JPH0365149B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の利用分野〕 本発明は、新規なα−アミラーゼとその製造方
法に係り、特に殿粉加工及びのり抜きなどにおけ
る殿粉の液化反応に好適な耐熱性α−アミラーゼ
とその製造方法に関する。 〔発明の背景〕 耐熱性酵母は常温用酵素に比べ、加熱やPHの変
化にも安定性が高く、酵素利用工業には極めて有
用である。従来のα−アミラーゼは好気性細菌の
起源とするものに限られている（嶋村等：特公昭
46−12946号公報、L.L.Campbell at al.：J.Biol.
Chem，236，2952 1961年）。そのうち、バチル
ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）及びバチル
ス・リチエニホルミス（Bacillus licheniformis）
を起源とするα−アミラーゼは、すでに工業生産
され、殿粉加工や繊維ののり抜きに使用されてい
る。これら公知のα−アミラーゼは、いずれも酵
素本体のたん白質だけでは耐熱性を発揮できず、
カルシウムイオンの存在下ではじめて耐熱性を示
す。通常数ｍＭ〜20ｍＭ（服部：特開昭51−44652
号公報、特開昭51−44690号公報）、少なくとも１
ｍＭ（斉藤：特開昭48−35083号公報）のカルシウ
ム濃度を必要とする。したがつて、従来の耐熱性
α−アミラーゼは、１ｍＭ未満、カルシウムがな
い場合には、第１図の曲線５，６にバチルス・リ
チエニホルミス起源のα−アミラーゼの１例を示
すように耐熱性が著しく低下する（曲線５，６）。
このため、水道水のカルシウム濃度に相当する
100μM以下の極めて希薄な濃度では、反応中に
失活がおこり、高価な酵素をそれだけ消費するこ
とになる。このため、通常は数ｍＭの塩化カルシ
ウムなどの可溶性カルシウム塩を添加して反応し
ている。しかし、ぶどう糖や異性化糖等に代表さ
れる殿粉加工の最終製品を得る場合には、反応後
にカルシウムを除去することが必要となり、イオ
ン交換樹脂を用いる脱塩工程への負荷が著しく増
大する。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、絶対嫌気性菌を起源とし、耐
熱性にすぐれ、かつカルシウム要求性の極めて低
い新規なα−アミラーゼとその製造方法を提供す
ることにある。 〔発明の概要〕 本発明者等は、耐熱性にすぐれ、かつカルシウ
ム要求性の低いα−アミラーゼを得ることを目的
に酵素及び酵素生産用微生物の探索を行つた。そ
の結果、クロスツリジウム属に属する偏性嫌気性
細菌（クロスツリジウム属細菌RS−0001、
clostridium sp RS−0001、微工研菌寄第7918
号）が、酵素の特性、特にカルシウム要求性なら
びに作用PH域が従来のα−アミラーゼと全く異な
る新規な耐熱性α−アミラーゼを生成することを
見い出し、本発明に至つた。すなわち本発明は、
クロスツリジウム属（clostridium）に属する嫌
気性細菌（微工研菌寄第7918号）が生産する、作
用好適PHが２〜６、最適PHが３〜５、作用至適温
度が60〜85℃で、60℃における最適PH域が４付近
にあり、PH２で81％以上の活性を示し、分子量が
20000以上よりなることを特徴とする耐熱性α−
アミラーゼである。ここで、基質無添加で80％、
30分間加熱処理した際に、0.1ｍＭ以下のカルシ
ウム塩濃度下で少なくとも70％以上のα−アミラ
ーゼ活性を保持するものがよい。また、基質無添
加で80℃、30分間加熱処理した際に、0.1ｍＭ〜
0.1Mのカルシウム塩存在下で100％のα−アミラ
ーゼ活性を保持するものがよい。 また本発明はクロスツリジウム属
（clostridium）に属する嫌気性細菌（微工研菌寄
第7918号）をでん粉、ペプトン及び酵母エキスを
