JPH0192659A - 抗ｆｒ−９００５０６物質抗体、および高感度酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星呈上二」月皇里 この発明は、新規な抗体、高感度酵素免疫測定法および
その測定法を実施するための試験キットに関する。

許らに詳細には、この発明はＦＲ−９００５０６物質中
に存在する抗原決定基を認識する抗体、固定化抗体を利
用するＦＲ−９００５０６物質の高感度酵素免疫測定法
（直接法）、被検物質を認識する第一抗体、および該第
一抗体を認識する固定化された第二抗体とからなる、低
分子物質の高感度酵素免疫測定法（間接法）、および直
接法もしくは間接法によりＦＲ−９００５０６物質を検
出するための試験キットに関する。

′　のｔ′及び　明が　　しようとする、　代ＦＲ−９
００５０６物質は、ストレプトミセス（鈷正匹朋圧朋）
属、特にストレプトミセス・ンクバエンシス（５ｔｒａ
　ｔｏｍ　ａｓｓ　ｔｓｕｋｕｂａａｎｓｉｓ　）　Ｎ
ｏ。

９９９３　（微工研条寄第９２７号）が産生ずる免疫抑
制活性、抗菌活性等の薬理活性を有する化合物で、下記
の構造式を有することが知られている（特開昭６１−１
４ＦＨ８Ｌ号）。

ＦＲ−９００５０６物質は微量で非常に強力な免疫抑制
活性を有するため、例えば臓器移植等の移植の際発現す
る拒絶反応を有効且つ持続的に抑制するには、該化合物
の生体投与後の薬物の血中濃度を容易に、かつ高感度に
モニタリングする技術が必要であり、その為には、微量
濃度を正確に測定する技術の確立が、きわめて重要と考
えられる。

しかしながら、ＦＲ−９００５０６物質の微量濃度を高
感度で且つ簡便に測定する技術は未だ開発きれておらず
、またＦＲ−９００５０６物質の検出において重要な意
味をもつ該物質を認識する抗体も未開発の状況にあった
。

従来、生体試料等に含まれる微量低分子物質の測定法と
しては、ガスクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラ
フィ、ラジオイムノアッセイ法や酵素免疫測定法などが
用いられている。

しかしながら、これらの方法は、（１）微量濃度の薬理
活性物質を測定するには感度が不充分である、（２）操
作が煩雑である、（３）大型装置を必要とする、（４〉
危険なラジオアイソトープを使用しなければならない、
等の問題点があった。

問題点を　決するための手段 本発明の発明者等は、鋭意研究の結果、ＦＲ−９００５
０６物質を認識する抗体を得ることに成功し、次いでこ
の抗体を固定化し、これニＦＲ−９００５０６物質を含
む検体および酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質
を競合的に反応させることにより、微量のＲ−９００５
０６物質を高感度で且つ簡便に検出できることを見い出
した。

更に発明者等は鋭意研究を重ねた結果、被検物質を認識
する第一抗体と、該第一抗体を認識する固定化された第
二抗体を用い、これに被検物質を含む検体および酵素で
標識された被検物質を競合的に反応させることにより、
極めて微量の被検物質をより高感度で且つ簡便に検出す
る測定法を見い出した。また、前記測定を実施する際に
便利な試験キットを作成し、この発明を完成した。

本発明を概説すれば次の４つの発明に分けられる。

（Ｉ　）ＦＲ−９００５０６物質中の抗原決定基を認識
する抗体。

（Ｉ［）ＦＲ−９００５０６物質中に存在する抗原決定
基を認識する抗体を固定化し、該固定化抗体にＦＲ−９
００５０６物質を含む検体および酵素で標識されたＦＲ
−９００５０６物質とを競合的に反応させ、固定化抗体
に結合した酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質を
検出することを特徴とするＦＲ−９００５０６物質の高
感度酵素免疫測定法（直接法）。

（ＩＩＩ）被検物質を認識する第一抗体および該第一抗
体を認識する固定化された第二抗体とからなり、検体に
含まれる被検物質と、酵素で標識された被検物質とを該
第一抗体に競合的に反応させ、得られる第二抗体に結合
した第一抗体に結合している酵素で標識された被検物質
を検出することを特徴とする高感度酵素免疫測定法（間
接法）。

（■）構成成分として、ＦＲ−９００５０６物質中の抗
原決定基を認識する抗体、および酵素で標識されたＦＲ
−９００５０６物質を含むことを特徴とするＦＲ−９０
０５０６物質を検出するための試験キット。

以下本発明について詳細に説明する。

（Ｉ　）ＦＲ−９００５０６物質中の抗原決定基を認識
する抗体 上記抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を
含む。

ポリクローナル抗体は、その）（鎖（ｈｅａｖｙｃｈａ
ｉｎ）の違いによって、ＩｇＧ、　ＩｇＡ、　ＩｇＭ、
ＩｇＤまたはＩｇＥのようなりラスがあり、さらにこれ
らの各クラスにはいくつかのサブクラスが存在するが、
本発明の抗体はＦＲ−９００５０６物質中の抗原決定基
を認識するものであれば、いずれのタイプのものでも使
用でき、特に好ましいクラスはＩｇＧである。

