JPS5886458A - 酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素免疫測定法における新規な定量方法に関
し、更に詳しくは新規な発光反応による定量方法に関す
る。

抗原抗体反応を利用して、生体内の微量の物質管定量す
る方法としては、螢光免疫側定法（ｙｘム）、放射免疫
測定法（ＲＩム）、酵素免疫測定法（ｍエム）など種々
の方法が使用されていた。なかでも高感度で定量できる
Ｒｒムが広（使用されていた。しかしながら、同位元素
標識化合物に不安定なものが多いこと、人体に対する危
険性お１ひ環境汚染の立場からそｏＩＲｎ扱いが厳しく
廃秦が困難であることなど、問題点が多い。そこで最近
になり、安全性に問題がなく実験室の制約もなく、また
測定に使用てれる物質も比較的安定で保存でき、操作も
比較的容易であるＩ工Ａが注目さｎえ。とくに、標識と
して使用される酵素の活性の測定において、Ｒエム　に
匹敵する高感度の測定法、即ち像光反応や発光反応管利
用する方法が開発されるに到９、更に重要視されてき喪
。その中でも、発光反応を利用し良方法がより感度が高
い、。

従来、発光反応管利用したｌエムには、発光物質として
ルイノール、インルイノールなどが利用されている。一
方、生体成分は通常他の蛋肉質と結合している場合が多
り、＄−７エリノー１−ナツメレンスルフオン酸（ムＨ
ａ）によってこの曽會を切った後に測定が行なわｎるこ
とが多い。儒見＃ｆｔイロキシン（〒４）のＩｇＡにお
いて、ｔｗＧ（ｔイロイド・パインディング・グロブリ
ン）ブロッカ−としてム舅８が用いられるが、洗Ｓｔ−
繰返してもＡｌ１が残り、仁の微量に残存するムＭｅの
九めに酵票活性測定か訪書される。

本発明者は、このよりなムＭＥの影響をカバーするよう
な発光物質について種々研究したとζろ、上記ムＩＩＩ
自身がバーオキジオギザレート発光法［アナリテイカ・
キミカ・アク爽ＩＴ＠２１頁（１１Ｆ−年）コの発光物
質としても優れた結果を与えることを見い出して本発明
管なした。

本発明に係る酵素免疫測定の方法は、標識に使用された
酵素によって発生した過酸化水素をパーオキジオギザレ
ート発光法によって測定する方法において、発光物質と
してム夏Ｓを使用することを特徴とするものである。

本発明に係る測定方法は、酵素反応によって生じた過酸
化水素を含む溶液に、ＡＮｌｉおよびオギザレートの夫
々の溶液を加え、反応混合液よりの光量音測定すること
に工って害鳥に実施される。

上記の方法において使用さｎる過酸化水素を含む溶液と
は、＊＊酵索として過酸化水素を生成する各種のすキシ
ダーゼ例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオ
キシダーゼ、コレステロールオキシダーゼなどを使用し
九通常の酵素免疫法の測定システムによって得も】−一
酸化水素を含む反応液である。ムＭｔ３は中性または塩
基性の緩１１１１１　Ｓ４９　Ｋ　ｌ５ｉｔ　＠〜Ｉ４
程度の緩価液例えばバルビッール緩衝液の溶液として使
用され、通常血清アルブインが添加さｎる。オギＶレー
トとしては好ましくはビス（２，４＠−１すＩロロフエ
轟ル）オギずし一ト（Ｔ　ＯＰＯ）が使用域れ、それら
社有機溶媒例えば酢酸エチル溶液として使用域れる。

本発＠に係る方法社、通常ｌエムの対象とされる物質に
対して適用することができる。例えばサイロキシン（テ
、）、トリ画一ドサイロニン（２Ｍ）、エストリオール
、グログステロン、コルチゾール、インシ具リン、ＨＰ
Ｉ１％ＨＯＧ％丁ｓＨα−フェトプロティン、カルチノ
エンプリオ抗ＨＣＯＮム）、ツエリチン、β２−ぜクロ
グロプリ’、ＨＢ＠ＡＩ　、ＸＩｇＣｋ　Ｎ　ＩｇＭ　
％　　ＩｇＡ、ｘｇｍなどの定量に％使用することがで
きる。

次に、二抗体固相法による〒４の測定に適用し水実施例
ｔあげて本発明の方法を具体的に説明するが、本発明の
方法はこれによって限定されるｔのではカい。

参考例１　抗プイロキシン血清の調製 カルボシイイド法により、サイロキシンを牛血清アルブ
ミン（Ｂ日ム）に結合し、常法に１リウナギへの免疫に
より抗体を産生させた（タリエカル・ケイストリー　２
０巻１０号１１１１頁１−１４年）。

