JPH0153650B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （発明の分野） この発明は人体使用のための新規な抗凝固因子
を必須成分とする抗血液凝固剤の提供に関し、ま
たこれをその目的に有する。この発明の特別な目
的は抗トロンビンおよびヘパリンが適用されると
ころの新規なレクチン含有水不溶性ゲル基盤を用
いて大量に抗トロンビン―高活性ヘパリン複合体
を製造することにある。この発明の他の目的は以
下の記述から明らかになるであろう。以下の記述
において、部およびパーセントは他に特別の指示
がない限り重量になる。

（従来技術の記述） ヘパリンはウロン酸、グルコサミンおよび硫酸
塩部分を有するグリコサミノグリカンである。グ
リコサミノグリカンは阻子剤の抗トロンビンと結
合し、またこの阻止剤が凝固機構のセリンプロテ
アーゼを中和する速度を促進することによつて血
液の抗凝固因子として作用する。

分画されないヘパリン単独の注射（静脈内また
は皮下のどちらでも）は緊急の患者における凝固
形成の防止およびトロンボエムボリズムの処置の
ために日常的に用いられる。これらの目的のため
のその広範で且つ生長する用途にもかかわらず、
副作用および効能に関する問題が指摘された。こ
の抗凝固因子療法に関する問題の若干のものは次
のとおりである。

(1) 患者は屡々服用されたヘパリンに対して広い
範囲の薬用量反応（dose response）を示す。
これはむしろ特記された処置手段および結果と
して生じた凝固特性の定常的な監視を必要とす
る。所望の薬用量は、屡々過剰のヘパリンの中
和に必要である量を超過する。

(2) 臨床的に用いられるヘパリンは、抗凝固因子
としては約30％活性である（トロンビンおよび
他の凝固プロテアーゼの急速な阻害をもたらす
抗トロンビンと相互に作用するためのその能力
によつて定義されたもの）、服用されたヘパリ
ンの大部分（70％）は抗トロンビンに対する親
和性を示さないが好ましくない結果とともに他
の多くの血漿タン白質と相互に反応しうる。こ
の現象の最良の例は循環するトリグリセライド
を片付けるリポタン白リパーゼの活性化であ
る。

(3) ヘパリンは高度に荷電したポリアニオンであ
り、血漿タン白質、血液細胞および内皮表面と
非特定の静電的な相互反応をすることができ
る。注射においてヘパリンはこれらの構成要素
の中に分布される。抗トロンビンは特定の形で
また高い親和性をもつて、ヘパリン全体の活性
画分に結合するけれども、抗凝固因子のすべて
のヘパリンが血漿トロンビンに結合することは
ありそうにない。かくしてヘパリン療法の間に
受入れられたヘパリンの実際上の抗凝固因子の
薬用量は、形成されかつ生じたヘパリン―抗ト
ロンビン複合体の量を減少する何度もの平衡の
複合作用である。

(4) ヘパリンは、血小板との相互作用による血小
板減少症の原因として長期間の抗凝固因子療法
を経験する患者と関係してきた。

(5) 循環している抗凝固因子のレベルは、ヘパリ
ンの長期間の服用の結果として減少して示され
る。このようにして低下された抗トロンビンの
レベルは処置が終つてから数日の間は低下した
ままであると報告される。これは血栓症にかか
りやすくなつた患者にとつて特に好ましくない
結果でありうる。