ポリクローナル抗体は動物に免疫原となる物質（例えば
、ＦＲ−９００５０６物質）を投与して免疫し、得られ
る抗血清から単離・精製される。

免疫操作は常法により行なわれる。

免疫感作される動物は特に限定きれないが、通常ウサギ
、モルモット、ラット、マウス、ヤギ等が使用され、特
に好ましいものはウサギである。

免疫原となる物質（例えばＦＲ−９００５０６物質）は
通常免疫原性を高めるため、例えば牛血清アルブミン（
以下ＢＳＡと表記）、ゼラチン、ヘモシアニン等の担体
と結合させて使用する。免疫原となる物質がＦＲ−９０
０５０６物質である場合、ＢＳＡとの結合体（ＢＳＡ　
−ＦＲ−９００５０６物質結合体）は、例えばＲ−９０
０５０６物質をこはく酸等のジカルボン酸のハーフエス
テルに変換し、次いでジシクロへキシルカルボジイミド
等の縮合剤の存在下Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド等を
作用させて、該ハーフエステルの活性エステルに導き、
さらにＢＳＡと反応きせることにより得られる。

ポリクローナル抗体は、得られた抗血清から硫安等の塩
析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなどの
常法の操作に付して単離・精製される。

モノクローナル抗体もそのＨ鎖の違いによってポリクロ
ーナル抗体と同様のクラスやサブクラスを有するが、本
発明のモノクローナル抗体はＦＲ−９００５０６物質中
の抗原決定基を認識するものであれば、いずれのタイプ
のものも使用でき、特に好ましいクラスはＩｇＧである
。

モノクローナル抗体は通常細胞融合法により製造される
が、遺伝子操作の技術によっても製造できる。

扁胞融合において使用される抗体産生細胞（例えば、抗
ＦＲ−９００５０６物質抗体産生細胞）は、免疫原性を
高められた物質（例えば、ＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０
６物質結合体）で免疫された動物（例えば、マウス、ラ
ット、ラビット、ヤギ等）の肺細胞、リンパ節細胞もし
くは末梢リンパ球等である。また、あらかじめ取り出さ
れた前述の細胞あるいはリンパ球等に培養液中で免疫原
を作用させてできる抗体産生細胞も使用できる。尚、後
者の操作を用いる場合にはヒト由来の抗体産生細胞も調
製できる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は融合可能であれ
ば、互いに異なる動物種に由来するものであってもよい
が、同種の動物由来のものを使用するのが好ましい。

細胞融合法によるモノクローナル抗体の製造は、例えば
ケーラーとミルスタイン（Ｋ６ｈｌｅｒ　ａｎｄＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ　）の基本方法［ネイチャー第２５６巻、第
４９５頁（１９７５）］に従って常法により行なわれる
。

特に好ましくは、ＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結
合体で免疫したマウスから得られた肺細胞と、マウス骨
髄腫細胞とを細胞融合して／Ｓイブリドーマを製造し、
その中からＦＲ−９００５０６物質に特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生じているノｈイプリドーマを選別する
。該ハイブリドーマをマウス腹腔で増殖浮せ、その腹水
からＩｇＧ画分の抗ＦＲ−９００５０６物質モノクロー
ナル抗体を取得する。

（Ｉ［）ＦＲ−９００５０６物質の酵素免疫測定法（直
接法）直接法による酵素免疫測定はＰＲ−９００５０６
物質中に存在する抗原決定基を認識する抗体を固定化し
、該固定化抗体にＦＲ−９００５０６物質を含む検体お
よび酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質とを競合
的に反応させ、固定化抗体に結合した酵素で標識された
ＦＲ−９００５０６物質を検出することにより行なわれ
る。ＦＲ−９００５０６物質中に存在する抗原決定基を
認識する抗体とは、発明（１）記載の抗体を意味し、ポ
リクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のどちら
でも使用できるが、より選択性が高く、各製造ロット間
でその特性に差がない等の理由からモノクローナル抗体
が好ましい。固定化する場合の同相としては、例えばプ
レート（イムノプレート等）、粒子（イムノビーズ等）
、ポリスチレンポールや試験管等が使用されるが、簡便
な操作性の点でイムノプレートが好ましい。ＦＲ−９０
０５０６物質を標識する酵素としては、酵禦免疫測定法
に通常使用される酵素が挙げられる。例えば、ペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、グルコースオキシターセ、アセチルコリンエ
ステラーゼ、グルコース−６−りん酸脱水素酵素、りん
ご酸脱水素酵素もしくはウレアーゼ等が使用できるが、
好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと表記
）である。

酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質は常法に従い
調製される。例えば架橋剤を用いる場合は前記発明（Ｉ
）記載のＦＲ−９００５０６物質とこはく酸等のジカル
ボン酸から作られるハーフエステルにＮ−ヒドロキジサ
クシンイミド等を作用させ、生成する該ハーフエステル
の活性エステルに、ＰＯＤ等の標識に使用できる酵素を
反応きせることにより得られる。

固定化抗体に結合した酵素標識物質の検出は、標識に使
用されている酵素の活性を常法により測定することによ
り行なわれる。例えば標識に用いられた酵素がＰＯＤの
場合には、Ｏ−フエニレンジアミンと過酸化水素水とを
含む酵素基質溶液を使用し、固定化抗体に結合したＰＯ
Ｄ−ＦＲ−９００５０６物質標識体の量に応じて酸化さ
れた基質の発色の程度を吸光度測定することによりＦＲ
−９００５０６物質の定量が行なわれる。

本直接法により、ＦＲ−９００５０６物質の微量濃度（
１０−１〜１１０３ｎ／ｍＱ　）を高感度かつ簡便に定
量的および定性的に測定することができる。

（Ｉ［）酵素免疫測定法（間接法） 間接法による酵素免疫測定は、被検物質を認識する第一
抗体および該第一抗体を認識する固定化された第二抗体
を使用し、該第一抗体に検体に含まれる被検物質と酵素
で標識された被検物質とを競合的に反応させ、得られる
第二抗体に結合した第一抗体に結合している酵素で標識
された被検物質を検出することにより行なわれる。