含有する液体培地に嫌気性条件下で培養し、培養
液から新規α−アミラーゼを採取することを特徴
とする耐熱性α−アミラーゼの製造方法である。
本発明のα−アミラーゼを産生するクロスツリジ
ウム属細菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託している（受託番号；微工研菌寄第7918号
（FERM Ｐ−7918））である。まず、本菌の菌学
的性質の詳細を説明する。 Ａ 形態的性質 (1) 栄養細胞の形態 下記の殿粉・ペプトン培地の寒天平板上、
嫌気性雰囲気中、60℃で２日間培養した場
合、栄養細胞は0.4〜0.8×２〜5μｍの大きさ
の直状の桿菌である。３日間以上の培養で
は、上記の形状の栄養細胞が単独に存在する
他、連鎖するものも生ずる。液体培養でも同
様となる。 殿粉・ペプトン培地の組成 可溶性殿粉 1.5％ ペプトン 0.5％ 酵母エキス 0.5％ KH₂PO₄ 0.7％ Na₂HPO₄ 0.35％ MgSO₄・7H₂O 0.001％ 寒 天 2.0％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 水道水 PH6.4 (2) 胞子の有無 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養及び液
体培養で胞子の形成が認められる。 Ｂ 培養的特性 (1) コロニーの形態 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養でのコ
ロニーは、中心部がやや隆起した扁平な円形
となり、周縁部は全縁である。色素生成は見
られず、表面に光択を有し乳白色不透明であ
る。また、粘着性を有する。 (2) 肉汁培地の寒天平板培養及び穿刺絶養生育
して殿粉・ペプトン培地と同様のコロニーを
生ずる。 肉汁寒天培地組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ノトリウム 0.1％ 寒 天 1.5％ 蒸留水 PH6.0 (3) 肉汁培地の穿刺培養 水素と炭素ガスを含むガスの発生を伴つて
生育し、このため寒天培地が２〜３個所で分
断される。 (4) 肉汁液体培養 嫌気的雰囲気下でのみ生育し、培養液が自
濁する。 肉汁培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (5) 肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。 肉汁・ゼラチン培地の組成 肉エキス 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ ゼラチン 15％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ 蒸留水 PH6.0 (6) リトマスミルク培養 ガス発生を伴い、固く凝固し、酸の生成に
より赤変する。 Ｃ 生理的性質 (1) 生育の温度範囲 40〜63％で生育する。30℃では生育認めら
れず、60℃付近で良好。 (2) 生育のPH範囲 PH５〜７。5.6付近が良好。 (3) 酸素に対する態度 偏性嫌気性 (4) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Laifson変法） 空気雰囲気中では生育みられず陰性。流動
パラフイン重層による嫌気性条件下では菌が
生育し、酸を生成して培養液が黄色となる。 培地組成 ペプトン 0.2％ グルコース 1.0％ 食 塩 0.5％ K₂HPO₄ 0.03％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1％ ブロムクレゾールパープル 0.002％ 寒 天 0.3％ 蒸留水 PH6.0 (5) 硝酸塩の還元 陰性。 (6) VPテスト 陰性。 (7) MRテスト 陽性、赤変化する。 (8) インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できな
