JPH0157955B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0157955B2 JPH0157955B2 JP59043617A JP4361784A JPH0157955B2 JP H0157955 B2 JPH0157955 B2 JP H0157955B2 JP 59043617 A JP59043617 A JP 59043617A JP 4361784 A JP4361784 A JP 4361784A JP H0157955 B2 JPH0157955 B2 JP H0157955B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- leu
- ser
- ala
- val
- ctc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト癌壊死因子ポリペプチド並びにそ
れらをコードするクローン化DNA、それらクロ
ーン化DNAを組込んだベクター及びそれらのベ
クターで形質転換された宿主に関する。 本明細書では記載の簡略化のために以下の略号
を使用する。 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フエニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトフアン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 オリゴ（dC） オリゴデオキシシチジル酸 オリゴ（dG） オリゴデオキシグアニル酸 オリゴ（dT） オリゴデオキシチミジル酸 ポリ(A) ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ） ポリウリジル酸 ポリ（dA） ポリデオキシアデニル酸 ポリ（dC） ポリデオキシシチジル酸 ポリ（dG） ポリデオキシグアニル酸 ポリ（dT） ポリデオキシチミジル酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 bp 塩基対 Carswellらは、あらかじめbacillus Calmette
−Gue′rin（BCG）で感染させ、次いでエンドト
キシンで処理したマウスの血清中には、移植した
Meth Ａ肉腫による癌を壊死させる物質が含まれ
ていることを見いだし、この物質を癌壊死因子と
名づけた［Proc.Nat.Acad.Sci.USA、72、3666
（1975）］。 癌壊死因子はマクロフアージから放出される生
理活性物質と考えられており、その特徴として、
(i)担癌動物に投与するとある種の癌を壊死させ治
癒せしめること(ii)in vitroである種の癌細胞（例
えばマウスの癌細胞であるＬ細胞、ヒト癌由来の
PC−10細胞）を傷害するが、正常細胞にはほと
んど有害な作用を及ぼさないこと、及び(iii)その作
用が種特異的でないことなどが知られている。こ
のような特徴の故に癌壊死因子は、新しいタイプ
の制癌剤としてその臨床的応用が強く期待されて
いる。 しかしながら、従来の癌壊死因子製造法はマウ
スやウサギなどの動物にBCG又は
Propionibacterium acnesを注射し、次いでエン
ドトキシンを投与した後その血液及び体液より癌
壊死因子を単離精製するものであるため、安定し
て多量の癌壊死因子を安価に得ることは難しい状
況であつた。更に、癌壊死因子を医薬として使用
するためには、抗原性等の観点からヒト由来の癌
壊死因子がより好ましいが、上記方法はヒト由来
の癌壊死因子製造には採用できない。 従来、ヒトマクロフアージ由来の癌細胞傷害因
子として、Matthewsにより報告された、正常人
の末梢単球細胞あるいは骨髄性単球性白血病細胞
が産生する因子（Anti−tumor cytotoxin）
［Immunology、44、135（1981）］及びReedらに
より報告された、ヒト末梢血中の培養器壁付着細
胞が産生する因子（Adherent cell toxin）［J.
Immunol.、115、395（1975）］などが知られてい
る。また、Williamsonらは、ヒトＢ細胞樹立株
から産生される分子量約７万ダルトンの物質をヒ
ト癌壊死因子として報告している［Proc.Nat.
Acad.Sci.USA、80、5397（1983）］。しかし、い
ずれの場合もその物質としての実体は不明であつ
た。 本発明者らは、ヒト由来の癌壊死因子の大量生
産法を確立するために、遺伝子組換え技術に着目
して鋭意研究を行い、まずウサギ癌壊死因子をコ
ードするクローン化DNAの単離に成功した（特
願昭58−228790号参照）。更に研究を続けた結果、
このクローン化DNAをプローブとして、ヒト癌
壊死因子をコードするcDNAをクローン化するこ
とに成功し、更にこのクローン化DNAを組込ん
だプラスミドで形質転換された微生物がヒト癌壊
死因子を産生することを確認して本発明を完成し
た。 本明細書において、ヒト癌壊死因子とはヒト由
来細胞が産生する蛋白質であつて、in vitroで少
なくともＬ細胞を傷害する能力、及びin vivoで
少なくとも移植したMeth Ａ肉腫による癌を壊死
させる能力を有するものを意味し、癌壊死因子活
性とは、このような生物活性を意味する。 本発明は、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又は
その活性中心部分を含むポリペプチド、及びそれ
らをコードするクローン化DNAを提供するもの
である。特に、次のアミノ酸配列（） Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
Phe Gly Ile Ile Ala Leu （） を有するヒト癌壊死因子［以下ポリペプチド
（）と記す］、ポリペプチド（）のＮ末端に更
に次のアミノ酸配列（） Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp
Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Lys
Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg
Cys Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu
Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys
Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln
Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu
Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg
（） を有するポリペプチド［以下ポリペプチド（＋
）と記す］、及びポリペプチド（）のＮ末端
にMetを有するポリペプチド、並びに次の塩基配
列（） （5′）−TCA TCT TCT CGA ACC CCG
AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT
GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG
CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC
GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG
TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC
ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC
ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC
CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT
GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG
GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC
AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT
CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG
AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG
ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC
TTT GCC GAC TCT GGG CAG GTC TAC
TTT GGG ATC ATT GCC CTG−（3′）
（） を有する、ポリプペプチド（）をコードするク
ローン化DNA［以下DNA（）と記す］及び
DNA（）の5′末端に更に次の塩基配列（） （5′）−ATG AGC ACT GAA AGC ATG
ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG
GAG GCG CTC CCC AAG AAG ACA GGG
GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC
TTG TTC CTC AGC CTC TTC TCC TTC
CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG
CTC TTC TGC CTG CTG CAC TTT GGA
GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG
TTC CCC AGG GAC CTC TCT CTA ATC
AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA
−（3′） （） を有する、ポリペプチド（＋）をコードする
クローン化DNA［以下DNA（＋）と記す］、
及びDNA（）の5′末端に開始コドンATGを有
するDNAを提供するものである。 本明細書において、ヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列を含むポリペプチドとは、ポリペプチド
（）又はそのＮ末端又はＣ末端にアミノ酸又は
ペプチドが結合しているポリペプチドであつて、
それ自身が、又は酵素等により切断されて生じる
ポリペプチドがポリペプチド（）と同様のヒト
癌壊死因子活性を示すものを意味する。また、ヒ
ト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性中心部分を含
むポリペプチド（）のアミノ酸配列のうちヒト
癌壊死因子活性を発現するのに必須のアミノ酸配
列を含むポリペプチドであつて、ポリペプチド
（）と同様のヒト癌壊死因子活性を示すものを
意味する。本発明には、ヒト癌壊死因子のアミノ
酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチ
ド、それらをコードするDNA、それらのDNAを
組込んだベクター及びそれらのベクターで形質転
換された宿主だけでなく、得られたポリペプチド
が本発明のポリペプチド（）と高い相同性を有
し、同様のヒト癌壊死因子活性を示し、かつ免疫
学的に交差するものである限り、そのようなポリ
ペプチド並びにそれらをコードするDNA、それ
らのDNAを組込んだベクター及びそれらのベク
ターで形質転換された宿主も又含まれる。例え
ば、ヒト癌壊死因子DNAの対立遺伝子変異体及
び遺伝子コードの縮重又は一部の修飾を含むヒト
癌壊死因子DNAの誘導体及びこれらから得られ
るポリペプチドも又本発明に含まれる。なお、一
部の修飾を含むヒト癌壊死因子DNAの誘導体と
は、ヒト癌壊死因子DNAの一部が欠失した誘導
体及びヒト癌壊死因子DNAに他のDNA断片が付
加した誘導体を意味する。 本発明のヒト癌壊死因子をコードする塩基配列
を有するDNAは、例えば次のようにして製造す
ることができる。 (1) ウサギ癌壊死因子をコードするクローン化
DNAの調製 特願昭58−228790号に開示されている方法
（例えば参考例２の方法）に従つて、ウサギ癌
壊死因子cDNAを得る。このクローン化DNA
の塩基配列は第１表に示す通りで、ウサギ癌壊
死因子のポリペプチドをコードする領域は第
277〜738番である。 このウサギ癌壊死因子cDNAに、適当な長さ
のDNA断片を与えるように制限酵素を作用さ
せてDNA断片を切り出し、以下に述べるヒト
癌壊死因子cDNAのクローニングのためのプロ
ーブとする。制限酵素としては、例えばAva
、Hae、BstN、Hinc、Rsaが挙げ
られる。DNA断片は異なる領域に由来する２
種以上のものを使用するのが好ましい。第１表
には、制限酵素としてAva及びHaeを用い
て、それぞれ299bp及び88bpのDNA断片を切
り出す場合の切断部位を示している。 【表】 ｜ ｜
｜ ｜
｜ ｜
A A G C C T C T A G C C C A C
G T A G T A G C A A A C C C G C A
A G T G G A G G G C C A G C T C
C A G T G G C T G A G C
T T C G G A G A T C G G G T G
C A T C A T C G T T T G G G C G T
T C A C C T C C C G G T C G A G
G T C A C C G A C T C G
370 380
390 400
410 420
｜ ｜
｜ ｜
｜ ｜
C A G C G T G C G A A C G C C
C T G C T G G C C A A C G G C A T
G A A G C T C A C G G A C A A C
C A G C T G G T G G T G
G T C G C A C G C T T G C G G
G A C G A C C G G T T G C C G T A
C T T C G A G T G C C T G T T G
G T C G A C C A C C A C
【表】 ｜ ｜
｜ ｜
｜ ｜
T T T G G G A T C A T T G C C
C T G T G A G G G G A C T G A C C
A C C A C T C C T C C C C C T C
T C C C A C C C C A G C
A A A C C C T A G T A A C G G
G A C A C T C C C C T G A C T G G
T G G T G A G G A G G G G G A G
A G G G T G G G G T C G
790 800
｜ ｜
C C C C T C A C T C T G G G C
G C C C T C A G
G G G G A G T G A G A C C C G
C G G G A G T C
〓 〓内はウサギ癌壊死因子をコードする領域
を示す。
(2) ヒト癌壊死因子mRNAの調製 ヒトのマクロフアージを肺胞、血液、腹腔、
胎盤、脾臓、その他の組織から採取する。例え
ば、肺胞からはSoneらの方法［J.Immunol.、
129、1313（1982）］、血液からはMatthewsの方
法［Br.J.Cancer、48、405（1983）］、胎盤から
はWilsonらの方法［J.Immunological
Methods、56、305（1983）］により採取する。
このマクロフアージを培養器面１cm2当たり約２
×104〜106個播き、35〜38℃、好ましくは約37
℃、約５〜10％炭酸ガス含有空気中、湿度約90
〜100％で約30分〜２時間前培養する。次いで
グラム陰性菌より得られたエンドトキシン、例
えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のリポポリ
サツカライドを加え、更に培養を３〜８時間継
続してヒト癌壊死因子mRNAの産生を誘導さ
せる。このとき蛋白合成阻害剤（例えばシクロ
ヘキシミド）を加えることにより、ヒト癌壊死
因子mRNAを蓄積させることができる。なお
前培養は省略してもよい。エンドトキシンの添
加量は、一般に約0.1〜1000μｇ／ml（最終濃
度、以下同じ）、好ましくは約１〜100μｇ／ml
である。この際、ホルボール−12−ミリステー
ト−13−アセテート、ホルボール−12，13−ジ
デカノエート、ホルボール−12，13−ジベンゾ
エートのようなホルボールエステル類を約１〜
2000nｇ／ml添加してもよい。蛋白合成阻害剤
の添加量は、化合物の種類等により異なるが、
例えばシクロヘキシミドの場合、0.1〜50μｇ／
mlである。培地としては、高等動物細胞の培養
に適した各種合成培地が用いられ、例えば
RPMI−1640、イーグルのMEM培地、ダルベ
ツコ変法によるMEM培地（以上の培地の組成
については、例えば宗村庚修編「細胞培養マニ
ユアル」、講談社、1982年に記載されている）
が挙げられる。培地には、全培養液量の約１〜
20％の動物血清（例えば牛胎児血清、子牛血
清）を加えておくのが好ましい。培養終了後、
細胞より常法、例えばChirgwinらの方法
［Biochemistry、18、5294（1979）］により全
RNAを抽出し、次いでこれを常法に従つてオ
リゴ（dT）セルロース又はポリ（Ｕ）セフア
ロース（フアルマシア社）などを用いる吸着カ
ラムクロマトグラフイーに付すか又はバツチ法
によりpoly(A)mRNA画分を分離する。この
poly(A)mRNA画分を酸性尿素アガロースゲル
電気泳動又はシヨ糖密度勾配遠心分離に付すこ
とにより、ヒト癌壊死因子mRNAを濃縮精製
することができる。 ここに得られたmRNA画分が目的とするヒ
ト癌壊死因子をコードするmRNAを含有して
いることを確認するためには、mRNAを蛋白
質に翻訳させてその生物活性を調べればよい。
例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis）
の卵母細胞、網状赤血球ライセート、小麦胚芽
のような適当な蛋白合成系にmRNAを注入又
は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマ
ウスＬ−929細胞に対して細胞傷害活性を示す
ことを確認することにより行われる。なお、ア
フリカツメガエルの卵母細胞を用いる方法は、
例えば次のようにして行われる。卵母細胞１個
当たり約50nｇのmRNAをマイクロインジエク
シヨン法で注入し、その10個を100μのバー
ス培養液［Gurdon、J.B.、J.Embryol.Exp.