(6) 先天的に抗トロンビン欠乏を有する患者に
は、ヘパリンの投与は全く効果がない。

抗トロンビンの投与は、また緊急の患者におけ
る好ましくない凝固形成を抑制する手段であると
提案されてきた。この療法から最大の利益を得た
者は、或る種の外科的処置を経験している個々の
者と同様に抗トロンビンに先天的に欠乏している
者であろう。このタイプの効果的であるべき療法
のために、非常に多量の抗トロンビンが必要にな
るだろう。また抗トロンビン濃縮物による先天的
な抗トロンビン欠乏症の処置は、抗トロンビンの
血漿半減期が約３日であるために頻度の高い服用
量において、多量のタン白質を必要とする。ヘパ
リンを高い活性と低い活性をもつ構成成分に分画
することは、活性は連鎖を有するヘパリン種が不
活性な連鎖を有するものと事実上区別できないが
ゆえに、困難である。しかしながら、抗トロンビ
ン―ヘパリン補因子（cofactor）と混合されたヘ
パリンのシヨ糖密度傾斜遠心分離（sucrose
density gradient centrifugation）によつて、ヘ
パリンを高活性の構成成分と低活性のものに分離
された。（Lam et al.Biochemical and
Biophysicel Research Communications.1976年
第69巻、第２号第570〜577頁）ヘパリンはまた固
定化された抗トロンビン上の新和性クロマトグラ
フイーによつて分画された。（Ho″o″k et al、
FEBS Letter、1976年第66巻、第90―93頁）こ
の方法において、抗トロンビンはシアノーゲンブ
ロミドで活性化され、水不溶性の基盤、たとえば
セフアデツクス 、セフアローズ などのごとき
ものと共有結合的に結合される。ヘパリンは固定
化された抗トロンビン物質に適用され、このもの
は高活性のヘパリン種を吸着する。低活性のヘパ
リン成分から吸着された高活性成分を含む基盤の
分離後に、高活性のヘパリン種をそれから溶離す
るために、その基盤は高い塩の媒質（high salt
medium）によつて処理される。

代替的な方法は、セフアデツクス R100上の
ゲルクロマトグラフイーによる末結合のヘパリン
からヘパリン―抗トロンビン複合体の分離を包含
する。しかしながら、商業的なヘパリン製剤に固
有の粒子不均一性およびヘパリン自身の結果的に
広いクロマトグラフ的プロフイルによつて、上記
の方法は、ヘパリン―抗トロンビン複合体の分離
を許容するために、定義された分子量を有するヘ
パリン画分を用いなければならない。これは6000
ダルトンの平均分子量を有する低分子量ヘパリン
によつて達成された。（Rosenberg et al、Proc.
Nat.Acad.Sci.1978年第75巻、第７号、第3065〜
3069頁）この場合、ヘパリン―抗トロンビン複合
体は、最初のゲルクロマトグラフの段階で遊離の
ヘパリンから分離され、そして複合体を崩壊させ
るために高い塩の存在において第２のクロマトグ
ラフイーにかけられた。この連続法において得ら
れた高度の親和力をもつヘパリンは96単位／mgを
有する当初の混合物に比べて約360単位／mgの抗
凝固因子の比活性を有していた。出発物質の反覆
的な処理によつて４単位／mgの低い親和力のヘパ
リン混合物が得られた。

セフアデツクス G100上のゲルクロマトグラ
フイーによつて、抗トロンビンと高分子量高親和
性のヘパリンの複合体がつくられた。
（Rosenberg et al、B.B.R.C.1979年第86巻．第
４号．第1319―1324頁）この例において、含有さ
れる比率の分析的な特徴ずけの目的のために過剰
の抗トロンビンから複合体が分離され、またその
サイズと活性のために予じめ分画されたヘパリン
種の使用を必要とした。上述のすべての方法にお
いて工業が直面する最大の問題は分画または調整
が実験室的な規模において達成されただけという
ことである。換言すれば、大規模の製造または薬
剤的に有用な量の製造は方法に固有の制限または
抗トロンビンの制限された利用性のどちらかのた
めに実現されなかつた。抗トロンビンと高活性の
ヘパリンを薬剤的に有用な量で含み、本質的に低
活性のヘパリンを含まず、高活性ヘパリンの分子
量がサイズにより分画されていないヘパリンの典
型である組成物は先行技術では得られなかつた。

ヘパリンを高活性と低活性の構成成分に分画す
ることは水不溶性の基盤に結合する抗トロンビン
が、抗トロンビンの実質的および全体の分解なし
に得られないという事実によつてさらに複雑なも
のになる。これは抗トロンビンが、たとえばシア
ノーゲンブロミドのカプリング法によつて基盤と
結合され、その結合を切り離すのに必要な条件は
抗トロンビンを破壊するがゆえにもたらされる。