該間接法はペブタイド、ステロイド、プロスタグランジ
ン、多糖類もしくは大環状化合物等をはじめ種々の物質
を被検物質として測定できるが、大環状化合物、より具
体的にはＦＲ−９００５０６物質の濃度測定に使用でき
る。

第一抗体は被検物質を認識できる抗体であればポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでも使用でき
るが、より選択性が高く、各製造ロフト間でその特性に
差がない等の理由からモノクローナル抗体が好ましい。

該第一抗体は発明（Ｉ）の記載と同様に調製され、被検
物質がＦＲ−９００５０６物質の場合には、第一抗体は
発明（Ｉ）により記載きれている抗体が使用される。

該第一抗体を認識する第二抗体としては、第一抗体もし
くは第一抗体と同一種の抗体を抗原として用い常法によ
り調製された抗体でも、市販されている抗体でも使用で
きるが、第一抗体と被検物質との抗原抗体反応を妨げず
、第一抗体を認識するものであればポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体にかかわらず使用できる。好まし
くはラビットから得られたＩｇＧクラスの抗体を第一抗
体として使用する場合は、第二抗体としてヤギ抗ラビッ
トＩｇＧを用い、またマウスから得られたＩｇＧクラス
の抗体を第一抗体として使用する場合は、第二抗体とし
てラビット抗マウスＩｇＧ−を使用する。

固定化する同相、被検物質を標識する酵素およびその酵
素の検出方法は発明（Ｉ［）に記載のものと同様の物お
よび方法が使用される。

本間接法は、固定化された第二抗体が認識する第一抗体
の量を調節することにより、被検物質の検出限界値を変
えることができる。すなわち、本発明の具体例として記
載のＦＲ−９００５０６物質の定量の場合は、１０−”
ｎｇ／　ｍＱ程度の極めて微量な濃度まで高感度に且つ
簡便に定量的および定性的に測定できることが示された
。

（ＩＶ）試験キット この試験キットは、ＦＲ−９００５０６物質中に存在す
る抗原決定基を認識する抗体と、酵素で標識されたＦＲ
−９００５０６物質を含むことを特徴とする。

’　ＦＲ−９００５０６物質中に存在する抗原決定基を
認識する抗体」とは前述の（１）に記載されたポリクロ
ーナル抗体もしくはモノクローナル抗体が示すが、好ま
しくはモノクローナル抗体である。なお該抗体は固体状
態でも、溶液状態でも供給することができる。

酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質とは、前述の
（Ｉ［）で記載されたものを示すが、好ましくは、ペル
オキシダーゼで標識されたＦＲ−９００５０６物質であ
る。

なお該化合物も、固体状態または溶液状態のいずれでも
供給することができる。

この試験キットは、きらに本願中の高感度酵素免疫測定
法を実施する際に使用される物を含んでいてもよい。た
とえば、ＦＲ−９００５０６物質を定量的に測定する際
に必要な既知の量のＦＲ−９００５０６物質を、標準試
料として含んでいてもよい。また別の例としては、本願
発明（Ｉ［［）において示されたような”ＦＲ−９００
５０６物質中に存在する抗原決定基を認識する抗体゛を
認識する抗体があげられる。

そして、さらに別の例としては、ＦＲ−９００５０６物
質の標識として用いられた酵素の基質があげられる。

実施例１．抗ＦＲ−９００５０６物　ポリクローナル抗
体二■１ １）こはく酸−ＦＲ−９００５０６物質ハーフエステル
の活性エステルの合成 ＦＲ−９００５０６物質 ↓ こはく酸−ＦＲ−９００５０６物質ハーフエステル■ ＦＲ−９００５０６物質（２４８ｍｇ　）をピリジン（
７ｍｍ）に溶解し、これにこはく酸無水物（１４５ｍｇ
）と４−ジメチルアミンピリジン（７−）を加え、室温
で１８時間攪拌する。反応液を減圧下で濃縮乾固し、残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィにかけ、酢酸エ
チルで展開してこはく酸−ＦＲ−９００５０６物質ハー
フエステル（９０ｍｇ）を得る。このハーフエステル（
９０ｍｇ）を酢酸エチル（ｔｏｍＱ　）に溶解した溶液
に、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（１２，６ｍｇ）を
溶解し、これに水冷攪拌下ジシクロへキシルカルボジイ
ミド（２２ｍｇ　）を添加し、室温下−晩攪拌する。沈
澱物を濾去し、濾液を減圧留去する。残渣をシリカゲル
薄層クロマトグラフィに付し、酢酸エチルで展開するこ
とにより精製し、上記化合物の活性エステル（７４，１
ｍｇ　）を得る。

ＩＲν　（ニー））　　：　　１８１３．　１７８４．
　１７３５．　１６４０゜１２００　ｃｔｎ−” ２）ＢＳＡ−ＦＲ−９００５０６物質結合体の調製上記
で得られたこはく酸−ＦＲ−９００５０６物質ハーフエ
ステルの活性エステル（３７ｍｇ）をジオキサン（４ｍ
ｍ）に溶解した溶液に、ＢＳＡ（アルモア製薬社製）　
（３０，１ｍｇ　）を０．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７
，３＞（１０＋１１１１　）に溶解した溶液を加え、４
°Ｃで３日間攪拌し、反応混合物を０．０５Ｍりん酸緩
衝液（ｐＨ７，３）に対して２４時間透析することによ
りＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結合体を調製する
。