Morphol.、20、401（1968）］中、22℃で24〜72
時間培養し、ホモジナイズした後、その遠心上
清液（10000rpm、10分間）を検体として、Ｌ
−929細胞傷害活性を指標として癌壊死因子活
性を測定する［Ｌ−929細胞傷害活性の測定法
はRuff、M.R.、et al.、J.Immunol.、125、
1671（1980）に記載されている］。 (3) ヒト癌壊死因子cDNAのクローニング (2)の工程で得られたmRNAを鋳型とし、
Gublerらの方法［Gene、25、263（1983）］に従
つてオリゴ（dT）をプライマーとして、
dATP、dGTP、dCTP、dTTPの存在下で逆
転写酵素（例えばトリ骨髄性白血病ウイルス由
来逆転写酵素）によりmRNAと相補的な単鎖
cDNAを合成し、次いで大腸菌リボヌクレアー
ゼＨと大腸菌DNAポリメラーゼを用いて二
重鎖cDNAを合成する。ここに得られたDNA
を、ポリ（dG）−ポリ（dC）又はポリ（dA）−
ポリ（dT）ホモポリマー伸長法［Noda、M.、
et al.、Nature、295、202（1982）；Nelson、
T.S.、“Methods in Enzymology、”68、41
（1979）、Academic Press Inc.、New York］
のような常法に従つて、例えばプラスミド
pBR322の制限酵素Pst切断部位に組込ませ
る。得られた組換えプラスミドを、例えば
Cohenらの方法［Proc.Nat.Acad.Sci.USA、
69、2110（1972）］に準じて、例えばE.coli
χ1776株のような宿主に導入して形質転換さ
せ、テトラサイクリン耐性株を選択してcDNA
ライブラリーを作製する。 このcDNAライブラリーについて、(1)の工程
で得たウサギ癌壊死因子をコードするDNAの
断片を 32Pで標識したものをプローブとして、
コロニー・ハイブリダイゼーシヨン試験
［Hanahan、D.、et al.、Gene、10、63
（1980）］を行い、ウサギ癌壊死因子cDNA断片
とハイブリダイズするクローンをスクリーニン
グする。 このようにして得られた多くのクローン化
DNAについて、例えばMaxam−Gilbert法
［Proc.Nat.Acad.Sci.USA、74、560（1977）］に
従つて塩基配列を解析し、既に明らかになつてい
るウサギ癌壊死因子の塩基配列と相同性のある塩
基配列を探し、最終的にヒト癌壊死因子の全翻訳
領域に対応する塩基配列を含むcDNAを選び出す
ことにより、ヒト癌壊死因子ポリペプチドをコー
ドする塩基配列を有するクローン化DNAを得る
ことができる。 ここに得られたクローン化DNAの組込まれた
組換えプラスミドを、例えばE.coli HB101株の
ような宿主に導入して形質転換体を得た後、これ
を培養し、Ｌ−929細胞傷害活性を指標にして蛋
白質を分離、精製することにより、ヒト癌壊死因
子ポリペプチドを得ることができる。 更に形質発現効率を上げるためには、本発明の
クローン化DNAのヒト癌壊死因子をコードする
領域を適当な制限酵素で切り出した後、適当なプ
ロモーターを有する形質発現ベクターに組込んで
ヒト癌壊死因子ポリペプチド生産用ベクターを作
製すればよい。 例えば、実施例でクローン化したヒト癌壊死因
子をコードするDNAを添付図面に示す如く、制
限酵素Avaで処理し、第４表の塩基配列の第
250番目以降のDNAフラグメントを取得し、5′末
端側の欠失部分（TCA−TCT−TCT−CGA−
ACC）に開始コドンATGを付したDNAを化学
合成し、これを上記のAva切断部に結合させた
後、プロモーターを有する形質発現ベクターに組
込めばよい。プロモーターとしては、例えばlac
プロモーター、trpプロモーター、tacプロモータ
ー、PLプロモーター、SV40初期プロモーターな
どが挙げられる。ベクターとしては、形質転換さ
せる宿主中で増殖するものはすべて用いることが
できる。例えばプラスミド（pBR322、pDR540
など）、フアージ（ラムダフアージ誘導体など）、
ウイルス（SV40など）が挙げられる。これらは
単独で、又はそれらの組合わせ、例えばpBR322
−SV40ハイブリツドプラスミドなどの形で用い
てもよい。 ここに得られたクローン化DNAを組込んだベ
クターを常法により適当な宿主に作用させて形質
転換させることにより形質発現宿主が得られる。
形質転換に用いられる宿主としては、例えば大腸
菌、枯草菌、酵母などの微生物、COS monkey
細胞などの動物培養細胞及び植物培養細胞が挙げ
られる。 かくして得られる形質転換体を常法に従い培養
し、培養物をTNF活性を指標として精製するこ
とにより、ヒト癌壊死因子ポリペプチドを得るこ
とができる。 本発明のヒト癌壊死因子は、ウサギ癌壊死因子
と極めて相同性の高いアミノ酸配列を有してお
り、DNA塩基配列においても高い相同性が認め
られる。第２表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊
死因子の前駆体のアミノ酸配列の相同性を示し、
第３表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊死因子の
前駆体をコードするDNAの塩基配列の相同性を
示す。特願昭58−228790号で説明しているよう
に、ウサギ癌壊死因子は尿素非存在下では会合体
の形で存在し、第２表に示した第82番目のSerに
始まり、第236番目のLeuに終わる154個のアミノ
酸から成るポリペプチドがその基本構成単位であ
ると考えられている。即ち、前駆体ポリペプチド
のＮ末端部分が生体内で適当な酵素により切断さ
れ、活性化されるものと考えられる。ヒト癌壊死
因子の場合も、第82番目のSerに始まり、第236
番目のLeuで終わる155個のアミノ酸から成るポ
リペプチドがヒト癌壊死因子の基本構成単位であ
ると考えられる。第２及び第３表から明らかなよ
うに、ヒト及びウサギ癌壊死因子のポリペプチド
のアミノ酸配列の相同性は81％であり、それぞれ
をコードするDNA塩基配列の相同性は85％であ
る。また、ヒト癌壊死因子前駆体とウサギ癌壊死
因子前駆体との間にも高い相同性が認められ、ポ
リペプチドのアミノ酸配列の相同性は79％であ
り、塩基配列の相同性は84％である。 ヒト及びウサギ癌壊死因子間のこのように高い
相同性は、両因子が系統発生学的には共通の分子
から派生していることを推測させるとともに、相
同性の極めて高い領域に癌壊死因子の生物活性発
現のために必須の領域があり、癌壊死因子の活性
中心部分であることを示唆している。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ヒト癌壊死因子は、後記試験例で示すように、
ウサギ癌壊死因子とは免疫学的に全く交差せず、
ウサギ癌壊死因子とは免疫学的に区別し得るポリ
ペプチドである。このように、ヒト及びウサギ癌
壊死因子は全体としては高い相同性を示すにもか
かわらず、そのポリペプチドの性質には明らかな
相違がある。 このことは、癌壊死因子の全アミノ酸配列がそ
の生物活性に必須ではなく、活性中心を構成する
部分のアミノ酸配列が同一であればその他の部分
のアミノ酸配列が多少変化し、それに伴つてポリ
ペプチドの性質が変化しても、癌壊死因子の活性
は保持されることを示している。 本発明により明らかにされたヒト癌壊死因子ポ
リペプチドのアミノ酸配列やDNA塩基配列に関
する知見に基づいて、遺伝子組換え技術の常法に
従い、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド又はヒト癌壊死因子の活性中心部分を含
むポリペプチドをコードするDNAあるいは一部
修飾されたヒト癌壊死因子DNAの変異体を得る
ことができるし、それらを用いてヒト癌壊死因子
活性を有するポリペプチドを容易に生産すること
ができる。また、本発明で明らかにされたDNA
塩基配列の一部を化学合成し、これをプローブと
して用いることにより、対立遺伝子変異や遺伝子
コードの縮重のあるヒト癌壊死因子DNAも容易
に入手でき、それらを用いてヒト癌壊死因子活性
を有するポリペプチドを生産することができる。
更に、ヒト癌壊死因子ポリペプチドのアミノ酸配
列に基づいて、それをコードする塩基配列の
DNAを全合成することも可能である。これらは
すべて本発明の範囲内に含まれる。 本発明のヒト癌壊死因子ポリペプチドは、優れ
た抗腫瘍作用を有するので、抗腫瘍剤として悪性
腫瘍の治療に用いることができる。 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定
されるものではない。 実施例 (1) ヒト癌壊死因子をコードするクローン化
DNAを検出するためのプローブの調製 特願昭58−228790号に開示されている方法
（例えば参考例２の方法）に従つて、第１表
（既出）に示すウサギ癌壊死因子をコードする
クローン化DNAを得た。このDNAを制限酵素
Hae及びAvaを用いて切り出し、それぞれ
第33〜120番の88bpから成るDNA断片と第285
〜583番の299bpから成るDNA断片を得た。制
限酵素Avaで切り出した299bpのDNA断片
はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり、
Haeで切り出した88bpのDNA断片はウサギ
癌壊死因子前駆体をコードする領域に相当する
部分である。 この２種のDNA断片を 32Pで標識して、ヒ
ト癌壊死因子cDNAのクローニングのためのプ
ローブとして、(8)項で使用した。 (2) ヒト肺胞マクロフアージからのmRNA画分
の単離 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて
肺胞マクロフアージを6.3×107個採取した。こ
の肺胞マクロフアージを10％牛胎児血清含有の
RPMI−1640培地に懸濁させてペトリデイツシ
ユ（直径８cm）に１枚当たり９×106個となる
ように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空気中、
湿度90〜100％で前培養した。１時間の前培養
の後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリ
サツカライド）、TPA（ホルボール−12−ミリ
ステート−13−アセテート）及びシクロヘキシ
ミドをそれぞれ最終濃度が10μｇ／ml、10n
ｇ／ml及び1μｇ／／mlとなるように添加混和
し、更に培養を継続した。４〜4.5時間後（通
算５〜5.5時間）に培養液を吸引除去し、デイ
ツシユ上に残つたマクロフアージを0.6％ラウ
ロイルサルコシン酸ナトリウムと６ｍＭクエン
酸ナトリウムを含む5Mグアニジルチオシアネ
ート液で溶解し、ホモジナイズした。このホモ
ジネートを0.1M EDTA含有5.7M塩化セシウ
ム水溶液上に重層し、超遠心分離機（RPS27
−２ローター、日立製作所）を用い26500rpm
で20時間遠心し、全RNA画分をペレツトとし
て得た。これを0.35M NaCl、20ｍＭ Tris及
び20ｍＭ EDTAを含む7M尿素液の少量に溶
解し、エタノール沈殿として回収した。全
RNAとして159μｇが得られた。 この全RNA画分を１ｍＭ EDTAを含む10
ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）（以下TE液
という）１mlに溶解し、65℃で５分間加熱し
た。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平
衡化したオリゴ（dT）セルロースカラムに付
し、吸着したpoly(A)mRNAをTE液で溶出する
ことにより、8μｇのpoly(A)mRNAを得た。こ
のpoly(A)mRNAを1.9nｇ／ｎの濃度で蒸留
水に溶解し、これをアフリカツメガエルの卵母
細胞１個当たり50nずつ注入し、前述の方法
に従つて、卵母細胞中で翻訳された蛋白質のＬ
−929細胞傷害活性を測定した。その結果、10
個の卵母細胞のホモジネート0.1ml中に6.6単
位／mlの活性を認め、このpoly(A)mRNA調製
品中にヒト癌壊死因子のmRNAが含まれてい
ることを確認した。 (3) cDNAの合成 (2)項で得られたpoly(A)mRNAを鋳型として
Gublerらの方法［Gene、25、263（1983）］に従
つてcDNAを合成した。 反応液量；40μ 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH8.3）；10ｍＭ
MgCl2；10ｍＭジチオスレイトール；４ｍＭ
ピロホスフエート ナトリウム；1.25ｍＭ
dGTP、dATP、dTTP；0.5ｍＭ dCTP；
0.167μM α− 32P−dCTP（比活性3000Ci／ｍ
mole）；4μｇオリゴ（dT）12〜18；6μｇpoly(A)
mRNA；120単位トリ骨髄性白血病ウイルス由
来逆転写酵素。 43℃で30分間反応させた後、EDTAを加え
て反応を停止させ、フエノール−クロロホルム
混液（１：１）で抽出し、その水層に酢酸アン
モニウムを最終濃度2.5Mになるように加え、
エタノールによる反応生成物（単鎖cDNA−
RNA複合体）を沈殿させた。この単鎖cDNA
−RNA複合体を下記組成の反応緩衝液100μ
に溶解した。 反応緩衝液組成： 20ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.5）；５ｍＭ
MgCl2；10ｍＭ （NH4）2SO4；100ｍＭ
KCl；0.15ｍＭ β−ニコチンアミド アデニ
ン ジヌクレオチド；50μｇ／mlウシ血清アル
ブミン；40μM dGTP、dATP、dTTP、
dCTP；0.9単位大腸菌リボヌクレアーゼＨ；23
単位大腸菌DNAポリメラーゼ。 12℃で60分間、続いて22℃で30分間反応させ
た後、EDTAを加えて反応を停止させ、上記
と同様にフエノール−クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより沈殿させて二重鎖cDNA
を得た。 (4) オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製 (3)項で得られた二重鎖cDNAに次の組成の反
応緩衝液100μを加え、37℃で30分間反応さ
せ、二重鎖cDNAにオリゴ（dC）テールを付
加させた。 反応緩衝液； ２ｍＭ CoCl2、0.2ｍＭジチオスレイトー
ル、0.1ｍＭ α− 32P−dCTP（比活性3Ci／ｍ
mole）及び10単位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフエラーゼを含有する100ｍ
Ｍカコジル酸ナトリウム（PH7.2）。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、
フエノール−クロロホルム混液で抽出し、オリ
ゴ（dC）テール付加cDNAをエタノールによ
り沈殿させ回収した。これを10ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH7.4）、１ｍＭ EDTA及び100
ｍＭ NaClを含む水溶液に１ml当たり2μｇの
オリゴ（dC）テール付加cDNAを含むように
溶解した。 (5) オリゴ（dG）テール付加プラスミド
pBR322DNAの調製 20ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）、10ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ （NH4）2SO4及び１ml当た
り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液
100μにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素Pst
エンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１
時間反応させた。反応終了後、反応液をフエノ
ール−クロロホルム混液で抽出し、水層からエ
タノール沈殿によつてDNAを回収した。得ら
れたDNAを前述のオリゴ（dC）テール付加に
用いた水溶液（但し 32P−dCTPの代わりに
3H−dGTPを含む）200μに溶解し、ターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ80単位を用いて37℃で20分間反応させ、約10
〜15個のdG残基を取り込ませた。反応液をフ
エノール−クロロホルム混液で抽出し、水層か
らエタノール沈殿によつてオリゴ（dG）テー
ル付加プラスミドpBR322DNAを回収した。
これをオリゴ（dC）テール付加cDNAの場合
と同様の緩衝液に１ml当たり20μｇのオリゴ
（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAを含
むように溶解した。 (6) 組換え体プラスミドの作製 (4)項で得られたオリゴ（dC）テール付加
cDNA溶液120μを、(5)項で得られたオリゴ
（dG）テール付加pBR322DNA溶液120μと混
合し、65℃で５分間、57℃で120分間インキユ
ベートしてアニーリングを行い、組換え体プラ
スミド溶液を調製した。 (7) 形質転換体の選択 (6)項で得られた組換え体プラスミド溶液を用
い、E.coliχ1766株（ATCC No.31244）を形質
転換させた。即ち、E.coliχ1776株を、ジアミ
ノピメリン酸100μｇ／ml及びチミジン40μｇ／
mlを補つたＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度
（600nｍ）が0.5となるまで培養し、菌体を４℃
で遠心して集め、50ｍＭ CaCl2含有10ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH7.3）10mlに分散し、４
℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同
じ緩衝液２mlに分散し、０℃で５分間静置し
た。この分散液0.2mlに(6)項で得られた組換え
体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で
15分間静置し、更に42℃で２分間保持した後、
前の培養で用いたのと同一組成のＬ−ブロス
0.5mlを加えて１時間振盪培養を行つた。この
培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラ
サイクリン15μｇ／mlを含むＬ−ブロス寒天平
板に広げ、37℃で約12時間培養し、テトラサイ
クリン耐性菌を選択してcDNAライブラリーを
作製した。 (8) クローニング (7)項で得られたcDNAライブラリーについ
て、ヒト癌壊死因子をコードするcDNAを含む
プラスミドを持つ形質転換体をスクリーニング
するため、(1)項で得られたウサギ癌壊死因子を
コードするDNAの制限酵素Avaで切り出し
た断片（299bp）の 32P標識物をプローブと
し、コロニー・ハイブリダイゼーシヨン試験を
Hanahanらの方法［Gene、10、63（1980）］に
従つて行つた。約２万個のコロニーから、この
標識プローブと強く結合する塩基配列を含む組
換え体プラスミドを持つ形質転換体43個を選び
出した。 更に、この43個のコロニーについて、制限酵
素Haeで切り出したウサギ癌壊死因子コード
領域の上流に相当するDNA断片（88bp）の
32P標識物をプローブとし、二次スクリーニン
グを行い、このプローブと強くハイブリダイズ
する６個のコロニーを選び出した。この２回の
スクリーニングにより、ウサギ癌壊死因子をコ
ードするDNA塩基配列及びその上流部分と相
同性の高い塩基配列を含むDNAを得た。 (9) 形質発現 (8)項で選ばれた６個のクローン（プラスミド
番号pHTNF−１、−４、−５、−13、−22、−26）
から、それぞれの組換え体プラスミドを取り出
し、E.coli HB101株（ATCC No.33694）を宿
主として形質転換体を得た。それぞれの形質転
換体について、Nagataらの方法［Nature、
284、316（1980）］に準じて50ml培養を行つた。
培地にはLBブロスを用いた。吸光度（600nｍ）
が約0.8になるまで培養し、約３〜５×1010個
の菌体を集めた。0.1％リゾチームを含む50ｍ
Ｍ Tris−HCl緩衝液（PH8.0）と30ｍＭ
NaClより成る溶液の１mlに菌体を懸濁させ、
氷水中で30分間静置した後、凍結融解を６回繰
返して菌体を破壊し、遠心分離して菌体抽出液
を得た。それぞれの形質転換体から得られた抽
出液について、Ｌ−929細胞傷害活性を測定し
た結果、プラスミドpHTNF−13による形質転
換体の抽出液に186.1単位／mlの活性を認めた。 (10) クローン化DNAの塩基配列の決定 (9)項で選択された組換え体プラスミド
pHTNF−13による形質転換体をLBブロスで
培養して菌体を得た。この菌体をWilkieらの
方法［Nucleic Acids Res.、７、859（1979）］
に従つて処理し、プラスミドDNAを得た。こ
のプラスミドDNAを制限酵素Pstで分解し、
分離精製してクローン化DNAを得た。このク
ローン化DNA断片を種々の制限酵素で分解し、
16種の制限酵素断片について、それぞれの塩基
配列をMaxam−Gilbert法により脱リン酸化、
32Pによる末端標識、塩基特異的化学分解反
応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフイー
を行い決定した。 図面に塩基配列決定に用いた制限酵素の切断
部位と塩基配列を決定した方向及び範囲（矢印
で表示）を示す。部分はヒト癌壊死因子前
駆体ポリペプチドをコードする領域を示す。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳され
たアミノ酸配列は第４表の通りである。ヒト癌
壊死因子のポリペプチドをコードする領域は、
第１表に示したウサギ癌壊死因子をコードする
塩基配列との相同性に基づいて推定した。即
ち、ヒト癌壊死因子ポリペプチドは、第４表の
第235〜237番のTCAのコドン（Serに対応）か
ら始まり、第697〜699番のCTG（Leuに対応）
で終わり、155残基のアミノ酸から成つている。
Ｃ末端のロイシンのコドンに続いてTGAの終
止コドンがある。塩基配列第１〜234番はヒト
癌壊死因子の前駆体をコードするために必要な
配列と考えられる。 【表】 【表】 【表】 参考例 １ 抗ウサギ癌壊死因子抗体の作製 特願昭58−228790号に開示されている方法（例
えば参考例３の方法）に従つて得た、精製ウサギ
癌壊死因子1.9×105単位を含む溶液を等量のフロ
インドの完全アジユバンドで乳濁化し、それをモ
ルモツトの背部皮下数カ所に注射した。その後、
１、３及び６週後に同様の方法で免疫した。更に
８週後に、同量の精製ウサギ癌壊死因子を水酸化
アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。最
初の免疫から９週後に心臓より全採血し、遠心分
離により血清を分離することによつて抗ウサギ癌
壊死因子抗体を含む抗血清を得た。 この抗血清を、正常ウサギ血清成分をカツプリ
ングさせたセフアロース4B（フアルマシア社）カ
ラムに３回繰返して通過させることによりウサギ
の血清成分に対する抗体を完全に除去し、ウサギ
癌壊死因子に対する特異抗体のみを含む精製抗血
清を得た。この抗血清は、免疫電気泳動法及びゲ
ル内二重拡散法により精製ウサギ癌壊死因子との
間にのみ単一の沈降線を形成した。この精製抗血
清を約60000倍希釈したものは、ウサギ癌壊死因
子のＬ−929細胞傷害活性500単位を50％中和する
能力を有する。 参考例 ２ (1) ウサギ肺胞マクロフアージからのmRNA分
画の単離精製 ウサギ（体重約2.5Kg）にプロピオニバクテ
リウム アクネス（Propionibacterium
acnes）死菌体を１羽当り100mgの投与量で静
脈内に注入し、８日後に屠殺した。直ちに開胸
気管切開し、気管内に挿入したチユーブを介し
てリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰返
し、肺胞マクロフアージを採取した。12羽のウ
サギより約３×109個の肺胞マクロフアージが
得られた。この肺胞マクロフアージを10％牛胎
児血清含有のRPMI−1640培地に懸濁させてペ
トリデイツシユ（直径８cm）に１枚当り２×
107個となるように播き、37℃で５％炭酸ガス
含有空気中、湿度90〜100％で前培養した。１
時間の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由
来のリポポリサツカライド）、TPA（ホルボー
ル−12−ミリステート−13−アセテート）及び
シクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μ
ｇ／ml、10nｇ／ml及び1μｇ／mlとなるように
添加混和し、更に培養を継続した。４〜4.5時
間後（通算５〜5.5時間）に培養液を吸引除去
し、デイツシユ上に残つたマクロフアージを
0.6％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと６
ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する5Mグアニ
ジルチオシアネート液で溶解しホモジナイズし
た。このホモジネートを0.1M EDTA含有
5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心
分離機（RPS27−２ローター、日立製作所）
を用い26500rpmで20時間遠心し全RNA画分を
ペレツトとして得た。これを0.35M NaCl、20
ｍＭ Tris及び20ｍＭ EDTAを含む7M尿素
液の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収
した。12羽のウサギより全RNAとして5.2mgが
得られた。 この全RNA画分を１ｍＭ EDTAを含む10
ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）（以下TE液
という）２mlに溶解し、65℃で５分間加熱し
た。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平
衡化したオリゴ（dT）セルロースカラムに付
し、吸着したpoly(A)mRNAをTE液で溶出する
ことにより、314μｇのpoly(A)mRNAを得た。
ここで得たpoly(A)mRNAの220μｇをアガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度１％、6M尿素存在
下、PH４）に付し、その分子サイズに従つて７
つの画分に分け、ゲルを融解（70℃、10分間）
させた後、水飽和フエノールによる抽出とクロ
ロホルムによる抽出ののち、エタノールにより
沈殿させて各画分よりpoly(A)mRNAを回収し
た。各画分のpoly(A)mRNAについてアフリカ
ツメガエルの卵母細胞を用いる方法でウサギ癌
壊死因子mRNA量を測定し、分子サイズとし
て1.6〜2.7kbに相当する画分にウサギ癌壊死因
子mRNAを高濃度に回収した。この精製poly
(A)mRNAの比活性は約1230単位／μｇRNAで
あり、末精製poly(A)mRNA調製品の比活性約
320単位／μｇRNAに比べて約４倍に濃縮され
た。 ここで得られた精製poly(A)mRNAを以下の
実験に用いた。 (2) cDNAの合成 精製poly(A)mRNA4μｇを用い以下に示す条
件でcDNAを合成した。 反応液量；100μ 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH8.3）；10ｍＭ
MgCl2；70ｍＭ KCl；１ｍＭジチオスレイ
トール；0.5ｍＭ dTTP、dCTP、dATP、
dGTP（但しdCTPは 32Pで標識、比活性4.4×
106cpm／nmole）；3μｇオリゴ（dT）12〜18、80
単位トリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写酵
素。 43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液
で反応を停止させた。フエノール−クロロホル
ム混液（１：１）によりcDNA−mRNA複合
体を抽出し、エタノールにより沈殿させ回収し
た。更に、アルカリ加温処理することにより
mRNAを分解除去した後、合成された単鎖
cDNAをエタノールにより沈殿させた回収し
た。 この単鎖cDNAを下記組成の反応緩衝液40μ
に溶解した。 反応緩衝液； 0.5ｍＭ dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
５ｍＭ MgCl2；70ｍＭ KCl；1.5ｍＭ β
−ムルカプトエタノール；８単位大腸菌DNA
ポリメラーゼ（ラージフラグメント）を含有
する0.1Mヘペス（Hepes）緩衝液（PH6.9）。 15℃で20時間反応させ二重鎖cDNAを合成し
た。反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を
加えて反応を停止させ、二重鎖cDNAをフエノ
ール−クロロホルム混液で抽出し、エタノール
により沈殿させ回収した。 得られた二重鎖cDNAの沈殿を、50ｍＭ酢酸
ナトリウム（PH4.5）、１ｍＭ、ZnSO4、200ｍ
Ｍ NaCl、0.5％グリセロール及びS1ヌクレア
ーゼ0.5単位を含有する水溶液100μに溶解し、
37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂さ
せた。反応はEDTA水溶液を添加して停止さ
せ、フエノール−クロロホルム混液で抽出し、
更にエーテルで再抽出した後、エタノールによ
り沈殿さてcDNAを回収した。 (3) オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製 上記により得られた二重鎖cDNAに次の組成
の反応緩衝液100μを加え37℃で20分間反応
させ、二重鎖cDNAにオリゴ（dC）テールを
付加させた。 反応緩衝液； １ｍＭ CoCl2、0.1ｍＭジチオスレイトー
ル、0.2μｇポリ(A)、0.1ｍＭ 3H−dCTP（比活
性5400cpm／ｐ mole）及び10単位ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
を含有する130ｍＭカコジル酸ナトリウム630ｍ
Ｍ Tris.HCl緩衝液（PH6.8）。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、
フエノール−クロロホルム混液で抽出し、更に
エーテルで再抽出した後、オリゴ（dC）テー
ル付加cDNAをエタノールにより沈殿させ回収
した。これを10ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH
7.4）、１ｍＭ EDTA及び100ｍＭ NaClを含
む水溶液に１ml当たり2μｇのオリゴ（dC）テ
ール付加cDNAを含むように溶解した。 (4) オリゴ（dG）テール付加プラスミド