最近、上皮生長因子―ウロガストロン
（urogastrone）（EGF−URO）の受容体のごと
き可溶化された膜の受容体に対する配位子の結合
の測定のための新しい方法がNexco et al、J.
Biol.Chem.1979年第254巻、第18号第8740―8743
頁によつて記述される。先ず可溶性の受容体がレ
クチン―アガローズのビーズ上に固定化され、そ
して配位子結合がビーズに結合した受容体上で測
定される。可溶化された受容体のクロマトグラフ
的および結合の性質は、受容体の配位子の認知性
の回復のために研究されることができる。可溶化
された受容体がレクチン―アガローズ上に固定化
された後は、EGF−UROのをごとき、固定化さ
れた受容体に対する配位子の結合は、急速、可逆
的、ペプチド特定的であり、また高い親和力を有
する。著者は彼の方法は炭水化物を含まない配位
子を認知する受容体の研究のために考慮する価値
があると述べる。

〔発明の要約〕

私は、抗トロンビンと高活性ヘパリンの複合体
がその複合体をレクチン含有の水不溶性の基盤の
上に可逆的に固定化することによつてつくられる
ことを見出した。抗トロンビンは、先ず最初に基
盤に可逆的に結合され、その次にヘパリンの高活
性成分が結合される。低活性および非結合のヘパ
リンは基盤から選択的に分離される。その後に基
盤を処理することによつて上記の複合体を与え
る。抗トロンビンおよびヘパリンを混合物の形で
基盤に適用することができるが、また抗トロンビ
ンが最初に適用され、ヘパリンがそれに続くこと
もできる。このようにしてつくられた抗トロンビ
ン―高活性ヘパリン複合体は抗凝固因子として人
体に使用するのに適するこれまでに、たとえば抗
凝固因子の如き治療薬として抗トロンビン―ヘパ
リン複合体を用いることはその技術において公知
であつたことは注目されるべきである。

この発明の第１の利点は抗トロンビン―ヘパリ
ン複合体が、治療の使用のために迅速かつ簡単な
方法によつて大量につくられうることである。か
くして、価値のある治療薬は今や薬剤的に有用な
量において入手しうる。かかる薬剤およびその使
用は従来技術において未知である。この発明の抗
トロンビン―ヘパリン複合体は、この複合体がヘ
パリンの高活性成分のみを含むがゆえに、高度に
効能のある薬剤である。基盤から抗トロンビン高
活性ヘパリン種の溶離に先立つて、低活性ヘパリ
ン種が除去される。

〔好ましい具体例の記述〕

次の記述において、強調は抗トロンビン―
HAH複合体の製造に向けられる。レクチン含有
水不溶性基盤は水不溶性の重合された材料とレク
チンからつくられる。水不溶性の重合された材料
として、レクチンが結合されうるいかなる材料で
も使用することができる。かくして架橋されたデ
キストラン、架橋されたアガロースなどは実施例
の方法により限定なく使用することができる。た
とえば、アガロースまたはセフアロース 4Bま
たはその類似物を使用することができる。レクチ
ンはCuatecasas、J.Biol.Chem、1970年第245巻
第30593065頁により記述された方法を用いてシア
ノ−ゲンブロミドまたはその類似物によつて基盤
に共有結合的に結合される。この発明の基盤をつ
くるために、レクチンを水不溶性の基盤に共有的
に付着させる方法は使用できることが注目される
べきである。

レクチンは非免疫性起源の炭水化物結合タン白
質であつて、このものは細胞を膠着させおよび／
または複合体の炭水化物を沈でんさせ、また通常
植物の種子から単離される。ヘパリンを分画する
ための基盤をつくるのに好適なレクチンはコンカ
カナバリンＡ（Concanavalin Ａ）である。しか
しながら他のＤ―マンノース（Ｄ―グルコース）
−結合レクチンは、たとえばGoldstein et al、
Advances in Carbohydrate Chemistry and
Biochemistry1978年、第35巻、第334−335頁に
よつて記述されたものの如く使用できる。