２Ｏ− ３）ＰＯＤ−ＦＲ−９００５０６物質標識体の調製１）
で得られたこはく酸−ＦＲ−９００５０６物質ハーフエ
ステルの活性エステル（０，４８ｍｇ　）のジオキサン
溶液（ＩＯＡ　）に、ホースラデイツシュ・ペルオキシ
ダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　Ｐａｒｏｘｉｄａｓ
ａ、　ｒｙｐａ　ＶＩ＋シグマ社製）　（１０ｍｇ）の
ジオキサン−０，５％炭酸水素ナトリウム（１：　ｌｖ
／ｖ）混合溶液（０，３６ｎ＋ｕ）を加え、４℃で２３
５時間間接ｆする。これに０．１％ｗ／ｖゼラチンー０
．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）（１，７７順）を
加えた後、０．０５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）ニ対
シテ透析し、ＰＯＤ　−ＦＲ−９００５０６物質標識体
溶液を得る。

４）抗ＦＲ−９００５０６物質ポリクロ一ナル抗体の調
製２）テ得りＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結合体
（ＢＳＡ量として１．６ｍｇ　）のりん酸緩衝生理食塩
水（以下ＰＢＳ溶液と表記）（２，５１１９）を等量の
フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバントに乳化
し、ニューシーラントホワイト種ラビット（雌）７匹の
フ・ントバッド（ｆｏｏｔ　ｐａｄ　）と皮下にそれぞ
れ５戚ずつ注射して免疫を行なう。２週後と３週後に、
前記と同量のＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結合体
のＰＢＳ溶液を等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ　）の
不完全アジュバントで乳化したものを５ｍｆＬずつフッ
トパッドと皮下に注射して追加免疫を行なう。

更に追加免疫から３週後、同様にして最終免疫を行なう
。最終免疫９日後に全採血を行ない、得られる抗血清（
３４０ｍ１ｌ　）に等量のＰＢＳ溶液及び等量の１００
％飽和硫安を加え塩析する。得られる析出物を遠心分離
（１０，ＯＯＯｒｐｍＸ　１０分）して集め、２０ｍＭ
りん酸緩衝液（ｐＨ８，０）　（２００ｍＱ　）に溶解
し、同緩衝液（ｐＨ８，０）に対し、充分透析後、同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５２、ワッ
トマン・ケミカル・セパレーション社製）にて精製し、
抗ＦＲ−９００５０６物質ポリクロ一ナル抗体（５，６
ｇ）を含む素通り画分（ＩｇＧ画分）を得た（抗体の量
は波長２８０ｎｍにおける吸光度の値から計算した）。

なお、本実施例にて用いられるＰＢＳ溶液とは、水１．
０ρ中に下記組成を含む溶液を意味し、以下の実施例に
おいても同様である。

ＮａＣ１８，Ｏｇ Ｎａ２ＨＰＯ４１，１５ｇ ＫＣｌ　　　　　　　　　　　０．２ｇＫＨ２ＰＯ４０
，２ｇ 実施例２．抗ＦＲ−９００５０６モノクローナル抗立■
１ １〉抗ＦＲ９００５０６物質モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマの調製 実施例１の２）で得られたＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０
６物質結合体（ＢＳＡ量として５０ｘ）のＰＢＳ溶液（
０，２１１１１１＞を等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ
　）の完全アジュバントに乳化し、ＢＡＬＢ／ｃマウス
（雌）に腹腔的注射する。

その後同量のＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結合体
のＰＢＳ溶液を等量のフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ　）の
不完全アジュバントで乳化したものを、２適間隔で２回
腹腔内注射し、２次、３次の免疫を行なう。さらにその
後、４次免疫として、１０倍量のＢＳＡ−ＦＲ−９００
５０６物質結合体（ＢＳＡ量としてｓｏｏｓｇ　）のＰ
ＢＳ溶液（０，２ＩｌＩＱ）をフロイント（Ｆｒｅｕｎ
ｄ　）の不完全アジュバントに乳化し、皮下注射した後
、最終免疫とじてＢＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結
合体（ＢＳＡ量として２００（）のＰＢＳ溶液（０，ｚ
ｍＱ）を尾静脈より静注し、３日後に肺臓を取り出す。

この肺臓をビンセットでほぐし、得られる肺細胞とマウ
スミエローマ細胞Ｐ３　Ｘ　６３Ａｇ８Ｕ・１とを下記
方法に従って融合する。

すなわち、肺細胞をダルベツコ氏改変イーグルズ・ミニ
マム・エッセンシ〜ルメデイウム（最小必須培地、以下
Ｄ　−ＭＥＭという）に浮遊させ、浮遊液中の赤血球を
０．８３％塩化アンモニウム溶液（９容量）と０．１７
Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６５，１容量）との混液で４°Ｃで５分間
処理して破壊し遠心分離により除去する。１０％ウシ胎
仔血清加Ｄ−ＭＥＭ中で培養したマウスミエローマ細胞
と肺細胞をＤ−ＭＥＭで数回洗浄する マウスミエローマ細胞（４Ｘ１０７個）の浮遊液に肺細
胞（２Ｘ１０８個）の浮遊液を加え、混液を５０１１１
９のプラスチック管（コーニング・グラス・ワークス社
製５０ＩＩＩＱコーニング遠心管）中でよく混合する。

培地を遠心分離により除去し、細胞を水浴中で３７°Ｃ
に加温する。この細胞に、振り混ぜながら４５％ポリエ
チレングリフール（メルク社製、平均分子量４．０００
）溶液（１眠）を１分間かけて徐々に加え、混合物を室
温で５分間放置する。反応混合物に５分間かけてＤ　−
ＭＥＭ　（１５ｍＡ　）を消却して細胞融合反応を停止
させ、大量のＤ　−ＭＥＭを加えた後、混合物を遠心分
離して上清を除去する。残渣に１５％ウシ胎仔血清（セ
ンタウラス社製、ロット７５７）、グルタミン２ｍＭ、
２−メルカプトエタノール２×１０−５Ｍ、硫酸ストレ
プトマイシン１１００Ｎ／ｍＱ、ペニシリンＧ１００Ｕ
／ｍＱ、硫酸ゲンタマイシン８０ｘ／ｍｕおよびファン
ギゾン（アンホテリシンＢ１ギブコラボラトリー製）を
補ったＤ−ＭＥＭよりなる完全培地（以下ＣＭという）
を加える。

