JPH0191772A - 新規バチルス・ステアロサーモフィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、種々の有用酵素を菌体外分泌する新規なバ
チルス・ステアロサーモフィルスに関する。

本願発明者らは、ウマのサラブレッドの糞から種々の有
用酵素を菌体外分泌する。新規な好熱菌バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉ　１ｕｓ）を分離することに成功し。

この発明を完成した。

すなわち、この発明は、最少培地で生育でき、アミラー
ゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ。

キシラナーゼ、セルラーゼ及びリパーゼを菌体外゛分泌
するバチルス・ステアロサーモフィルスを提供する。

この発明のバチルス・ステアロサーモフィルスは、上記
６種の有用酵素を菌体外に多量に分泌するのマ、これら
の酵素の製造に用いることができる。これら６種の酵素
を全て産生ずるバチルス・ステアロサーモフィルスは従
来知られていなかったものである。また、上記酵素のそ
れぞれ１種類を産生ずるバチルス・ステアロサーモフィ
ルスはそれぞれ知られているが、本願発明のバチルス・
ステアロサーモフィルスによる酵素の分泌量は、それぞ
れ１種類の酵素を産生ずるバチルス・ステアロサーモフ
ィルスによる分泌量と比較しても多い。

この発明のバチルス・ステアロサーモフィルスハ、最少
培地（組成：　１．４ｇ　Ｋ、ＨＰＯ４、０，６ＸにＨ
２ＰＯ４，０，２１（Ｈシ）ｔｓｏ、　、　０．＋１　
りｓ−ン酸ナトリラム、０．０２１　ＭｇＳＯ４’１ｌ
ｔｏ、　０．５％グルコース）テ生育する。

この発明のバチルス・ステアロサーモフィルスは、温度
５０℃〜６０℃、　ｐＨ５，７〜８で最少培地又はＬ培
地（Ｉ！ペプトン、０．５ｚ酵母エキス、０．５Ｘ　Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ１７，２）又は２倍濃度の培地（２Ｌ培地
）等の培地中で培養することが好ましい。

この発明のバチルス・ステアロサーモフィルスを用いた
上記酵素の生産には次のような利点がある。

１、最少培地で生育するので培地が安価である。

２、後の実施例で明らかになるように、高い菌体濃度で
増殖できるので、培養にかかるコストが低く、また、酵
素の分離精製も容易である。

３、好熱菌であるので、酵素が耐熱性を有し、工業的な
応用範囲が広い。

４、高温で培養するので雑菌汚染の危険が小さい。

５、増殖速度が大きいので生産効率が高い。

６、高温で培養するので冷却水のコストが小さい。

［実施例］ 以下、この発明を、単離されたバチルス・ステアロサー
モフィルスＳＩ６株に基づいて説明する。

バチルス・ステアロサーモフィルスＳＩ６株の半鐘 ウマのサラブレッドの糞を採取し、その中に含まれる細
菌をＬ寒天培地（組成ニドリプトン又はペプトン１０　
ｇハ、イーストエキストラクト５ｇ／ｌ　、　ＮａＣｌ
　５　ｇ／１．寒天１５ｇ／Ｉ　、　ｐＨ７，２）上で
５５℃で培養して単コロニー化し、各コロニーを形成す
る細菌の各・種性質を調べた。その中て、アミラーゼ、
プロテアーゼ、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラー
ゼ及びリパーゼの６種類の酵素を菌体外分泌するものが
１つあり、これをバチルス・ステアロサーモフィルスＳ
Ｉ６株と命名した。これを工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した。受託番号は微工研菌寄第９６３０号で
ある。