レクチン含有水不溶性の基盤は抗トロンビンと
混合される。抗トロンビンは基盤上、特に基盤上
のレクチンに結合される。好適ではあるが任意的
である予備的な段階において、レクチン含有水不
溶性基盤は以下に用いられるのと同じ緩衝液とし
て一般的に特徴ずけられる適当な緩衝液中で平衡
される。この中で抗トロンビンとヘパリンの混合
物が基盤に適用される。この緩衝剤は0.25Mより
も大きくないヘパリン、好ましくは生理的濃度
（0.15M）の塩化ナトリウムを含み、６から8.5の
範囲のPHを有する。平衡は約0.1〜２時間の間、
約５―30℃の温度において行われる。

レクチン含有水不溶性基盤が平衡された後、こ
のものは、純品であつてもよく、またレクチンと
結合しないであろうところのタン白質との混合物
であつてもよい抗トロンビンと、得られた系が高
活性ヘパリン（HAH）を含むような量における
過剰のヘパリンとともに混合される。通常、約50
―100部の基盤が１部の抗トロンビンと混合され
る。１部の抗トロンビン当り約１―100部、好ま
しくは４―20部の分画されないヘパリンが用いら
れることが過剰のヘパリンを意味する。

抗トロンビン、ヘパリンおよびレクチン含有水
不溶性基盤の混合物は抗トロンビンが基盤のレク
チン部分に結合することを許容するのに充分な時
間と温度での接触において保持される。この時間
の間、HAHは抗トロンビンに対して複合体化さ
れる。かくして、抗トロンビン、ヘパリンおよび
基盤の混合物は約0.1―２時間の期間、系と両立
しうる温度、通常、約５―30℃の温度に保持され
る。一般的に抗トロンビンとヘパリンは適当な緩
衝液、好ましくはレクチン含有水不溶性基盤の上
記の平衡に用いられた緩衝系中の溶液の中にあ
り、またその溶液はレクチン含有基盤のベツドま
たたはカラムに適用される。

次に基盤は洗浄され、未結合ヘパリンを除去す
る。洗浄液は基盤からすべての未結合ヘパリンを
除去するのに充分であるが、抗トロンビン―
HAH複合体を除去するのに不充分なイオン強
度、好ましは約0.1〜0.4のイオン強度を有する生
理的に受入可能の塩を含むべきである。洗浄液の
PHは約6.0―8.5であるべきである。

この発明のこの局面によつて適当な水溶液は、
実施例によるが限定されないものであつて、PHが
6.0―8.5における0.1―0.4M塩化ナトリウム（イ
オン強度：0.1―0.4）である。0.1よりも少ないイ
オン強度は避けるべきである。低いイオン強度は
レクチンとヘパリン自身の間の非特定的な相互作
用を促進する。低温度は、かかる温度がまた上記
の相互作用を促進するので避けられるべきであ
る。かくして、複合体の製造は５℃よりも大きい
温度、好ましくは20―30℃の範囲の温度のうち、
および37℃よりも大きくないものにおいて行われ
るべきである。一般的に温度とイオン強度は選択
的な複合体の形成のために必要とされる適当な結
合を達成するように調整される。ここでは、より
高温は上記範囲内のより低いイオン強度を必要と
する。

