JPH0153422B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0153422B2 JPH0153422B2 JP56185646A JP18564681A JPH0153422B2 JP H0153422 B2 JPH0153422 B2 JP H0153422B2 JP 56185646 A JP56185646 A JP 56185646A JP 18564681 A JP18564681 A JP 18564681A JP H0153422 B2 JPH0153422 B2 JP H0153422B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ans
- thyroxine
- luminescence
- hydrogen peroxide
- oxalate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素免疫測定法における新規な定量
方法に関し、更に詳しくは新規な発光反応による
定量方法に関する。
方法に関し、更に詳しくは新規な発光反応による
定量方法に関する。
抗原抗体反応を利用して、生体内の微量の物質
を定量する方法としては、螢光免疫測定法
（FIA）、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定
法（EIA）など種々の方法が使用されていた。な
かでも高感度で定量できるRIAが広く使用されて
いた。しかしながら、同位元素標識化合物に不安
定なものが多いこと、人体に対する危険性および
環境汚染の立場からその取り扱いが厳しく廃棄が
困難であることなど、問題点が多い。そこで最近
になり、安全性に問題がなく実験室の制約もな
く、また測定に使用される物質も比較的安定で保
存でき、操作も比較的容易であるEIAが注目され
た。とくに、標識として使用される酵素の活性の
測定において、RIAに匹敵する高感度の測定法、
即ち螢光反応や発光反応を利用する方法が開発さ
れるに到り、更に重要視されてきた。その中で
も、発光反応を利用した方法がより感度が高い。
を定量する方法としては、螢光免疫測定法
（FIA）、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定
法（EIA）など種々の方法が使用されていた。な
かでも高感度で定量できるRIAが広く使用されて
いた。しかしながら、同位元素標識化合物に不安
定なものが多いこと、人体に対する危険性および
環境汚染の立場からその取り扱いが厳しく廃棄が
困難であることなど、問題点が多い。そこで最近
になり、安全性に問題がなく実験室の制約もな
く、また測定に使用される物質も比較的安定で保
存でき、操作も比較的容易であるEIAが注目され
た。とくに、標識として使用される酵素の活性の
測定において、RIAに匹敵する高感度の測定法、
即ち螢光反応や発光反応を利用する方法が開発さ
れるに到り、更に重要視されてきた。その中で
も、発光反応を利用した方法がより感度が高い。
従来、発光反応を利用したEIAには、発光物質
としてルミノール、イソルミノールなどが利用さ
れている。一方、生体成分は通常他の蛋白質と結
合している場合が多く、８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルフオン（ANS）によつてこの結合を
切つた後に測定が行なわれることが多い。例えば
サイロキシンT4のEIAにおいて、TBG（サイロイ
ド・バインデイング・グロブリン）ブロツカーと
してANSが用いられるが、洗滌を繰返しても
ANSが残り、この微量に残存するANSのために
酵素活性測定が妨害される。
としてルミノール、イソルミノールなどが利用さ
れている。一方、生体成分は通常他の蛋白質と結
合している場合が多く、８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルフオン（ANS）によつてこの結合を
切つた後に測定が行なわれることが多い。例えば
サイロキシンT4のEIAにおいて、TBG（サイロイ
ド・バインデイング・グロブリン）ブロツカーと
してANSが用いられるが、洗滌を繰返しても
ANSが残り、この微量に残存するANSのために
酵素活性測定が妨害される。
本発明者は、このようなANSの影響をカバー
するような発光物質について種々研究したとこ
ろ、上記ANS自身がパーオキシオギザレート発
光法［アナリテイカ・キミカ・アクタ97巻21頁
（1978年）］の発光物質としても優れた結果を与え
ることを見い出して本発明をなした。
するような発光物質について種々研究したとこ
ろ、上記ANS自身がパーオキシオギザレート発
光法［アナリテイカ・キミカ・アクタ97巻21頁
（1978年）］の発光物質としても優れた結果を与え
ることを見い出して本発明をなした。
本発明に係る酵素免疫測定法の方法は、標識に
使用された酵素によつて発生した過酸化水素をパ
ーオキシオギザレート発光法によつて測定する方
法において、発光物質としてANSを使用するこ
とを特徴とするものである。
使用された酵素によつて発生した過酸化水素をパ
ーオキシオギザレート発光法によつて測定する方
法において、発光物質としてANSを使用するこ
とを特徴とするものである。