pBR322DNAの調製 20ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）、10ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ （NH4）2SO4及び１ml当り
0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液100μ
にpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素Pstエ
ンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間
反応させた。反応終了後、反応液をフエノール
抽出し、水層からエタノール沈殿によつて
DNAを回収した。得られたDNAを前述のオリ
ゴ（dC）テール付加に用いた水溶液（但し 3H
−dCTPの代りに 3H−dGTPを含む）200μ
に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ80単位を用いて37℃で20分
間反応させ、約10〜15個のdG残基を取り込ま
せた。反応液を水飽和フエノール−クロロホル
ム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によ
つてオリゴ（dG）テール付加プラスミド
pBR322DNAを回収した。これをオリゴ（dC）
テール付加cDNAの場合と同様の緩衝液に１ml
当り2μｇのオリゴ（dG）テール付加プラスミ
ドpBR322DNAを含むように溶解した。 (5) 組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（dC）テール付加cDNA溶液50μを
オリゴ（dG）テール付加pBR322DNA溶液50μ
と混合し、65℃で10分間、57℃で120分間、
45℃で60分間、35℃で60分間及び室温で60分間
インキユベートしてアニーリングを行い、組み
換え体プラスミド溶液を調製した。 (6) 形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を
用い、E.coliχ1776株を形質転換させた。即ち、
E.coliχ1776株を、ジアミノピメリン酸100μ
ｇ／ml及びチミジン40μｇ／mlを補つたＬ−ブ
ロス20ml中、37℃で吸光度（600nｍ）が0.5と
なるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機で
集め、50ｍＭ CaCl2含有10ｍＭ Tris−HCl
緩衝液（PH7.3）10mlに分散し、０℃で再度遠
心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩衝液２
mlに分散し、０℃で５分間静置した。この分散
液0.2mlに上記組み換え体プラスミド溶液0.1ml
を添加混合し、０℃で15分間静置し、更に42℃
で２分間保持した後、前の培養で用いたのと同
一組成のＬ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪
培養を行つた。この培養液の一部を取り、前述
の成分の他にテトラサイクリン15μｇ／mlを含
むＬ−ブロス寒天平板に広げ37℃で約12時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択して
cDNAライブラリーを作製した。 (7) ハイブリダイゼーシヨン試験 前記のcDNAライブラリーについて、ウサギ
癌壊死因子をコードするcDNAを含むプラスミ
ドを持つ形質転換体をスクリーニングするため
32P標識cDNAプローブを用いるコロニー・ハ
イブリダイゼーシヨン試験をハナハン
（Hanahan）らの方法［Gene、10、63（1980）］
に従つて行つた。 32PcDNAプローブは、誘導
プラス及びマイナス肺胞マクロフアージより上
記(1)項の方法で得たmRNAを鋳型として、(2)
項の方法で合成した。但し、 32P−dCTPは高
放射能比活性のものを用い、高濃度に標識し
た。この試験により誘導プラスのプローブと強
く結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブ
リダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラ
スミドを有する形質転換体を選別した。約２万
個のコロニーから50個のコロニーが選び出され
た。 次いで、これらの選択された菌株についてハ
イブリダイゼーシヨン・トランスレーシヨン試
験を“モレキユラー クローニング”
〔Maniatis、T.、et al.、（ed）“Molecular
Cloning”、329（1982）、Cold Spring Harbor
Lab.、〕に記載の方法に従つて行つた。それぞ
れの形質転換体よりプラスミドDNAを抽出し、
ニトロセルロースフイルター上に加熱変性させ
たのち固定し、これに上記(1)項で得たウサギ癌
壊死因子mRNAを含むpoly(A)mRNA画分を加
え、50℃で180分間反応させ、ハイブリダイゼ
ーシヨンを行つた。結合したmRNAを溶出回
収した後アフリカツメガエルの卵母細胞に注入
し、回収されたmRNAがウサギ癌壊死因子
mRNAであるか否かを検定した。この試験に
より、上記で選択された20個の形質転換体より
ウサギ癌壊死因子mRNAと強くハイブリダイ
ズするcDNAを含むプラスミドを持つ菌株３個
を見いだした。そのうち最も長いcDNA（約
750bp）を有するプラスミドより、制限酵素
DdeでDNA断片を切り出し、二次スクリー
ニング用のプローブとした。このDNA断片を
32Pで標識し、上記(6)項で得たcDNAライブラ
リーについて再度コロニー・ハイブリダイゼー
シヨン試験を行い、標識プローブと強く結合す
るcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体を
選んだ。cDNAライブラリーの約６万個のコロ
ニーのうち98個が陽性コロニーであつた。これ
からcDNAを制限酵素Pstで切り出し、その
サイズをポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、1kbp以上のサイズを有する17個のクロー
ンを選び出した。これらのうち最も大きな
cDNAを含む形質転換体（菌体番号：
PTNF802、クローン化DNA番号：
pRTNF802）について、クローン化DNAを単
離し、後述の方法で塩基配列を決定した。 (8) クローン化DNAの塩基配列の決定 (7)項で選択された菌株（RTNF802）をジア
ミノピメリン酸及びチミジンを添加したＬ−ブ
ロスで培養して菌体を得た。この菌体をウイル
キー（Wilkie）らの方法［Nucleic Acids
Res.、７、859（1979）］に従つて処理し、プラ
スミドDNAを得た。このプラスミドDNAを制
限酵素Pstで分解し、分離精製してクローン
化DNAを得た。このクローン化DNA断片を
種々の制限酵素で分解し、適当な制限酵素断片
についてそれぞれの塩基配列をマキサム−ギル
バート（Maxam−Gilbert）法により脱リン酸
化、 32Pによる末端標識、塩基特異的化学分解
反応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフイ
ーを行い決定した。 その塩基配列は第１表の通りである。 参考例 ３ ウサギ癌壊死因子の単離精製 ウサギ（体重2.5〜3.0Kg）にプロピオニバクテ
リウム アクネス（Propionibacterium acnes）
死菌体50mgを耳静脈より注射した。８日後にエン
ドトキシン（大腸菌由来のリポポリサツカライ
ド）100μｇを耳静脈より注射し、２時間後に心
臓より全採血した。採取した血液に100ml当り100
単位のヘパリンナトリウムを加えた後、5000rpm
で30分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固形
物を除去した。400羽のウサギより3000単位／ml
の力価を有する血漿24が得られた。 この血漿24にEDTA24ｇ及びセライト240ｇ
を加えて１時間攪拌した後、孔径3μ、1μ及び0.2μ
のフイルターで順次濾過した。 濾液24に0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）
12を加えた後、0.1M NaClを含む0.04M Tris
−HCl緩衝液（PH7.8）で十分に平衡化した
DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア社）
のカラム（27×45cm）に徐々に付した。次いでカ
ラム平衡化緩衝液75及び0.15M NaClを含む
0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）50で順次洗
浄後、0.18M NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝
液（PH7.2）を用いて溶出した。溶出液は８ず
つ分画して活性画分を集めた。この活性画分に同
容量の0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）を加え
て希釈した後、DEAE−セフアロースCL−6Bの
カラム（10×13cm）に付した。次いで0.1M
NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）１
を用いて洗浄した後、0.18M NaClを含む
0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.2）５を用いて
溶出した。溶出液は250mlずつ分画して活性画分
を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し70℃の湯浴中に浸
し、攪拌しながら溶出液の温度が60℃になるまで
加熱した。その後60℃の別の湯浴に移し、30分間
加熱処理した後、速やかに４℃に冷却した。加熱
処理した溶液は、限外濾過により濃縮した。 0.1M NaClを含む0.005Mリン酸緩衝液（PH
7.4）で十分に平衡化したセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社）のカラム（５×80cm）に上記
濃縮液を付し、同緩衝液で溶出した。40mlずつ分
画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮し
た。 ゲル濾過によつて得られた活性画分の濃縮液を
Zn2+キレートセフアロースカラムに付した。ポ
ラス（Porath）らの方法〔Nature、258、598
（1975）〕で得られたキレートセフアロース（イミ
ノジ酢酸固定化樹脂）を充填したカラム（1.6×
20cm）に、１mg／mlの塩化亜鉛水溶液120mlを流
した。次いで0.1M NaClを含む0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.4）で十分に平衡化した後、前工程で得
られた濃縮液を付し、同緩衝液で溶出した非吸着
画分を採取した。活性はこの画分にほとんどが回
収された。前精製工程で得られた活性画分を濃縮
し、0.15M NaClを含む0.005Mリン酸緩衝液（PH
7.4）で十分に平衡化したトヨパールHW−55（東
洋ソーダ株式会社）のカラム（1.5×90cm）に付
した。同緩衝液で溶出し活性画分を採取した。全
精製工程を通しての活性の回収率は60％、精製度
は7.5×104倍であつた。このようにして得られた
精製ウサギ癌壊死因子の比活性は6.0×106単位／
mg蛋白質であつた（活性単位の定義は特開昭58−
174330号のそれと同じである）。また、マウスに
移植したMeth Ａ肉腫を用いる生物評価におい
て、１匹当り3000〜5000単位を静脈内に投与した
場合の活性は（＋）以上であつた。 試験例 ヒト癌壊死因子の免疫学的性質 実施例の(9)項で得られた、プラスミドpHTNF
−13による形質転換体の抽出液に、参考例１で調
製した精製抗ウサギ癌壊死因子抗血清の100倍希
釈液を等量加えた。混液を37℃で２時間インキユ
ベートした後、Ｌ−929細胞に対する細胞傷害活
性を測定した。結果を第５表に示す。第５表から
明らかなように、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊死
因子と免疫学的に全く交差しない。 【表】 出液
れらをコードするクローン化DNA、それらクロ
ーン化DNAを組込んだベクター及びそれらのベ
クターで形質転換された宿主に関する。 本明細書では記載の簡略化のために以下の略号
を使用する。 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フエニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトフアン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 オリゴ（dC） オリゴデオキシシチジル酸 オリゴ（dG） オリゴデオキシグアニル酸 オリゴ（dT） オリゴデオキシチミジル酸 ポリ(A) ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ） ポリウリジル酸 ポリ（dA） ポリデオキシアデニル酸 ポリ（dC） ポリデオキシシチジル酸 ポリ（dG） ポリデオキシグアニル酸 ポリ（dT） ポリデオキシチミジル酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 bp 塩基対 Carswellらは、あらかじめbacillus Calmette
−Gue′rin（BCG）で感染させ、次いでエンドト
キシンで処理したマウスの血清中には、移植した
Meth Ａ肉腫による癌を壊死させる物質が含まれ
ていることを見いだし、この物質を癌壊死因子と
名づけた［Proc.Nat.Acad.Sci.USA、72、3666
（1975）］。 癌壊死因子はマクロフアージから放出される生
理活性物質と考えられており、その特徴として、
(i)担癌動物に投与するとある種の癌を壊死させ治
癒せしめること(ii)in vitroである種の癌細胞（例
えばマウスの癌細胞であるＬ細胞、ヒト癌由来の
PC−10細胞）を傷害するが、正常細胞にはほと
んど有害な作用を及ぼさないこと、及び(iii)その作
用が種特異的でないことなどが知られている。こ
のような特徴の故に癌壊死因子は、新しいタイプ
の制癌剤としてその臨床的応用が強く期待されて
いる。 しかしながら、従来の癌壊死因子製造法はマウ
スやウサギなどの動物にBCG又は
Propionibacterium acnesを注射し、次いでエン
ドトキシンを投与した後その血液及び体液より癌
壊死因子を単離精製するものであるため、安定し
て多量の癌壊死因子を安価に得ることは難しい状
況であつた。更に、癌壊死因子を医薬として使用
するためには、抗原性等の観点からヒト由来の癌
壊死因子がより好ましいが、上記方法はヒト由来
の癌壊死因子製造には採用できない。 従来、ヒトマクロフアージ由来の癌細胞傷害因
子として、Matthewsにより報告された、正常人
の末梢単球細胞あるいは骨髄性単球性白血病細胞
が産生する因子（Anti−tumor cytotoxin）
［Immunology、44、135（1981）］及びReedらに
より報告された、ヒト末梢血中の培養器壁付着細
胞が産生する因子（Adherent cell toxin）［J.
Immunol.、115、395（1975）］などが知られてい
る。また、Williamsonらは、ヒトＢ細胞樹立株
から産生される分子量約７万ダルトンの物質をヒ
ト癌壊死因子として報告している［Proc.Nat.