一般的に基盤は、公知方法により測定されたと
き洗浄液中に未結合ヘパリンが現われなくなるま
で、洗浄される。

上に記述されたように、未結合ヘパリンについ
てはぎ取られている基盤は、基盤を、基盤から複
合体を置き換えるための能力を有する炭水化物の
溶液と接触させることによつて、抗トロンビン―
HAH複合体を分離するために処理される。溶液
中の炭水化物の濃度および溶液のPHは、基盤から
複合体の分離を生じさせるのに充分であるべきで
ある。一般的にPH６―8.5における炭水化物の約
0.02〜0.5M水溶液が、抗トロンビンが基盤から
除去されるまで適用される。炭水化物として、グ
ルコピラノシド、マンノピラノシドおよびフラク
トフラノシドのごとき、Goldstein et al、（前
掲）により開示されたそれらの炭水化物を用いる
ことができる。モノ―およびジサツカライドはま
た基盤から複合体を分離するために用いられ、そ
してこれらのものはこの特別な段階において好ま
しく。かくして、実施例によるが限定されるもの
でない、グルコース、マルトース、マンノース、
ガラクトース、フラクトース、ラクトース、シユ
ークロースおよび類似物を用いることができる。
上記の複合体を分離するためにマニトール、ソル
ビトールおよび類似物のごとき糖アルコールを用
いることはこの発明の限界の中にある。

複合体の分離の後、溶離された溶液は透析、透
析過などのごとき型通りの手段によつてその炭
水化物濃度を減少するように処理され、そしてそ
の後使用のための条件にそれを置くように加工さ
れる。一般的に溶離液はまた濃縮され、すなわ
ち、その生物学的活性を実質的に減少させること
なく生物学的に活性なタン白質から水を除去する
ための公知方法によりその水含量を減少させるよ
うに処理される。濃縮物は型通りの方法により殺
菌され、殺菌的に過され、そしてそれらを非肝
炎感染にするように処理される。

抗トロンビン―HAH複合体濃縮物は製薬的製
剤に処方されうる。「製薬的製剤」の用語は、治
療目的、試薬の目的、診断の目的、組織培養の目
的などが用いられる製剤を含むようにここでは広
範な感覚を意図する。治療の使用を意図する製薬
的製剤は複合体の療法的な量、すなわち予防的ま
たは病気に効く健康処置のために必要な量を含む
べきである。製薬的製剤が試薬として用いられる
べきであるときはそれは複合体の試薬量を含むべ
きである。同様に製薬的製剤を組織培養または培
養基として用いるときは製薬的製剤は所望の生育
を得るために充分な量の複合体を含むべきであ
る。この発明によつてつくられた抗トロンビン―
HAH複合体を含む組成物が薬剤的に有用な量の
複合体を含むことはこの組成物の特徴である。先
に述べたとおり、抗トロンビン―ヘパリン複合体
は、ゲルクロマトグラフイーによるヘパリンの実
験室的規模における中間体としてのみにつくられ
た。したがつて薬剤的に有用な量の複合体を含む
組成物はこのために未知であつた。さらにゲルク
ロマトグラフイーを用いる上記のヘパリンの製造
においてヘパリンは使用に先立つてサイズによつ
て必要的に分別されねばならなかつた。また重量
によつてのみ分画されたヘパリンが用いられた。
この発明の複合体における高活性ヘパリンの分子
量はサイズによつて分画されないヘパリン、すな
わち、予じめサイズにより分画されないヘパリン
に由来する代表的なものである。この発明の複合
体が本質的に低活性のヘパリンを含まず、また複
合体中の高活性ヘパリンの活性が約300単位／mg
よりも大きく、通常約400〜750単位／mgの範囲内
にあることは注目すべきことである。

静脈内投与のための組成物をつくるために、そ
の組成物は塩化ナトリウム、シヨ糖および類似物
のごとき生理的に両立しうる物質を生理的に両立
しうる濃度において含み、生理的条件と両立しう
る緩衝されたPHを有する水中において通常構成さ
れる。一般に静脈的に投与される組成物のための
指針は政府の規制により確立される。