混合物を少し混ぜた後、生じた融合細胞浮遊液を２４ウ
エルのプレート（ヌンク社製）１０枚に肺細胞が１ウェ
ル当り１×１０６個になるよう１ウ工ルＩｍｕずつ分注
し、５％炭酸ガス気中３７℃で１日培養した後、アミノ
プテリン（４Ｘ１０”Ｍ）、チミジン（１，６Ｘ　１０
＝Ｍ　）およびヒボキサンチン（ＩＸＩＯ−’Ｍ〉を含
有するＣＭ　（ＨＡＴ培地）１ｍＱを各ウェルに添加す
る。１日後、各ウェルから半量の培地を吸引除去しＨＡ
Ｔ培地を添加する。その後２日または３日毎に培地交換
を続ける。

ハイブリドーマの生育した１６１ウェル中固相ＢＳＡ−
ＦＲ−９００５０６物質結合体に反応性を示し、且つＲ
−９００５０６物質に対し特異的に反応性を示す１４ウ
エルを選択する。きらにその１４ウエルの中から抗体価
（ｔｉｔｅｒ　）の高い８ウエルを、ＢＡＬＢ／　ｃマ
ウスの胸腺細胞をフィーダー層（５×１０６細胞／ｍＱ
）として用いた９６ウエル平底マイクロプレート（ヌン
ク社製）を用いて、限界希釈法によりクローニング操作
を行ない、ＦＲ−９００５０６物質に特異性を示すモノ
クローナル抗体を産生ずる３種類のハイブリドーマを得
る。

なお、前記各ウェル中の抗体アッセイは、下記に示すよ
うな固相ＢＳＡ−ＦＲ−９００５０６物質結合体に反応
し、かつその反応が過剰量のＦＲ−９００５０６物質に
より拮抗するクローンを選出する方法で行なすなわちＢ
ＳＡ　−ＦＲ−９００５０６物質結合体に対する反応性
の確認は、該結合体を同相コーティング（固相コーティ
ング条件は２０Ｐｇ／ｌ１ｌｕＰＢＳ溶液を１００鴻／
ウエル添加して３７°Ｃで２時間静置）した各ウェルに
培養液（Ｌｏｏｍ　）を添加して３７℃で２時間静置す
る。吸引除去、洗浄後ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ（マイ
ルス社製、コード６１−２０４・１）の１％ＢＳＡを含
むＰＢＳ溶液（以下１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液と表記）に
よる２０００倍希釈液（１００鴻）を添加し、３７℃で
１時間放置する。吸引除去、洗浄後常法の発色法にてＰ
ＯＤ活性を測定する。また、ＦＲ−９００５０６物質に
特異的に反応する抗体であるかどうかの確認は、ＢＳＡ
−ＦＲ−９００５０６物質結合体を固相コーティングし
た各ウェルに、１００Ｐｔ、／ｍＱ濃度に調製したＦＲ
−９００５０６物質の１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液（５０
縛）を添加した上で、培養液（１００ｔａＱ　）を添加
して反応後、ＰＯＤｍ識抗マウスＩｇＧにより同様の反
応、発色操作を行ない、過剰のＦＲ−９００５０６物質
を加えることによってその発色が抑えられることにより
確認する。

２）モノクローナル抗体の単離・精製 ２　、６．１０．１４−テトラメチルペンタデカンを投
与して免疫抑制状態にしたＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）の
腹腔内に、実施例２の１〉で得た３種類のハイブリドー
マを、各々１マウス当り１×１０７個移植し、１０〜１
４日後に腹水を採取する。５０％の飽和硫安により分画
した後、１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）にて透析
する。１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化し
たＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィに付し、
１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）中、０〜１５０ｍ
Ｍの塩化ナトリウム連続濃度勾配法で溶出させ、各ハイ
ブリドーマの産生するＩｇＧの分画を得た。各ＩｇＧの
サブクラスはオフタロニーの二重免疫拡散法により決定
した（表１）。

表１ １）抗体の同相への吸着操作 モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体の溶液
（２に／ｎｉｌ、　ＰＢＳ溶液）　２００ｄずつをエリ
ザ用プレートＳ　（ＭＳ−３４９６Ｆ、住友ベークライ
ト社製）の各ウェルに分注し、４°Ｃで１晩静置する。

抗体溶液を回収後、プレートをＰＢＳ溶液で３回洗浄す
る。

２）非特異的吸着防止操作 上記の各プレートに、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を満たし
、３７℃で３０分放置後、ＰＢＳ溶液を吸引除去する。

３）抗原抗体反応 （１）１０％正常血漿を含む１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液
で希釈した標準ＦＲ−９００５０６物質溶液１００縛ず
つを上記各ウェルに分注する。

（２）実施例１の３）で調製したＰＯＤ　−ＦＲ−９０
０５０６物質標識体溶液を１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液で
２×１０５倍希釈した液１００縛ずつを上記の各ウェル
に分注する。

（３）上記各ウェルをプレートミキサーで１０秒間攪拌
し、４°Ｃで一晩放置する。

４〉酵素反応 ００５％ツイーン（Ｔｗａｅｎ　）　２０を含むＰＢＳ
溶液で上記各ウェルを２回、さらにＰＢＳ溶液で２回洗
浄後、下記のように調製した酵素基質溶液（２００）１
１１）を上記各ウェルに分注し、３０分間室温で反応き
せる。酵素基質溶液は使用直前に調製する。