バチルス・ステアロサーモフィルスＳＩ６株の性質 バチルス・ステアロサーモフィルスＳＩ６株は以下の性
質を有する。

胞子形成：有り １λ皿ユＩ：無し 左ヱラ：！【支虞：有り グルコース発酵 酸発生：有り ガス発生：無し 翌１１ ｐＨｓ、７での生育：可 ｐＨ５ての生育：不可 生育温度 ７０℃での生育：不可 ６５℃ての生育：可 ５０℃での生育：可 ４５℃での生育：不可 ４０℃での生育：不可 釆邊υ１姓 ストレプトマイシン（ＳＩ１．１１００ＩＬ／ｍｌ）　
　：感受性カナマイシン（Ｋｍ、　２５　ｐｇ／ｍｌ）
　　：感受性エリスロマイシン（Ｅ＋ｓ、　１０１Ｌｇ
／ｍｌ）　　：感受性テトラサイクリン（Ｔｃ、　２５
　ｐｇ／ｍｌ）　　：感受性アンピシリン（＾ｐ、　２
５　ｐｇ／＋ｓｌ）　　：感受性クロラムフェニコール
（Ｃｌ、２５　ＪＬｇ／ｍｌ）　　：感受性 セファロスポリンＣ（Ｃｐ、２５鉢ｇ／ｍｌ）　　：感
受性毘玄上！鵞りとｌ上：有り　（２２±Ｉ　Ｍｄ）ダ
ラム染色：陽性 Ｉ培地におけるノ１育：町 ｌ友１止孟薄”：６．７ ＊５００ｍ１フラスコ内で１００１の２Ｌ培地中て６０
’Ｃ，ｐＨ７，２で８時間培養後の培養液の６６０ｎ■
における吸光度 上記性質のうち、 １．６５℃で生育すること ２　、　ｐｎｓ、７で生育するがｐ１１５では生育しな
いこと３、絶対好気性であること ４、胞子を作ること ５．ダラム陽性であること、及び ６、カタラーゼを生成することから、バージエイの細菌
分類マニュアル第９版に基づき、バチルス・ステアロサ
ーモフィルスであると判定した。

バチルス・ステアロサーモフィルスＳＩＢ株の酵素産生 （１）アミラーゼ生産と活性測定 Ｌ　ｂｒｏｔｈ、５５℃で２０時間培養した後、遠心分
離（８０００ｘｇ、１０分間）で菌体を除き、その上澄
液についてアミラーゼ活性を測定した。

活性測定は、デン粉を基質とし、ジニトロサリチル酸法
により還元力の増加を測定することにより行なった。具
体的方法は（Ｓ、　Ａｉｂａ。

Ｋ、　Ｋｉｔａｉ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｉｍａｎａｋａ；　
”Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎＩＩｅｎｔａ
ｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　４６．　
Ｎｏ、　５゜ｐｐ、１０５’ｌ　−１０６５（１９８３
））に従った。

アミラーゼ活性１単位は、４０℃、３分間の反応により
還元糖（マルトースとして）１霞ｇを生成するのに必要
な量と定義した。

本菌を用いた培養で乾燥細胞ｌ■ｇ当たり１２．Ｆ３３
単の活性が認められた。

（２）プロテアーゼ生産と活性測定 ２１ＭのＣａＣｌ２を含むＬ　ｂｒｏｔｈ、　　５５℃
で１２時間培養した後、遠心分＠（８０００ｘ　ｇ、　
１０　分１１１）で菌体な除き、上澄液を得た。　　　
　゛これを５　ｍＭ　ＣａＣ１，＋　５０８Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ｃＩ　緩衝液（ｐＨ７，５）中で充分透析し、
プロテアーゼ活性を測定した。

プロプアーゼ活性はカゼインの加水分解活性を測定する
ことにより求めた。具体的には、に。

Ｆｕｊｉｉ、　Ｍ、τａｋａｇｉ、　Ｔ、　Ｉａａｎａ
ｋａ　ａｎｄ　Ｓ、　Ａｉｂａ：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１５４．　
Ｎｏ、　２゜ｐ　８３１　（１９８３）に記載の方法に
従った。

なお、プロテアーゼ１単位は、３７℃、１分間にｌルｇ
チロシン相当量の吸光度（２７５ｎ■）を増加するのに
必要なｌＳｙ素量と定義した。

木閑の培養により得られた酵素量は、乾燥細胞ｌ■ｇ当
たり５７単位であった。

（３）プルラナーゼ生産と活性測定 １％可溶性デン粉を含むＬ　ｂｒｏｔｈ中で、５５’Ｃ
，２０時間培養後、遠心分ｇｌ　（８０００Ｘ　ｇ、１
０分間）で菌体を除き、その上澄液についてプルラナー
ゼ活性を測定した。

活性測定は、１％プルランを基質とし、ジニトロサリチ
ル酸法により還元力の増加を測定することにより行なっ
た。具体的には、Ｈ，Ｈ，Ｈｙｕｎａｎｄ　Ｊ、　Ｇ、
　Ｚｅｉｋｕｓ：　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉ
ｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏ
ｌ、　４９．　ｐｐ、１１６８０１１７３　（１９８５
）に従った。