現在流通するヘパリンについての多くの問題と
制限は循環する抗トロンビンによつてつくられた
ヘパリンの不適当なレベルからもたらされている
ようだから、予じめつくられたHAH―抗トロン
ビン複合体の投与はこの問題を解決する。かくし
て得られたHAH―抗トロンビン複合体のレベル
は、単独で投与されたヘパリンの完全な抗凝固因
子のしぼり出しを通常妨げる多くの平衡の条件に
したがわないであろう。さらに付加的なヘパリン
は抗トロンビンに結合する以外に与えられないか
ら、ヘパリンと他の血漿成分との相互作用に由来
する副作用が大きく消滅するであろうことが期待
されるべきである。増大された効能とそれに伴う
必要とされる低下されたヘパリンの服用量に加え
て、HAH―抗トロンビン投与の薬用量反応
（dose response）の特性は、現在の方法による
よりもずつと予言できることが期待される。

２つの利益が適合する。第１に、循環する抗ト
ロンビンのレベルは、恐らくは外生的にのみ加え
られた抗トロンビンはHAHと複合体化されるべ
きであり、かくして急速にさばけるので（ヘパリ
ンは90分にすぎない循環の半減期を有する）、こ
の抗トロンビン療法の結果として減少されるべき
でない。第２に、HAHにより複合体化された抗
トロンビンは先天的な抗トロンビン欠乏者に利益
的であるべきである。この者にとつて、通常の循
環するレベルへの完全な回復は経済的に困難であ
りまたヘパリン単独の投与は効果がない。

上記からヘパリンの不存在下に、平衡化された
レクチン含有水不溶性基盤上に抗トロンビンを最
初に可逆的に固定化することおよびこの基盤を複
合体をつくるために使用することはこの発明の範
囲内にある。かくして、基盤は、純粋であつても
よくまたは基盤上のレクチンに結合しない他のタ
ン白との混合物であつてもよい抗トロンビンと、
得られた系が抗トロンビン―HAH複合体をつく
るような量において混合されうる。通常、50―
1000部の基盤が１部の抗トロンビンと混合され
る。抗トロンビンを基盤に結合するための反応条
件はヘパリンが存在するとき上に述べたそれらと
同じである。抗トロンビン溶液（上述のように適
当な緩衝系にある）が基盤のベツドまたはカラム
に適用される場合、抗トロンビンと結合した基盤
は抗トロンビン溶液からそれを分離するために処
理される。これは過、傾斜および類似の手段の
ごとき技術において公知である手法により達成さ
れる。

次に基盤は、残留する抗トロンビン溶液および
基盤に結合されない不純物を除去するために洗浄
される。好ましくは、洗浄溶液は平衡段階におけ
る上述の同じ緩衝溶液である。

抗トロンビンが基盤上のレクチンを通じてそれ
に可逆的に結合されることは、上記の系の特徴で
ある。抗トロンビンはそれに固定化するのに充分
ではあるが基盤からその除去の際に抗トロンビン
の破壊を起させるには充分に大きくない程度に結
合される。かくして抗トロンビンはレクチン含有
基盤に非破壊的に離脱できるように結合される。
この可逆的な結合の正確な性質はわからない。し
かしながら水素結合と荷電双極子
（chargedipole）は含まれるようである。

この発明のこの具体例における次の段階におい
て、ヘパリンは抗トロンビン含有レクチン含有水
不溶性基盤と接触され、その上で高活性ヘパリン
が吸着される。一般的実施において、分別されな
いヘパリンは、塩化ナトリウムを0.4Mよりも少
ない濃度、通常約0.1―0.4M、好ましくは生理的
濃度、すなわち0.15Mにおいて含んでいる緩衝系
内の溶液の形に存在する。緩衝溶液のPHは約6.0
―8.5、通常約7.5であるべきである。緩衝溶液と
して、たとえば、0.01Mトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノエタン（TRIS）および0.15M塩化ナ
トリウムの混合物を使用する。基盤と混合される
ヘパリンの量は複合体中に得られるHAHの活性
を最高にするのに充分であるべきであり、基盤上
の抗トロンビン１部当り１部よりも少なくない、
好ましくは４―20部の未分別のヘパリンが基盤に
適用される。ヘパリンは純粋の形であつてもよ
く、またはそれは顕著な量において抗トロンビン
に結合しない他のタン白および類似物と混合され
てもよい。一般的に、ヘパリン溶液と基盤の間の
接触は新たに平衡化された基盤のベツドを形成さ
れることおよびこれにヘパリン溶液を通すことに
よつて達成される。