本発明に係る測定方法は、酵素反応によつて生
じた過酸化水素を含む溶液に、ANSおよびオギ
ザレートの夫々の溶液を加え、反応混合液よりの
光量をを測定することによつて容易に実施され
る。
じた過酸化水素を含む溶液に、ANSおよびオギ
ザレートの夫々の溶液を加え、反応混合液よりの
光量をを測定することによつて容易に実施され
る。
上記の方法において使用される過酸化水素を含
む溶液とは、標識酵素として過酸化水素を生成す
る各種のオキシダーゼ例えばグルコースオキシダ
ーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼなどをを使用した通常の酵素免疫
法の測定システムによつて得られる過酸化水素を
含む反応液である。ANSは中性または塩基性の
緩衝液、特にPH８〜9.5程度の緩衝液例えばバル
ビツール緩衝液の溶液として使用され、通常血清
アルブミンが添加される。オギザレートとしては
好ましくはビス（２，４，６−トリクロロフエニ
ル）オギザレート（TCPO）が使用され、それら
は有機溶媒例えば酢酸エチル溶液として使用され
る。
む溶液とは、標識酵素として過酸化水素を生成す
る各種のオキシダーゼ例えばグルコースオキシダ
ーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、コレステロー
ルオキシダーゼなどをを使用した通常の酵素免疫
法の測定システムによつて得られる過酸化水素を
含む反応液である。ANSは中性または塩基性の
緩衝液、特にPH８〜9.5程度の緩衝液例えばバル
ビツール緩衝液の溶液として使用され、通常血清
アルブミンが添加される。オギザレートとしては
好ましくはビス（２，４，６−トリクロロフエニ
ル）オギザレート（TCPO）が使用され、それら
は有機溶媒例えば酢酸エチル溶液として使用され
る。
本発明に係る方法は、通常EIAの対象とされる
物質に対して適用することができる。例えばサイ
ロキシンT4、トリヨードサイロニンT3、エスト
リオール、プロゲステロン、コルチゾール、イン
シユリン、HPL、HCG、TSH、α−フエトプロ
テイン、カルチノエンブリオ抗原（CEA）、フエ
リチン、β2−ミクログロブリン、HBsAg、IgG、
IgM、IgA、IgEなどの定量にも使用することが
できる。
物質に対して適用することができる。例えばサイ
ロキシンT4、トリヨードサイロニンT3、エスト
リオール、プロゲステロン、コルチゾール、イン
シユリン、HPL、HCG、TSH、α−フエトプロ
テイン、カルチノエンブリオ抗原（CEA）、フエ
リチン、β2−ミクログロブリン、HBsAg、IgG、
IgM、IgA、IgEなどの定量にも使用することが
できる。
次に、二抗体固相法によるT4の測定に適用し
た実施例をあげて本発明の方法を具体的に説明す
るが、本発明の方法はこれによつて限定されるも
のではない。
た実施例をあげて本発明の方法を具体的に説明す
るが、本発明の方法はこれによつて限定されるも
のではない。
参考例 １
抗サイロキシン血清の調製
カルボジイミド法により、サイロキシンを牛血
清アルブミンBSAに結合し、常法によりウサギ
への免疫により抗体を産生させた（クリニカル・
ケミストリー20巻10号1353頁1974年）。
清アルブミンBSAに結合し、常法によりウサギ
への免疫により抗体を産生させた（クリニカル・
ケミストリー20巻10号1353頁1974年）。
参考例 ２
サイロキシン−グルコースオキシダーゼ結合物
の調製 10ml用ナス型コルベンにサイロキシン遊離酸３
mgを95％ジメチルホルムアミド１mlに溶解し、グ
ルコースオキシダーゼ10mgを含む水溶液１mlを加
え、撹拌し、１％グルタルアルデヒド溶液0.21ml
を加え、室温で２時間反応する。得られた結合物
は0.05Mリン酸緩衝液（PH8.0）に透析し、
Tyopalカラムクロマトグラフイーにより精製し
た。
の調製 10ml用ナス型コルベンにサイロキシン遊離酸３
mgを95％ジメチルホルムアミド１mlに溶解し、グ
ルコースオキシダーゼ10mgを含む水溶液１mlを加
え、撹拌し、１％グルタルアルデヒド溶液0.21ml
を加え、室温で２時間反応する。得られた結合物
は0.05Mリン酸緩衝液（PH8.0）に透析し、
Tyopalカラムクロマトグラフイーにより精製し
た。
実施例
サイロキシンの酵素免疫測定法
ａ イムノアツセイ
ポリスチレンチユーブ（10×75mm）に0.12M
バルビタール緩衝液（PH8.6、0.2％BSA含有）
で希釈した抗サイロキシン血清（×400）溶液
0.1ml、試料（サイロキシン：0.05〜50ng／0.1
ml）水溶液0.1ml、サイロキシン−グルコース
オキシダーゼ結合物（×1000）溶液0.1mlを加
え、次いで精製された家兎のIgGを結合させた
セフアローズゲルを使用したアフイニテイクロ
マトグラフイーにより精製した抗家兎IgG山羊
IgGをコーテイングしたビーズ（ポリスチレン
製：6φ×６mm歯車形）１個を加え、よく撹拌
し、４℃で一夜放置して反応させる。反応液を
吸引除去後、生理食塩水２mlを加えて洗浄し、
吸引除去をを行なう。この操作をさらに２回繰
返した後、酢酸緩衝液（0.01M、PH5.0）に溶
解した0.5Mグルコース溶液0.3mlを加え、室温
で３時間反応させる。
バルビタール緩衝液（PH8.6、0.2％BSA含有）
で希釈した抗サイロキシン血清（×400）溶液
0.1ml、試料（サイロキシン：0.05〜50ng／0.1
ml）水溶液0.1ml、サイロキシン−グルコース
オキシダーゼ結合物（×1000）溶液0.1mlを加
え、次いで精製された家兎のIgGを結合させた
セフアローズゲルを使用したアフイニテイクロ
マトグラフイーにより精製した抗家兎IgG山羊
IgGをコーテイングしたビーズ（ポリスチレン
製：6φ×６mm歯車形）１個を加え、よく撹拌
し、４℃で一夜放置して反応させる。反応液を
吸引除去後、生理食塩水２mlを加えて洗浄し、
吸引除去をを行なう。この操作をさらに２回繰
返した後、酢酸緩衝液（0.01M、PH5.0）に溶
解した0.5Mグルコース溶液0.3mlを加え、室温
で３時間反応させる。
生成した過酸化水素はANS−TCPO系によ
る発光反応により測定する。
る発光反応により測定する。
ｂ 化学発光法
ガラスチユーブ（10φ×75mm）に反応溶液
（生成した過酸化水素）100μ、0.2Mバルビタ
ール緩衝液（PH9.0）に0.02％ANS、0.1％BSA
を含むANS溶液100μ、酢酸エチルに溶解し
たTCPO5mM溶液200μを加え、Photon
Counter（浜松テレビ社製HTV−C767）により
測定した。測定結果が第１図に示されている。
（生成した過酸化水素）100μ、0.2Mバルビタ
ール緩衝液（PH9.0）に0.02％ANS、0.1％BSA
を含むANS溶液100μ、酢酸エチルに溶解し
たTCPO5mM溶液200μを加え、Photon
Counter（浜松テレビ社製HTV−C767）により
測定した。測定結果が第１図に示されている。
第１図はT4の検量線であり、横軸は試料T4の
量、縦軸はT4の添加に伴なう発光強度の相対値
を示す。B0はT4無添加のときの発光強度であり、
ＢはT4を添加したときの発光強度である。
量、縦軸はT4の添加に伴なう発光強度の相対値
を示す。B0はT4無添加のときの発光強度であり、
ＢはT4を添加したときの発光強度である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 標識に使用された酵素によつて発生した過酸
化水素をパーオキシオギザレート発光法によつて
測定する方法において、発光物質として８−アニ
リノ−１−ナフタレンスルフオン酸を使用するこ
とを特徴とする酵素免疫測定法。 ２ パーオキシオギザレート発光法においてオギ
ザレートとしてビス（２，４，６−トリクロロフ
エニル）オギザレートを使用する特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３ 標識に使用される酵素がグルコースオキシダ
ーゼである特許請求の範囲第１項乃至第２項記載
の方法。 ４ 測定される対象が生体内に存在する低分子化
合物および高分子化合物の中より選択された一種
である特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ
か一項に記載の方法。 ５ 測定される対象がサイロキシンである特許請
求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項に記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18564681A JPS5886458A (ja) | 1981-11-19 | 1981-11-19 | 酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18564681A JPS5886458A (ja) | 1981-11-19 | 1981-11-19 | 酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5886458A JPS5886458A (ja) | 1983-05-24 |
| JPH0153422B2 true JPH0153422B2 (ja) | 1989-11-14 |
Family
ID=16174407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18564681A Granted JPS5886458A (ja) | 1981-11-19 | 1981-11-19 | 酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5886458A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5737261A (en) * | 1980-08-15 | 1982-03-01 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | Measuring method of physiological active substance |
-
1981
- 1981-11-19 JP JP18564681A patent/JPS5886458A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5886458A (ja) | 1983-05-24 |
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