プルラナーゼ１４１位は、６０℃、１分間に還元糖（グ
ルコースとして）ＩＪＬＩｌｏｌを生成するのに必要な
酵素量と定義した。

木菌を用いた培養で０．５単位１１の活性が認められた
。

（４）キシラナーゼ生産と活性測定 ２％キシランを含むＬ　ｂｒｏｔｈにて、５５℃で１５
時間培養後、遠心分子ｌｌＩ　（８０００ｘ　ｇ、　１
０分間）て菌体を除き、その上澄液についてキシラナー
ゼ活性を測定した。

活性測定はキシランを基質とし、生じた還元糖量を測定
することにより行なった。Ａ体重方法はＩｆ、　Ｐａｎ
ｂａｎｇｒｅｄ、　Ａ、　Ｓｈｉｎｍｙｏ、　Ｓ、　Ｋ
ｉｎｏｓｈｉｔａａｎｄ　Ｈ，０ｋａｄａ：　Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ
ｅｔｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　４７．　Ｎｏ、　５．　
ｐｐ、９５７−９５：ｌ　（１９８：ｌ）に従った。

キシラナーゼ１単位は、６０℃、１分間にｌル■ｏｌの
キシロースを生成するのに必要な量と定義した。

本菌を用いた培養で、　１０．５単位／ｍｌの活性が認
められた。

（５）セルラーゼ生産と活性測定 １％カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩を含む
Ｌ　　ｂｒｏｔｈにて５５℃、２０時間培養後、遠心分
離（８０００ｘ　ｇ、　１０分間）で菌体を除き、その
上澄液についてセルラーゼ活性を測定した。

活性測定は、１％Ｈａ−Ｃ肛溶液（５０ｓＭ酢酸ナトリ
ウムに溶解させたもの、　ｐＨ５，５）　０．５■１に
酵素液０．４１を加えて６０℃にて１０分間保温し、生
じた還元糖をキシラナーゼの場合と同様に測定すること
により行なった。

セルラーゼ１単位は、６０℃、１分間に還元糖（クルコ
ースとして）Ｉｇｍｏｌを生成するのに必要な酵素量と
定義した。

木菌の培養により、０．６単位／１の活性が認められた
。

（６）リパーゼ生産と活性測定 ｏ、ｓｘトリブチリンを含むＬ　ｂｒｏｔｈにて、５５
℃、２０時間培養後、遠心分Ｉｌｌ　（８０００ｘ　ｇ
、１０分間）で菌体な除き、その上澄液についてリパー
ゼ活性を測定した。

活性測定はオリーブオイルを２！ｉｎとし、生成酸量を
測定することにより行なった。具体的にはＹ、　Ｏｔａ
、　Ｔ、　Ｎａｋａｍｉｙａ　ａｎｄ　Ｋ、　Ｙａｓａ
ｄａ：Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　ｖｏｌ。

３４、　Ｎｏ、　９．　ｐｐ、１３６８−１３７４　（
１９７０）に従った。

リパーゼ１単位は、３７℃、１分間に酸ＩＪＬｍｏｌを
生成するのに必要な酵素量と定義した。

本菌を用いた培養て、８単位／ｍｌの活性か認められた
。

上記から明らかなように、バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＳＴ６株は、最少培地て生育するので培地のコス
トが安く、また、最大菌体濃度が非常に高いので培養や
酵素の分離、精製の効率が良い、また、上記６種の酵素
を大量に菌体外分泌するのでこれらの酵素の生産に非常
に有用である。さらに、主な抗生物質に対して全て感受
性てあり、遺伝子操作系の改良が容易である。また、潜
在性プラスミドを有するのて、これを組み換えて形質転
換できる可能性がある。このように、バチルス・ステア
ロサーモフィルスＳＩ６株は工業的に非常に重要な価値
を有する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）最少培地で生育でき、アミラーゼ、プロテアーゼ
   、プルラナーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ及びリパー
   ゼを菌体外分泌するバチルス・ステアロサーモフィルス
   。
2. （２）バチルス・ステアロサーモフィルスＳＩ６株であ
   る特許請求の範囲第１項記載のバチルス・ステアロサー
   モフィルス。