Acad.Sci.USA、80、5397（1983）］。しかし、い
ずれの場合もその物質としての実体は不明であつ
た。 本発明者らは、ヒト由来の癌壊死因子の大量生
産法を確立するために、遺伝子組換え技術に着目
して鋭意研究を行い、まずウサギ癌壊死因子をコ
ードするクローン化DNAの単離に成功した（特
願昭58−228790号参照）。更に研究を続けた結果、
このクローン化DNAをプローブとして、ヒト癌
壊死因子をコードするcDNAをクローン化するこ
とに成功し、更にこのクローン化DNAを組込ん
だプラスミドで形質転換された微生物がヒト癌壊
死因子を産生することを確認して本発明を完成し
た。 本明細書において、ヒト癌壊死因子とはヒト由
来細胞が産生する蛋白質であつて、in vitroで少
なくともＬ細胞を傷害する能力、及びin vivoで
少なくとも移植したMeth Ａ肉腫による癌を壊死
させる能力を有するものを意味し、癌壊死因子活
性とは、このような生物活性を意味する。 本発明は、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又は
その活性中心部分を含むポリペプチド、及びそれ
らをコードするクローン化DNAを提供するもの
である。特に、次のアミノ酸配列（） Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
Phe Gly Ile Ile Ala Leu （） を有するヒト癌壊死因子［以下ポリペプチド
（）と記す］、ポリペプチド（）のＮ末端に更
に次のアミノ酸配列（） Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp
Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Lys
Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg
Cys Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu
Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys
Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln
Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu
Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg
（） を有するポリペプチド［以下ポリペプチド（＋
）と記す］、及びポリペプチド（）のＮ末端
にMetを有するポリペプチド、並びに次の塩基配
列（） （5′）−TCA TCT TCT CGA ACC CCG
AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT
GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG
CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC
GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG
TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC
ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC
ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC
CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT
GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG
GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC
AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT
CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG
AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG
ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC
TTT GCC GAC TCT GGG CAG GTC TAC
TTT GGG ATC ATT GCC CTG−（3′）
（） を有する、ポリプペプチド（）をコードするク
ローン化DNA［以下DNA（）と記す］及び
DNA（）の5′末端に更に次の塩基配列（） （5′）−ATG AGC ACT GAA AGC ATG
ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG
GAG GCG CTC CCC AAG AAG ACA GGG
GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC
TTG TTC CTC AGC CTC TTC TCC TTC
CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG
CTC TTC TGC CTG CTG CAC TTT GGA
GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG
TTC CCC AGG GAC CTC TCT CTA ATC
AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA
−（3′） （） を有する、ポリペプチド（＋）をコードする
クローン化DNA［以下DNA（＋）と記す］、
及びDNA（）の5′末端に開始コドンATGを有
するDNAを提供するものである。 本明細書において、ヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列を含むポリペプチドとは、ポリペプチド
（）又はそのＮ末端又はＣ末端にアミノ酸又は
ペプチドが結合しているポリペプチドであつて、
それ自身が、又は酵素等により切断されて生じる
ポリペプチドがポリペプチド（）と同様のヒト
癌壊死因子活性を示すものを意味する。また、ヒ
ト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性中心部分を含
むポリペプチド（）のアミノ酸配列のうちヒト
癌壊死因子活性を発現するのに必須のアミノ酸配
列を含むポリペプチドであつて、ポリペプチド
（）と同様のヒト癌壊死因子活性を示すものを
意味する。本発明には、ヒト癌壊死因子のアミノ
酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチ
ド、それらをコードするDNA、それらのDNAを
組込んだベクター及びそれらのベクターで形質転
換された宿主だけでなく、得られたポリペプチド
が本発明のポリペプチド（）と高い相同性を有
し、同様のヒト癌壊死因子活性を示し、かつ免疫
学的に交差するものである限り、そのようなポリ
ペプチド並びにそれらをコードするDNA、それ
らのDNAを組込んだベクター及びそれらのベク
ターで形質転換された宿主も又含まれる。例え
ば、ヒト癌壊死因子DNAの対立遺伝子変異体及
び遺伝子コードの縮重又は一部の修飾を含むヒト
癌壊死因子DNAの誘導体及びこれらから得られ
るポリペプチドも又本発明に含まれる。なお、一
部の修飾を含むヒト癌壊死因子DNAの誘導体と
は、ヒト癌壊死因子DNAの一部が欠失した誘導
体及びヒト癌壊死因子DNAに他のDNA断片が付
加した誘導体を意味する。 本発明のヒト癌壊死因子をコードする塩基配列
を有するDNAは、例えば次のようにして製造す
ることができる。 (1) ウサギ癌壊死因子をコードするクローン化
DNAの調製 特願昭58−228790号に開示されている方法
（例えば参考例２の方法）に従つて、ウサギ癌
壊死因子cDNAを得る。このクローン化DNA
の塩基配列は第１表に示す通りで、ウサギ癌壊
死因子のポリペプチドをコードする領域は第
277〜738番である。 このウサギ癌壊死因子cDNAに、適当な長さ
のDNA断片を与えるように制限酵素を作用さ
せてDNA断片を切り出し、以下に述べるヒト
癌壊死因子cDNAのクローニングのためのプロ
ーブとする。制限酵素としては、例えばAva
、Hae、BstN、Hinc、Rsaが挙げ
られる。DNA断片は異なる領域に由来する２
種以上のものを使用するのが好ましい。第１表
には、制限酵素としてAva及びHaeを用い
て、それぞれ299bp及び88bpのDNA断片を切
り出す場合の切断部位を示している。 【表】 ｜ ｜
｜ ｜
｜ ｜
A A G C C T C T A G C C C A C
G T A G T A G C A A A C C C G C A
A G T G G A G G G C C A G C T C
C A G T G G C T G A G C
T T C G G A G A T C G G G T G
C A T C A T C G T T T G G G C G T
T C A C C T C C C G G T C G A G
G T C A C C G A C T C G
370 380
390 400
410 420
｜ ｜
｜ ｜
｜ ｜
C A G C G T G C G A A C G C C
C T G C T G G C C A A C G G C A T
G A A G C T C A C G G A C A A C
C A G C T G G T G G T G
G T C G C A C G C T T G C G G
G A C G A C C G G T T G C C G T A
C T T C G A G T G C C T G T T G
G T C G A C C A C C A C
【表】 ｜ ｜
｜ ｜
｜ ｜
T T T G G G A T C A T T G C C
C T G T G A G G G G A C T G A C C
A C C A C T C C T C C C C C T C
T C C C A C C C C A G C
A A A C C C T A G T A A C G G
G A C A C T C C C C T G A C T G G
T G G T G A G G A G G G G G A G
A G G G T G G G G T C G
790 800
｜ ｜
C C C C T C A C T C T G G G C
G C C C T C A G
G G G G A G T G A G A C C C G
C G G G A G T C
〓 〓内はウサギ癌壊死因子をコードする領域
を示す。
(2) ヒト癌壊死因子mRNAの調製 ヒトのマクロフアージを肺胞、血液、腹腔、
胎盤、脾臓、その他の組織から採取する。例え
ば、肺胞からはSoneらの方法［J.Immunol.、
129、1313（1982）］、血液からはMatthewsの方
法［Br.J.Cancer、48、405（1983）］、胎盤から
はWilsonらの方法［J.Immunological
Methods、56、305（1983）］により採取する。
このマクロフアージを培養器面１cm2当たり約２
×104〜106個播き、35〜38℃、好ましくは約37
℃、約５〜10％炭酸ガス含有空気中、湿度約90
〜100％で約30分〜２時間前培養する。次いで
グラム陰性菌より得られたエンドトキシン、例
えば大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来のリポポリ
サツカライドを加え、更に培養を３〜８時間継
続してヒト癌壊死因子mRNAの産生を誘導さ
せる。このとき蛋白合成阻害剤（例えばシクロ
ヘキシミド）を加えることにより、ヒト癌壊死
因子mRNAを蓄積させることができる。なお
前培養は省略してもよい。エンドトキシンの添
加量は、一般に約0.1〜1000μｇ／ml（最終濃
度、以下同じ）、好ましくは約１〜100μｇ／ml
である。この際、ホルボール−12−ミリステー
ト−13−アセテート、ホルボール−12，13−ジ
デカノエート、ホルボール−12，13−ジベンゾ
エートのようなホルボールエステル類を約１〜
2000nｇ／ml添加してもよい。蛋白合成阻害剤
の添加量は、化合物の種類等により異なるが、
例えばシクロヘキシミドの場合、0.1〜50μｇ／
mlである。培地としては、高等動物細胞の培養
に適した各種合成培地が用いられ、例えば
RPMI−1640、イーグルのMEM培地、ダルベ
ツコ変法によるMEM培地（以上の培地の組成
については、例えば宗村庚修編「細胞培養マニ
ユアル」、講談社、1982年に記載されている）
が挙げられる。培地には、全培養液量の約１〜
20％の動物血清（例えば牛胎児血清、子牛血
清）を加えておくのが好ましい。培養終了後、
細胞より常法、例えばChirgwinらの方法
［Biochemistry、18、5294（1979）］により全
RNAを抽出し、次いでこれを常法に従つてオ
リゴ（dT）セルロース又はポリ（Ｕ）セフア
ロース（フアルマシア社）などを用いる吸着カ
ラムクロマトグラフイーに付すか又はバツチ法
によりpoly(A)mRNA画分を分離する。この
poly(A)mRNA画分を酸性尿素アガロースゲル
電気泳動又はシヨ糖密度勾配遠心分離に付すこ
とにより、ヒト癌壊死因子mRNAを濃縮精製
することができる。 ここに得られたmRNA画分が目的とするヒ
ト癌壊死因子をコードするmRNAを含有して
いることを確認するためには、mRNAを蛋白
質に翻訳させてその生物活性を調べればよい。
例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis）
の卵母細胞、網状赤血球ライセート、小麦胚芽
のような適当な蛋白合成系にmRNAを注入又
は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマ
ウスＬ−929細胞に対して細胞傷害活性を示す
ことを確認することにより行われる。なお、ア
フリカツメガエルの卵母細胞を用いる方法は、
例えば次のようにして行われる。卵母細胞１個
当たり約50nｇのmRNAをマイクロインジエク
シヨン法で注入し、その10個を100μのバー
ス培養液［Gurdon、J.B.、J.Embryol.Exp.
Morphol.、20、401（1968）］中、22℃で24〜72
時間培養し、ホモジナイズした後、その遠心上
清液（10000rpm、10分間）を検体として、Ｌ
−929細胞傷害活性を指標として癌壊死因子活
性を測定する［Ｌ−929細胞傷害活性の測定法
はRuff、M.R.、et al.、J.Immunol.、125、
1671（1980）に記載されている］。 (3) ヒト癌壊死因子cDNAのクローニング (2)の工程で得られたmRNAを鋳型とし、
Gublerらの方法［Gene、25、263（1983）］に従
つてオリゴ（dT）をプライマーとして、
dATP、dGTP、dCTP、dTTPの存在下で逆
転写酵素（例えばトリ骨髄性白血病ウイルス由
来逆転写酵素）によりmRNAと相補的な単鎖
cDNAを合成し、次いで大腸菌リボヌクレアー
ゼＨと大腸菌DNAポリメラーゼを用いて二
重鎖cDNAを合成する。ここに得られたDNA
を、ポリ（dG）−ポリ（dC）又はポリ（dA）−
ポリ（dT）ホモポリマー伸長法［Noda、M.、
et al.、Nature、295、202（1982）；Nelson、
T.S.、“Methods in Enzymology、”68、41
（1979）、Academic Press Inc.、New York］
のような常法に従つて、例えばプラスミド
pBR322の制限酵素Pst切断部位に組込ませ
る。得られた組換えプラスミドを、例えば
Cohenらの方法［Proc.Nat.Acad.Sci.USA、
69、2110（1972）］に準じて、例えばE.coli
χ1776株のような宿主に導入して形質転換さ
せ、テトラサイクリン耐性株を選択してcDNA
ライブラリーを作製する。 このcDNAライブラリーについて、(1)の工程
で得たウサギ癌壊死因子をコードするDNAの
断片を 32Pで標識したものをプローブとして、
コロニー・ハイブリダイゼーシヨン試験
［Hanahan、D.、et al.、Gene、10、63
（1980）］を行い、ウサギ癌壊死因子cDNA断片
とハイブリダイズするクローンをスクリーニン
グする。 このようにして得られた多くのクローン化
DNAについて、例えばMaxam−Gilbert法
［Proc.Nat.Acad.Sci.USA、74、560（1977）］に
従つて塩基配列を解析し、既に明らかになつてい
るウサギ癌壊死因子の塩基配列と相同性のある塩
基配列を探し、最終的にヒト癌壊死因子の全翻訳
領域に対応する塩基配列を含むcDNAを選び出す
ことにより、ヒト癌壊死因子ポリペプチドをコー
ドする塩基配列を有するクローン化DNAを得る
ことができる。 ここに得られたクローン化DNAの組込まれた
組換えプラスミドを、例えばE.coli HB101株の
ような宿主に導入して形質転換体を得た後、これ
を培養し、Ｌ−929細胞傷害活性を指標にして蛋
白質を分離、精製することにより、ヒト癌壊死因
子ポリペプチドを得ることができる。 更に形質発現効率を上げるためには、本発明の
クローン化DNAのヒト癌壊死因子をコードする
領域を適当な制限酵素で切り出した後、適当なプ
ロモーターを有する形質発現ベクターに組込んで
ヒト癌壊死因子ポリペプチド生産用ベクターを作
製すればよい。 例えば、実施例でクローン化したヒト癌壊死因
子をコードするDNAを添付図面に示す如く、制
限酵素Avaで処理し、第４表の塩基配列の第
250番目以降のDNAフラグメントを取得し、5′末
端側の欠失部分（TCA−TCT−TCT−CGA−
ACC）に開始コドンATGを付したDNAを化学
合成し、これを上記のAva切断部に結合させた
後、プロモーターを有する形質発現ベクターに組
込めばよい。プロモーターとしては、例えばlac
プロモーター、trpプロモーター、tacプロモータ
ー、PLプロモーター、SV40初期プロモーターな
どが挙げられる。ベクターとしては、形質転換さ
せる宿主中で増殖するものはすべて用いることが
できる。例えばプラスミド（pBR322、pDR540
など）、フアージ（ラムダフアージ誘導体など）、
ウイルス（SV40など）が挙げられる。これらは
単独で、又はそれらの組合わせ、例えばpBR322
−SV40ハイブリツドプラスミドなどの形で用い
てもよい。 ここに得られたクローン化DNAを組込んだベ
クターを常法により適当な宿主に作用させて形質
転換させることにより形質発現宿主が得られる。
形質転換に用いられる宿主としては、例えば大腸
菌、枯草菌、酵母などの微生物、COS monkey
細胞などの動物培養細胞及び植物培養細胞が挙げ
られる。 かくして得られる形質転換体を常法に従い培養
し、培養物をTNF活性を指標として精製するこ
とにより、ヒト癌壊死因子ポリペプチドを得るこ
とができる。 本発明のヒト癌壊死因子は、ウサギ癌壊死因子
と極めて相同性の高いアミノ酸配列を有してお
り、DNA塩基配列においても高い相同性が認め
られる。第２表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊
死因子の前駆体のアミノ酸配列の相同性を示し、
第３表にヒト癌壊死因子及びウサギ癌壊死因子の
前駆体をコードするDNAの塩基配列の相同性を
示す。特願昭58−228790号で説明しているよう
に、ウサギ癌壊死因子は尿素非存在下では会合体
の形で存在し、第２表に示した第82番目のSerに
始まり、第236番目のLeuに終わる154個のアミノ
酸から成るポリペプチドがその基本構成単位であ
ると考えられている。即ち、前駆体ポリペプチド
のＮ末端部分が生体内で適当な酵素により切断さ
れ、活性化されるものと考えられる。ヒト癌壊死
因子の場合も、第82番目のSerに始まり、第236
番目のLeuで終わる155個のアミノ酸から成るポ
リペプチドがヒト癌壊死因子の基本構成単位であ
ると考えられる。第２及び第３表から明らかなよ
うに、ヒト及びウサギ癌壊死因子のポリペプチド
のアミノ酸配列の相同性は81％であり、それぞれ
をコードするDNA塩基配列の相同性は85％であ
る。また、ヒト癌壊死因子前駆体とウサギ癌壊死
因子前駆体との間にも高い相同性が認められ、ポ
リペプチドのアミノ酸配列の相同性は79％であ
り、塩基配列の相同性は84％である。 ヒト及びウサギ癌壊死因子間のこのように高い
相同性は、両因子が系統発生学的には共通の分子
から派生していることを推測させるとともに、相
同性の極めて高い領域に癌壊死因子の生物活性発
現のために必須の領域があり、癌壊死因子の活性
中心部分であることを示唆している。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ヒト癌壊死因子は、後記試験例で示すように、
ウサギ癌壊死因子とは免疫学的に全く交差せず、
ウサギ癌壊死因子とは免疫学的に区別し得るポリ
ペプチドである。このように、ヒト及びウサギ癌
壊死因子は全体としては高い相同性を示すにもか
かわらず、そのポリペプチドの性質には明らかな
相違がある。 このことは、癌壊死因子の全アミノ酸配列がそ
の生物活性に必須ではなく、活性中心を構成する
部分のアミノ酸配列が同一であればその他の部分
のアミノ酸配列が多少変化し、それに伴つてポリ
ペプチドの性質が変化しても、癌壊死因子の活性
は保持されることを示している。 本発明により明らかにされたヒト癌壊死因子ポ
リペプチドのアミノ酸配列やDNA塩基配列に関
する知見に基づいて、遺伝子組換え技術の常法に
従い、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド又はヒト癌壊死因子の活性中心部分を含
むポリペプチドをコードするDNAあるいは一部
修飾されたヒト癌壊死因子DNAの変異体を得る
ことができるし、それらを用いてヒト癌壊死因子
活性を有するポリペプチドを容易に生産すること
ができる。また、本発明で明らかにされたDNA
塩基配列の一部を化学合成し、これをプローブと
して用いることにより、対立遺伝子変異や遺伝子
コードの縮重のあるヒト癌壊死因子DNAも容易
に入手でき、それらを用いてヒト癌壊死因子活性
を有するポリペプチドを生産することができる。
更に、ヒト癌壊死因子ポリペプチドのアミノ酸配