前述のことによつて、この発明は、この発明の
抗トロンビン―ヘパリン複合体を製造することの
特別の方法に限定することを意味しない。私は新
規な治療薬、すなわち抗トロンビン―ヘパリン複
合体を見出し、そしてその製造のための新規な方
法をまた開発した。他の方法により得られた抗凝
固因子の用途のための抗トロンビン―ヘパリン複
合体は、私の発明の範囲内にある。さらに、予じ
め分画されたヘパリンもまた私の方法に使用でき
る。

例 この発明は次の実例により示される。

評価方法 抗トロンビン：標準試料として人間の血清ア
ルブミ量を用いて、ローリー（Lowry）のタン
白分析法が用いられた。（Lowry et al、J.Biol.
Chem、1951年第193巻第265―275頁） (a) カルバゾールの分析：ウロン酸の標準曲線を
基準とするヘパリンの定性分析。30％のウロン
酸含有がヘパリンと仮定される。（Hook et al
FEBS Letters1976年第66巻第90―93頁）分析
はAnal.Biochemistry、1962年第４巻第330―
334頁においてビツター（Bitter et al）によ
つて記載された。

(b) アズレの方法：Jacks et al、J.Physiol
（London）、1949年第109巻、第41−49頁
（Lam.et al、BBRC、1976年第69巻第570―
577頁参照） ヘパリンの抗凝固活性：全ヘパリン画分の活性は
商業的に得られた製剤のそれに関係する （Lipo−Hepin 、Riker Laboratories
Inc）。その米国単位はラベルに表示された。標準
曲線は上記のヘパリンにより確立れ、そして未知
の活性を有する全ヘパリン画分は次の案によりこ
の曲線と比較することにより計量された。

(1) 抗トロンビン（約30μｇ／ml）を含む200μ
の試料および200μのヘパリン含有溶液が合
体され、37℃に温められた。

(2) 過剰のトロンビンにおける水準においてトロ
ンビン（Pentex bouine thrombin Miles
Laboratories Inc.）を含む溶液の200μの試
料が上記(1)の混合物に加えられ、急激に混合さ
れた。

(3) 正確に30分後、1mMのＳ―2238（Ｈ−Ｄ−
Phe−Ｌ−Dip−Ｌ−arg−ｐ−nitroanilide、
Kabi Diagnostica、Sweden）および0.5mgの
ポリブレン（Poly brene ：Aldrich
Chemical Co.lnc.）の200μの溶液が混合物
に混合され、このものは再び急激に混合され
た。

(4) 正確に60分後、200μの50％酢酸がエステ
ル分解反応（esterolytic reaction）を停止さ
せるために加えられた。

(5) 各々の試料の紫外線吸収が405ナノメーター
（nm）において測定された。

実施例 １ 抗トロンビン―コンカナバリンＡ―セフアロー
ズ支持体の調製 10mlのコンカナバリンＡ―セフアローズ
（Pharmacia Corp.Piscataway、N.J.）のケン濁
液からカラム（1.6×５cm）がつくられた。この
アガロースはその製造者によつて述べられている
とおり、膨潤したゲルのml当り、８mgの共有的に
結合されたレクチンタン白質を含む。カラムは
0.15Mの塩化ナトリウムと0.01Mのトリス
（TRIS）、PH7.5を含む緩衝液により平衡化され
た。（任意的には、細菌の生育を阻止する薬剤、
たとえばナトリウムアジト0.02％およびコンカナ
バリンＡを安定化する他の塩類すなわち、
0.1mMの塩化カルシウムおよび0.1mMの塩化マ
グネシウムを含むことができるが、これらのもの
は記述されるべき実験のために、その他の点で本
質的でない。） 上記の緩衝液中に抗トロンビンを含む溶液はカ
ラムに適用される。カラムに結合されなかつたタ
ン白質は、280μｍにおける紫外線分光により監
視された。未結合タン白質画分について約９％
（12.5mg）の適用された物質を示す1.13mgを含む
ことが見出された。かくして略々11.4mgの抗トロ
ンビンがコンカナバリンＡにより結合され、これ
はコンカナバリンＡ―レクチンのmg当り1.4mgの
抗トロンビンである。