酵素基質溶液： Ｏ−フェニレンジアミン（１００ｍｇ）と３０％過酸化
水素水（５０ｍ　）をｐＨ５，４のマクバイン（Ｍｃｌ
ｌｖａｉｎｅ　）緩衝液（０，１Ｍりん酸水素二ナトリ
ウム溶液に０．１Ｍ＜えん酸を加えｐＨ５，４に調製し
たもの）　（ｔｏｏｍＱ）に溶解したもの。

５〉反応停止操作 ４Ｎ硫酸溶液（５０ｓＱ　）を上記各ウェルに分注し、
反応を停止させる。

６）測定 基質溶液を対照とし、マルチスキャン（商品名、タイタ
ーチック社製）により波長４９２ｎｍで、反応液の吸光
度を測定する。

以上の測定方法に従い、実施例１で得た抗ＦＲ−９００
５０６物質ポリクローナル抗体及び実施例２で得り抗Ｆ
Ｒ−９００５０６物質モノクローナル抗体（３種類）を
用い、それぞれ正常血漿として正常ピーグル大（雄）の
血漿を用いた場合の結果を表２に示す。

表２　直接法による、ＦＲ−９００５０６物質の酵素免
疫測定結果 Ｐｏ−Ａｂ　　　−抗ＦＲ−９００５０６ポリクローナ
ル抗体Ｍｏ−Ａｂ（１）　−−−モノクローナル抗体Ｆ
Ｒ−９００５０６−１−４０−５６Ｍｏ−Ａｂ（２）・
・・／／ＦＲ−９００５０６−１−５３−１９Ｍｏ−Ａ
ｂ（３）・・・／／ＦＲ−９００５０６−１−６０−４
６列４　、　ＦＲ−９００５０６の　　　　ｌ　法（５
遺里１ １）抗体の同相への吸着操作 第二抗体溶液（３ｐｇ／＋ｎＱ％ＰＢＳ溶液）　２００
４ずつをエリザ用プレートＨ（ＭＳ−３５９６Ｆ　、住
人ベークライト社製）の各ウェルに分注し、４℃で１晩
靜置する。抗体溶液を回収後、該プレートをＰＢＳ溶液
で３回洗浄する。

２〉非特異的吸着防止操作 上記各プレートに１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液を３００４
満たし、３７°Ｃで３０分放置後、ＰＢＳ溶液を吸引除
去する。

３〉抗原抗体反応 （１）１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液で希釈（第一抗体がポ
リクローナル抗体の場合は５Ｘ１０’倍希釈、第−抗一
体がモノクローナル抗体の場合は、２×１０５倍希釈）
したＰＯＤ−ＦＲ−９００５０６物質標識体溶液１００
縛ずつを上記各ウェルに分注する。

（２）１０％正常血漿を含む１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液
で希釈した標準ＦＲ−９００５０６物質溶液１００ＪＪ
ずつを上記各ウェルに分注する （３）１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液で調製した第一抗体溶
液（第一抗体がポリクローナル抗体の場合は、４００ｎ
ｇ／ｍＱ、第一抗体がモノクローナル抗体の場合は、Ｌ
ｏｎｇ／ｍ１１　）　５０Ｓずつを上記各ウェルに添加
する。

（４）上記各ウェルをプレートミキサーで１０秒間攪拌
し、４℃で一晩放置する。

４）酵素反応 実施例３の４〉と同様。

５〉反応停止 実施例３の５）と同様。

６〉測定 実施例３の６）と同様。

以上の測定方法に従い、実施例１で得た抗ＦＲ−９００
５０６物質ポリクローナル抗体及び実施例２で得たモノ
クローナル抗体ＦＲ−９００５０６−１−６０−４６を
それぞれ第一抗体として用い、正常血漿として正常ピー
グル大（雄）の血漿を用いた場合の結果を表３．４にそ
れぞれ示す。

表３　　抗ＦＲ−９００５０６物質ポリクロ一ナル抗体
利用の間接法によるＦＲ−９００５０６物質の酵素免疫
測定結果 表４　　モノクローナル抗体ＦＲ−９００５０６−１−
６０−４６利用の間接法によるＦＲ−９００５０６物質
の酵素免疫測定結果 向、第二抗体は第一抗体が抗ＦＲ−９００５０６物質ポ
リクロ一ナル抗体の場合は、ヤギ抗ラビットＩｇＧ（マ
イルス社の抗血清（コード６４−３３１−１　）を硫安
塩析後、　ＤＥＡＥセルロースにて精製したもの）を、
また第一抗体がモノクローナル抗体ＦＲ−９００５０６
−１−６０−４６の場合はラビット抗マウス＝３６− ＩｇＧ　（イーワイーラボラトリー社製・カタログＮｏ
。

ＡＦ−０１１）をそれぞれ使用している。

り５．闇　　による血　中゛　測　試 下記組成のＦＲ−９００５０６物質を含む固体分散製剤
をピーグル犬（雄）３匹に経口にて単回投与（１ｍｇ／
　ｋｇ　）　Ｌ、、実施例４に記載の測定法（第一抗体
としてモノクローナル抗体ＰＲ−９００５０６−１−６
０−４６を使用した系）に従って、１０％正常血漿を含
む１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶液で希釈した標準ＦＲ−９０
０５０６物質溶液のかわりに、１％ＢＳＡ　−ＰＢＳ溶
液で１０倍希釈した検体（血漿）を用い、血漿中濃度を
モニタリングした。結果（３匹の平均値）を表５に示す
。