列に基づいて、それをコードする塩基配列の
DNAを全合成することも可能である。これらは
すべて本発明の範囲内に含まれる。 本発明のヒト癌壊死因子ポリペプチドは、優れ
た抗腫瘍作用を有するので、抗腫瘍剤として悪性
腫瘍の治療に用いることができる。 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定
されるものではない。 実施例 (1) ヒト癌壊死因子をコードするクローン化
DNAを検出するためのプローブの調製 特願昭58−228790号に開示されている方法
（例えば参考例２の方法）に従つて、第１表
（既出）に示すウサギ癌壊死因子をコードする
クローン化DNAを得た。このDNAを制限酵素
Hae及びAvaを用いて切り出し、それぞれ
第33〜120番の88bpから成るDNA断片と第285
〜583番の299bpから成るDNA断片を得た。制
限酵素Avaで切り出した299bpのDNA断片
はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり、
Haeで切り出した88bpのDNA断片はウサギ
癌壊死因子前駆体をコードする領域に相当する
部分である。 この２種のDNA断片を 32Pで標識して、ヒ
ト癌壊死因子cDNAのクローニングのためのプ
ローブとして、(8)項で使用した。 (2) ヒト肺胞マクロフアージからのmRNA画分
の単離 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて
肺胞マクロフアージを6.3×107個採取した。こ
の肺胞マクロフアージを10％牛胎児血清含有の
RPMI−1640培地に懸濁させてペトリデイツシ
ユ（直径８cm）に１枚当たり９×106個となる
ように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空気中、
湿度90〜100％で前培養した。１時間の前培養
の後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリ
サツカライド）、TPA（ホルボール−12−ミリ
ステート−13−アセテート）及びシクロヘキシ
ミドをそれぞれ最終濃度が10μｇ／ml、10n
ｇ／ml及び1μｇ／／mlとなるように添加混和
し、更に培養を継続した。４〜4.5時間後（通
算５〜5.5時間）に培養液を吸引除去し、デイ
ツシユ上に残つたマクロフアージを0.6％ラウ
ロイルサルコシン酸ナトリウムと６ｍＭクエン
酸ナトリウムを含む5Mグアニジルチオシアネ
ート液で溶解し、ホモジナイズした。このホモ
ジネートを0.1M EDTA含有5.7M塩化セシウ
ム水溶液上に重層し、超遠心分離機（RPS27
−２ローター、日立製作所）を用い26500rpm
で20時間遠心し、全RNA画分をペレツトとし
て得た。これを0.35M NaCl、20ｍＭ Tris及
び20ｍＭ EDTAを含む7M尿素液の少量に溶
解し、エタノール沈殿として回収した。全
RNAとして159μｇが得られた。 この全RNA画分を１ｍＭ EDTAを含む10
ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）（以下TE液
という）１mlに溶解し、65℃で５分間加熱し
た。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平
衡化したオリゴ（dT）セルロースカラムに付
し、吸着したpoly(A)mRNAをTE液で溶出する
ことにより、8μｇのpoly(A)mRNAを得た。こ
のpoly(A)mRNAを1.9nｇ／ｎの濃度で蒸留
水に溶解し、これをアフリカツメガエルの卵母
細胞１個当たり50nずつ注入し、前述の方法
に従つて、卵母細胞中で翻訳された蛋白質のＬ
−929細胞傷害活性を測定した。その結果、10
個の卵母細胞のホモジネート0.1ml中に6.6単
位／mlの活性を認め、このpoly(A)mRNA調製
品中にヒト癌壊死因子のmRNAが含まれてい
ることを確認した。 (3) cDNAの合成 (2)項で得られたpoly(A)mRNAを鋳型として
Gublerらの方法［Gene、25、263（1983）］に従
つてcDNAを合成した。 反応液量；40μ 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH8.3）；10ｍＭ
MgCl2；10ｍＭジチオスレイトール；４ｍＭ
ピロホスフエート ナトリウム；1.25ｍＭ
dGTP、dATP、dTTP；0.5ｍＭ dCTP；
0.167μM α− 32P−dCTP（比活性3000Ci／ｍ
mole）；4μｇオリゴ（dT）12〜18；6μｇpoly(A)
mRNA；120単位トリ骨髄性白血病ウイルス由
来逆転写酵素。 43℃で30分間反応させた後、EDTAを加え
て反応を停止させ、フエノール−クロロホルム
混液（１：１）で抽出し、その水層に酢酸アン
モニウムを最終濃度2.5Mになるように加え、
エタノールによる反応生成物（単鎖cDNA−
RNA複合体）を沈殿させた。この単鎖cDNA
−RNA複合体を下記組成の反応緩衝液100μ
に溶解した。 反応緩衝液組成： 20ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.5）；５ｍＭ
MgCl2；10ｍＭ （NH4）2SO4；100ｍＭ
KCl；0.15ｍＭ β−ニコチンアミド アデニ
ン ジヌクレオチド；50μｇ／mlウシ血清アル
ブミン；40μM dGTP、dATP、dTTP、
dCTP；0.9単位大腸菌リボヌクレアーゼＨ；23
単位大腸菌DNAポリメラーゼ。 12℃で60分間、続いて22℃で30分間反応させ
た後、EDTAを加えて反応を停止させ、上記
と同様にフエノール−クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより沈殿させて二重鎖cDNA
を得た。 (4) オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製 (3)項で得られた二重鎖cDNAに次の組成の反
応緩衝液100μを加え、37℃で30分間反応さ
せ、二重鎖cDNAにオリゴ（dC）テールを付
加させた。 反応緩衝液； ２ｍＭ CoCl2、0.2ｍＭジチオスレイトー
ル、0.1ｍＭ α− 32P−dCTP（比活性3Ci／ｍ
mole）及び10単位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフエラーゼを含有する100ｍ
Ｍカコジル酸ナトリウム（PH7.2）。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、
フエノール−クロロホルム混液で抽出し、オリ
ゴ（dC）テール付加cDNAをエタノールによ
り沈殿させ回収した。これを10ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH7.4）、１ｍＭ EDTA及び100
ｍＭ NaClを含む水溶液に１ml当たり2μｇの
オリゴ（dC）テール付加cDNAを含むように
溶解した。 (5) オリゴ（dG）テール付加プラスミド
pBR322DNAの調製 20ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）、10ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ （NH4）2SO4及び１ml当た
り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液
100μにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素Pst
エンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１
時間反応させた。反応終了後、反応液をフエノ
ール−クロロホルム混液で抽出し、水層からエ
タノール沈殿によつてDNAを回収した。得ら
れたDNAを前述のオリゴ（dC）テール付加に
用いた水溶液（但し 32P−dCTPの代わりに
3H−dGTPを含む）200μに溶解し、ターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ80単位を用いて37℃で20分間反応させ、約10
〜15個のdG残基を取り込ませた。反応液をフ
エノール−クロロホルム混液で抽出し、水層か
らエタノール沈殿によつてオリゴ（dG）テー
ル付加プラスミドpBR322DNAを回収した。
これをオリゴ（dC）テール付加cDNAの場合
と同様の緩衝液に１ml当たり20μｇのオリゴ
（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAを含
むように溶解した。 (6) 組換え体プラスミドの作製 (4)項で得られたオリゴ（dC）テール付加
cDNA溶液120μを、(5)項で得られたオリゴ
（dG）テール付加pBR322DNA溶液120μと混
合し、65℃で５分間、57℃で120分間インキユ
ベートしてアニーリングを行い、組換え体プラ
スミド溶液を調製した。 (7) 形質転換体の選択 (6)項で得られた組換え体プラスミド溶液を用
い、E.coliχ1766株（ATCC No.31244）を形質
転換させた。即ち、E.coliχ1776株を、ジアミ
ノピメリン酸100μｇ／ml及びチミジン40μｇ／
mlを補つたＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度
（600nｍ）が0.5となるまで培養し、菌体を４℃
で遠心して集め、50ｍＭ CaCl2含有10ｍＭ
Tris−HCl緩衝液（PH7.3）10mlに分散し、４
℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同
じ緩衝液２mlに分散し、０℃で５分間静置し
た。この分散液0.2mlに(6)項で得られた組換え
体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で
15分間静置し、更に42℃で２分間保持した後、
前の培養で用いたのと同一組成のＬ−ブロス
0.5mlを加えて１時間振盪培養を行つた。この
培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラ
サイクリン15μｇ／mlを含むＬ−ブロス寒天平
板に広げ、37℃で約12時間培養し、テトラサイ
クリン耐性菌を選択してcDNAライブラリーを
作製した。 (8) クローニング (7)項で得られたcDNAライブラリーについ
て、ヒト癌壊死因子をコードするcDNAを含む
プラスミドを持つ形質転換体をスクリーニング
するため、(1)項で得られたウサギ癌壊死因子を
コードするDNAの制限酵素Avaで切り出し
た断片（299bp）の 32P標識物をプローブと
し、コロニー・ハイブリダイゼーシヨン試験を
Hanahanらの方法［Gene、10、63（1980）］に
従つて行つた。約２万個のコロニーから、この
標識プローブと強く結合する塩基配列を含む組
換え体プラスミドを持つ形質転換体43個を選び
出した。 更に、この43個のコロニーについて、制限酵
素Haeで切り出したウサギ癌壊死因子コード
領域の上流に相当するDNA断片（88bp）の
32P標識物をプローブとし、二次スクリーニン
グを行い、このプローブと強くハイブリダイズ
する６個のコロニーを選び出した。この２回の
スクリーニングにより、ウサギ癌壊死因子をコ
ードするDNA塩基配列及びその上流部分と相
同性の高い塩基配列を含むDNAを得た。 (9) 形質発現 (8)項で選ばれた６個のクローン（プラスミド
番号pHTNF−１、−４、−５、−13、−22、−26）
から、それぞれの組換え体プラスミドを取り出
し、E.coli HB101株（ATCC No.33694）を宿
主として形質転換体を得た。それぞれの形質転
換体について、Nagataらの方法［Nature、
284、316（1980）］に準じて50ml培養を行つた。
培地にはLBブロスを用いた。吸光度（600nｍ）
が約0.8になるまで培養し、約３〜５×1010個
の菌体を集めた。0.1％リゾチームを含む50ｍ
Ｍ Tris−HCl緩衝液（PH8.0）と30ｍＭ
NaClより成る溶液の１mlに菌体を懸濁させ、
氷水中で30分間静置した後、凍結融解を６回繰
返して菌体を破壊し、遠心分離して菌体抽出液
を得た。それぞれの形質転換体から得られた抽
出液について、Ｌ−929細胞傷害活性を測定し
た結果、プラスミドpHTNF−13による形質転
換体の抽出液に186.1単位／mlの活性を認めた。 (10) クローン化DNAの塩基配列の決定 (9)項で選択された組換え体プラスミド
pHTNF−13による形質転換体をLBブロスで
培養して菌体を得た。この菌体をWilkieらの
方法［Nucleic Acids Res.、７、859（1979）］
に従つて処理し、プラスミドDNAを得た。こ
のプラスミドDNAを制限酵素Pstで分解し、
分離精製してクローン化DNAを得た。このク
ローン化DNA断片を種々の制限酵素で分解し、
16種の制限酵素断片について、それぞれの塩基
配列をMaxam−Gilbert法により脱リン酸化、
32Pによる末端標識、塩基特異的化学分解反
応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフイー
を行い決定した。 図面に塩基配列決定に用いた制限酵素の切断
部位と塩基配列を決定した方向及び範囲（矢印
で表示）を示す。部分はヒト癌壊死因子前
駆体ポリペプチドをコードする領域を示す。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳され
たアミノ酸配列は第４表の通りである。ヒト癌
壊死因子のポリペプチドをコードする領域は、
第１表に示したウサギ癌壊死因子をコードする
塩基配列との相同性に基づいて推定した。即
ち、ヒト癌壊死因子ポリペプチドは、第４表の
第235〜237番のTCAのコドン（Serに対応）か
ら始まり、第697〜699番のCTG（Leuに対応）
で終わり、155残基のアミノ酸から成つている。
Ｃ末端のロイシンのコドンに続いてTGAの終
止コドンがある。塩基配列第１〜234番はヒト
癌壊死因子の前駆体をコードするために必要な
配列と考えられる。 【表】 【表】 【表】 参考例 １ 抗ウサギ癌壊死因子抗体の作製 特願昭58−228790号に開示されている方法（例
えば参考例３の方法）に従つて得た、精製ウサギ
癌壊死因子1.9×105単位を含む溶液を等量のフロ
インドの完全アジユバンドで乳濁化し、それをモ
ルモツトの背部皮下数カ所に注射した。その後、
１、３及び６週後に同様の方法で免疫した。更に
８週後に、同量の精製ウサギ癌壊死因子を水酸化
アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。最
初の免疫から９週後に心臓より全採血し、遠心分
離により血清を分離することによつて抗ウサギ癌
壊死因子抗体を含む抗血清を得た。 この抗血清を、正常ウサギ血清成分をカツプリ
ングさせたセフアロース4B（フアルマシア社）カ
ラムに３回繰返して通過させることによりウサギ
の血清成分に対する抗体を完全に除去し、ウサギ
癌壊死因子に対する特異抗体のみを含む精製抗血
清を得た。この抗血清は、免疫電気泳動法及びゲ
ル内二重拡散法により精製ウサギ癌壊死因子との
間にのみ単一の沈降線を形成した。この精製抗血
清を約60000倍希釈したものは、ウサギ癌壊死因
子のＬ−929細胞傷害活性500単位を50％中和する
能力を有する。 参考例 ２ (1) ウサギ肺胞マクロフアージからのmRNA分
画の単離精製 ウサギ（体重約2.5Kg）にプロピオニバクテ
リウム アクネス（Propionibacterium
acnes）死菌体を１羽当り100mgの投与量で静
脈内に注入し、８日後に屠殺した。直ちに開胸
気管切開し、気管内に挿入したチユーブを介し
てリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄を繰返
し、肺胞マクロフアージを採取した。12羽のウ
サギより約３×109個の肺胞マクロフアージが
得られた。この肺胞マクロフアージを10％牛胎
児血清含有のRPMI−1640培地に懸濁させてペ
トリデイツシユ（直径８cm）に１枚当り２×
107個となるように播き、37℃で５％炭酸ガス
含有空気中、湿度90〜100％で前培養した。１
時間の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由
来のリポポリサツカライド）、TPA（ホルボー
ル−12−ミリステート−13−アセテート）及び
シクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μ
ｇ／ml、10nｇ／ml及び1μｇ／mlとなるように
添加混和し、更に培養を継続した。４〜4.5時
間後（通算５〜5.5時間）に培養液を吸引除去
し、デイツシユ上に残つたマクロフアージを
0.6％ラウロイルサルコシン酸ナトリウムと６
ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する5Mグアニ
ジルチオシアネート液で溶解しホモジナイズし
た。このホモジネートを0.1M EDTA含有
5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心
分離機（RPS27−２ローター、日立製作所）
を用い26500rpmで20時間遠心し全RNA画分を
ペレツトとして得た。これを0.35M NaCl、20
ｍＭ Tris及び20ｍＭ EDTAを含む7M尿素
液の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収
した。12羽のウサギより全RNAとして5.2mgが
得られた。 この全RNA画分を１ｍＭ EDTAを含む10
ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）（以下TE液
という）２mlに溶解し、65℃で５分間加熱し
た。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加え
た後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平
衡化したオリゴ（dT）セルロースカラムに付
し、吸着したpoly(A)mRNAをTE液で溶出する
ことにより、314μｇのpoly(A)mRNAを得た。
ここで得たpoly(A)mRNAの220μｇをアガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度１％、6M尿素存在
下、PH４）に付し、その分子サイズに従つて７
つの画分に分け、ゲルを融解（70℃、10分間）
させた後、水飽和フエノールによる抽出とクロ
ロホルムによる抽出ののち、エタノールにより
沈殿させて各画分よりpoly(A)mRNAを回収し
た。各画分のpoly(A)mRNAについてアフリカ
ツメガエルの卵母細胞を用いる方法でウサギ癌
壊死因子mRNA量を測定し、分子サイズとし
て1.6〜2.7kbに相当する画分にウサギ癌壊死因
子mRNAを高濃度に回収した。この精製poly
(A)mRNAの比活性は約1230単位／μｇRNAで
あり、末精製poly(A)mRNA調製品の比活性約
320単位／μｇRNAに比べて約４倍に濃縮され
た。 ここで得られた精製poly(A)mRNAを以下の
実験に用いた。 (2) cDNAの合成 精製poly(A)mRNA4μｇを用い以下に示す条
件でcDNAを合成した。 反応液量；100μ 50ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH8.3）；10ｍＭ
MgCl2；70ｍＭ KCl；１ｍＭジチオスレイ
トール；0.5ｍＭ dTTP、dCTP、dATP、
dGTP（但しdCTPは 32Pで標識、比活性4.4×
106cpm／nmole）；3μｇオリゴ（dT）12〜18、80
単位トリ骨髄性白血病ウイルス由来逆転写酵
素。 43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液
で反応を停止させた。フエノール−クロロホル
ム混液（１：１）によりcDNA−mRNA複合
体を抽出し、エタノールにより沈殿させ回収し
た。更に、アルカリ加温処理することにより
mRNAを分解除去した後、合成された単鎖
cDNAをエタノールにより沈殿させた回収し
た。 この単鎖cDNAを下記組成の反応緩衝液40μ
に溶解した。 反応緩衝液； 0.5ｍＭ dATP、dTTP、dGTP、dCTP；
５ｍＭ MgCl2；70ｍＭ KCl；1.5ｍＭ β
−ムルカプトエタノール；８単位大腸菌DNA
ポリメラーゼ（ラージフラグメント）を含有
する0.1Mヘペス（Hepes）緩衝液（PH6.9）。 15℃で20時間反応させ二重鎖cDNAを合成し
た。反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を
加えて反応を停止させ、二重鎖cDNAをフエノ
ール−クロロホルム混液で抽出し、エタノール
により沈殿させ回収した。 得られた二重鎖cDNAの沈殿を、50ｍＭ酢酸
ナトリウム（PH4.5）、１ｍＭ、ZnSO4、200ｍ
Ｍ NaCl、0.5％グリセロール及びS1ヌクレア
ーゼ0.5単位を含有する水溶液100μに溶解し、
37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂さ
せた。反応はEDTA水溶液を添加して停止さ
せ、フエノール−クロロホルム混液で抽出し、
更にエーテルで再抽出した後、エタノールによ
り沈殿さてcDNAを回収した。 (3) オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製 上記により得られた二重鎖cDNAに次の組成
の反応緩衝液100μを加え37℃で20分間反応
させ、二重鎖cDNAにオリゴ（dC）テールを
付加させた。 反応緩衝液； １ｍＭ CoCl2、0.1ｍＭジチオスレイトー
ル、0.2μｇポリ(A)、0.1ｍＭ 3H−dCTP（比活
性5400cpm／ｐ mole）及び10単位ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
を含有する130ｍＭカコジル酸ナトリウム630ｍ
Ｍ Tris.HCl緩衝液（PH6.8）。 反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、