実施例 ２ 抗トロンビン―HAH複合体の製造 シグマ化学会社（Sigma Chemical Co、St.
Louis、Missouri）からのヘパリン（85mg）が
0.15Mの塩化ナトリウムおよび0.01Mのトリスを
含む水溶液（PH：7.5）の10ml中に溶解され、こ
の溶液が実施例１におけるがごとくつくられたカ
ラムに適用された。カラムは0.01Mのトリスおよ
び0.15Mの塩化ナトリウムを含む緩衝水溶液
（PH：7.5）により、ヘパリンが溶離液中に検出さ
れなくなるまで溶出された。カラムの溶離液中の
ヘパリンの存在はアズレＡ法の変法により監視さ
れた。この方法においてムコ多糖類の存在は
500nmにおける染料の可視吸収における増加をも
たらす。

次にカラムは上記の緩衝液に溶解した中性シヨ
糖により溶出された。この場合、0.2Mの１―０
―メチル―α−Ｄ―グルコピラノシドの溶液が用
いられた。カラムからの抗トロンビン―HAHの
溶出は280nmにおける紫外線吸収および上に記述
したアズレＡ方法により検出された。上記の複合
体に含まれるヘパリンは500単位／mgの比抗凝固
活性を示す高い活性を有することを示した。複合
体に含まれる物質の相対的な量の定量はヘパリン
に対する抗トロンビンの過剰モル数が約２倍であ
ることを示した。この値は、抗トロンビン１分子
と相互反応するために、ヘパリンの異質の粒子分
布とより大きい種の能力によつて１から2.5の間
で変化することが期待される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ レクチン含有水不溶性基盤上に可逆的に固定
   化された抗トロンビンと高活性ヘパリンの複合体
   を必須成分として含有する抗血液凝固剤。 ２ この複合体中における高活性ヘパリンの活性
   がミリグラム当り約300単位よりも大きいもので
   あり、またこの複合体中における高活性ヘパリン
   が予じめサイズにより分別されないヘパリンに由
   来するものを含むことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の抗血液凝固剤。 ３ (a) レクチン含有水不溶性基盤に可逆的に結
   合した抗トロンビン、基盤上で抗トロンビンに
   複合体化される高活性ヘパリンを有するレクチ
   ン含有水不溶性基盤を得るために、レクチン含
   有水不溶性基盤をヘパリンおよび抗トロンビン
   と接触させること、 (b) 基盤から低活性ヘパリンを含む未結合ヘパリ
   ンを分離すること、および (c) 基盤から抗トロンビン―高活性ヘパリン複合
   体を分離すること の各段階を有することを特徴とする、レクチン含
   有水不溶性基盤上に可逆的に固定化された抗トロ
   ビンと高活性ヘパリンの複合体を必須成分として
   含有する抗血液凝固剤の製造方法。 ４ レクチンがコンカナバリンＡであることを特
   徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５ 水不溶性基盤がアガロースゲルであることを
   特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ６ 基盤を、未結合ヘパリンを基盤から除去する
   のに充分であるが、高活性ヘパリンを除去するの
   に充分でないイオン強度を有する塩類水溶液で処
   理することによつて、未結合のヘパリンが基盤か
   ら分離されることを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項に記載の方法。 ７ 基盤から可逆的に固定化された複合体を分離
   する段階をさらに含むことを特徴とする特許請求
   の範囲第３項に記載の方法。 ８ 基盤が、基盤から可逆的に結合された複合体
   を分離するのに充分な量で炭水化物が存在する炭
   水化物の水溶液と接触されることを特徴とする特
   許請求の範囲第３項または第７項に記載の方法。