い。 (9) 硫化水素の生成 陰性（Kligrerの培地使用において）。 (10) 殿粉の加水分解 陽性。可溶性殿粉だけでなく、馬鈴著殿粉
など粒状殿粉も分解する。 (11) クエン酸の利用 陰性（Simmons培地使用において）。 (12) アンモニウム塩の利用 ペプトン水に生育しないため測定でき
ない。 (13) 色素の菌体外生成 陰性。 (14) ウレアーゼ 陰性。 (15) オキシダーゼ 陰性。 (16) カタラーゼ 陰性。 (17) 糖の資化性 糖の資化性及びダラーム管を用いたガ
ス発生有無の観察結果を下表に示す。

【表】 (18) 無機塩培地への生育 生育認められず。 (19) 有機酸の生成 各種培地から生成する有機酸組成を第
２表に示す。

【表】 供試液体培地の組成 炭素源 1.0％ ペプトン 1.0％ 食 塩 0.2％ チオグリコール酸ナトリウム 0.1 蒸留水 PH6.4 これらの結果よりHoldemanの嫌気性細菌分類
マニユアルに基づき、クロスツリジウム属に属す
る細菌と同定した。 次に、本発明なる耐熱性α−アミラーゼの酵素
的特性について記す。 尚、α−アミラーゼ活性の測定方法は次のよう
に行つた。 Blue value法（日本化学会編：実験化学講座
24巻、生物化学、p279、丸善書店、1969）に
よる糊精化力を測定した。本法は、殿粉の分子が
加水分解されるのに伴い、殿粉−より素complex
に基づく青色の発色量が、分子量の低下に比例し
て減少する原理を応用したものである。まず、２
mg／mlの殿粉溶液２ml及び0.1Mくえん酸緩衝液
（PH4.0）１mlを試験管に取り、60℃水浴中で５分
間振盪した。次いで、粗酸素液として培養液１
mlを加え、30分間反応させた。反応後、反応液
0.4mlを採取し、直ちに0.5M酢酸溶液２mlと混合
して酵素反応を停止させた。次のその１mlを10ml
の1/3000Ｎよう素溶液中に加え、680nｍでの吸
光度を分光光度計を用いて測定した。一方、酵素
液を加えた直後の反応液を採取して同様に発色さ
せ、吸光度を測定した。なお、殿粉としては重合
度約2000のアミロースを用いた。 α−アミラーゼ活性は次式により算出した。 α−アミラーゼ活性（単位）＝Otime反応液の
吸光度−30分反応液の吸光度／Otime反応液の吸光度×1
0 (1) 作用及び基質特異性 本酵素は、馬鈴しよ、とうもろこし、甘しよ
等の殿粉を加水分解する液体型α−アミラーゼ
である。 (2) 至適PH 第１図に、従来公知の代表的なα−アミラー
ゼの作用PH曲線を示す。曲線４で示した小笠原
等のバチルス・ズブチリス（J.Biochem.67、
65、1970年）及び曲線６で示した斉藤等のバチ
ルス・リチエニホルミス（特開昭48−35083号
公報）を起源とするα−アミラーゼは、PH４〜
11に好適域を有する（最適PHでの活性の80％を
有するPH域とする）。従来公知の酸性α−アミ
ラーゼのうち、最も酸性側で活性の高い田中等
によるバチルス・リチエニホルミス起源α−ア
ミラーゼ（特開昭52−151970号公報曲線３）で
は好適域が3.5〜6.3にあり、PH２で全く活性を
示さない。 これに対し、本発明なるα−アミラーゼ
（曲線１）ならびにα−アミラーゼ（曲線２）
の60℃における最適PH域は、いずれも４付近に
あり、かつ好適PHはそれぞれ２〜5.7，２〜6.3
にあつて、従来の酸性α−アミラーゼにくら
べ、さらに酸性側でも高い活性を有する。すな
わち、PH２では、従来の酸性α−アミラーゼが
全く活性を示さないのに対し、本発明のα−ア
ミラーゼはそれぞれ95％、81％の高い活性を示
す。 なお、酵素反応は次の反応系を用いた。 酵素液：0.6〜1.3μｇ／ml 基 質：アミロース１mg／ml クエン酸緩衝液：0.025M 上述したように、本発明α−アミラーゼは従
来の酸性α−アミラーゼと作用PH域を異にする
ことから、新しいα−アミラーゼであることは
明らかである。 (3) PH安定性 本発明のα−アミラーゼ及びを、PH２、
４、６、７の各PH（0.025Mクエン酸緩衝液）
下で、60℃、30分間インキユベートした。反応
液を稀釈してPHを4.0に調整し、アミロースを
基質として残存活性を測定した。その結果両α
−アミラーゼは、上記のPH処理で完全に活性が
保持されていた。したがつて、本α−アミラー
ゼは酸性域でも安定性が高い特徴を有してい
る。 (4) 至適温度 第２図に示す如く、本発明α−アミラーゼ
（曲線１１）及び（曲線１２）の至適PH4.0に
おける至適温度は、いずれも80℃付近である。
好適温度（最適温度での活性の80％を有する温
度域とする）は65〜87℃である。なお、反応に
はくえん酸緩衝液0.025Mを用いた。 (5) 熱安定性 本発明α−アミラーゼをPH6.0で20μM塩化
カルシウムの存在下に60〜97℃に加熱処理し、
残存活性を測定した。これをもとに各温度にお
ける活性半減期を求め、その結果を第３図に示
す。80℃及び90℃における活性半減期（基質無
添加）はそれぞれ８時間、0.5時間であり、熱
安定性にすぐれている。α−アミラーゼにつ
いても90℃における活性半減期は約0.5時間と、
α−アミラーゼと同等の耐熱性を有する。一
方、従来のα−アミラーゼの例とし、バチル
ス・リチエニホルミスに属するα−アミラーゼ
生産菌、及びバチルス・ズブチリスに属するα
−アミラーゼ生産菌の培養液から調製した部分
精製α−アミラーゼ標品を用い、カルシウム濃
度20ｍＭにおいて半減期を実測した。この結果
を第３図に付記する。反応は、くえん酸緩衝液
を用いて、両α−アミラーゼの最適PHである
6.0で行つた。前者の80℃における半減期は0.6
時間、後者の70℃いおける半減期は0.6時間で
ある。本発明α−アミラーゼの耐熱性（曲線２
１）は、従来公知のサーマス属の耐熱性α−ア
ミラーゼには及ばないが、バチルス属のα−ア
ミラーゼ（バチルス・リチエニホルシスSP.を
起源とする耐熱性α−アミラーゼ、曲線２２と
くらべ遜色ない。 (6) 液熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明α−アミラーゼの耐熱性に及ぼす金
属塩の影響を第３表に示す。α−アミラーゼ
の水溶液に各種の金属塩を５ｍＭ濃度になる様
に添加し、加熱処理を行つて活性を測定した。
そして、加熱処理前に対する加熱処理後の活
性、すなわち残存活性を％で表示した。加熱処
理及び活性測定は以下の条件で行つた。 加熱処理条件 PH6.0 加熱温度：80℃ 保持時間：30分

〔発明の実施例〕

以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説
明する。 実施例 １ 可溶性殿粉1.5％、ポリペプトン0.5％、酵母エ
キス0.5％、りん酸第１カリウム0.7％、りん酸第
２ソーダ0.35％、硫酸マグネシウム・ク水和物
0.01％、チオグルコール酸ナトリウム0.1％及び
水道水を含む液体培地（PH6.4）4.56Kgを、内容
積５の培養槽３基に152Kgずつ分注し、120℃で
20分間殺菌する。これに同上培地で嫌気的に培養
した本発明者等により分離せるクロズソリジウム
属の菌体懸濁液80ｇを各槽毎に添加した。次い
で、ガス出口に水封トラツプを付し、発酵槽内気
相部をアルゴンガスで十分置換後、嫌気条件下で
培養する。培養液のPHは6.0に自動調整し、温度
も60℃に自動調整する。46時間培養後、培養物を
合せ600rpmで遠心分離し、菌体を除去する。こ
の上澄液は49単位／ｇの比活性を示した。 次に、上記上澄液3.5Kgをモレキユラシーブ膜
（分画分子量：20000）で過し、1.5Kgに濃縮し
た。濃縮液を２分し、0.75Kg分を架橋デキストラ
ンゲル（分画分子量：2500、フアルマシア社製）
を充填したカラム（直径100mm、長さ450mm）にチ
ヤージし、モレキユラシーブ液体クロマトグラフ
イを実施した。そのα−アミラーゼ活性の溶出パ
ターンを第５図に示す。溶出は脱イオン水で行
い、100mlずつ分画した。図中に示すように、溶
出液量1.2〜２のフラクシヨンにα−アミラー
ゼ活性がみとめられた。上記の液体クロマトグラ
フイーをのこりの上澄液についても実施し、両α
−アミラーゼフラクシヨンを合せた。これを
40torrの減圧下で凍結乾燥し、乾燥粗粉末2.7ｇ
を得た。 本粗酵素乾燥標品の比活性は39000単位／ｇで、
上澄液の比活性に比べ約800倍に向上した。活性
収率は約60％である。上清液から粗酵素乾燥標品
調製における比活性、活性収量及び活性回収率の
変化を第４表に示した。

〔発明の効果〕

本発明なる方法により製造せる新しい耐熱性α
−アミラーゼを殿粉の加水分解（液化）に用いれ
ば、水道水なみのカルシウムを含む仕込水です
み、従来行つてきたカルシウムの添加も不要とな
る。さらに、殿粉の液化、糖化両工程での中和も
不要となり、その結果、反応後の脱塩工程への負
荷を大巾に軽減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の耐熱性α−アミラーゼ及び
従来の耐熱性α−アミラーゼに関するα−アミラ
ーゼ活性（糊精化力）に及ぼすPHの影響を示す特
性図、第２図は、本発明の耐熱性α−アミラーゼ
のα−アミラーゼ活性に及ぼす温度の影響を示す
特性図、第３図は、本発明の耐熱性α−アミラー
ゼと従来の耐熱性α−アミラーゼの各例における
耐熱性を示す特性図、第４図は、本発明の耐熱性
α−アミラーゼと従来の耐熱性α−アミラーゼの
各例における加熱処理によるα−アミラーゼ活性
に対するカルシウム濃度の影響を示す特性図、第
５図は、本発明の耐熱性α−アミラーゼの架橋デ
キストランゲルを用いたモレキユラシーブ液体ク
ロマトグラフイのα−アミラーゼ活性溶出パター
ン図、第６図は、本発明の耐熱性α−アミラーゼ
のジエチルアミノエチル化架橋デキストランゲル
を用いたイオン交換液体クロマトグラフイによる
α−アミラーゼ活性溶出パターン図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ クロスツリジウム属（Clostridium）に属す
   る嫌気性細菌（微工研菌寄第7918号）が産生す
   る、作用好適PHが２〜６、最適PHが３〜５、作用
   至適温度が60〜85℃で、60℃における最適PH域が
   ４付近にあり、PH２で81％以上の活性を示し、分
   子量が20000以上よりなることを特徴とする耐熱
   性α−アミラーゼ。 ２ 基質無添加で80℃、30分間加熱処理した際
   に、0.1ｍＭ以下のカルシウム塩濃度下で少なく
   とも70％以上のα−アミラーゼ活性を保持するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の耐熱
   性α−アミラーゼ。 ３ 基質無添加で80℃、30分間加熱処理した際
   に、0.1ｍＭ〜0.1Mのカルシウム塩存在下で100
   ％のα−アミラーゼ活性を保持することを特徴と
   する特許請求の範囲第２項記載の耐熱性α−アミ
   ラーゼ。 ４ クロスツリジウム属（Clostridium）に属す
   る嫌気性細菌（微工研菌寄第7918号）をでん粉、
   ペプトン及び酵母エキスを含有する液体培地に嫌
   気性条件下で培養し、培養液から新規α−アミラ
   ーゼを採取することを特徴とする耐熱性α−アミ
   ラーゼの製造方法。