フエノール−クロロホルム混液で抽出し、更に
エーテルで再抽出した後、オリゴ（dC）テー
ル付加cDNAをエタノールにより沈殿させ回収
した。これを10ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH
7.4）、１ｍＭ EDTA及び100ｍＭ NaClを含
む水溶液に１ml当たり2μｇのオリゴ（dC）テ
ール付加cDNAを含むように溶解した。 (4) オリゴ（dG）テール付加プラスミド
pBR322DNAの調製 20ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH7.4）、10ｍＭ
MgCl2、50ｍＭ （NH4）2SO4及び１ml当り
0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液100μ
にpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素Pstエ
ンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間
反応させた。反応終了後、反応液をフエノール
抽出し、水層からエタノール沈殿によつて
DNAを回収した。得られたDNAを前述のオリ
ゴ（dC）テール付加に用いた水溶液（但し 3H
−dCTPの代りに 3H−dGTPを含む）200μ
に溶解し、ターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ80単位を用いて37℃で20分
間反応させ、約10〜15個のdG残基を取り込ま
せた。反応液を水飽和フエノール−クロロホル
ム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によ
つてオリゴ（dG）テール付加プラスミド
pBR322DNAを回収した。これをオリゴ（dC）
テール付加cDNAの場合と同様の緩衝液に１ml
当り2μｇのオリゴ（dG）テール付加プラスミ
ドpBR322DNAを含むように溶解した。 (5) 組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（dC）テール付加cDNA溶液50μを
オリゴ（dG）テール付加pBR322DNA溶液50μ
と混合し、65℃で10分間、57℃で120分間、
45℃で60分間、35℃で60分間及び室温で60分間
インキユベートしてアニーリングを行い、組み
換え体プラスミド溶液を調製した。 (6) 形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を
用い、E.coliχ1776株を形質転換させた。即ち、
E.coliχ1776株を、ジアミノピメリン酸100μ
ｇ／ml及びチミジン40μｇ／mlを補つたＬ−ブ
ロス20ml中、37℃で吸光度（600nｍ）が0.5と
なるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機で
集め、50ｍＭ CaCl2含有10ｍＭ Tris−HCl
緩衝液（PH7.3）10mlに分散し、０℃で再度遠
心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩衝液２
mlに分散し、０℃で５分間静置した。この分散
液0.2mlに上記組み換え体プラスミド溶液0.1ml
を添加混合し、０℃で15分間静置し、更に42℃
で２分間保持した後、前の培養で用いたのと同
一組成のＬ−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪
培養を行つた。この培養液の一部を取り、前述
の成分の他にテトラサイクリン15μｇ／mlを含
むＬ−ブロス寒天平板に広げ37℃で約12時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択して
cDNAライブラリーを作製した。 (7) ハイブリダイゼーシヨン試験 前記のcDNAライブラリーについて、ウサギ
癌壊死因子をコードするcDNAを含むプラスミ
ドを持つ形質転換体をスクリーニングするため
32P標識cDNAプローブを用いるコロニー・ハ
イブリダイゼーシヨン試験をハナハン
（Hanahan）らの方法［Gene、10、63（1980）］
に従つて行つた。 32PcDNAプローブは、誘導
プラス及びマイナス肺胞マクロフアージより上
記(1)項の方法で得たmRNAを鋳型として、(2)
項の方法で合成した。但し、 32P−dCTPは高
放射能比活性のものを用い、高濃度に標識し
た。この試験により誘導プラスのプローブと強
く結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブ
リダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラ
スミドを有する形質転換体を選別した。約２万
個のコロニーから50個のコロニーが選び出され
た。 次いで、これらの選択された菌株についてハ
イブリダイゼーシヨン・トランスレーシヨン試
験を“モレキユラー クローニング”
〔Maniatis、T.、et al.、（ed）“Molecular
Cloning”、329（1982）、Cold Spring Harbor
Lab.、〕に記載の方法に従つて行つた。それぞ
れの形質転換体よりプラスミドDNAを抽出し、
ニトロセルロースフイルター上に加熱変性させ
たのち固定し、これに上記(1)項で得たウサギ癌
壊死因子mRNAを含むpoly(A)mRNA画分を加
え、50℃で180分間反応させ、ハイブリダイゼ
ーシヨンを行つた。結合したmRNAを溶出回
収した後アフリカツメガエルの卵母細胞に注入
し、回収されたmRNAがウサギ癌壊死因子
mRNAであるか否かを検定した。この試験に
より、上記で選択された20個の形質転換体より
ウサギ癌壊死因子mRNAと強くハイブリダイ
ズするcDNAを含むプラスミドを持つ菌株３個
を見いだした。そのうち最も長いcDNA（約
750bp）を有するプラスミドより、制限酵素
DdeでDNA断片を切り出し、二次スクリー
ニング用のプローブとした。このDNA断片を
32Pで標識し、上記(6)項で得たcDNAライブラ
リーについて再度コロニー・ハイブリダイゼー
シヨン試験を行い、標識プローブと強く結合す
るcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体を
選んだ。cDNAライブラリーの約６万個のコロ
ニーのうち98個が陽性コロニーであつた。これ
からcDNAを制限酵素Pstで切り出し、その
サイズをポリアクリルアミドゲル電気泳動で調
べ、1kbp以上のサイズを有する17個のクロー
ンを選び出した。これらのうち最も大きな
cDNAを含む形質転換体（菌体番号：
PTNF802、クローン化DNA番号：
pRTNF802）について、クローン化DNAを単
離し、後述の方法で塩基配列を決定した。 (8) クローン化DNAの塩基配列の決定 (7)項で選択された菌株（RTNF802）をジア
ミノピメリン酸及びチミジンを添加したＬ−ブ
ロスで培養して菌体を得た。この菌体をウイル
キー（Wilkie）らの方法［Nucleic Acids
Res.、７、859（1979）］に従つて処理し、プラ
スミドDNAを得た。このプラスミドDNAを制
限酵素Pstで分解し、分離精製してクローン
化DNAを得た。このクローン化DNA断片を
種々の制限酵素で分解し、適当な制限酵素断片
についてそれぞれの塩基配列をマキサム−ギル
バート（Maxam−Gilbert）法により脱リン酸
化、 32Pによる末端標識、塩基特異的化学分解
反応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフイ
ーを行い決定した。 その塩基配列は第１表の通りである。 参考例 ３ ウサギ癌壊死因子の単離精製 ウサギ（体重2.5〜3.0Kg）にプロピオニバクテ
リウム アクネス（Propionibacterium acnes）
死菌体50mgを耳静脈より注射した。８日後にエン
ドトキシン（大腸菌由来のリポポリサツカライ
ド）100μｇを耳静脈より注射し、２時間後に心
臓より全採血した。採取した血液に100ml当り100
単位のヘパリンナトリウムを加えた後、5000rpm
で30分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固形
物を除去した。400羽のウサギより3000単位／ml
の力価を有する血漿24が得られた。 この血漿24にEDTA24ｇ及びセライト240ｇ
を加えて１時間攪拌した後、孔径3μ、1μ及び0.2μ
のフイルターで順次濾過した。 濾液24に0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）
12を加えた後、0.1M NaClを含む0.04M Tris
−HCl緩衝液（PH7.8）で十分に平衡化した
DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア社）
のカラム（27×45cm）に徐々に付した。次いでカ
ラム平衡化緩衝液75及び0.15M NaClを含む
0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）50で順次洗
浄後、0.18M NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝
液（PH7.2）を用いて溶出した。溶出液は８ず
つ分画して活性画分を集めた。この活性画分に同
容量の0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）を加え
て希釈した後、DEAE−セフアロースCL−6Bの
カラム（10×13cm）に付した。次いで0.1M
NaClを含む0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.8）１
を用いて洗浄した後、0.18M NaClを含む
0.04M Tris−HCl緩衝液（PH7.2）５を用いて
溶出した。溶出液は250mlずつ分画して活性画分
を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し70℃の湯浴中に浸
し、攪拌しながら溶出液の温度が60℃になるまで
加熱した。その後60℃の別の湯浴に移し、30分間
加熱処理した後、速やかに４℃に冷却した。加熱
処理した溶液は、限外濾過により濃縮した。 0.1M NaClを含む0.005Mリン酸緩衝液（PH
7.4）で十分に平衡化したセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社）のカラム（５×80cm）に上記
濃縮液を付し、同緩衝液で溶出した。40mlずつ分
画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮し
た。 ゲル濾過によつて得られた活性画分の濃縮液を
Zn2+キレートセフアロースカラムに付した。ポ
ラス（Porath）らの方法〔Nature、258、598
（1975）〕で得られたキレートセフアロース（イミ
ノジ酢酸固定化樹脂）を充填したカラム（1.6×
20cm）に、１mg／mlの塩化亜鉛水溶液120mlを流
した。次いで0.1M NaClを含む0.05Mリン酸緩衝
液（PH7.4）で十分に平衡化した後、前工程で得
られた濃縮液を付し、同緩衝液で溶出した非吸着
画分を採取した。活性はこの画分にほとんどが回
収された。前精製工程で得られた活性画分を濃縮
し、0.15M NaClを含む0.005Mリン酸緩衝液（PH
7.4）で十分に平衡化したトヨパールHW−55（東
洋ソーダ株式会社）のカラム（1.5×90cm）に付
した。同緩衝液で溶出し活性画分を採取した。全
精製工程を通しての活性の回収率は60％、精製度
は7.5×104倍であつた。このようにして得られた
精製ウサギ癌壊死因子の比活性は6.0×106単位／
mg蛋白質であつた（活性単位の定義は特開昭58−
174330号のそれと同じである）。また、マウスに
移植したMeth Ａ肉腫を用いる生物評価におい
て、１匹当り3000〜5000単位を静脈内に投与した
場合の活性は（＋）以上であつた。 試験例 ヒト癌壊死因子の免疫学的性質 実施例の(9)項で得られた、プラスミドpHTNF
−13による形質転換体の抽出液に、参考例１で調
製した精製抗ウサギ癌壊死因子抗血清の100倍希
釈液を等量加えた。混液を37℃で２時間インキユ
ベートした後、Ｌ−929細胞に対する細胞傷害活
性を測定した。結果を第５表に示す。第５表から
明らかなように、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊死
因子と免疫学的に全く交差しない。 【表】 出液
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト マクロフアージを誘導剤と共に培養
し、該細胞からヒト癌壊死因子mRNAを含む画
分を分離し、逆転写酵素を用いて該mRNAから
単鎖cDNAを作製し、これを二重鎖cDNAに変換
したのち、該DNAをベクターに挿入し、該ベク
ターを宿主に導入し、形質転換せしめ、cDNAラ
イブラリーを作製し、ウサギ癌壊死因子をコード
するDNA若しくはその断片をプローブとして用
い、該ライブラリーよりヒト癌壊死因子をコード
するcDNAをクローン化することを特徴とするヒ
ト癌壊死因子をコードするDNAの製法。 ２ ヒト癌壊死因子をコードするcDNAが下記式
で示されるアミノ酸配列からなるヒト癌壊死因子
をコードするDNA又はその塩基配列を含んでな
るDNAである特許請求の範囲第１項記載のDNA
の製造方法： Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
Phe Gly Ile Ile Ala Leu ３ ヒト癌壊死因子をコードするcDNAが下記式
で示される塩基配列からなるDNA又はその塩基
配列を含んでなるDNAである特許請求の範囲第
１項記載のDNAの製造方法： （5′）−TCA TCT TCT CGA ACC CCG
AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT
GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG
CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC
GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG
TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC
ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC
ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC
CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT
GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG
GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC
AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT
CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG
AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG
ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC
TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC
TTT GGG ATC ATT GCC CTG−（3′） ４ ヒト癌壊死因子をコードするcDNAが下記式
で示されるアミノ酸配列からなるボリペプチドを
コードするDNAである特許請求の範囲第１項記
載のDNAの製造方法： Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp
Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Lys
Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg
Cys Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu
Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys
Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln
Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu
Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu
Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Gln
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His
Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile
Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
Leu Scr Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg
Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val
Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
Ile Ile Ala Leu ５ ヒト癌壊死因子をコードするcDNAが下記式
で示される塩基配列からなるDNAである特許請
求の範囲第１項記載のDNAの製造方法： （5′）−ATG AGC ACT GAA AGC ATG
ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG
GAG GCG CTC CCC AAG AAG ACA GGG
GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC
TTG TTC CTC AGC CTC TTC TCC TTC
CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG
CTC TTC TGC CTG CTG CAC TTT GGA
GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG
TTC CCC AGG GAC CTC TCT CTA ATC
AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA
TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC
AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA
AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC
CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT
GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG
CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG
GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC
ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG
GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT
GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC
CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC
AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC
AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC
CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC
TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG
GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG
GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC
AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT
GCC GAC TCT GGG CAG GTC TAC TTT
GGG ATC ATT GCC CTG−（3′） ６ 下記式で示されるアミノ酸配列からなるヒト
癌壊死因子をコードするDNA又はその塩基配列
を含んでなるDNA： Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys
Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val
Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln
Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser
Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val
Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly
Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr
Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr
Phe Gly Ile Ile Ala Leu ７ ヒト癌壊死因子をコードするDNAが下記式
で示される塩基配列からなるDNA又はその塩基
配列を含んでなるDNAである特許請求の範囲第
６項記載のDNA： （5′）−TCA TCT TCT CGA ACC CCG
AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT
GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG
CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC
GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG
TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC
ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC
ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC
CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT
GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG
GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC
AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT
CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG
AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG
ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC
TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC
TTT GGG ATC ATT GCC CTG−（3′） ８ ヒト癌壊死因子をコードするDNAが下記式
で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードするDNAである特許請求の範囲第６項記
載のDNA： Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp
Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Lys
Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg
Cys Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu
Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys
Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln
Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu
Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val
Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu
Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His
Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile
Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu
Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg
Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val
Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly
Ile Ile Ala Leu ９ ヒト癌壊死因子をコードするDNAが下記式
で示される塩基配列からなるDNAである特許請
求の範囲第６項記載のDNA： （5′）−ATG AGC ACT GAA AGC ATG
ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG
GAG GCG CTC CCC AAG AAG ACA GGG
GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC
TTG TTC CTC AGC CTC TTC TCC TTC
CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG
CTC TTC TGC CTG CTG CAC TTT GGA
GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG
TTC CCC AGG GAC CTC TCT CTA ATC
AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA
TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC
AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA
AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC
CAG TGG CTG ACC CGC CGG GCC AAT
GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG
CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG
GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC
ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG
GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT
GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC
CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC
AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC
AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC
CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC
TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG
GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG
GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC
AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT
GCC GAC TCT GGG CAG GTC TAC TTT
GGG ATC ATT GCC CTG−（3′）
Priority Applications (17)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043617A JPS60185799A (ja) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | ヒト癌壊死因子 |
| DE8585102093T DE3582183D1 (de) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| DE1999175063 DE19975063I2 (de) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | DNS den menschlichen Tumornekrosisfaktor kodierendund das menschliche Tumornekronisfaktor-Polypepti d. |
| EP85102093A EP0155549B1 (en) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| AT85102093T ATE61817T1 (de) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| AU39448/85A AU584608B2 (en) | 1984-03-06 | 1985-03-01 | DNA encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| CA000475653A CA1341240C (en) | 1984-03-06 | 1985-03-04 | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| PH31937A PH22108A (en) | 1984-03-06 | 1985-03-04 | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| DK100985A DK172013B1 (da) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | DNA, vektor indeholdende dette DNA, vært transformeret med vektoren,polypeptid indeholdt i DNA'et og salt deraf, aggregat indeholdende polypeptidet samt pharmaceutisk sammensætning indeholdende polypeptidet eller aggregatet. |
| KR1019850001374A KR920010225B1 (ko) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | 인간암괴사인자 및 그를 코우드하는 dna의 제법 |
| HU85828A HU202921B (en) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | Process for producing coding dns for human tumor necrosis factor the corresponding polypeptide with utilizing them and pharmaceutical compositions containing this polypeptide as active component |
| ES540939A ES8802159A1 (es) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | Un procedimiento de producir un acido desoxirribonucleico (adn)que tiene o contiene una secuencia de base que codificaun polipeptido de factor de necrosis tumoral de humano |
| SU853869300A SU1614765A3 (ru) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК pHTN 713, кодирующей фактор некроза опухоли человека |
| ES550939A ES8703490A1 (es) | 1984-03-06 | 1986-01-16 | Un procedimiento para producir un polipeptido que tiene o contiene un polipeptido de factor de necrosis de tumor humano |
| US08/084,445 US5288852A (en) | 1984-03-06 | 1993-07-01 | Human tumor necrosis factor polypeptides |
| FR99C0037C FR99C0037I2 (ja) | 1984-03-06 | 1999-10-12 | |
| NL990034C NL990034I2 (nl) | 1984-03-06 | 1999-10-12 | DNA dat codeert voor humane tumor necrosis faktor en humane tumor necrosis faktor polypeptide. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59043617A JPS60185799A (ja) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | ヒト癌壊死因子 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63220749A Division JPH01156999A (ja) | 1988-09-03 | 1988-09-03 | ヒト癌壊死因子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60185799A JPS60185799A (ja) | 1985-09-21 |
| JPH0157955B2 true JPH0157955B2 (ja) | 1989-12-08 |
Family
ID=12668798
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59043617A Granted JPS60185799A (ja) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | ヒト癌壊死因子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60185799A (ja) |
| SU (1) | SU1614765A3 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879226A (en) * | 1984-04-06 | 1989-11-07 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel human physiologically active polypeptide |
| GR851626B (ja) * | 1984-07-05 | 1985-11-26 | Genentech Inc | |
| JP2675294B2 (ja) * | 1984-10-15 | 1997-11-12 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
| EP0216786B1 (en) * | 1984-12-21 | 1992-03-18 | Biogen, Inc. | Purification, production and use of tumor necrosis factors |
| DE68926679T2 (de) * | 1988-09-22 | 1996-10-17 | Teijin Ltd | Physiologisch aktives polypeptid, rekombinantes plasmid, rekombinante mikrobielle zellen, medizinisches präparat sowie verfahren zur gewinnung des gereinigten polypeptids |
| JPH0242986A (ja) * | 1989-06-28 | 1990-02-13 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ |
| JPH07101993A (ja) * | 1993-10-01 | 1995-04-18 | Akira Kaji | 新規抗腫瘍性ペプチド |
| ES2924027T3 (es) * | 2010-11-25 | 2022-10-04 | Imcyse Sa | Péptidos inmunogénicos para su uso en la prevención y/o tratamiento de enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunitarias, respuestas inmunitarias a alofactores, enfermedades alérgicas, tumores, rechazo de injerto y respuestas inmunitarias contra vectores virales usados para terapia génica o vacunación génica |
-
1984
- 1984-03-06 JP JP59043617A patent/JPS60185799A/ja active Granted
-
1985
- 1985-03-05 SU SU853869300A patent/SU1614765A3/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SU1614765A3 (ru) | 1990-12-15 |
| JPS60185799A (ja) | 1985-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0155549B1 (en) | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide | |
| JP2557053B2 (ja) | 腫瘍壊死因子の精製、製造および使用法 | |
| US5288852A (en) | Human tumor necrosis factor polypeptides | |
| JPS60252496A (ja) | 新規なヒト生理活性ポリペプチド | |
| EP0146026A2 (en) | DNA encoding rabbit TNF, vector having said DNA inserted thereinto, host transformed with said vector, rabbit TNF polypeptide, and process for production thereof | |
| US5247070A (en) | N-terminal muteins of tumor necrosis factor | |
| JPH107699A (ja) | インターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド | |
| JPH0157955B2 (ja) | ||
| US5519119A (en) | Muteins of TNF pharmaceutical compositions and a method of making | |
| JP2634132B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| JPH0827189A (ja) | インターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 | |
| JP2515975B2 (ja) | 抗腫瘍作用を有するポリペプチド | |
| JP2002523100A (ja) | 新規なヒトリゾチーム遺伝子、それによりコードされたポリペプチド、およびそれらの作製方法 | |
| JPS6034915A (ja) | ポリペプチド | |
| JPH01156999A (ja) | ヒト癌壊死因子 | |
| JP2584206B2 (ja) | ヒト癌壊死因子 | |
| JP2675294B2 (ja) | ヒト腫瘍壊死因子 | |
| JPS60232097A (ja) | ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 | |
| JP2002523099A (ja) | 新規なヒトリゾチーム遺伝子、それによりコードされたポリペプチド、およびそれらの作製方法 | |
| JP3897343B2 (ja) | 免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 | |
| JPH066066B2 (ja) | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の熱処理法 | |
| WO2000012717A1 (en) | A new gene of human lysoenzyme, the encoding polypeptide and methods for preparing them | |
| EP0477791A2 (en) | Polypeptide | |
| JP2544255B2 (ja) | ヒト インタ―ロイキン１活性を有するポリペプチドの製法 | |
| JPH0242986A (ja) | 新規なヒト生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |