir, triklopir i MCPA

[0104] Određena je tolerancija kukuruza i sojinih biljaka koje sadrže MON-HT1 na primene 2,4-D, fluroksipir, triklopir i MCPA. Seme F1 hibridnog kukuruza za tri jedinstvena događaja koji sadrže MON-HT 1 sa semenom soje 'A' CTP i R2 zasađeno je u saksijama. Kao kontrola korišćeno je seme hibridnog kukuruza koje sadrži NK603 x MON89034 i ista sojina germplazma koja se koristi za transformaciju biljaka. Biljke su uzgajane u stakleniku i za svaki tretman su korišćene po četiri biljke. Biljke su prskane herbicidom u komori za rast kada su biljke bile visoke između 6-8 inča (soja) i 10-12 inča (kukuruz), a zatim prenete u staklenik programiran za održavanje optimalnih uslova rasta.

[0105] Za soju je korišćena 2X stopa primene herbicida u svakom od sledećih slučajeva: (1) 2,4-D amin 4 (1680 g ae/ha) (2) triklopir (840 g ae/ha, GARLON<®>); (3) fluroksipir (840 g ae/ha, Starane<®>); ili (4) MCPA (880 g ae/ha). Nakon primene triklopira, fluroksipira ili MCPA, primarna simptomatologija na soji bila je teška nekroza i epinastija. Vizuelne ocene oštećenja biljaka su napravljene za sve tretmane na skali ocena od 0% do 100%, gde je 0% predstavljalo biljke ekvivalentne neobrađenim kontrolama i 100% predstavljalo biljke koje su bile potpuno mrtve. Sve ocene su uzete sedam dana nakon tretmana. Biljke za sva tri događaja soje MON-HT1 pokazale su dobru toleranciju na 2,4-D amin (2,4-D), u proseku manje od 7% oštećenja useva u poređenju sa kontrolama na 90-97% oštećenja useva. Nijedan događaj soje nije pokazao toleranciju na triklopir ili fluroksipir, sa ocenama oštećenja u sva tri događaja u proseku 81-97% oštećenja useva u poređenju sa kontrolama na 91% oštećenja useva. Jedan od tri događaja soje pokazao je nizak nivo tolerancije na MCPA sa prosečnom ocenom oštećenja od 72%, dok su druga dva događaja imala 90% oštećenja useva u poređenju sa kontrolama sa 90% oštećenja. Vidi tabelu 22.

Tabela 22.

[0106] Za kukuruz je korišćena 4X stopa primene herbicida u svakom od sledećih: (1) 2,4-D amin 4 (3360 g ae/ha) (2) triklopir (1680 g ae/ha, GARLON<®>); (3) fluroksipir (1680 g ae/ha, Starane<®>); ili (4) MCPA (3360 g ae/ha). Nakon primene triklopira, fluroksipira ili MCPA na kukuruz, primarna simptomatologija je bila poleganje. Biljke za sva tri događaja MON-HT1 kukuruza tolerisale su 2,4-D u proseku manje od 15% oštećenja u poređenju sa kontrolama od 43% oštećenja useva. Tri MON-HT1 događaja kukuruza pokazala su nizak nivo tolerancije na triklopir sa oštećenjima useva u proseku 26%-37% u poređenju sa kontrolama sa oštećenjima useva od 47%. Tri događaja kukuruza MON-HT1 pokazala su nizak nivo tolerancije na fluroksipir sa oštećenjem useva u proseku od 20%-21% u poređenju sa kontrolama sa oštećenjem useva od 55%. Dva događaja kukuruza MON-HT1 pokazala su dobru toleranciju na MCPA sa prosečnim oštećenjem useva manjim od 6% u poređenju sa kontrolama na 31% oštećenja useva. Treći događaj kukuruza MON-HT1 imao je prosečnu ocenu oštećenja od 20%. Vidi tabelu 23. Ovi rezultati niske tolerancije na triklopir i fluroksipir i dobre tolerancije na MCPA bili su u skladu sa in vitro enzimskim podacima sa prečišćenim enzimom MON-HT1.

Tabela 23.

4

4

4

4

4

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

11

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Molekul rekombinantne DNK koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid SEQ ID NO:14, naznačen time, što navedeni polipeptid daje transgenskoj biljci toleranciju na herbicid.

2. Molekul rekombinantne DNK iz zahteva 1, naznačen time, što je sekvenca nukleinske kiseline izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:15, 16 i 17.

3. Molekul rekombinantne DNK iz zahteva 1, naznačen time, što je molekul rekombinantne DNK iz zahteva 1 operabilno povezan sa heterolognim promotorom koji funkcioniše u biljnoj ćeliji.

4. Molekul rekombinantne DNK iz zahteva 3, naznačen time, što je molekul rekombinantne DNK dalje operabilno povezan sa molekulom DNK koji kodira hloroplast tranzitni peptid.

5. DNK konstrukt koji se sastoji od heterolognog promotora koji funkcioniše u biljnoj ćeliji operabilno povezanoj sa molekulom rekombinantne DNK iz zahteva 1.

6. DNK konstrukt iz zahteva 5, koji se dalje sastoji od DNK molekula koji kodira hloroplast tranzitni peptid operabilno povezan sa molekulom rekombinantne DNK.

7. DNK konstrukt iz zahteva 5, naznačen time, što je DNK konstrukt prisutan u genomu transgenske biljke.

8. Biljka, seme, biljno tkivo, biljni deo ili ćelija koja se sastoji od molekula rekombinantne DNK iz zahteva 1.

9. Biljka, seme, biljno tkivo, biljni deo ili ćelija iz zahteva 8, naznačen time, što biljka, seme, biljno tkivo, biljni deo ili ćelija obuhvata toleranciju na najmanje jedan herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

10. Biljka, seme, biljno tkivo, biljni deo ili ćelija koja se sastoji od DNK konstrukta iz zahteva 5.

11. Biljka, seme, biljno tkivo, biljni deo ili ćelija koja se sastoji od polipeptida kodiranog molekulom rekombinantne DNK iz zahteva 1.

12. Polipeptid SEQ ID NO:14, naznačen time, što navedeni polipeptid daje transgenskoj biljci toleranciju na herbicid.

13. Polipeptid iz zahteva 12, naznačen time, što polipeptid ima aktivnost oksigenaze protiv najmanje jednog herbicida izabranog iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

14. Metoda za davanje tolerancije na herbicida biljci, semenu, ćeliji ili biljnom delu, koja obuhvata ekspresiju polipeptida iz zahteva 12 u pomenutoj biljci, semenu, ćeliji ili biljnom delu.

15. Metoda iz zahteva 14, naznačena time, što navedena biljka, seme, ćelija ili biljni deo obuhvata DNK konstrukt koji se sastoji od heterolognog promotora koji funkcioniše u biljnoj ćeliji koja je operabilno povezana sa molekulom rekombinantne DNK, koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid SEQ ID NO:14.

16. Metoda iz zahteva 14, naznačena time, što biljka, seme, ćelija ili biljni deo obuhvata toleranciju na najmanje jedan herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od AOPP herbicida, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

17. Metoda za proizvodnju transgenske biljke tolerantne na herbicid, koja se sastoji od transformacije biljne ćelije ili tkiva sa molekulom rekombinantne DNK koji se sastoji od sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja se sastoji od:

a) sekvence nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiseline SEQ ID NO:14; i

b) sekvence nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:15, 16 i 17.

i regeneracije transgenske biljke tolerantne na herbicid iz transformisane biljne ćelije ili tkiva.

18. Metoda iz zahteva 17, naznačena time, što navedena transgenska biljka tolerantna na herbicide obuhvata toleranciju na najmanje jedan herbicid izabran iz grupe koja se sastoji od herbicida AOPP, herbicida fenoksi kiseline i herbicida piridiniloksi kiseline.

11