尚、表中の時間は、ＦＲ−９００５０６物質を含む固体
分散製剤を投与後の経過時間を示す。

固体分散製剤の組成（１，０ｇあたり）ＦＲ−９００５
０６物質　　　　　　　　　　　　０．２ｇヒドロキシ
プロピルメチルセルロース ２９１０（ＴＣ−５Ｒ）　　　　　　　　　　　　０．
２ｇクロスカルメロースナトリウム （ＡＣ−Ｄｉ−５ｏｌ）　　　　　　　　　　　０．２
ｇ乳＠　　　　　　　　　　　　　　　　０・４ｇ表５
．　間接法によるＦＲ−９００５０６物質の血漿中濃度
モニタリング結果 く構成成分（１０００検体用）〉 （１）第一抗体（抗ＦＲ−９００５０６物質モノクロー
ナル抗体）溶液（５００４）１〉： １％ＢＳＡ　−ＰＢＳにてｌｘ／ｍＡに調製したもの（
２）　ＰＯＤ−ＦＲ−９００５０６物質溶液（５００鴻
）２）：実施例１の３）で得られた溶液を１％ＢＳＡ−
ＰＲ５４こて１０００倍希釈したもの （３）　ＦＲ−９００５０６物質標準溶液（１ｍｍ）３
）。

メタノールにて１　ｍｇ／　ｍＱに調製したもの（４）
第二抗体（ラビット抗マウスＩｇＧ　）溶液（６００、
、）４）： ＰＢＳにて１　ｍｇ／　ｍＱに調製したもの１）・・１
％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１００倍希釈して使用する。

２〉・・１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで２００倍希釈して使用
する。

３）・・１％ＢＳＡ　−ＰＢＳで必要濃度まで希釈して
使用する。

４）・・ＰＢＳで３３３倍希釈して使用する。

該試験キット（Ｉ＞は、間接法を実施するに際し、実施
例４の操作手順に従って用いられる。

実施例７３間接法　施のための試験キ・シト（■）く構
成成分（ｔｏｏｏ検体用）〉 （１）第一抗体（抗ＦＲ−９００５０６物質モノクロー
ナル抗体）溶液（１＋ａｌｌ）１）。

１％ＲＡＳ　−ＰＢＳで１椰／躯に調製したもの。

（２）　ＰＯＤ−ＦＲ−９００５０６物質溶液（７００
縛）２〉：実施例１の３）で得られた溶液を１％ＢＳＡ
−ＰＩ６にて１０００倍希釈したもの。

（３）　ＦＲ−９００５０６物質標準溶液（各々１ｍｕ
）：メタノールにて、各々、１００．５０．２０．１０
．５．２．１．０．５．０．２あるいはＯｎｇ／ｍｌｌ
に調製したもの （４）第二抗体（ラビット抗マウスＩｇＧ）溶液（１戚
）３）： ＰＢＳにて１ｍｇ／ｍＱに調製したもの１〉・・・・１
％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ　
（以降、１％ＢＳＡ−０，０５％ツイーン２Ｏ−ＰＢＳ
と略記）で５０倍希釈して使用する。

２）・・・・１％ＢＳＡ−０，０５％ツイーン２０−　
ＰＢＳで３００倍希釈して使用する。

３〉・・・・ＰＢＳで２００倍希釈して使用する該試験
キット（■）は間接法を実施するに際し、次に記載する
ようなカラムルートもしくは抽出ルートに従って用いら
れる。

［カラムル−トコ １、測定サンプル（血漿もしくは血清）　（１ｏｏｎ　
）に（１，ＩＮ塩酸（１ｍｍ）およびメタ／　−ル（１
０）ＬＱ　）を加え、２〜３分間攪拌する。

１　’　、　ＦＲ−９００５０６物質の標準溶液の調製
正常血漿もしくは正常血清（１００Ｓ　）に、０．ＩＮ
塩酸（１ｍｍ）およびＦＲ−９００５０６物質標準溶液
（１０縛）を加え、２〜３分間攪拌する。

２、カラム処理 ｉ）セップーパックカラム（商標名；Ｃ１８カートリッ
ジカラム、ウォータース　アソシエイツ製（米国））を
メタノール（５１１１１１）で活性化し、次いで４％酢
酸溶液（２０ｍＱ　）で洗浄する。

ｉ）該セップーバック力ラムに前記１もしくは１′の測
定サンプルもしくは標準溶液をかける。

ｉ）該セップーパックカラムを４％酢酸溶液（２０ｍ＋
、）で洗浄する。

〜）　ＦＲ−９００５０６物質をメタノール（３ｍｍ）
で溶出させ、遠心沈殿管で集める。

３．窒素ガス気流にて乾固する。

４　、ＰＯＤ−ＦＲ−９００５０６物質の１％ＢＳＡ−
０，０５％ツイーン２Ｏ−ＰＢＳ溶＃　（２００縛）に
て、その残渣を溶解する。

５、第二抗体溶液（２０ＯＮ　）を９６−ウェル平底マ
イクロタイタープレートの各ウェルに加え、４℃で一晩
攪拌反応させる。

６、第二抗体溶液を各ウェルから吸引除去する。

７、ＰＢＳで３回洗浄する。

８．３回目の洗浄の後、ただちに、プレートの各ウェル
に、１％ＢＳＡ−０．０５％ツイーン２０−　ＰＢＳ　
Ｃ非特異的吸着防止溶液）　（３００Ｓ　）ずつを加え
る。

９、室温下、１時間放置する。

１０、非特異的吸着防止溶液をウェルから吸引除去し、
ただちに４で得られた測定サンプルもしくは標準溶液（
１８（ｌａＱ　）をそのウェルに加える。

この操作は、各ウェルごとに行なう。

１１、第一抗体（５０Ｓ　）を各ウェルに加える。

１２、プレートを４℃で一晩攪拌反応きせる。

１３溶液を吸引除去後、プレートを０．０５％ツイーン
２０−　ＰＢＳで２回洗浄し、そしてさらにＰＢＳで２
回洗浄する。

１４、ただちに、実施例３の４〉に記載の基質溶液（２
００ｄ　）を各ウェルに加え室温にて１５分間攪拌反応
させる。

１５、４　Ｎ硫酸溶液を各ウェルに加えて、酵素基質反
応を停止する。

１６基質溶液をブランクとし、波長４９２ｎｍにおける
各ウェルの吸光度を測定する。

［抽出ルート］ １、測定サンプル（血漿もしくは血清）　（１００ＰＡ
）に、メタノール（１（ＩＪＩ　）、０．２Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）　（１ｍＱ　）およびジクｏ　ｏ　
Ｊ　タン（６，０ｍＱ）を加える。

１′、正常血漿もしくは正常血清（１００ｔＪｌ　）に
、Ｒ−９００５０６物質標準溶液（１ＯＮ　）、０．２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　（１，０ｍ１ｌ　）お
よびジクロロタン（６，０ｍＱ）を加える。

２、各々の混合物を１０分間攪拌した後、３０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離する。

３、下層のジクロロメタン（５，ｏｍＱ）を取得し、窒
素ガス気流にて乾固する。

上記３．で得られる乾燥残渣は、前記記載のカラムルー
トの４〜１６と同様の方法に従って処理され、間接法が
実施される。

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＦＲ−９００５０６物質中に存在する抗原決定基
   を認識する抗体。
2. （２）ポリクローナル抗体である第（１）項記載の抗体
   。
3. （３）ポリクローナル抗体のクラスがＩｇＧである第（
   ２）項記載の抗体。
4. （４）モノクローナル抗体である第（１）項記載の抗体
   。
5. （５）動物の抗ＦＲ−９００５０６物質抗体産生細胞と
   骨髄腫細胞との細胞融合により形成されたハイブリドー
   マから産生される抗ＦＲ−９００５０６物質モノクロー
   ナル抗体である第（４）項記載の抗体。
6. （６）抗ＦＲ−９００５０６物質抗体産生細胞が、肺臓
   細胞である第（５）項記載の抗体。
7. （７）動物が、マウスである第（５）項または第（６）
   項記載の抗体。
8. （８）モノクローナル抗体のクラスがＩｇＧである第（
   ４）項、第（５）項、第（６）項または第（７）項記載
   の抗体。
9. （９）ＦＲ−９００５０６物質中に存在する抗原決定基
   を認識する抗体を固定化し、該固定化抗体にＦＲ−９０
   ０５０６物質を含む検体および酵素で標識されたＦＲ−
   ９００５０６物質とを競合的に反応させ、固定化抗体に
   結合した酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質を検
   出することを特徴とするＦＲ−９００５０６物質の高感
   度酵素免疫測定法。
10. （１０）抗体がポリクローナル抗体である第（９）項記
    載の高感度酵素免疫測定法。
11. （１１）抗体がモノクローナル抗体である第（９）項記
    載の高感度酵素免疫測定法。
12. （１２）被検物質を認識する第一抗体および該第一抗体
    を認識する固定化された第二抗体とからなり、検体に含
    まれる被検物質と酵素で標識された被検物質とを該第一
    抗体に競合的に反応させ、得られる第二抗体に結合した
    第一抗体に結合している酵素で標識された被検物質を検
    出することを特徴とする高感度酵素免疫測定法。
13. （１３）第一抗体がポリクローナル抗体である第（１２
    ）項記載の高感度酵素免疫測定法。
14. （１４）第一抗体がモノクローナル抗体である第（１２
    ）項記載の高感度酵素免疫測定法。
15. （１５）酵素がペルオキシダーゼである第（１２）項、
    第（１３）項または第（１４）項記載の高感度酵素免疫
    測定法。
16. （１６）第二抗体が、プレートに固定化されている第（
    １２）項、第（１３）項、第（１４）項または第（１５
    ）項記載の高感度酵素免疫測定法。
17. （１７）被検物質が、ＦＲ−９００５０６物質である第
    （１２）項、第（１３）項、第（１４）項、第（１５）
    項または第（１６）項記載の高感度酵素免疫測定法。
18. （１８）構成成分として第１項記載の抗ＦＲ−９００５
    ０６物質抗体、および酵素で標識されたＦＲ−９００５
    ０６物質を含むことを特徴とするＦＲ−９００５０６物
    質を検出するための試験キット。
19. （１９）抗ＦＲ−９００５０６物質抗体が抗ＦＲ−９０
    ０５０６物質モノクローナル抗体である第（１８）項記
    載の試験キット。
20. （２０）酵素で標識されたＦＲ−９００５０６物質が、
    ペルオキシダーゼで標識された、ＦＲ−９００５０６物
    質である第（１８）項または第（１９）項記載の試験キ
    ット。
21. （２１）既知の量のＦＲ−９００５０６物質をさらに含
    む第（１８）項、第（１９）項、または第（２０）項記
    載の試験キット。
22. （２２）抗ＦＲ−９００５０６物質抗体を認識する抗体
    をさらに含む第（１８）項、第（１９）項、第（２０）
    項または第（２１）項記載の試験キット。
23. （２３）抗ＦＲ−９００５０６物質抗体を産生するハイ
    ブリドーマを培養し、その培養物から抗ＦＲ−９００５
    ０６物質抗体を単離することを特徴とする、第（４）項
    記載のモノクローナル抗体の製造方法。