参考例２　フィロキシンーグルコースオキシダーぞ結合
物の調製 １０−用ナス型コルベンにサイロキシン遊離酸ｓＭｆＩ
ｔｓｓ＊ジメチルホルムアイド　１−に、溶解し、グル
コースオキシダーゼ　１・Ｖｔ含む水溶液１−を加え、
攪拌し、１−グルタルアルデヒド溶液ｒＬ２１−を加え
、室温で２時間反応する。得らｎた結合物はａ、Ｏ５Ｍ
ＩＪン酸緩衝液（ｇａ、ｅ）に透析し、〒７ｏｐａ１カ
ラムクｃ１マドグラフィーにより精製した。

爽施例　フィロキシンの酵素免疫測定法１、　イムノア
ッセイ ポリスチレンチューブ（１ｏｘ７＠■）に０１２Ｍバに
ビＩ−ル緩１１液（ＸＪＨＩｌ、１．ａ２１Ｂｓム含有
）て希釈しえ抗すイ四キシン血清（Ｘ　４０１１　）溶
液１１−１試料（ナイロキシン＝１０１〜■鳳Ｊｌ／Ｉ
ＬＩＩＩＩＪ）水溶液１１−、プイロキシンーグルコー
スオ中シダーゼ曽合物（ｘｌ＠０）浴液１１−を加え、
次いで精製された家兎のＩｇ（）を結合させた七ツァロ
ーズゲル管使用し次アフィエティ１ｗｘマドグラフィー
により精製した抗家１＠　ｘｇａ山羊ＸｇＧ　ｔＰココ
−ィングしたビーズ（ボ９スチレシ製２・φＸ−曽歯車
形）１債を加え、！＜４１１拌Ｌ％４℃で一夜放置して
反応させる。

屓応液を微開除去後、生坦食埴水２ｊＩ７ｔ−加えて洗
浄し、吸引除去を行なう１．この操作をさらに１回繰返
した螢、酢酸緩衝液（０，０１Ｍ　、　ｐＨ５，＠）に
溶解した＆１Ｍグルコース溶１１２０　ｍ１１７１１）
、ｔ、寓温で３時間反応させる。

生成した過酸化水素はムＩｓ　−ＴＯＰＯ系による発光
反応によ〕測定する。

１、化学発光法 ガラスチェーブ（１０φＸ　Ｔ　５　ｗｍ　）に反応溶
液（生成した過酸化水素）　１００μｔＸ６２Ｍバルビ
タール緩衝液（ｐＨ１ｏ　）　Ｋ　Ｏ，０２％ＡＭＩＥ
Ｉ、　Ｌ１＊Ｂ８ムを含むムＭＢ溶液１０ａＪＪｔ１酢
酸エチルに溶解したＴＯＰＯＳ　ｍＭ溶液２００μ／を
加え、Ｐｈｏｔｏｎｃｏｕｎｔｅｒ　（浜松テレビ社製
ＨＴｖ−ａＴ＠Ｔ）により測定した。測定結果が第１図
に示名ｎている。

ＩＬ！ｌ１ｌＷＩＩＪの簡単な説明 第１図はテ、の検量線であり、横軸は試料テ。

の量、縦軸はＴ４の添加に伴なう発光強度の相対値を示
す。ＢｏＦｉ　Ｔ４無添加のときの発光強度であり、Ｂ
はＴ４を添加したときの発光強度である。

特許出願人　三共株式会社 代理人弁理士　　樫　出　□庄　治

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）＠−に使用さｎた酵素によって発生し九過酸化水嵩
   をパーオキシオギダレート発光法によってａ＋＊する方
   法ＫｊｌＰいて、発光物質として一轡ア墨９ノー１−ナ
   フタレンスルフォン酸ｔＩ！周すゐことｔ４１徽とする
   酵素免疫測定法。 りパーオキシオギ望し−ト発光法においてオギダレート
   としてビス（λ４．＠−ト９１ｃ１０フエ墨ル）オギ望
   レートを使用する特許請求の範Ｓ墜１項記ｌ！Ｏ方法。 ３）　標識に１１！！用６れる酵素がダルコースオキシ
   メーゼ″ｅ６Ｊｂ４１許請求の範囲第１項乃至第２項記
   ｍｅ、ｉｓｉ。 ４）一定量れる対象が生体内に存在する低分子化合物お
   よび高分子化合物の中より選択された一種である特許請
   求の範囲第１項乃至第３項記載の方法。 Ｓ）測定される対象がサイロキシンである特許請求の範
   囲第１項乃至第３項記載の方法。